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利用IPS细胞和胚泡互补的器官再生法.pdf

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利用 IPS 细胞 互补 器官 再生
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摘要
申请专利号:

CN200980142469.6

申请日:

20090821

公开号:

CN102196722A

公开日:

20110921

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01K67/027,A61L27/00,C12N15/09,C12N5/10 主分类号: A01K67/027,A61L27/00,C12N15/09,C12N5/10
申请人: 国立大学法人东京大学
发明人: 中内启光,小林俊宽,山口智之,滨中早苗
地址: 日本东京都
优先权: 2008-214711,2009-040045
专利代理机构: 中国专利代理(香港)有限公司 代理人: 吴娟;郭文洁
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法律状态
申请(专利)号:

CN200980142469.6

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明明确了下述事实:在胚泡互补方法中,通过向发育的胚泡中注入诱导型多能干细胞(iPS细胞),可以补偿胰脏等器官的缺失,利用上述事实可以进行器官的再生,从而解决了上述课题。由此,本发明提供:在具有在发育期目标器官未发育的异常的非人哺乳动物的生物体内,使用iPS细胞制造来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的该目标器官的方法。

权利要求书

1.制造目标器官的方法,该方法是在具有在发育期目标器官未发育的异常的非人哺乳动物的生物体内,制造来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的该目标器官,该方法包括以下步骤:a)制备来自该异个体哺乳动物的诱导型多能干细胞即iPS细胞的步骤;b)将该细胞移植到该非人哺乳动物的胚泡期的受精卵中的步骤;c)使该受精卵在非人临时代理哺乳动物的母胎中发育以得到产仔的步骤;以及d)由该产仔个体获得该目标器官的步骤。2.权利要求1所述的方法,其中,上述iPS细胞来自人、大鼠或小鼠。3.权利要求1所述的方法,其中,上述iPS细胞来自大鼠或小鼠。4.权利要求1所述的方法,其中,上述要制造的器官选自胰脏、肾脏、胸腺和毛。5.权利要求1所述的方法,其中,上述非人哺乳动物为小鼠。6.权利要求5所述的方法,其中,上述小鼠为Sall1敲除小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠、Pdx-1敲除小鼠或裸鼠。7.权利要求1所述的方法,其中,上述目标器官是完全来自上述异个体哺乳动物的器官。8.权利要求1所述的方法,该方法进一步包括:使初期化因子与体细胞接触而得到上述iPS细胞的步骤。9.权利要求1所述的方法,其中,上述iPS细胞和上述非人哺乳动物是异种的关系。10.权利要求1所述的方法,其中,上述iPS细胞来自大鼠,上述非人哺乳动物为小鼠。11.非人哺乳动物,其具有在发育期目标器官未发育的异常,该非人哺乳动物是通过包括下述步骤的方法生产的:a)制备来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的iPS细胞的步骤;b)将该iPS细胞移植到该非人哺乳动物的胚泡期的受精卵中的步骤;以及c)使该受精卵在非人临时代理哺乳动物的母胎中发育以得到产仔的步骤。12.非人哺乳动物在使用iPS细胞的目标器官的制造中的应用,所述非人哺乳动物具有在发育期该目标器官未发育的异常。13.用于制造目标器官的组合,该组合具备:A)非人哺乳动物,其具有在发育期该目标器官未发育的异常;以及B)来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的iPS细胞或初期化因子以及所需的体细胞。14.生产目标器官或身体部分的方法,该方法包括以下步骤:A)提供动物的步骤,所述动物包含编码若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分的缺失原因的缺失原因基因、且该器官或身体部分通过胚泡互补而得到补偿,该步骤中上述缺失原因基因是编码该目标器官或身体部分的缺失原因的基因;B)由该动物获得卵子,并使之成长为胚泡的步骤;C)将具有所期望的基因组的目标iPS细胞导入该胚泡中,以生产嵌合胚泡的步骤,该所期望的基因组具有补偿由该缺失原因基因引起的缺失的能力;以及D)由该嵌合胚泡生产个体,再由该个体获得该目标器官或身体部分的步骤。15.权利要求14所述的方法,该方法进一步包括:通过使初期化因子与体细胞接触而得到上述iPS细胞的步骤。16.权利要求14所述的方法,其中,上述D)步骤包含:使上述嵌合胚泡在非人临时代理哺乳动物的母胎中发育以得到产仔,再由该产仔个体获得该目标器官。17.权利要求14所述的方法,其中,上述目标iPS细胞来自大鼠或小鼠。18.权利要求14所述的方法,其中,上述目标器官或身体部分选自胰脏、肾脏、胸腺和毛。19.权利要求14所述的方法,其中,上述动物为小鼠。20.权利要求19所述的方法,其中,上述小鼠为Sall1敲除小鼠、Pdx-1敲除小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠或裸鼠。21.权利要求14所述的方法,其中,上述目标器官或身体部分完全来自上述目标多能细胞。22.权利要求14所述的方法,其中,上述iPS细胞和上述非人哺乳动物是异种的关系。23.权利要求14所述的方法,其中,上述iPS细胞来自大鼠,上述非人哺乳动物为小鼠。24.用于制造目标器官或身体部分的组合,该组合具备:A)非人动物,该非人动物包含编码若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分的缺失原因的基因、且该器官或身体部分通过互补而得到补偿;以及B)来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的iPS细胞或初期化因子和所需的体细胞的组合。25.权利要求24所述的组合,其中,上述非人动物和上述iPS细胞是异种的关系。

说明书



技术领域

本发明涉及使用iPS细胞在生物体内制作来自所期望的细胞的器官的方法。

背景技术

在以细胞移植或器官移植的形式评论再生医疗时,对具有多分化能的干细胞的期待很大。由胚泡期受精卵的内部细胞团块建立的ES细胞具有多分化能,被用于各种细胞分化的研究,在体外将其分化诱导成特定的细胞系谱的分化控制方法的开发是再生医学研究的话题。

太阳城集团在使用ES细胞的体外分化研究中,在胚发育初期进行分化的血细胞、血管、心肌、神经系统等容易向中胚叶、外胚叶系分化。但是,已知一般的趋势是:在胚发育中期以后,通过细胞间相互作用难以向复杂的组织形成和目标器官的分化。

太阳城集团例如,作为哺乳类的成体肾脏的后肾在胚发育中期由中间部中胚叶发育。具体而言,利用后肾间叶细胞和输尿管芽上皮这两种组成部分的相互作用,肾脏开始发育,最终利用向在数十种其他器官中见不到的程度的多种功能细胞分化和由上述分化产生的以肾小球、肾小管为中心的复杂的肾单位结构的构成,成体肾脏完成。由于肾脏的发育时期和该过程的复杂性,可以容易地推察在体外由ES细胞诱导肾脏是非常费事的、困难的工作,认为事实上是不可能的。此外,在肾脏等器官中,体性干细胞的鉴定尚未确定,已经判明:一时盛行研究的骨髓细胞对障害肾脏修复过程的帮助也没有那么大。

将具有多分化能的ES细胞注入胚泡期受精卵的内腔时,产生个体形成嵌合小鼠。对于缺失T细胞、B细胞系谱的Rag-2敲除小鼠,过去有人报道了:利用应用了该技术的胚泡互补作用(blastocyst complementation)进行的T细胞、B细胞系谱的拯救实验(非专利文献1)。该嵌合小鼠·测定被用作确认不存在体外测定系统的T细胞系谱的分化的体内测定系统。

但是,即使一旦明确了在某器官中可以使用这样的技术,但由于器官在体内的作用、例如缺失器官时的致死性等不同,所以实际上难以预测在其他器官中是否成功,受各种要因的影响。而且,认为这次选择的器官缺失模型的缺失基因也是重要的要因,这是由于必需选择在缺失的基因的产生过程中的功能、特别是在器官形成过程中的各器官的干/前体细胞等的分化、维持所必需的转录因子的缘故。

预想若利用由于体液因子或分泌因子的缺失的原因而显示出器官缺失的模型,则只有其释放的因子通过从来自ES细胞的细胞中释放出来而得到补充,在器官水平形成嵌合状态。

太阳城集团由此认为:在本发明中,在器官方面选择适当的模型动物是解决问题的要因,考虑到在其他器官中的应用时,难以在其他器官中使用与本发明显示出同样的表型的模型。

太阳城集团作为器官再生方法,本发明人等申请了PCT/JP2008/51129。

太阳城集团此外,最近诱导型多能性干(iPS)细胞受到关注(例如非专利文献2)。认为iPS细胞与ES细胞具有同等的功能。

现有技术文献

非专利文献

太阳城集团非专利文献1:Chen J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第90卷,第4528-4532页,1993

非专利文献2:Okita K等人,Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.Nature 448(7151)313-7、2007

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的课题在于:使用可以简便制作的诱导型多能干细胞(iPS细胞),提供适合产业用的器官再生的技术。即,以提供根据个人的特性,由皮肤等体细胞再生“自己的器官”的技术为课题。此外,本发明的课题还在于:根据具有目标基因组的细胞,生产诱导型多能干细胞(iPS细胞)以实施本发明,从而进行使用来自各种基因组的器官的研究开发。并且,本发明还以回避在ES细胞方面成为问题的有关伦理的问题为课题。

解决课题的方法

本发明发现:在胚泡互补方法中,通过向发育的胚泡中注入诱导型多能干细胞(iPS细胞)来补偿胰脏等器官的缺失时,诞生下一代;本发明还发现:胰脏得到补偿的转基因动物可以作为建立者(founder)向下一代传递表型,由此明确了:可以使用这样的建立者进行器官再生,从而解决了上述课题。

太阳城集团本发明中发现:例如,向以胰脏等器官的缺失为特征的敲除小鼠和转基因动物(例如小鼠)中移植作为多能细胞的诱导型多能干细胞(iPS细胞)以补偿胰脏,可以高效率地得到作为建立者的产仔。

本发明中明确了:即使使用诱导型多能干细胞(iPS细胞),根据基因型分型的结果,胰脏得到补偿的敲除小鼠也正常地发育成成体。

太阳城集团得到补偿的敲除(本说明书以下还称作“KO”。)小鼠,由于作为建立者向下一代传递其表达型的KO与异型小鼠的交配,理论上按照孟德尔遗传定律,应该以1/2的概率形成KO或异型个体,发现实际上就是这样。认为当为补偿了胰脏的KO之间的交配时,100%可以在下一代中得到KO个体,使用了KO个体的分析明显变得容易进行。

太阳城集团另外,将诱发器官缺失的导入基因放入卵细胞中,之后进行移植,这即使在以往的转基因(Tg)动物制作方法中,通过向发育的胚泡中注入ES细胞来补偿胰脏的缺失时,以及即使在诞生下一代的较新的方法中,判明也能够使用诱导型多能干细胞(iPS细胞)。而且,即使是诱导型多能干细胞(iPS细胞),也确认到胰脏得到补偿的转基因动物可以作为建立者向下一代传递表型。因此明确了:使用这样的建立者,即使使用诱导型多能干细胞(iPS细胞),也可以进行器官再生。

