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一种节水型的九孔鲍育苗方法.pdf

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一种 节水 九孔 育苗 方法
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摘要
申请专利号:

CN201010271038.4

申请日:

20100831

公开号:

太阳城集团CN102017912B

公开日:

20121226

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01K61/00,A23K1/18,A23K1/16,C12N1/20,C12R1/01 主分类号: A01K61/00,A23K1/18,A23K1/16,C12N1/20,C12R1/01
申请人: 华南理工大学
发明人: 蔡俊鹏,陈小红
地址: 510640 广东省广州市天河区五山路381号
优先权: CN201010271038A
专利代理机构: 广州市华学知识产权代理有限公司 代理人: 裘晖
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法律状态
申请(专利)号:

CN201010271038.4

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种节水型的九孔鲍育苗方法。该方法包括步骤:(1)培藻;(2)加营养盐;(3)采苗布卵:将培藻池换掉水后,加入蛭弧菌游泳体菌液,使池水中的蛭弧菌游泳体起始浓度达10~107pfu/mL;下苗时每池布九孔鲍受精卵4~5万粒;(4)换水:每隔5~30天换掉池水一次,每次换水后加入蛭弧菌游泳体菌液,使池水中的蛭弧菌游泳体浓度达到10~107pfu/mL;(5)剥离采收。本发明育苗方法对九孔鲍鲍苗的生长有了明显的促进作用,并极大地提高了九孔鲍鲍苗的存活率,同时改善了养殖环境的水质。由于蛭弧菌游泳体对鲍鱼无毒副作用,因此适合于鲍鱼大规模工厂化养殖,为促进九孔鲍育苗提供了一种新的养殖技术。

权利要求书

太阳城集团1.一种节水型的九孔鲍育苗方法,其特征在于包括以下操作步骤:(1)培藻:采苗前30~45天开始在培藻池中进行培藻;培藻过程中控制光照强度在2000~5000lux,控制水温在15~28℃;(2)加营养盐:培藻期间,按照3~5g/m养殖水体,2~4天添加一次的方式添加营养盐;(3)采苗布卵:将培藻池换掉池水,加入蛭弧菌游泳体菌液,使池水中的蛭弧菌游泳体的起始浓度达10~10pfu/mL;下苗时每池布九孔鲍受精卵4~5万粒,并按照曝气量10~60L/h/m进行曝气,光照控制在200~3000lux,水温控制在15~28℃;(4)换水:每隔5~30天换水一次,每次换水后加入蛭弧菌游泳体菌液,使池水中的蛭弧菌游泳体的浓度达到10~10pfu/mL;(5)剥离采收:下苗30~50天,稚鲍壳长达到3.0~6.5mm后进行剥离采收;步骤(1)所述藻为底栖硅藻;步骤(3)和(4)所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,所述蛭弧菌于2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 209172。2.根据权利要求1所述的一种节水型的九孔鲍育苗方法,其特征在于:步骤(1)所述培藻池洗刷干净后采用高锰酸钾溶液进行消毒,然后注入经过砂滤和沉淀处理的海水;培藻池在注入海水之前,在池进水管口包扎一过滤袋,防止细沙入池。3.根据权利要求1所述的一种节水型的九孔鲍育苗方法,其特征在于:所述底栖硅藻为月形藻、菱形藻、舟形藻和卵形藻。4.根据权利要求1所述的一种节水型的九孔鲍育苗方法,其特征在于:步骤(1)所述培藻以无色透明聚乙烯薄膜为附着基。5.根据权利要求1所述的一种节水型的九孔鲍育苗方法,其特征在于:步骤(2)所述营养盐含有质量比为5∶1∶1∶1的N元素、P元素、Si元素和Fe元素。6.根据权利要求1所述的一种节水型的九孔鲍育苗方法,其特征在于:所述蛭弧菌游泳体菌液按照以下方法制备得到:接种宿主于营养肉汤液体培养基中,在28℃和200rpm摇床培养18h,培养液经4℃,5000~8000rpm离心10~20min后,沉淀加入至DNB液体培养基中,接入蛭弧菌BDFM05,在温度25~35℃下,以150~300rpm摇床培养36~48h,得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液,培养液在4℃温度下以6000~8000rpm离心15~20min后,将所得上清液经16000~18000rpm离心15~20min后,沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2~7.6的磷酸盐缓冲液悬浮,得到浓度为106~10pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液。7.根据权利要求6所述的一种节水型的九孔鲍育苗方法,其特征在于:所述宿主为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸馏水中,调节pH值至7.2~7.6。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖贝类育苗方法领域,涉及一种水产养殖贝类育苗方法,特别涉及一种节水、节能、减排的九孔鲍(Haliotis diversicolor aquatilis)的育苗方法。 

