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一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法.pdf

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一种 山羊 精液 玻璃化 冷冻 解冻 配方 方法
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201410399002.2

申请日:

20140813

公开号:

CN104161037B

公开日:

20160113

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A01N1/02 主分类号: A01N1/02
申请人: 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所
发明人: 花卫华,刘伟忠,孙伟,刘泉
地址: 212400 江苏省镇江市句容市宁杭路112号
优先权: CN201410399002A
专利代理机构: 北京众合诚成知识产权代理有限公司 代理人: 龚燮英
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法律状态
申请(专利)号:

CN201410399002.2

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法,其中山羊精液玻璃化冷冻配方包括:1)基础液:含20mg/ml牛血清白蛋白的MEM培养基;2)平衡液:基础液添加20%乙二醇;3)玻璃化冷冻液:于基础液中添加70%乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10%聚乙烯吡咯烷酮。解冻配方包括解冻液1(TS1):基础液添加0.4mol/L海藻糖解冻;解冻液2(TS2):基础液。本发明还选择了合适的冷冻及解冻方法,提高了解冻后精子活力,具有冷冻过程简单易于操作,冷冻效果好的特点。

权利要求书

1.一种山羊精液玻璃化冷冻液,其特征在于:包括:1)基础液:含20mg/ml牛血清白蛋白的MEM培养基;2)平衡液:基础液添加20%乙二醇;3)玻璃化冷冻液:于基础液中添加70%乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10%聚乙烯吡咯烷酮。2.一种山羊精液玻璃化解冻液,其特征在于,包括解冻液1(TS1):基础液添加0.4mol/L海藻糖解冻;解冻液2(TS2):基础液。3.一种山羊精液玻璃化解冻方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)将权利要求2中的解冻液1和解冻液2常温下平衡;(2)冷冻脉管从液氮中取出,于37度水浴60sec;(3)剪去脉管塞一端,从管中吹出冷冻精液到TS1中,300g混匀离心,去上清;(4)沉淀用TS2稀释到需要浓度,显微镜分析,备用。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明动物生殖生理与繁殖技术领域,具体涉及一种山羊精液玻璃化冷冻和解冻配方与方法。

背景技术

太阳城集团羊冷冻精液的研究国外起始于20世纪30年代,我国起始于1978年,但到目前为止仍未形成成熟稳定的程序化冷冻技术。羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱,在冷冻、解冻过程极易形成损伤,从而失去受精能力;虽然用于冷冻的精液要求冷冻前活率达到0.8以上,但因不同公羊个体差异所产生的精子活力不同,精子冷冻效果很不稳定。同时,现有羊冷冻精液解冻后活率低于0.35且存在很多“衰老”精子和弱死精子,有效精子少,活力低,质量差。羊冷冻精液在我国辽宁、贵州有少量生产,2008年山西省岢岚县引进部分羊冷冻精液,人工授精后妊娠率不足30%,无法进行批量生产。

太阳城集团授权太阳城集团号为CN102657149B,发明名称为“一种超高活力羊细管精液冷冻方法”的中国专利中公开了其制备方法:“吸取羊新鲜精液注入装有清洗液的第一离心管底部,在CO2培养箱中静置30-60min,高活力精子上游至上清液,吸取上清液,注入第二离心管中离心,离心管底部获得高浓度、高活力的精液;吸取该浓缩的高活力精液加入冷冻稀释液中,混合均匀后灌装细管,程序冷冻,液氮保存,输精前解冻”,羊细管冷冻精液冷冻前的活率为0.8以上,解冻后活率为0.45-0.60。但是这种方法冷冻过程繁琐,冷冻效率还有提升空间。

发明内容

太阳城集团针对这一问题,本发明提供一种山羊精液玻璃化冷冻方法,采用了玻璃化冷冻方法并优化了冷冻液的配方,通过于基础液中添加70%乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10%聚乙烯吡咯烷酮的玻璃化冷冻液进行保存,然后通过解冻液解冻,提高其解冻后的活率,具有冷冻过程简单易于操作,冷冻效果好的特点。

为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:

太阳城集团山羊精液的冷冻保存,包括冷冻配方的选择,选择合适的冷冻方法,选择合适的解冻配方及方法。具体如下:

山羊精液玻璃化冷冻配方,包括:1)基础液:含20mg/ml牛血清白蛋白的MEM培养基;2)平衡液:基础液添加20%乙二醇;3)玻璃化冷冻液:于基础液中添加70%乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10%聚乙烯吡咯烷酮。

太阳城集团山羊精液玻璃化冷冻的方法,包括如下步骤:

太阳城集团(1)用上述的山羊精液玻璃化冷冻配方——基础液、平衡液、玻璃化冷冻液在常温下平衡;

(2)按照常规方法获取羊精液,液化后进行CASA分析;

太阳城集团(3)将平衡液与等量的羊精液混合,平衡5~10分钟;

太阳城集团(4)将等量的玻璃化冷冻液加入到混合液中;

(5)立即将混入了玻璃化冷冻液的精液装入500μl冷冻脉管中;

(6)冷冻脉管投入液氮罐中保存;

太阳城集团(7)记录本次冷冻结果,保存位置等太阳城集团。

山羊精液玻璃化解冻配方,其特征在于,包括解冻液1(TS1):基础液添加0.4mol/L海藻糖解冻;解冻液2(TS2):基础液。

山羊精液玻璃化解冻方法,包括如下步骤:

太阳城集团(1)将权利要求3中的解冻液1和解冻液2常温下平衡;

太阳城集团(2)冷冻脉管从液氮中取出,于37度水浴60sec;

(3)剪去脉管塞一端,从管中吹出冷冻精液到TS1中,300g混匀离心,去上清;

太阳城集团(4)沉淀用TS2稀释到需要浓度,显微镜分析,备用。

具体步骤见图1。

有益效果:

太阳城集团减少程序冷冻太阳城集团,使冷冻过程简单化,便于在畜牧生产中过程中操作。

附图说明

太阳城集团本发明图1是山羊精液保存过程示意图。

具体实施方式

选择8月龄波杂山羊(公)作为试验对象,试验前对山羊精液进行常规分析,达到精液质量要求的进入实验,剔除精液质量较差的山羊。对其进行如下处理:

配备好山羊精液玻璃化冷冻配方,包括:1)基础液:含20mg/ml牛血清白蛋白的MEM培养基;2)平衡液:基础液添加20%乙二醇;3)玻璃化冷冻液:于基础液中添加70%乙二醇、0.8mol/ml海藻糖、10%聚乙烯吡咯烷酮。然后将上述的基础液、平衡液、玻璃化冷冻液在常温下平衡;按照常规方法获取羊精液,液化后进行CASA分析;将平衡液与等量的羊精液混合,平衡5分钟;将等量的玻璃化冷冻液加入到混合液中;立即将混入了玻璃化冷冻液的精液装入500μl冷冻脉管中;然后将冷冻脉管投入液氮罐中保存;记录本次冷冻结果,保存位置等太阳城集团。

在使用时对其进行解冻处理:

首先配制好山羊精液玻璃化解冻配方,包括解冻液1(TS1):基础液添加0.4mol/L海藻糖解冻;解冻液2(TS2):基础液,然后将解冻液1和解冻液2常温下平衡;再将冷冻脉管从液氮中取出,于37度水浴60sec;剪去脉管塞一端,从管中吹出冷冻精液到TS1中,300g混匀离心,去上清;沉淀用TS2稀释到需要浓度,冻后活力检查,精子图像计算机辅助分析仪进行活力的检查,重复检查两次结果取平均值。

本实验共采用10只山羊进行实验,玻璃化冷冻组(实验组)和常程序冷冻组(对照组)各5只,每只羊进行3次取精、冷冻,取平均值,其比较结果见表1。

表1玻璃化冷冻与程序冷冻对于山羊精液保存效果的影响

试验组与对照组在冷冻前精子活率差异不显著(p<0.5),解冻后在精子活率、顶体完整率、情期受胎率三个衡量指标上,试验组与对照组差异不显著(p<0.5)。但试验组花太阳城集团少,使用方便。

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