太阳城集团一旦明确了可以对某器官应用本发明的方法,则理解为:对于该器官,可以根据成功的事例,加入适当的变更后应用。其理由如下。当存在适当的缺失动物时,如本说明书中所示,使用荧光标记的iPS细胞(例如来自从皮肤或尾端采集的成纤维细胞)等,利用同样的分析方法时,可以明确所构建的器官是来自宿主还是来自iPS细胞等,可以判定能否构建器官,根据同样的理论,理解为可以再生产下一代的动物。

因此,本发明提供以下内容。

太阳城集团在一种局面中,本发明提供制造目标器官的方法,该方法是在具有在发育期目标器官未发育的异常的非人哺乳动物的生物体内,制造来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的该目标器官,该方法包括以下步骤:

太阳城集团a)制备来自该异个体哺乳动物的诱导型多能干细胞(iPS细胞)的步骤;

太阳城集团b)将该细胞移植到该非人哺乳动物的胚泡期的受精卵中的步骤;

太阳城集团c)使该受精卵在非人临时代理(仮親)哺乳动物的母胎中发育以得到产仔的步骤;以及

太阳城集团d)由该产仔个体获得该目标器官的步骤。

太阳城集团在一实施方案中,上述iPS细胞来自人、大鼠或小鼠。

在一实施方案中,上述iPS细胞来自大鼠或小鼠。

在一实施方案中,上述要制造的器官选自胰脏、肾脏、胸腺和毛。

在一实施方案中,上述非人哺乳动物为小鼠。

在一实施方案中,上述小鼠为Sall1敲除小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠、Pdx-1敲除小鼠或裸鼠。

太阳城集团在一实施方案中,上述目标器官是完全来自上述异个体哺乳动物的器官。

太阳城集团在一实施方案中,本发明的方法进一步包括:使初期化因子与体细胞接触而得到上述iPS细胞的步骤。

太阳城集团在一实施方案中,在本发明的方法中,上述iPS细胞和上述非人哺乳动物是异种的关系。

太阳城集团在一实施方案中,在本发明的方法中,上述iPS细胞来自大鼠,上述非人哺乳动物为小鼠。

太阳城集团在另一局面中,本发明提供非人哺乳动物,其具有在发育期目标器官未发育的异常,该非人哺乳动物是通过包括下述步骤的方法生产的:

a)制备来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的iPS细胞的步骤;

b)将该iPS细胞移植到该非人哺乳动物的胚泡期的受精卵中的步骤;以及

太阳城集团c)使该受精卵在非人临时代理哺乳动物的母胎中发育以得到产仔的步骤。

在又一局面中,本发明涉及具有在发育期目标器官未发育的异常的非人哺乳动物在使用iPS细胞的该目标器官的制造中的应用。

在另一局面中,本发明提供用于制造目标器官的组合,该组合具备:

A)非人哺乳动物,其具有在发育期该目标器官未发育的异常;以及

B)来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的iPS细胞或初期化因子以及所需的体细胞。

在又一局面中,本发明提供生产目标器官或身体部分的方法,该方法包括以下步骤:

太阳城集团A)提供动物的步骤,所述动物包含编码若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分的缺失原因的缺失原因基因、且该器官或身体部分通过胚泡互补而得到补偿,该步骤中上述缺失原因基因是编码该目标器官或身体部分的缺失原因的基因;

太阳城集团B)由该动物获得卵子,并使之发育成胚泡的步骤;

C)将具有所期望的基因组的目标iPS细胞导入该胚泡中,以生产嵌合胚泡的步骤,该所期望的基因组具有补偿由该缺失原因基因引起的缺失的能力;以及

D)由该嵌合胚泡生产个体,再由该个体获得该目标器官或身体部分的步骤。

在一实施方案中,本发明的方法进一步包括:通过使初期化因子与体细胞接触而得到上述iPS细胞的步骤。

在一实施方案中,上述D)步骤包含:使上述嵌合胚泡在非人临时代理哺乳动物的母胎中发育以得到产仔,再由该产仔个体获得该目标器官。

在另一实施方案中,上述目标iPS细胞来自大鼠或小鼠。

在又一实施方案中,上述目标器官或身体部分选自胰脏、肾脏、胸腺和毛。

并且,在又一实施方案中,上述动物为小鼠。

在又一实施方案中,上述小鼠为Sall1敲除小鼠、Pdx-1敲除小鼠、Pdx1-Hes1转基因小鼠或裸鼠。

并且,在又一实施方案中,上述目标器官或身体部分完全来自上述目标多能细胞。

并且,在又一实施方案中,上述iPS细胞和上述非人哺乳动物是异种的关系。

并且,在又一实施方案中,上述iPS细胞来自大鼠,而上述非人哺乳动物为小鼠。

在另一局面中,本发明提供用于制造目标器官或身体部分的组合,该组合具备:

A)非人动物,该非人动物包含编码若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分的缺失原因的基因、且该器官或身体部分通过互补(complement)而得到补偿;以及

太阳城集团B)来自不同于该非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的iPS细胞或初期化因子和所需的体细胞的组合。

太阳城集团在一实施方案中,上述非人动物和上述iPS细胞是异种的关系。

在本发明中,根据要制造的器官的动物种制备移植的细胞。例如,想要制造人的器官时,制备来自人的细胞;想要制造人以外的哺乳动物的器官时,制备来自该哺乳动物的细胞。在本发明中,所移植的细胞可以使用诱导多能干细胞(iPS细胞)。

在本发明的方法中,作为要制造的器官,只要是肾脏、心脏、胰脏、小脑、肺脏、甲状腺、毛和胸腺等具有一定形状的固形器官,可以是任一种器官,但优选列举肾脏、胰脏、毛和胸腺。这样的固形器官,通过在作为接受者的胚中产生全能细胞或多能细胞,而在产仔的体内制造。通过在胚中产生全能细胞或多能细胞,可以形成所有的器官,所以可以依赖于使用的全能细胞或多能细胞的种类而制造的固形器官并不受限制。

另一方面,本发明的特征在于:在来自作为接受者的非人胚的产仔个体的体内形成只来自所移植的细胞的器官,并不希望具有来自作为接受者的非人胚的细胞与所移植的细胞的嵌合的细胞构成。因此,作为接受者的非人胚优选使用来自在发育期要制造的器官未发育、在出生儿中具有缺失该器官的异常的动物的胚。只要是发生这样的器官缺失的动物,可以是通过特定的基因缺失而缺失器官的敲除动物,或者可以是通过插入特定的基因而缺失器官的转基因动物。或者,可以是本说明书中所说明的“建立者”动物。

例如,当制造作为器官的肾脏时,作为接受者的非人胚可以使用:具有在发育期肾脏未发育的异常的Sall1敲除动物(Nishinakamura,R.等人,Development,第128卷,第3105-3115页,2001)的胚等。当制造作为器官的胰脏时,作为接受者的非人胚可以使用:具有在发育期胰脏未发育的异常的Pdx-1敲除动物(Offield,M.F.等人,Development,第122卷,第983-995页,1996)的胚;当制造作为器官的小脑时,作为接受者的非人胚可以使用:具有在发育期小脑未发育的异常的Wnt-1(int-1)敲除动物(McMahon,A.P.和Bradley,A.,Cell,第62卷,第1073-1085页,1990)的胚;当制造作为器官的肺脏、甲状腺时,作为接受者的非人胚可以使用:具有在发育期肺脏和甲状腺未发育的异常的T/ebp敲除动物(Kimura,S.等人,Genes and Development,第10卷,第60-69页,1996)的胚等。此外,还可以使用引起肾脏、肺等多个器官的缺失、且使成纤维细胞增殖因子(FGF)受体(FGFR)的胞内结构域的缺失型过度表达的显性负性型转基因突变体动物模型(Celli,G.,等人,EMBO J.,第17卷,第1642-655页,1998)的胚。或者,可以使用裸鼠,以用于生产毛或胸腺。

太阳城集团本发明中,当提及作为接受者的胚的来源的非人动物时,只要是猪、大鼠、小鼠、牛、绵羊、山羊、马、狗、黑猩猩、大猩猩、猩猩、猴、狨、倭黑猩猩等人以外的动物,可以是任何动物。优选从成体大小与要制造的器官的动物种相似的非人动物中采集胚。

太阳城集团另一方面,作为为了形成要制造的器官而被移植到作为接受者的胚泡期的受精卵中的细胞的来源的哺乳动物,可以是人或人以外的哺乳动物、例如猪、大鼠、小鼠、牛、绵羊、山羊、马、狗、黑猩猩、大猩猩、猩猩、猴、狨、倭黑猩猩等中的任一种。

作为接受者的胚与所要移植的细胞的关系可以是同种的关系,也可以是异种的关系。

将如上操作制备的所要移植的细胞移植到作为接受者的胚泡期的受精卵的腔内,在胚泡期受精卵的内腔中可以形成来自胚泡的内部细胞和所要移植的细胞的嵌合的细胞混合物。

将如此操作移植有细胞的胚泡期受精卵移植到来自作为临时代理的胚泡期受精卵的种的伪妊娠或妊娠雌性动物的子宫内。使该胚泡期受精卵在临时代理子宫内发育,得到产仔。然后,可以由该产仔获得目标器官,作为来自哺乳动物细胞的目标器官。

太阳城集团因此,太阳城集团本发明的上述及其他优点,阅读以下的详细说明即可明白。

发明效果

太阳城集团根据本发明,提供了适于产业用的器官再生技术。而且,还提供根据个人的特性,由皮肤等体细胞再生“自己的器官”的技术。

另外,通过根据具有目标基因组的细胞生产诱导型多能干细胞(iPS细胞)以实施本发明,还可以进行使用来自各种基因组的器官的研究开发。这在现有技术中是完全不可能的技术。