背景技术

太阳城集团九孔鲍是我国南方海域重要的养殖品种之一,年产量曾达4000吨。但2000年以来,从福建到海南沿海发生了九孔鲍人工培育种苗大量死亡现象,90%以上的鲍苗场几乎无法培育出九孔鲍苗且经营困难,这迫使许多养殖户放弃养殖九孔鲍。因此,研究如何改善九孔鲍苗培育生态环境,减少掉板现象的发生,提高其存活率和生长率,在九孔鲍苗种的生产技术乃至鲍养殖业中都具有十分重要的意义。 

研究发现,病原体感染是引起掉板的主要原因,人工养殖条件下主要是细菌性疾病和病毒性疾病。常见的细菌性病原体有副溶血弧菌、河流弧菌、副溶藻弧菌等。副溶血弧菌主要导致鲍鱼肌肉萎缩病,死亡率可达50%左右,而河流弧菌和副溶藻弧菌引发的感染可造成60-70%的死亡率。目前常规的防治鲍鱼掉板的方法主要是定期施用抗生素,抗生素的优点是药物直接入水、浓度高、吸收快、疗效好;缺点是可能会对鲍鱼产生刺激性、引发新病症。如果长期大量使用抗生素不仅会使致病菌抗药性增强,也会使一些鲍病例变得难以治愈。此外鲍体内抗生素残留会影响鲍鱼品质,不利于销售,进而造成养殖者的经济损失。利用中草药防治鲍鱼掉板也是一种常见的办法,虽具有无药物残留、经济效益高的优点,但也有见效慢的缺点。因此寻求一种更高效、经济的育苗方法显得极为迫切。 

太阳城集团蛭弧菌是寄生于其他细菌,并能导致宿主细菌裂解的一类细菌;比一般细菌小,能通过细菌滤器,有类似噬菌体的作用;蛭弧菌游泳体是指蛭弧菌侵入宿主细菌前的生长形式。蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快,一般几秒 钟内即可完成。相对于蛭弧菌蛭质体而言,虽然存在着制备繁琐、不易保存的弱点,但蛭弧菌游泳体在控制养殖水体和水产动物肠道的潜在致病菌方面具有起效快、活力强的优点。此外,传统的九孔鲍人工育苗主要采用抽取外海水经过沙滤沉淀后进入养殖池,废水经管道直接排入海区,这种直抽直排方式存在能耗高,对海区污染大的缺点,不仅加重养殖成本,还成为鲍日后发生病害的一大隐患。而本发明结合了蛭弧菌游泳体的使用,采用周期换水的方式,如此不仅减少养殖用水和废水排放,更是减少能耗,降低了养殖成本,是一种便利可行、节能减排的绿色育苗方式。 

已有的研究表明,作为一种有益微生物制剂,无论是在食品工业还是在(海洋)水产养殖等领域,蛭弧菌的应用均是安全的。例如:在国外,Lenz and Hespell(1978)研究发现,蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R.W.,Hespell R.B.Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives of Microbiology,1978,119(3):245-248]。在国内,林茂等(2006)研究了蛭弧菌对鱼类细胞的作用,发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂,杨先乐,薛晖,曹海鹏,邱军强。蛭弧菌BDH21 02对鱼类细胞及病原菌的作用。微生物学通报,2006,33(1):7-11]。 

发明内容

太阳城集团为克服上述现有育苗技术中存在的不足,本发明的目的在于提供一种节水型的九孔鲍育苗方法。 

本发明的目的通过下述技术方案来实现:一种节能减排的九孔鲍育苗方法,包括以下操作步骤: 

(1)培藻:采苗前30~45天开始在培藻池中进行培藻;培藻过程中控制光照强度在2000~5000lux,控制水温在15~28℃; 

太阳城集团(2)加营养盐:培藻期间,按照3~5g/m3养殖水体,2~4天添加一次的方式添加营养盐; 

太阳城集团(3)采苗布卵:将培藻池换掉池水,加入蛭弧菌游泳体菌液,使池水中的蛭弧菌游泳体的起始浓度达10~107pfu/mL;下苗时每池布九孔鲍受精卵4~5万粒,并按照曝气量10~60L/h/m3进行曝气,光照控制在200~3000lux,水温控制在15~28℃; 