太阳城集团此外,本发明还具有以下优点:太阳城集团在ES细胞方面成为问题的有关伦理的问题,通过使用iPS细胞也可以部分回避,并且可以发挥同样的效果。

附图说明

太阳城集团图1显示使用了利用胚泡互补进行的来自iPS细胞的胰脏构建的治疗模型。

图2中,a.显示建立来自GFP小鼠的iPS细胞的策略。建立来自GFP小鼠尾端的成纤维细胞(Tail tip fibroblast:TTF)后,导入3因子(初期化因子),用ES细胞用培养基培养25~30天,挑选iPS集落和建立iPS细胞株。b.显示使用带有照相机的显微镜拍摄所建立的iPS细胞的形态的照片。左边显示GFP-iPS细胞#2的照片,右边显示#3的照片。c.显示碱性磷酸酶活性的测定。在荧光显微镜下拍摄iPS细胞,并用碱性磷酸酶染色试剂盒(Vector公司Cat.No.SK-5200)进行染色。左起显示亮视野像、GFP荧光像和碱性磷酸酶染色。d.显示通过使用了基因组DNA的PCR导入的3因子(初期化因子)的特定。从iPS细胞中提取基因组DNA并进行PCR的结果。上起显示Klf4、Sox2、Oct3/4、c-Myc和Myog的基因的表达。左起显示GFP-iPS细胞#2、#3、Nanog-iPS(4因子的图像)、作为对照的ES细胞(NC)的图像。最右边显示在蒸馏水中的结果。确认到本发明中使用的iPS细胞中的3因子的插入。e.显示通过RT-PCR进行的本发明中使用的细胞中的ES细胞的特征性基因表达图像的分析和导入基因的表达确认。上起为Klf4、Sox2、Oct3/4、c-Myc。显示Nanog、Rex1、Gapdh的基因的表达。最下方显示阴性对照(RT(-))。太阳城集团Klf4、Sox2、Oct3/4,分成总RNA和转基因(Tg)来确认表达。左起显示GFP-iPS细胞#2、#3、作为对照的ES细胞(NC)和作为另一对照的TTF(阴性对照)的表达的形态。最右边显示在蒸馏水中的结果。f.显示使用iPS细胞的嵌合小鼠的制作。显示将所建立的iPS细胞注入通过C57BL6与BDF1系统的小鼠的交配而得到的胚泡中,制作嵌合小鼠的结果。上方显示胎生第13.5天的亮视野像(左)、GFP荧光像(右)。下方显示新生儿期的图像。记作NC的是阴性对照。

太阳城集团图3显示通过胚泡互补构建的胰脏的形态(出生后第5天)。在同型小鼠中,胰脏的边缘清晰地由GFP阳性细胞构成,但在异型小鼠胰脏中,形成点状的嵌合。

图4显示来自iPS细胞的胰脏的组织学分析(出生后第5天)。这里,制作来自iPS细胞的胰脏的冷冻切片标本,利用DAPI和抗GFP抗体、抗胰岛素抗体进行染色作为核染色,利用正象荧光显微镜和共聚焦激光显微镜进行观察、拍摄。左起显示亮视野像、GFP+DAPI的图像,以及右侧显示利用抗胰岛素抗体进行的染色。上图示板(パネル)显示向本发明的Pdx1LacZ/LacZ中导入GFP-iPS细胞的图像,下图示板显示向作为对照的Pdx1wt/LacZ中导入GFP-iPS细胞的图像。

图5显示通过沉默而成为GFP阴性的细胞存在的确认实验。从图3所示的同一小鼠中采集骨髓细胞,利用流式细胞仪分选GFP-的造血干/前体细胞(c-Kit+、Sca-1+、Linage标记-:KSL细胞),在96孔板的每孔中加入1个细胞。在添加细胞因子的条件下培养该细胞12天,形成集落,从这些集落中提取基因组DNA,用于基因型判定。由此,即使在GFP-侧含有通过基因沉默使GFP的表达消失的细胞,也可以进行来自1个细胞的克隆的基因判定,可以简便地区别宿主的细胞、发生了基因沉默的细胞。a.显示使用由骨髓细胞纯化的KSL细胞的集落形成法的策略;b.显示培养第12天时血细胞集落的形态;c.显示使用由各集落提取的DNA的嵌合个体的基因型判定。a中的图示板自左起显示骨髓中的造血干/前体细胞的c-Kit+、Sca-1+、Linage-(KSL)的FACS图像。b中的照片自左起分别显示培养第12天的集落、中央显示亮视野像、左边显示GFP荧光像。c中显示按照使用上述Qiagen公司的试剂盒的方法,从来自单细胞的集落中提取DNA,利用PCR法进行其基因型判定的结果。PCR法在与Pdx1产仔判定时相同的引物和条件下进行。

图5A显示向STZ诱发糖尿病小鼠中移植来自iPS的胰岛。a和b显示胰岛的分离。来自iPS的胰脏从总胆管(a.箭头)起进行胶原酶灌流,密度梯度沉淀后,浓缩来自表达EGFP的iPS的胰岛(b)。c显示自胰岛移植起2个月后的肾脏被膜。表达EGFP的位置(スポツト)(箭头)是所移植的胰岛。d显示肾脏切片的HE染色(左图示板)和利用DAPI进行的GFP染色(右图示板)。e显示向STZ诱发糖尿病小鼠中移植来自iPS的150的胰岛。箭头显示给予抗体混合物(カクテル,cocktail)(抗INF-γ、抗TNF-α、抗IL-1β)的时刻。自移植起到2个月后,每隔1周测定腹腔内的血糖值。移植了iPS胰岛的STZ诱发糖尿病小鼠以▲(黑三角)(n=6)表示,未移植iPS胰岛的STZ诱发糖尿病小鼠以■(黑四角)表示。f显示自胰岛移植起2个月后的葡萄糖耐性试验(GTT)。

图6显示Sall1敲除小鼠的利用胚泡互补进行的肾脏再生。上方显示Sall1等位基因的基因型判定结果。可知#3的小鼠是Sall1同型KO小鼠。下方显示以#3小鼠为宿主,利用iPS细胞进行胚泡互补,再生的肾脏的形态(生后第1天)。可知在同型KO小鼠中,整个肾脏清晰地由GFP阳性细胞构成。明确了:使用Sall1敲除小鼠,可以制作来自iPS细胞的肾脏。

图7显示使用来自B6的iPS细胞进行胚泡互补,确认生出的嵌合小鼠长有毛的照片。#1是C57BL/6(B6)野生型(对照)小鼠,可见黑色的毛。#3是KSN裸鼠(对照),没有毛。#2、#4和#5显示得到的3只嵌合小鼠,这些个体长有毛。

太阳城集团图8是确认嵌合小鼠和对照小鼠的胸腺的发育的图。在C57BL/6(B6)野生型小鼠(对照)中确认到胸腺。裸鼠中不存在胸腺。另一方面,在嵌合小鼠中确认到胸腺。

图9显示分别将来自C57BL/6(B6)野生型(对照)小鼠和图7的嵌合小鼠(#2、#4和#5)的末梢血分离成CD4、CD8阳性细胞(T细胞),分析GFP阳性细胞的结果。由GFP阴性细胞和GFP阳性细胞的分布显示出嵌合度。

图10显示:使雄性Pdx1(-/-)小鼠(建立者:利用小鼠iPS细胞来补偿胰脏的Pdx1(-/-)小鼠)与雌性Pdx1(+/-)小鼠交配,采集受精卵,使其在体外发育直至胚泡期,在显微镜下向得到的胚泡中微量注射10个用EGFP标记的大鼠iPS细胞。将其移植到疑似妊娠临时代理中,妊娠期满开腹,分析所得的新生儿的结果。在荧光实体显微镜下观察EGFP荧光时,由体表的EGFP表达可知:个体编号#1、#2、#3为嵌合小鼠。开腹时在#1、#2中可见一样表达EGFP的胰脏。另一方面,#3的胰脏虽然部分性地呈现EGFP的表达,但为马赛克状。#4和#1~3是同腹仔,但在体表没有见到EGFP荧光,由于开腹时缺失胰脏,所以是非嵌合的Pdx1(-/-)小鼠。此外,从这些新生儿中摘出脾脏,将从中制备的血细胞用抗小鼠或大鼠的CD45的单克隆抗体进行染色,利用流式细胞仪进行分析。其结果,在个体编号#1~#3中同时确认到小鼠CD45阳性细胞和大鼠CD45阳性细胞,由此确认:它们是夹杂有来自宿主小鼠和大鼠的iPS细胞的细胞的小鼠-大鼠异种间嵌合个体。并且,大鼠CD45阳性细胞分离中的细胞几乎全部呈现EGFP荧光,所以大鼠CD45阳性细胞是来自用EGFP标记的大鼠iPS细胞的细胞。

太阳城集团图10A显示利用PCR进行的个体编号#1~#3的宿主小鼠的Pdx1基因型的确认。为了确认宿主小鼠的基因型,从与图10相同的脾脏样品中回收图10的用点线方框围起来的小鼠CD45阳性细胞,提取基因组DNA,使用可以识别Pdx1的突变型等位基因或野生型等位基因的引物进行PCR。其结果,在#1和#2中只确认到突变型的谱带,在个体编号#3中检测到突变型和野生型两者的谱带。由此可知:在#1和#2中,宿主的基因型为Pdx1(-/-);在个体编号#3中,宿主的基因型为Pdx1(+/-)。由该结果可知:在本来不应该形成胰脏的Pdx1(-/-)小鼠即#1、#2中,通过应用以大鼠iPS细胞为供体的异种间胚泡互补技术,成功地在小鼠个体内构建了大鼠的胰脏。

具体实施方式

太阳城集团以下,说明本发明。在整篇本说明书中,只要没有特别言及,则单数形式的表达应理解为还包含其复数形式的概念。因此,只要没有特别言及,则单数形式的冠词(例如英语的“a”、“an”、“the”等)应理解为还包含其复数形式的概念。此外,本说明书中使用的用语,只要没有特别言及,则应理解为以该领域中通常使用的意义使用。因此,只要没有另外定义,则本说明书中使用的所有专业用语和科学技术用语均具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的意义相同的意义。发生矛盾时,本说明书(包含定义)优先。

为了具体说明本发明的实施方案,以下记载例示的实施方案。以下,作为例示,说明在小鼠的生物体内制造来自哺乳动物细胞的肾脏的方法。可理解为:胰脏、毛、胸腺也可以通过这样的方法来制作。(非人动物)

为了在小鼠等动物的生物体内制造来自人以外的哺乳动物细胞的肾脏,准备具有在发育期肾脏未发育的异常的小鼠等动物。在本发明的一个实施方案中,作为具有在发育期肾脏未发育的异常的小鼠,可以使用Sall1敲除小鼠(Nishinakamura,R.等人,Development,第128卷,第3105-3115页,2001)。该动物具有以下特征:当为Sall1(-/-)的同型接合体敲除基因型时,只有肾脏没有发育,在产仔个体中不存在肾脏。或者,还可以使用本说明书中说明的建立者动物。

该小鼠在Sall1基因的缺失为同型的状态(Sall1(-/-))下,肾脏没有形成,无法存活,所以以Sall1基因的缺失为异型的状态(Sall1(+/-))维持。使这样的异型状态的小鼠之间交配(Sall1(+/-)×Sall1(+/-)),从子宫内采集受精卵。受精卵在概率上以Sall1(+/+)∶Sall1(+/-)∶Sall1(-/-)=1∶2∶1的概率产生。本发明中使用以25%的概率产生的Sall1(-/-)的胚。但是,在初期胚的阶段难以确定基因型,现实中是在出生后确定产仔的基因型,在之后的步骤中只使用具有目标Sall1(-/-)的基因型的个体。

太阳城集团对于该敲除小鼠,可以在制作阶段敲除Sall1基因,同时在可表达的状态下向Sall1基因区敲入检测用的荧光蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)的基因(Takasato,M.等,Mechanisms of Development(发育机理),第121卷,第547-557页,2004)。若通过敲入这样的荧光蛋白,该基因的调节区被激活,则GFP代替Sall1产生表达,可以通过荧光检测确定Sall1基因的缺失状态。

太阳城集团本发明中,作为接受者的胚与所移植的细胞的关系可以是同种的关系,也可以是异种的关系。太阳城集团这样的异种间的嵌合动物的制作,一直以来在该技术领域有许多报道,例如,实际中有人报道了大鼠-小鼠间的嵌合制作(Mulnard,J.G.,C.R.Acad.Sci.Paris.276,379-381(1973);Stern,M.S.,Nature.243,472-473(1973);Tachi,S.& Tachi,C.Dev.Biol.80,18-27(1980);Zeilmarker,G.,Nature,242,115-116(1973))、绵羊-山羊间的嵌合制作(Fehilly,C.B.,等人,Nature,307,634-636(1984))等近缘动物种间的胚泡嵌合动物。因此,本发明中,例如在小鼠的生物体内制作来自人以外的哺乳动物细胞的肾脏时,根据这些一直以来已知的嵌合制作方法(例如将移植的细胞插入作为接受者的胚泡中的方法(Fehilly,C.B.,等人,Nature,307,634-636(1984))),可以在作为接受者的胚中制作异种的某器官。

太阳城集团本说明书中,“非人哺乳动物”是指使用所移植的细胞制作嵌合动物或嵌合胚等的对方的哺乳动物。

太阳城集团本说明书中,“异个体哺乳动物”是指不同于上述非人哺乳动物的个体的任意的哺乳动物,可以是同种异个体,也可以是异种的。

本说明书中,“非人临时代理哺乳动物”是指,通过移植来自不同于非人哺乳动物的个体的异个体哺乳动物的细胞而生成的受精卵在其母胎中发育(作为临时代理)的哺乳动物。

太阳城集团需要说明的是,“非人哺乳动物”和“非人临时代理哺乳动物”有时称作“非人宿主哺乳动物”或“宿主”,应该理解为:“非人哺乳动物”和“非人临时代理哺乳动物”是互不相同的动物,在本发明的上下文中是指哪一个,本领域技术人员是清楚的。

制造作为器官的胰脏时,作为接受者的非人胚可以使用:具有在发育期胰脏未发育的异常的Pdx-1敲除动物(Offield,M.F.,等人,Development,第122卷,第983-995页,1996)、或本说明书中说明的建立者动物的胚。

制造作为器官的毛时,作为接受者的非人胚可以使用没有长毛的裸鼠的胚。

太阳城集团制造作为器官的胸腺时,作为接受者的非人胚可以使用裸鼠的胚。

(所要移植的细胞)

太阳城集团接下来,以肾脏为例,说明所要移植的细胞时,作为用于制造来自哺乳动物细胞的肾脏的所要移植的细胞,准备iPS细胞(参照非专利文献2等)等。该细胞具有Sall1基因的野生型的基因型(Sall1(+/+)),并具有在肾脏的所有细胞中发育的能力。

太阳城集团该细胞在移植前可以以可表达的状态插入用于特异性检测的荧光蛋白。例如,作为这样的检测用荧光蛋白,可以对DsRed的基因突变体、DsRed.T4(Bevis B.J.和Glick B.S.,Nature Biotechnology第20卷,第83-87页,2002)进行序列设计,使之通过CAG启动子(巨细胞病毒增强子和鸡肌动蛋白基因启动子)的调节几乎在全身器官中表达,之后利用电穿孔法插入iPS细胞中。作为这样的荧光蛋白,可以使用绿色荧光蛋白(GFP)等该领域中公知的荧光蛋白。通过对这样的移植用细胞进行荧光标记,可以容易地检测所制造的器官是否只由所移植的细胞构成。

将该小鼠iPS细胞等移植到具有上述的Sall1(-/-)的基因型的胚泡期受精卵的内腔中,制作具有嵌合的内部细胞团块的胚泡期受精卵,使具有嵌合的内部细胞团块的该胚泡期受精卵在临时代理的子宫内发育,得到产仔。使用未标记的iPS细胞时,在用于嵌合制作时无法与宿主的胚侧进行区别,无法识别器官是否得到补偿。因此,为了解决这个问题,通过向iPS细胞株中导入荧光色素,可以利用实施例等中记载的常规方法进行实验。

(繁殖用的建立者动物的生产方法)

太阳城集团本发明中使用的繁殖用的建立者动物具有以下特征:包含编码若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分的缺失原因的基因、且该器官或身体部分通过胚泡互补而得到补偿。通过使用该动物(在本说明书中还称作“建立者动物”。)生产下一代动物,可以使目标器官缺失,对于该器官,生产具有所期望的基因组型的器官。而且判明:利用该方法进行生产时,在下一代中也可以生产器官,可知就连iPS细胞也可以使用,所以为本发明在产业中的应用打开了道路。

本说明书中,“若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分”是指,当言及某因子时,若通过该因子使器官或身体部分缺失或功能不全(例如不正常),则无法存活或难以存活。例如,当为外来基因时,将该基因导入生物中,若该基因正常表达,则某器官或身体部分中发生缺损,其结果,无法存活或难以存活。难以存活包括:下一代没有留下子孙、以及当为人时在社会生活中伴有障碍。作为器官或身体部分,例如有胰脏、肝脏、毛、胸腺等,但并不限于这些。

作为与这样的现象有关的基因,例如可以列举Pdx-1(其所对应的胰脏)等。

需要说明的是,用于器官生产时,应该选择补偿器官、且不会因为除此以外的要因(无法从母亲小鼠摄取乳汁等)而在出生后死亡的基因。作为这样的基因,可以列举Pdx-1。可以使用具有这种性质的基因来实施本发明。而且,例如,即使表型与胰脏的缺失相同,但含义也大不相同,具体而言,具有以下特征:通过敲除,生产效率提高;通过转基因,除生产效率提高以外,还可以进行致死表型的克隆分析。

本说明书中,“若发挥功能则无法存活或难以存活”是指,太阳城集团某要因,若该要因发挥功能,则作为宿主的动物完全无法存活而死亡,或者,虽然能够存活,但由于难以成长或难以生殖等原因,之后的存活实质上是不可能的,在该领域可以使用通常的知识来理解。

太阳城集团本说明书中,“器官”在该领域以通常的意义使用,是指构成动物身体的一般器官。

本说明书中,“身体部分”是指身体的任一部分,通常还包括不被称作器官的部分。例如,以肾脏为例,当具有正常基因时,虽然生成完全的肾脏,但若某基因缺失或存在异常,则虽然形成肾脏这样的器官,但其中一部分出现异常或缺失,出现这样的异常或缺失的部分可以作为该“身体部分”的例子。基因的缺失或异常未必对应于每一个器官,但往往会对其一部分产生影响,所以考虑到与基因的对应关系时,最好还要考虑到在身体部分的对应,在本说明书中,也会考虑这种对应关系。

太阳城集团本说明书中,“胚泡互补(作用)”(英文中称作blastocyst complementation)是指,若将具有多分化能的ES细胞、iPS细胞等多能细胞注入胚泡期受精卵的内腔,则产生个体形成嵌合小鼠,利用这种现象,补偿缺失的器官或身体部分的技术。本发明人等发现:太阳城集团被认为是困难的胚泡互补,可以在动物、特别是非人动物的生物体内制作肾脏、胰脏、毛和胸腺等具有包含多种细胞的复杂的细胞构成的哺乳动物的器官,并确认这即使使用iPS细胞也可以实施。因此,该技术在本发明中可以使用iPS细胞进行全面利用。

太阳城集团本说明书中,“标记”只要是用于识别所补偿的器官,可以是任何因子。例如,通过使特定的基因(例如表达荧光蛋白的基因等)只在所补偿的器官中表达,可以根据该特定基因产生的性质(例如荧光),从补偿的宿主中识别要补偿的器官。如此操作,可以区别是来自外部细胞的细胞通过补偿而成为完全的动物、还是来自内部细胞的细胞得到补偿而成为完全的动物,由此可以更简单地选择本发明中使用的建立者动物。该细胞在移植前可以以可表达的状态插入用于特异性检测的荧光蛋白。例如,作为这样的检测用荧光蛋白,可以对DsRed的基因突变体、DsRed.T4(Bevis B.J.和Glick B.S.,Nature Biotechnology第20卷,第83-87页,2002)进行序列设计,使之通过CAG启动子(巨细胞病毒增强子和鸡肌动蛋白基因启动子)的调节几乎在全身器官中表达,之后利用电穿孔法插入ES细胞中。通过对这样的移植用细胞进行荧光标记,可以容易地检测所制造的器官是否只由所移植的细胞构成。

这样的标记的例子有:例如绿色荧光蛋白(GFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(CFP)、其他荧光蛋白和LacZ等。

生产本发明中使用的建立者动物的方法包括以下步骤:A)提供具有上述基因的第一多能细胞的步骤;B)使该第一多能细胞发育成胚泡的步骤;C)向该胚泡中导入具有补偿该基因所引起的缺失的能力的第二多能细胞,以生产嵌合胚泡的步骤;D)由该嵌合胚泡生产个体,选择通过该第二多能细胞使上述器官或其一部分得到补偿的个体的步骤。

太阳城集团本说明书中,“编码若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分的缺失原因的(缺失原因)基因”或“缺失原因基因”可以交换使用,当言及某基因时,是指若通过该因子发挥功能(例如,当为外来基因时,将其导入并表达;或者,当为内源性基因时,这样的基因在发挥功能的条件下等),器官或身体部分缺失或功能不全(例如不正常),则无法存活或难以存活的基因。