太阳城集团(4)换水:每隔5~30天换水一次,每次换水后加入蛭弧菌游泳体菌液,使池水中的蛭弧菌游泳体的浓度达到10~107pfu/mL; 

(5)剥离采收:下苗30~50天,稚鲍壳长达到3.0~6.5mm后进行剥离采收。 

步骤(1)所述培藻池洗刷干净后采用高锰酸钾溶液进行消毒,然后注入经过砂滤和沉淀处理的海水;培藻池在注入海水之前,在池进水管口包扎一过滤袋,防止细沙入池。 

步骤(1)所述藻为底栖硅藻。所述底栖硅藻为月形藻、菱形藻、舟形藻和卵形藻。 

步骤(1)所述培藻以无色透明聚乙烯薄膜为附着基。 

步骤(2)所述营养盐含有质量比为5∶1∶1∶1的N元素、P元素、Si元素和Fe元素。 

步骤(3)和(4)所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05,所述蛭弧菌于2009年8月7日保藏于湖北省武汉市珞珈山武汉大学内的中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 209172。 

所述蛭弧菌BDFM05进行负染后于电子显微镜下进行形态观察:BDFM05呈单细胞,椭圆形,大小为1.43×0.53um,端生鞭毛,鞭毛长度至少2um;所述蛭弧菌BDFM05以双层平板法于28℃培养三天可形成直径2~3mm的透明圆形噬菌斑; 

所述蛭弧菌游泳体菌液按照以下方法制备得到:接种宿主于营养肉汤液体培养基中,在28℃和200rpm摇床培养18h,培养液经4℃,5000~8000rpm离心10~20min后,沉淀加入至DNB液体培养基中,接入蛭弧菌BDFM05,在温度25~35℃下,以150~300rpm摇床培养36~48h,得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液,培养液在4℃温度下以6000~8000rpm离心15~20min后,将所得上清液经16000~18000rpm离心15~20min后,沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2~7.6的磷酸盐缓冲液悬浮,得到浓度为106~109pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液。 

太阳城集团所述宿主为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila);所述DNB液体培养基是将营养肉汤0.8g、酪蛋白酸水解物0.5g和酵母精提物0.1g溶于1000mL蒸馏水中,调节pH值至7.2~7.6。 

本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果: 

(1)本发明的蛭弧菌游泳体对水产致病或潜在致病菌有强的裂解力,而且蛭弧菌游泳体本身能改善养殖生物肠道环境,促进生长,提高鲍苗免疫力。因此,与其他的微生物制剂相比,本发明中的蛭弧菌游泳体具有提高鲍苗自身的免疫力,提高其存活率,加快鲍苗的生长速度等特点。 

(2)现有的九孔鲍育苗技术采用的是流水的方式,如此一来,不仅耗费了巨大的人力、物力、财力,还会对环境造成一定的污染。而采用周期换水进行九孔鲍育苗,可以减少了供水量的需求,节约了生产成本,并且不会对环境造成不良影响,对鲍业及其他水产品养殖的可持续发展有着重要的意义。 

具体实施方式

太阳城集团下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数,可参照常规技术进行。 

本发明实施地为福建某鲍鱼养殖场。养殖池建在养殖大棚内,每个水池规格为2×2×0.75m,水深为0.45m。各池均用高锰酸钾溶液消毒,反复冲洗干净。水池上方盖上遮光度为70%的遮光布,避免光照过强。光照强度一般控制在(200-5000)lux。 

实施例1 

(1)蛭弧菌游泳体菌液的制备 

所用的蛭弧菌游泳体通过高密度蛭弧菌游泳体的发酵方法进行发酵:在装有100mL营养肉汤液体培养基(蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化钠5g,pH 7.4±0.2)的锥形瓶中接种0.5mL 107cfu/mL嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,菌种编号:GIM 1.172,来源于广东省微生物菌种保藏中心),200rpm、28℃摇床培养18小时,培养液分别于4℃、5000rpm离心15min,弃上清。用5mL生理盐水悬浮沉淀菌体,之后加入到一个装有100mL DNB(dilute nutrientbroth)液体培养基(营养肉汤0.8g,酪蛋白酸水解物0.5g,酵母精提物0.1g,海水晶28g,溶于1000mL蒸馏水,pH值为7.2~7.6)的锥形瓶中,再接入1mL含103pfu/mL的的蛭弧菌BDFM05(CCTCC M209172)。恒温摇床250rpm、28℃培养36h。培养液于4℃6000rpm离心20min,取上清液,再将上清液于4℃16000rpm离心20min,保留沉淀,加入10mL DNB液体培养基重新 悬浮沉淀物,得到浓度为109pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液。 