太阳城集团本说明书中,“多能细胞”可以列举:卵细胞、胚性干细胞(ES细胞)或诱导型多能干细胞(iPS细胞)、多能生殖干细胞(mGS细胞)等。

本说明书中,“第一多能细胞”是指,被用作适合作为建立者动物等的宿主(本说明书中也称作宿主。)的起源的多能细胞或来自该多能细胞的细胞团块,优选使用受精卵、胚。

本说明书中,言及“第二多能细胞”时,是指以要生产的器官为目的而使用的多能细胞,使用iPS细胞。

太阳城集团本说明书中,太阳城集团“具有补偿缺失的能力”,当言及因子或基因等时,是指可以补偿器官或身体部分的能力。

太阳城集团本说明书中,“嵌合胚泡”是指,来自第一多能细胞的细胞与来自第二多能细胞的细胞形成嵌合状态而形成的胚泡。这样的嵌合胚泡,除了利用注入法来生产以外,还可以通过利用称作“凝集法”的使“胚+胚”或“胚+细胞”在培养皿内密着来制作嵌合胚泡的方法等来生产。此外,本发明中,作为接受者的胚与所移植的细胞的关系可以是同种的关系,也可以是异种的关系。太阳城集团这样的异种间的嵌合动物的制作,一直以来在该技术领域有许多报道,例如,实际上有人报道了大鼠-小鼠间的嵌合制作(Mulnard,J.G.,C.R.Acad.Sci.Paris.276,379-381(1973);Stern,M.S.,Nature.243,472-473(1973);Tachi,S.& Tachi,C.Dev.Biol.80,18-27(1980);Zeilmarker,G.,Nature,242,115-116(1973))、绵羊-山羊间的嵌合制作(Fehilly,C.B.,等人,Nature,307,634-636(1984))等近缘动物种间的胚泡嵌合动物。因此,本发明中,例如在小鼠的生物体内制作来自人以外的哺乳动物细胞的肾脏时,根据上述一直以来已知的嵌合制作方法(例如将移植的细胞插入作为接受者的胚泡中的方法(Fehilly,C.B.,等人,Nature,307,634-636(1984))),可以在作为接受者的胚中制作异种的某器官。

太阳城集团在本发明中使用的建立者动物的生产方法中,提供具有编码若发挥功能则无法存活或难以存活的器官或身体部分的缺失原因的基因(在本说明书中,还称作“缺失原因基因”。)的第一多能细胞的步骤,例如,可以通过供给携带该基因的多能细胞、或向多能细胞中导入该基因以生产携带该基因的多能细胞来实施。这样的基因导入方法在该领域众所周知,本领域技术人员可以适当选择以实施这样的基因导入。优选使用电穿孔。其理由在于:通过对细胞悬浮液施加电脉冲,在细胞膜上产生微小的孔,之后使DNA送达细胞内部,从而发生转化即目标基因的导入,所以之后的损伤少等,但并不限于此。

在本发明中使用的建立者动物的生产方法中,使第一多能细胞(例如受精卵、胚等)发育成胚泡的步骤,可以利用用于使多能细胞成为胚泡的任意的公知的成长方法来实施。这样的条件在该领域众所周知,记载在Manipulating the Mouse Embryo A LABORATORY MANUAL(小鼠胚胎操作实验指南)第3版2002(Cold Spring Harbar Labolatory Press,Cold Spring Harbor,New York)(在本说明书中作为参考而引用。)。

在本发明中使用的建立者动物的生产方法中,向胚泡中导入作为具有补偿由该基因引起的缺失的能力的第二多能细胞的诱导型多能干细胞(iPS细胞)以生产嵌合胚泡的步骤,只要能够将作为第二多能细胞的诱导型多能干细胞(iPS细胞)导入胚泡中,可以使用该领域中公知的任何方法。作为这样的方法,例如有注入法或凝集,但并不限于这些方法。

本发明中使用的建立者动物的生产方法中,由嵌合胚泡生产个体的方法可以使用该领域中公知的方法。通常是将上述嵌合胚泡放回临时代理的胎中,使其临时妊娠,并在临时代理的胎内成长,但并不限于这种方法。

太阳城集团在本发明中使用的建立者动物的生产方法中,选择器官或其身体部分得到补偿的器官或其身体部分,这可以采用能够确认该器官或身体部分的补偿的任意的方法来实施。

作为这样的例子,可以列举:识别来自作为第二多能细胞的诱导型多能干细胞(iPS细胞)的识别子。本说明书中,“识别子”是指,可以特定某个体或种等、且特定其来源的任意的因子,还简称为“ID”。这样的识别子例如可以是作为第二多能细胞的诱导型多能干细胞(iPS细胞)所特有的基因组的序列、表达型等。或者,这样的选择可以通过使用标记的细胞或可被标记的细胞(还包括通过基因表达形成标记的细胞)作为第二多能细胞,鉴定该标记,来实施本发明的建立者小鼠的生产方法中的选择。此外,可以理解为:本领域技术人员可以适当地改善该方法后实施。

太阳城集团(使用建立者动物的器官再生方法)

在另一局面中,本发明提供:使用建立者动物,利用诱导型多能干细胞(iPS细胞)来生产目标器官或身体部分的方法。该方法包括以下步骤:提供建立者动物的步骤,该步骤中建立者动物中的缺失原因基因是编码该目标器官或身体部分的缺失原因的基因;B)由该动物得到卵子,使其发育成胚泡的步骤;C)向该胚泡中导入具有所期望的基因组的目标多能细胞的诱导型多能干细胞(iPS细胞),以生产嵌合胚泡的步骤,该所期望的基因组具有补偿由该基因引起的缺失的能力;以及D)由该嵌合胚泡生产个体,再由该个体获得该目标器官或身体部分的步骤。

这里,该D)步骤可以如下实施:使上述嵌合胚泡在非人临时代理哺乳动物的母胎中发育,得到产仔,再由该产仔个体得到该目标器官,由此即可实施。

(胰脏的形成)

太阳城集团胰脏的形成,可以采用肉眼之所见、染色后的显微镜观察、或利用荧光的观察等方法,进行宏观或微观的形态学分析、基因表达分析等,从而可以研究胰脏的形成。

太阳城集团例如,通过进行肉眼观察,可以研究器官是否实际存在、或器官的外观等特征。还可以与这样的宏观形态学分析相结合,利用显微镜在微观上观察苏木素-伊红染色等一般的组织染色后的组织。通过这样的微观观察,就连具体的胰脏内部的各种细胞的构成也可以一并研究。

并且,根据条件,还可以以发荧光的方式,进行使用荧光的基因表达分析。例如,当为通过上述的Pdx1-Lac-Z敲入而产生的敲除小鼠时,在野生型(+/+)或异型(+/-)个体中,使用荧光标记的ES细胞时,即使可见其有用之处,但显示出斑杂的嵌合状态的荧光,而在同型(-/-)个体中,由于胰脏完全由来自ES细胞的细胞构建,所以具有均匀地呈现出一样的荧光的特征。利用这样的特质,可以简便地研究目标器官或构成器官的细胞的Pd×1基因是哪一种基因型。使用未标记的iPS细胞时,在用于制作嵌合的情况下,无法与宿主的胚侧进行区别,无法确认器官是否得到补充。因此,为了解决这个问题,通过向iPS细胞株中导入荧光色素,可以按照上述同样的操作规程进行实验。而且,当使用以上那样的细胞时,可以按照与使用iPS细胞的情形相同的操作规程制作器官,并明确其来源。

(肾脏的形成)

太阳城集团肾脏的形成,可以采用肉眼之所见、染色后的显微镜观察、或利用荧光的观察等方法,进行宏观或微观的形态学分析、基因表达分析等,从而可以研究肾脏的形成。

例如,通过进行肉眼观察,可以研究器官是否实际存在、器官的外观等特征。还可以与这样的宏观形态学分析相结合,利用显微镜在微观上观察苏木素-伊红染色等一般的组织染色后的组织。通过这样的微观观察,就连具体的肾脏内部的各种细胞的构成也可以一并研究。

并且,根据条件,还可以以发荧光的方式,进行使用荧光的基因表达分析。例如,当为上述的Sall1基因敲除小鼠时,在Sall1基因的缺失为同型状态(Sall1(-/-))的情况下,由于GFP的荧光由两个烯丙基产生,所以具有下述特征:与只从一方的烯丙基产生荧光的Sall1基因的缺失为异型状态(Sall1(+/-))的荧光相比,荧光量变少。利用这样的特质,可以简便地研究目标器官或构成器官的细胞的Sall1基因是哪一种基因型。使用未标记的iPS细胞时,在用于嵌合制作时,无法与宿主的胚侧进行区别,无法识别器官是否得到补充。因此,为了解决这个问题,通过向iPS细胞株中导入荧光色素,可以明确其来源。

(毛的形成)

太阳城集团毛的形成,可以采用肉眼之所见、或利用荧光的观察等方法,进行宏观或微观的形态学分析、基因表达分析等,从而可以研究毛的形成。

太阳城集团例如,通过进行肉眼观察,可以研究毛是否实际存在、毛的外观等特征。还可以与这样的宏观形态学分析相结合,利用显微镜在微观上观察苏木素-伊红染色等一般的组织染色后的组织。通过这样的微观观察,就连具体的毛内部的各种细胞的构成也可以一并研究。

并且,根据条件,还可以以发荧光的方式,进行使用荧光的基因表达分析。例如,当为上述的裸鼠时,由于毛本身的荧光强,所以在荧光显微镜下用肉眼判断产生的毛是来自裸鼠还是来自iPS细胞非常困难,但也可以通过适当观察荧光的方法来观察。利用这样的特质,可以简便地研究目标器官或构成器官的细胞是哪一种基因型。使用未标记的iPS细胞时,在用于嵌合制作时,无法与宿主的胚侧进行区别,无法识别器官是否得到补充。因此,为了解决这个问题,通过向iPS细胞株中导入荧光色素,可以按照与上述相同的操作规程进行实验。而且,使用以上那样的细胞时,可以按照与使用iPS细胞时相同的操作规程制作器官,并明确其来源。

(胸腺的形成)

太阳城集团太阳城集团胸腺的形成,可以利用肉眼之所见、显微镜照片、利用FACS或荧光的观察等方法,进行宏观或微观的形态学分析、基因表达分析等,从而可以研究胸腺的形成。

太阳城集团例如,通过进行肉眼观察,可以研究器官是否实际存在、器官的外观等特征。还可以与这样的宏观形态学分析相结合,利用显微镜在微观上观察苏木素-伊红染色等一般的组织染色后的组织。通过这样的微观观察,就连具体的胸腺内部的各种细胞的构成也可以一并研究。

并且,根据条件,还可以以发荧光的方式,进行使用荧光的基因表达分析。例如,当为上述的裸鼠时,以往虽然不具有胸腺,但不影响存活,所以以缺失的状态自然出生、存活。通过胚泡互补向其中注入荧光标记的iPS细胞时,确认到iPS细胞的有用之处的个体中多数具有持有呈现荧光的胸腺的特征。利于这样的特质,可以简便地研究目标器官或构成器官的细胞是哪一种基因型。

(iPS细胞)

iPS细胞还可以通过其他方法来制作。即,通过使初期化因子(可以是单个或多个因子的组合)与体细胞接触,诱导初期化,可以生产iPS细胞。作为这样的初期化和初期化因子的例子,可以列举如下。例如,在本发明的实施例中,利用3个因子(Klf4、Sox2、Oct3/4;它们是本发明中使用的代表性的“初期化因子”。),使用从GFP转基因小鼠的尾端采集的成纤维细胞,本发明人等独自制作iPS细胞,但也可以使用除此以外的组合、例如被称作Yamanaka因子的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4个因子,还可以利用其改良法。即使用n-Myc代替c-Myc,并使用逆转录病毒载体中的一种即慢病毒载体,也可以建立iPS细胞(Blelloch R等人,(2007).Cell Stem Cell 1:245-247)。此外,通过向来自胎儿肺的成纤维细胞或来自新生儿包皮的成纤维细胞中导入Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28这4种基因,成功地建立了人iPS细胞(Yu J,等人,(2007).Science 318:1917-1920)。

太阳城集团还可以使用在小鼠iPS细胞的建立中使用的、作为小鼠基因的人同源基因的Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc,由成纤维样滑膜细胞和来自新生儿包皮的成纤维细胞生产人iPS细胞(Takahashi K,等人,(2007).Cell 131:861-872.)。使用在Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc这4种基因中加入了hTERT·SV40 large T的6种基因,也可以建立人iPS细胞(Park IH,等人,(2007).Nature 451:141-146.)。此外,研究显示:不导入c-Myc的基因,只使用Oct-4、Sox2和Klf4这3种因子,虽然效率低,但也可以在小鼠和人中建立iPS细胞,成功地抑制了iPS细胞变化为癌细胞,所以在本发明中也可以加以利用(Nakagawa M,等人,(2008).Nat Biotechnol 26:101-106.;Wering M,等人,(2008).Cell Stem Cell 2:10-12)。

本发明中得到的目标器官的特征在于:是完全来自上述异个体哺乳动物的器官。在以往的方法中是嵌合器官再生。虽然不希望受理论束缚,但认为原因在于:其是缺失的基因的发育过程中的功能、特别是器官形成过程中的各器官的干/前体细胞的分化、维持所必需的转录因子。可以使用iPS细胞。iPS细胞的制作如上所述。需要说明的是,当为称作Nanog-iPS的iPS细胞株时,由于没有进行标记,所以在用于嵌合制作时,无法与宿主的胚侧进行区别,无法识别器官是否得到补偿。因此,为了解决这个问题,通过向该Nanog-iPS细胞株中导入荧光色素,可以按照与上述ES细胞的情形同样的操作规程进行实验。而且,使用以上那样的细胞时,可以按照与使用ES细胞时同样的操作规程制作器官,并明确其来源。

本发明还提供通过本发明的方法生产的哺乳动物。具有这样的目标器官的动物以往是无法生产的,由此认为:动物本身也具有作为发明的价值。虽然不希望受理论束缚,但迄今为止无法制作这样的动物,认为其原因在于:通过基因缺失而显示的缺失器官是存活所必须的,而救济它们的方法并不存在。

太阳城集团本发明还提供非人哺乳动物在目标器官的制造中的使用,所述非人哺乳动物具有在发育期目标器官未发育的异常。在这样的用途中使用宿主细胞,这在以往没有被充分设想的。因此,认为这样的动物本身也具有作为发明的价值。虽然不希望受理论束缚,但迄今为止无法制作这样的动物,认为其原因在于:通过基因缺失而显示的缺失器官是存活所必需的,而目标个体不可能维持到达到性成熟的周龄。

(使用各种动物时的留意点)

太阳城集团使用小鼠以外的动物时,通过留意以下各点,可以应用本说明书的实施例中记载的方法来实施。例如,太阳城集团其他种类动物中的嵌合制作,与在小鼠以外的种中具有嵌合形成能的多能干细胞建立的报道相比,在胚或胚中注入了作为ES细胞的起源的内部细胞团块的嵌合的报告(大鼠:(Mayer,J.R.Jr.& Fretz,H.I.The culture of preimplantation rat embryos and the production of allophenic rats(小鼠胚胎移植前的培养和异表型大鼠的产生).J.Reprod.Fertil.39,1-10(1974));牛:(Brem,G.等人.Production of cattle chimerae through embryo microsurgery(通过胚胎显微外科手术生产牛嵌合体).Theriogenology.23,182(1985));猪:(Kashiwazaki N等人,Production of chimeric pigs by the blastocyst injection method(通过胚泡注入法生产嵌合猪),Vet.Rec.130,186-187(1992)))多,但即使使用注入有内部细胞团块的嵌合,也可以应用本说明书中记载的方法。象这样通过使用内部细胞团块来补偿缺失动物所失去的器官,这在事实上是可能的。即,例如可以将上述细胞均在体外培养直至形成胚泡,再以物理方式从得到的胚泡中剥离一部分内部细胞团块,将其注入胚泡中。使中途的8细胞期或桑椹胚彼此之间凝集,可以制作嵌合胚。

(一般技术)

本说明书中使用的分子生物学方法、生化学方法、微生物学方法,在该领域是众所周知且惯用的方法,例如记载在Sambrook J.等人.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验指南),Cold Spring Harbor及其第3版.(2001);Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行规范),Greene出版.Associates and Wiley-Interscience;Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(源自分子生物学现行规范的方法纲要),Greene出版.Associates and Wiley-Interscience;Innis,M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR实验规范:方法和应用指南),Academic Press;Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(源自分子生物学现行规范的方法纲要),Greene出版.Associates;Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(源自分子生物学现行规范的方法纲要),Greene出版.Associates;Innis,M.A.等人.(1995).PCR Strategies,Academic Press;Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(源自分子生物学现行规范的方法纲要),Wiley,and annual updates;Sninsky,J.J.等人.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics,Academic Press;别册实验医学“遺伝子導入&発現解析実験法”(基因导入&表达分析实验法)羊土社、1997等中,在本说明书中,这些文献的相关部分(可以是全部)作为参考而引用。

太阳城集团太阳城集团用于制作人工合成基因的DNA合成技术和核酸化学,例如记载在Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRLPress;Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press;Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approac,IRL Press;Adams,R.L.等人.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids(核酸生物化学),Chapman & Hall;Shabarova,Z.等人.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids(核酸的高等有机化学),Weinheim;Blackburn,G.M.等人.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology(化学和生物学中的核酸),Oxford University Press;Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques,Academic Press等中,在本说明书中,这些文献的相关部分作为参考而引用。

本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献,其全体以与各自具体记载的相同的程度在本说明书中作为参考而引用。

太阳城集团以上,为了容易理解,给出优选的实施方案来说明本发明。以下,根据实施例来说明本发明,但上述的说明和以下的实施例只是为了例示而提供,并不是为了限定本发明而提供。因此,本发明的范围既不受本说明书中具体记载的实施方案的限定,也不受实施例的限定,只通过权利要求书来限定。

实施例

在本实施例中,根据动物保护的精神,按照东京大学规定的动物处理相关规范进行以下的实验。

太阳城集团(iPS细胞的制备例)

本发明人等使用从GFP转基因小鼠尾端采集的成纤维细胞,利用3因子(Klf4、Sox2、Oct3/4)生产诱导型多能干(iPS)细胞。其操作规程如下。其图解见图1,详细地显示在图2a中。

(来自GFP小鼠尾端的成纤维细胞(Tail tip fibroblast:TTF)的建立)

从GFP转基因小鼠身上取下约1cm的尾端,剥皮,切成2~3片。将其放在MF-start培养基(TOYOBO,日本)中,培养5天。将其中出现的成纤维细胞重新接种在新的培养皿中进行多次传代,以其作为来自尾端的成纤维细胞(TTF)。

(+3因子(初期化因子)的导入)

太阳城集团导入目标基因和病毒包膜蛋白,从制作的产生病毒的细胞株(293gp或293GPG细胞株)中回收上清,离心浓缩后冷冻保存,将得到的病毒液在前一天加入到已传代的TTF细胞的培养液中,使达到1×105细胞/6孔板,将其作为3因子(初期化因子)的导入。

(用ES细胞用培养基培养25~30天)

导入3因子(初期化因子)后,第2天置换成ES培养用的培养液,培养25~30天。此时,每天进行培养液的置换。

太阳城集团(挑选iPS集落和建立iPS细胞株)

使用黄色微量吸管头(例如可以从Watson获取)挑选培养后出现的iPS细胞样集落,分散在0.25%胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen公司)中,直至形成单细胞,将其接种在新准备的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)上。

(结果)

结果证实:利用上述方法建立的iPS细胞株具有图2b-f所示的作为iPS细胞的特征、即未分化性和全能性。

上述实验的结果见图2。如图2b所示,使用带有照相机的显微镜拍摄所建立的两株iPS细胞株的形态。其条件如下。

将挑选后的iPS细胞传代,之后在皿上在形成半汇合的阶段进行观察和拍摄。

可知在形态上形成ES细胞样的未分化集落。

如图2c所示,在荧光显微镜下拍摄iPS细胞,并用碱性磷酸酶染色试剂盒(Vector公司Cat.No.SK-5200)进行染色。其条件如下。

太阳城集团使用带有照相机的显微镜观察、拍摄亮视野像、GFP荧光像,之后除去培养液,在用磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗的iPS细胞的培养皿中添加含有10%福尔马林、90%甲醇的固定液,实施1~2分钟的固定处理。将其用清洗液(0.1M Tris-HCl(pH9.5))清洗一次后,添加上述试剂盒的染色液,在暗处静置15分钟。之后,再次用清洗液清洗,之后进行观察、拍摄。

如图2c所示,可知:由于本实施例中制作的iPS细胞来自GFP小鼠,所以恒定表达GFP,并显示出未分化细胞的特征性的高碱性磷酸酶活性。

太阳城集团如图2d所示,为了鉴定在iPS细胞建立时插入在基因组DNA上的3因子,从iPS细胞中提取基因组DNA,进行PCR。其条件如下。

太阳城集团基因组DNA,使用DNA mini试剂盒(Qiagen公司),按照制造业者的操作规程从1×106个细胞中提取DNA。以其DNA为模板,使用以下引物进行PCR。

Oct3/4

太阳城集团Fw(mOct3/4-S1120):CCC TGG GGA TGC TGT GAG CCA AGG(SEQ ID NO:1)

Rv(pMX/L3205):CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA(SEQ ID NO:2)

Klf4

Fw(Klf4-S1236):GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC(SEQ ID NO:3)

Rv(pMXs-AS3200):TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG(SEQ ID NO:4)

Sox2

Fw(Sox2-S768):GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG(SEQ ID NO:5)

太阳城集团Rv(pMX-AS3200):同上(SEQ ID NO:4)

c-Myc

太阳城集团FW(c-Myc-S1093):CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC(SEQ ID NO:6)

太阳城集团Rv(pMX-AS3200):同上(SEQ ID NO:4)

太阳城集团其结果,如图2d所示,确认到3因子的插入。

如图2e所示,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法确认ES细胞的特征性基因表达图案和导入的基因的表达。其条件如下。