太阳城集团(2)蛭弧菌游泳体菌液在九孔鲍(Haliotis diversicolor aquatilis)育苗中应用。 

本发明一共可以分为两个阶段。第一阶段是培藻,培藻太阳城集团为40天,该阶段不添加蛭弧菌游泳体菌液;第二阶段是育苗阶段,本发明的内容主要在此阶段展开。育苗太阳城集团为40天,这一阶段实验组在每次换掉全池的水后立即添加蛭弧菌游泳体菌液。以不同的换水周期,分别向养殖水体投不同浓度的蛭弧菌游泳体菌液。换水周期分别为:5、10、15、20、25、30天,每次换水量为一个量程。所有实验池所处环境条件,包括温度、光照、pH值、盐度等相同。所有试验池共分25组,为A、B-1、B-2、B-3、B-4,C-1、C-2、C-3、C-4,D-1、D-2、D-3、D-4,E-1、E-2、E-3、E-4,F-1、F-2、F-3、F-4,G-1、G-2、G-3、G-4,每组2个平行。各组的换水周期及加菌浓度如下: 

下面具体对本实施步骤进行描述: 

A组:正常流水,日换水量为池水量的3倍,每天早上7:00用高压水冲洗池子,期间不加蛭弧菌游泳体菌液,为工厂生产方式; 

B组(B-1、B-2、B-3、B-4):5天换(全池)水一次; 

C组(C-1、C-2、C-3、C-4):10天换(全池)水一次; 

D组(D-1、D-2、D-3、D-4):15天换(全池)水一次; 

太阳城集团E组(E-1、E-2、E-3、E-4):20天换(全池)水一次; 

F组(F-1、F-2、F-3、F-4):25天换(全池)水一次; 

G组(G-1、G-2、G-3、G-4):30天换(全池)水一次; 

太阳城集团B-1、C-1、D-1、E-1、F-1、G-1组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体菌液,使水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到10pfu/mL。 

太阳城集团B-2、C-2、D-2、E-2、F-2、G-2组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体菌液,使水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到103pfu/mL。 

太阳城集团B-3、C-3、D-3、E-3、F-3、G-3组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体菌液,使水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到105pfu/mL。 

太阳城集团B-4、C-4、D-4,E-4、F-4、G-4组为每次换水后立即往水池中泼洒蛭弧菌游泳体菌液,使水体中蛭弧菌游泳体菌体浓度达到107pfu/mL。 

太阳城集团在第一阶段培藻过程中,每池布附着基膜20张,接藻种(当地海水中自 然生的),控制光照强度在2000~5000lux,水温在15~25℃;根据藻生长状况,按照5g/m3水体,4天添加一次的方式添加营养盐,营养盐的施加比例为N∶P∶Si∶Fe=5∶1∶1∶1(ppm),10天后,可以观察到整张薄膜上呈淡绿和金黄半透明色,其为附着一薄层藻,取少量在显微镜下镜检,所见藻类主要有大型舟形藻、小型舟形藻、菱形藻和卵形藻等,比例不一。 

在第二阶段育苗过程中,也需要合理调节光照,光照一般控制在200-2000lux之间,为藻提供比较适度的条件,以防止藻生长过快加速老化或生长速度过慢而被鲍苗消耗。 

太阳城集团在藻培起来后,把九孔鲍的受精卵泼洒到水池里。每池泼洒(也叫布卵)5万个。布卵水温控制在17-22℃左右,布卵3天内,可以观察到水体中浮游很多担轮幼虫,这一时期换水需要用200目滤网过滤,以防止幼虫流失。七天后,幼虫开始变态,在附着基上可以看到附着有微小的匍匐幼体,小心刮取显微镜下镜检,观察其活力。 

从培藻到收苗,太阳城集团为80天,稚鲍体长至3.4~6.4mm,附着基上的单细胞藻类部分老化,少数附着基上的藻已被吃光,所有水池没有发现白板或脱板现象,每张膜上的附苗量为500~800粒不等,最多的一张板上可以到达1300粒左右,具体育苗指标与测量方法如下: 