使用流式细胞仪分选1×105个GFP阳性细胞到Trizol-LS Reagent(invitrogen公司)中,使用ThermoScript RT-PCR系统试剂盒(invitrogen公司),按照附录的操作规程由从上述GFP阳性细胞中提取的mRNA合成cDNA。以合成的cDNA为模板,进行PCR反应。在转基因的表达(图中记作Tg)中,所用引物使用与上述图2d相同的引物;而在除此以外的基因表达中,使用根据Takahashi K & Yamanaka S的报道(Cell 2006 Aug 25;126(4):652-5.)等合成引物而得到的引物。

如图2e所示,可知:所有株均显示出与ES细胞几乎相同的表达图案,利用iPS细胞的高的基因沉默活性,所导入的基因(Tg)的表达被抑制。

如图2f所示,将所建立的iPS细胞注入胚泡中,制作嵌合小鼠。其条件如下。

太阳城集团使用从BDF1系统的小鼠(♀,8周龄)采集的卵子和来自C57BL/6的精子,进行体外受精(IVF;in vitro fertilizaiton),得到受精卵,所述BDF1系统的小鼠通过给予PMSG和hCG激素进行了过排卵诱起处理。培养该受精卵直至8细胞期/桑椹胚,之后冷冻保存至进行胚泡注入的前一天。对于iPS细胞,利用0.25%胰蛋白酶/EDTA剥离形成半汇合的部分,之后悬浮在ES细胞培养液中,用于注入。与胚泡互补中的方法一样,在显微镜下使用显微操纵器进行胚泡注入,经过注入后的培养,对ICR系统的临时代理子宫施行子宫移植。分析中,于胎生第13天和出生后第1天在荧光实体显微镜下进行观察和拍摄。

如图2f所示,在胎儿期和新生儿期可以确认来自iPS细胞的细胞(GFP阳性),提示所建立的iPS细胞株具有高的多分化能。

(实施例1)

在本实施例中,选择小鼠作为建立者动物,选择胰脏作为要缺失的器官。并且,为了制作以胰脏缺失为特征的敲除小鼠使用了Pdx1基因。

(使用的小鼠)

作为以胰脏缺失为特征的敲除小鼠,使用了Pdx1wt/LacZ和Pdx1LacZ/LacZ(建立者)。使用了来自向Pdx1基因座位中敲入(也可以是敲除)了LacZ基因的小鼠(Pdx1-LacZ敲入小鼠)的胚泡。

(Pdx1-LacZ敲入小鼠)

太阳城集团构建物成的制作,详细而言,可以根据已经报道的论文(Development 122,983-995(1996))来制作。简述如下。同源区的臂可以使用由包含Pdx1区的λ克隆进行克隆的臂。在本实施例中,使用由京都大学大学院医学研究科肿瘤外科学研究室川口义弥先生提供的同源臂。

太阳城集团(转基因、敲入的方法:Pdx1-LacZ敲入小鼠)

通过电穿孔将上述的构建物导入如上制备的iPS细胞中,进行阳性/阴性选择后,通过DNA印迹进行筛选,将得到的克隆注入胚泡中,制作嵌合小鼠。之后,确立与生殖系列附和的谱系,使遗传背景与C57BL/6系统回交,即可制作。

(建立者小鼠)

(使用的小鼠)

作为以胰脏缺失为特征的转基因小鼠,使用将在Pdx1启动子区下接合有Hes1基因的构建物注入小鼠前核期卵中制作的小鼠(Pdx1-Hes1小鼠)。太阳城集团构建物的制作,可以向已报道的论文(Diabetologia 43,332-339(2000))中使用的、包含Pdx1启动子区的构建物的Pax6基因位点插入Hes1基因(NCBI检索号NM_008235的mRNA),制作构建物。

(转基因的方法)

使用微量注射器,将上述的构建物注入将C57BL6小鼠和BDF1小鼠(从日本SLC株式会社购入)交配而得到的前核期卵中,之后移植到临时代理中,制作转基因小鼠。

胰脏的形成程度依赖于在Pd×1(特别是在胎生期的胰脏中表达)的启动子下表达的Hes1的表达量而不同。若高度表达(=拷贝数多),则显示出胰脏的缺失。显示Pd×1-Hes1转基因小鼠的通过胚泡互补进行的胰脏再生。可以使用相同的小鼠制作来自iPS细胞的胰脏。

由此证实:与Pd×1敲除小鼠一样,如此操作而制作的转基因小鼠也可以补偿胰脏。

(建立者转基因小鼠的制作)

已知上述转基因小鼠在出生后死亡,所以制作这样的小鼠的建立者。

太阳城集团简述如下:培养注入有Pd×1-Hes1转基因的胚,直至形成胚泡,之后使用显微操纵器,在显微镜下向其中注入iPS细胞等,从而补偿胰脏的缺失。此时的iPS细胞中,与敲除项一样,使用用GFP等标记的iPS细胞。可以使用与其同等的标记的iPS细胞等。将注入后的胚移植到临时代理的子宫中,可以得到产仔。这样,通过进行向导入有转基因的胚注入iPS细胞这样的双重胚操作,可以由第1代的转基因补偿胰脏,这些小鼠能够作为可向下一代传递胰脏缺失的表达型的建立者动物。

(交配)

太阳城集团接下来,在本实施例中,使如此操作建立的小鼠的异型小鼠之间交配后使用。由于上述敲入小鼠无法在同型间维持(出生后1周左右死亡)。所以使Pdx1wt/LacZ和Pdx1LacZ/LacZ(建立者)彼此之间交配,回收胚。

(小鼠的维持顺序和确认)

太阳城集团使用显微操纵器,在显微镜下向胚泡中注入上述iPS细胞(图1 iPS细胞的胚泡注入)。按照以往的方法,必需用GFP标记,但这次由于预先由GFP小鼠的体细胞建立iPS细胞,所以之后不必作标记,直接使用。当然,可以使用与其同等的标记的其他iPS细胞等。将注入后的胚移植到临时代理的子宫中,得到产仔。

当产仔为敲入小鼠时,成为同型的概率为1/4,所以必需判定目标“胰脏缺失+来自iPS细胞的胰脏”的小鼠是哪一个。因此,从两者的体内采集血液和组织细胞,利于流式细胞仪分选显示GFP阴性的细胞(不是来自iPS细胞,而是来自所注入的胚的细胞),提取基因组DNA、之后利用PCR法检测基因型,从而判定每一只小鼠。使用的引物如下。

太阳城集团正向(Fw):ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG(SEQ ID NO:7)

太阳城集团反向1(Rv1):TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC(SEQ ID NO:8)

反向(Rv2):TGT GAG CGA GTA ACA ACC(SEQ ID NO:9)。

太阳城集团利用该方法进行制作时,由于是异型之间的交配,所以根据孟德尔遗传定律,预想其仔为野生型∶异型∶KO=1∶2∶1。因此,为了特定其中的KO个体,如此地使用末梢血中的来自宿主的细胞进行基因型分析,特定其基因型。

作为确认被补偿的器官是否正常地发挥功能的最初步骤,在胰脏的形态观察容易的新生儿期进行功能标志物的表达分析。

显示对由在新生儿期解剖的小鼠胰脏制作的冷冻切片施行免疫染色的像。作为抗体,使用作为内分泌组织的指标的抗胰岛素抗体(从株式会社ニチレイバイオサイエンス购入cat.#422421),显示已染色的抗体。此外,还可以将作为外分泌组织的指标的抗α-淀粉酶抗体(从SIGMA公司购入cat.#A8273)、抗胰高血糖素抗体(从株式会社ニチレイバイオサイエンス购入cat.#422271)、抗生长抑素抗体(从株式会社ニチレイバイオサイエンス购入cat.#422651)、以及作为胰管的指标的DBA-凝集素(从Vector公司购入cat.#RL-1032)分别染色。胰岛素为阳性,由此理解为:即使不在其他抗体中进行染色,被补偿的胰脏也正常地发挥功能。

太阳城集团由该结果确认到几乎所有的功能标志物的表达,认为具有足以存活的正常的功能。

接下来,作为确认被补偿的器官是否正常地发挥功能的下一步骤,利用成体小鼠测定血糖值。

可以参考以血糖值为指标的胰脏补偿小鼠的胰功能评价结果。作为恒定状态的血糖值,可以参考利用Medisefumini GR-102(从TERUMO公司购入)测定成熟的胰脏补偿小鼠的血糖值的平均值和标准偏差。作为对照,可以使用携带异型Pd×1等位基因的嵌合小鼠和胰脏功能低下的STZ-DM模型的值。此外,可以参考利用同一Medisefumini测定糖负荷后的血糖值的变化的结果。这些结果显示出血糖调节能的正常性,提示所制作的胰脏补偿小鼠在被用作建立者时也可以长期存活。

即,糖负荷后,一度上升的血糖值也和用作对照的异型(+/-)嵌合一样回复到正常值,所以所制作的KO嵌合(建立者)没有显示出糖尿病等症状,显示出长期存活的可能性。

太阳城集团接下来,尝试着由通过与异型个体的交配得到的产仔,明确能否作为建立者小鼠向下一代传递其表型。从得到的产仔的尾端提取基因组DNA,使用在(小鼠的维持顺序和确认)项中使用的引物进行PCR。其结果,明确了只得到了异型或敲除个体,这强烈暗示:建立者是敲除个体,可以向下一代传递其表型。

即,由于是敲除小鼠(KO)与异型小鼠的交配,理论上按照孟德尔遗传定律,应该以1/2的概率形成KO或异型个体,结果的确如此。

太阳城集团由此认为:例如当为补偿了胰脏的KO之间的交配时,可以100%在下一代中得到KO个体,使用KO个体的分析变得极容易进行。

(嵌合的确认)

太阳城集团嵌合可以根据毛的颜色来判断。由于供体的iPS细胞来自GFP转基因小鼠,而宿主的胚来自野生型的C57BL6×BDF1(黑),所以可以利用GFP的荧光进行判断。利用从尾端提取的基因组DNA的PCR检测转基因,由此进行转基因的判定。

产仔为转基因时,转基因向下一代传递的概率1/2,所以必需判定目标“胰脏缺失+来自iPS细胞的胰脏”小鼠是哪一个。因此,使其与野生型小鼠交配,使用从产仔的尾端提取的基因组DNA,利用PCR法测定基因型,由此确认转基因的传递,同时观察这些产仔的胰脏形态。PCR中使用以下的引物组合。

正向(Fw):TGA CTT TCT GTG CTC AGA GG(SEQ ID NO:10)

反向(Rv):CAA TGA TGG CTC CAG GGT AA(SEQ ID NO:11)。

太阳城集团以与Pd×1启动子区对应的核苷酸序列杂交的方式制作所使用的正向引物,以与Hes1 cDNA(检索号为NM_008235的mRNA)核苷酸序列杂交的方式制作反向引物。附近存在这样的Pd×1启动子和Hes1 cDNA,这在野生型小鼠中不会发生,所以利用使用这些引物的PCR,可以高效率检测转基因。