太阳城集团1)九孔鲍鲍苗生长及存活情况 

a鲍苗初始量,每池5万苗。 

太阳城集团b收苗平均壳长,随机抽取100粒鲍苗,测量壳长,取平均值。 

太阳城集团c壳长平均日增长量,收苗平均壳长,取40天的平均值。 

太阳城集团d鲍苗平均个体重量,随机取100粒鲍苗,称其总重后取平均值。 

e收苗量,称取10g鲍苗,计算其粒数,将收集的鲍苗称其总重后估算鲍苗的粒数。 

f成活率,某阶段结束时鲍苗量占该阶段投苗量的百分率。 

太阳城集团2)鲍苗免疫指标测定 

太阳城集团试验结束每组取样100个,20个/管放于5个分别盛有1mL Hank’s缓冲液(pH=7.8)的Eppendoff管中,贮于-80℃以备抗免疫指标的测定。测定时取出样品,使其在冰上融化。进行匀浆,然后6000r/min,4℃离心5min,取上清用于免疫指标的测定。 

太阳城集团参照Bradford方法(文献Bradford M.A rapid and sensitive method for thequantification of microgram quantities of protein[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248-254)测定样品蛋白含量,以小牛血清蛋白为标准蛋白,建立标准曲线,以考马斯亮蓝为显色剂,于96孔酶标板中反应10min,用酶标仪测量各反应体系中的OD595nm值。 

a、超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定 

连苯三酚自氧化速率的测定,在25℃下,于4.5mL 50mmol/L,Ph=8.30的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中加入10μL 50mmol/L连苯三酚,迅速摇匀,倒入光径1cm的比色杯内,在325nm波长下每隔30s测A值一次,要求自氧化速率在0.070OD/min左右。酶活性测定,在加入连苯三酚前,加入待测SOD样(上清),测得数据,按下式计算酶活性: 

太阳城集团酶活性=(0.070-A325nm)/min×100%×反应液总体积×样液稀释倍数/(0.070×50%×样液体积) 

太阳城集团酶活单位定义:每毫升反应液中,每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶活单位(U/mL)。 

b、溶菌酶活力测定 

以溶壁微球菌冻干粉为底物。用0.1mol/L,pH=6.4的磷酸盐缓冲液配成底物悬液(OD570nm≈0.3),取3.0mL该悬液于试管内置冰浴中,再加入50μL待测样,混合,测A0值。然后将试液移入37℃温浴中置30min,取出后再置于冰浴中10min,以终止反应,测其A值。溶菌活力UL按(A0-A)/A式计算。 

实验结果由表1和表2所示。表1指不同育苗方式对九孔鲍苗生长情况的影响。可见,比起对照组(A组),所有实验组更显著地提高鲍苗的存活率,并促进鲍苗的生长。在相同的换水周期下,随着添加的蛭弧菌游泳体菌液浓度的升高,鲍苗的成活率和壳长也逐渐呈上升趋势。 

太阳城集团表2指不同育苗方式对九孔鲍苗免疫力的影响。数据表明,比起对照组(A组),所有实验组的SOD活力和溶菌酶活力都有明显的提高;在相同的换水周期下,随着添加的蛭弧菌游泳体菌液浓度的升高,鲍苗免疫力也有一定的增强。 

水质方面,氨态氮用次溴酸纳氧化法测定(GB12763.4-91);亚硝酸盐氮用重氮-偶氮光度法测定(GB12763.4-91)。经过测定,A组水池中的各项水质测 定值均高于试验组(B-G组)。其中,A组氨态氮和亚硝酸盐氮的检测结果分别为0.083mg/L和0.011mg/L,而试验组(B-G组)中,氨态氮和亚硝酸盐氮的检测结果分别为0.077-0.081mg/L和0.007-0.009mg/L。另外,细菌总数和弧菌总数检测方面,分别采用涂布营养肉汤平板法和TCBS平板法检测。结果显示,A组水体中的细菌总数和弧菌总数分别达到105和103的数量级(cfu/mL),添加蛭弧菌游泳体菌液的实验组的细菌总数和弧菌总数分别为102~103和101~102的数量级(cfu/mL),比对照组低,说明蛭弧菌游泳体能有效控制水体的细菌数量,改善水质。 

综合各方面结果,添加蛭弧菌游泳体菌液,能明显的提高鲍鱼的生长速度,提高成活率,增强免疫力,而且能够改善水质,达到节水节能的良好效果。 

表1不同育苗方式对九孔鲍苗生长情况的影响 

表2不同育苗方式对九孔鲍苗免疫力的影响 

上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。 

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