由以上实验得到了:提示是在下一代中能够发生胰脏缺失的建立者小鼠的结果。

太阳城集团不限于小鼠、还对其他大型动物等应用上述方法,从而应该可以高效率地生产具有致死性表型的转基因动物和敲除动物。

使制作的转基因且嵌合的个体与野生型交配。通过产仔的胰脏形态分析、或基因组DNA的PCR,明确了胰缺失的表型向下一代传递。如果转基因-嵌合小鼠能够成为建立者,则下一代产生缺失了胰脏的小鼠。可以在下一代中选择成功地缺失胰脏的小鼠。由于这样的小鼠在制作阶段补偿了胰脏,所以出生后显示出正常性。这样,即使使用转基因小鼠,也可以使用可以高效率地生产象器官缺失小鼠这样的在胎生期和刚刚出生后死亡的小鼠的建立者,与iPS细胞一起实现器官再生。

太阳城集团以上结果显示:使用iPS细胞,无论是包含通过HES-1的强制表达而无法形成胰脏的物质的小鼠、还是Pdx-1敲除小鼠,利用胚泡互补拯救器官不全动物的死亡,可以用作建立者。

(胰脏的再生)

图3显示胰脏的再生。这里,在显微镜下解剖出生后第5天的新生儿,露出胰脏。在荧光显微镜下观察和拍摄该胰脏。其结果的照片见图3。

(来自iPS细胞的胰脏的形态)

图4显示来自iPS细胞的胰脏的形态。这里,制作来自iPS细胞的胰脏的冷冻切片标本,利用DAPI和抗GFP抗体、抗胰岛素抗体进行染色,作为核染色,使用正象荧光显微镜和共聚焦激光显微镜进行观察、拍摄。

由图3和图4认为:在形态上胚泡互补成立。

图5显示宿主小鼠的基因型判定的方法。从图3所示的同一小鼠中采集骨髓细胞,利用流式细胞仪分选GFP阴性的造血干/前体细胞(c-Kit+,Sca-1+,Linage标记-:KSL细胞),在96孔板的每孔中加入1个细胞。将其在添加细胞因子的条件下培养12天,形成集落,从中提取基因组DNA,用于基因型判定。由此,即使在GFP-侧含有通过基因沉默而使GFP的表达消失的细胞,也可以进行来自1个细胞的克隆基因判定,可以简便地区别宿主细胞、发生了基因沉默的细胞。需要说明的是,图5中的实验作为确认胚泡互补的确立的证据(或许由于器官是空的(=敲除(KO)),所以才进行确认)的实验,为了慎重起见通过基因型分析确认是KO,考虑到基因沉默的影响,进行来自单细胞的基因型判定(图5)。a.显示其策略,b.显示培养后形成的集落像,c.显示判定结果。

(考察)

如上所述,证实iPS细胞是利用3因子(Klf4、Sox2、Oct3/4),使用从GFP转基因小鼠的尾端采集的成纤维细胞独自制作的器官的器官再生。Pdx1敲除小鼠由于同型和异型交配,所以应该以50%的概率生出同型的胰脏缺失小鼠,这已得到证实。而且,由图4所示的来自iPS细胞的胰脏的形态、以及如图5所示分离回收GFP阳性细胞、GFP阴性细胞进行PCR的结果,应该以50%的概率生出同型的胰脏缺失小鼠,这已得到证实。

太阳城集团(向STZ诱发糖尿病小鼠中移植来自iPS的胰岛)

(使用的小鼠)

使用的C57BL/6小鼠、BDF1小鼠、DBA2小鼠和ICR小鼠从日本SLC株式会社购入。使Pdx1异型接合性(Pdx1(+/-))小鼠(由京都大学大学院医学研究科川口义弥先生和Vanderbilt University的Dr.Wright提供)与DBA2小鼠或BDF1小鼠交配。C57BL/6小鼠用于链脲霉素(STZ)诱发糖尿病模型的供体。绝食16~20小时后,静脉内给予STZ(200mg/kg),然后,自该STZ注射起1周后,将血中葡萄糖水平超过400mg/dL的小鼠视作高血糖糖尿病小鼠。

(mES/miPS细胞的培养)

在明胶包被的皿中,在补充有10%胎牛血清(FBS;ニチレイバイオサイエンス制)、0.1mM 2-巯基乙醇(Invitrogen,San Diego,CA)、0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、1%L-谷氨酰胺青霉素链霉素(Sigma)和1000U/ml的白血病抑制因子(LIF;Millipore,Bedford,MA)的Glasgow改良Eagle培养基(GMEM;Sigma,St.Louis,MO)中,在没有饲养细胞的情况下维持未分化的小鼠胚性干(mES)细胞(G4.2)。该G4.2细胞(由RIKEN CDB的丹羽仁史先生提供)来自EB3ES细胞,而且,在CAG表达单元的调节下携带改良型绿色荧光蛋白(EGFP)基因。EB3ES细胞是来自E14tg2a ES细胞(Hooper M.等人,1987)的下位系统的细胞,是通过将Oct-3/4-IRES-BSD-pA载体的插入在Oct-3/4等位基因中标的化而建立的细胞(Niwa H.等人,2000),所述的Oct-3/4-IRES-BSD-pA载体构建成在Oct-3/4启动子调节下表达作为耐药性基因的杀稻瘟素。

在补充了15%敲除血清替代添加物(KSR;Invitrogen)、0.1mM 2-巯基乙醇(Invitrogen)、0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)、1mM HEPES缓冲溶液(Invitrogen)、1%L-谷氨酰胺 青霉素 链霉素(Sigma)和1000U/ml的白血病抑制因子(LIF;Millipore)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM;Invitrogen)中,在丝裂霉素C处理的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)上维持未分化的小鼠人工多能干(miPS)细胞(GT3.2)。GT3.2细胞是由使用逆转录病毒载体导入有Klf4、Sox2、Oct3/4这3个初期化因子的、从雄性GFP转基因小鼠(由大阪大学的冈部腾先生提供)的尾端采集的成纤维细胞建立的。GT3.2细胞在CAG表达单元的调节下到处表达EGFP。

(胚的培养和操作)

太阳城集团Pdx1异型接合性(Pdx1(+/-))的异种交配胚的制备按照已报道的操作规程(Nagy A.等人,2003)进行。简述如下:从Pdx1异种接合性小鼠的交配后2.5天的卵管和子宫中将小鼠的8细胞/桑椹胚期的胚采卵到M2培养基(Millipore)中。将这些胚移入KSOM-AA培养基(Millipore)滴中,然后,直至胚泡期培养24小时。

太阳城集团为了胚操作,将胚泡移入含有M2培养基的微小液滴中,然后,对mES/miPS细胞进行胰蛋白酶处理,之后悬浮于该培养基的微小液滴中。在8细胞/桑椹胚期,将胚移入含有HEPES缓冲mES/miPS培养基的微小液滴中。使用压力驱动的显微操纵器(プライムテツク制),在显微镜下非常小心地在透明带和营养外胚叶中开孔,之后向胚泡腔内的内部细胞团块(ICM)附近注入10~15个mES/miPS细胞。注入后,在KSOM-AA培养基中培养胚1~2小时,之后,将胚移植到2.5dpc的伪妊娠交配的临时代理雌性ICR小鼠的子宫内。

(胰岛的分离和移植)

通过胶原酶消化,从具有来自iPS的胰脏的小鼠中分离胰岛,然后,利用Ficoll梯度进行离心沉淀,分离这些胰岛。简单而言,屠杀10~12周龄的成体小鼠,使用27G的蝴蝶针,从胆管起在Hanks平衡盐溶液(HBSS:Invitrogen)中用2mg/ml的胶原酶(ヤクルト公司制)进行胰脏灌流。切开灌流的胰脏,在37℃下培养20分钟。用HBSS清洗已消化的组分2次,然后,使用滤网除去未被消化的组织。通过使用了HBSS中的Ficoll PM400(GE-Healthcare,Stockholm,Sweden)的密度梯度离心沉淀分离组分,然后,回收胰岛已被浓缩的组分到含有10%FCS的RPMI培养基(Invitrogen)中。使用玻璃制的微量移液管,在显微镜下回收直径超过约150μm的胰岛到管内。

使用玻璃制的微量移液管,将150个分离的胰岛移植到STZ诱发糖尿病小鼠的肾脏被膜下。为了防止胰岛的移植物立刻消失,在移植后第0天、第2天和第4天,向腹腔内给予3次所报道的抗炎促进性单克隆抗体的混合物[含有抗小鼠IFN-γ单克隆抗体(mAb)(R4-6A2;大鼠IgGκ:e-Bioscience)、抗小鼠TNF-αmAb(MP6-XT3;大鼠IgG1κ:e-Bioscience)和抗小鼠IL-1βmAb(B122;美国仓鼠IgG:e-Bioscience)]。

(免疫组织化学)

自胰岛移植起2个月后,观察GFP的表达(显示所移植的胰岛)。进行肾脏切片的HE染色和用DAPI进行的GFP染色,确认移植的胰岛的存在。

(血糖值的监测)

对于没有进行绝食的小鼠的血糖值,在给予mAb的时刻、以及从胰岛移植到2个月后为止,每隔1周采集血液样品,监测血糖值。使用Medisefumini GP-102(从TERUMO公司购入)测定血糖值。另外,自胰岛移植起2个月后进行葡萄糖耐性试验(GTT)。

数据见图5A。图5A中显示:向STZ诱发糖尿病小鼠中移植来自iPS由来的胰岛。a和b显示胰岛的分离。将来自iPS的胰脏从总胆管(a.箭头)起进行胶原酶灌流,密度梯度离心沉淀后,浓缩来自表达EGFP的iPS的胰岛(b)。c显示自胰岛移植起2个月后的肾脏被膜。表达EGFP的位置(箭头)是移植的胰岛。d显示肾脏切片的HE染色(左图示板)和用DAPI进行的GFP染色(右图示板)。e显示向STZ诱发糖尿病小鼠中移植来自iPS的150的胰岛。箭头显示给予抗体混合物(抗INF-γ、抗TNF-α、抗IL-1β)的时刻。移植起至2个月后,每隔1周测定腹腔内的血糖值。移植了iPS胰岛的STZ诱发糖尿病小鼠以▲(黑三角)(n=6)表示,未移植iPS胰岛的STZ诱发糖尿病小鼠以■(黑四角)表示。f显示自胰岛移植起2个月后的葡萄糖耐性试验(GTT)。

太阳城集团这样,由图5A的结果可知:通过移植来自iPS的胰岛,糖尿病的症状有所改善。因此,显示出由使用iPS的器官再生技术产生的治疗效果。

太阳城集团(实施例2:肾脏的情形的例子)

太阳城集团根据实施例1,进行肾脏的器官再生。

在本实施例中,向以肾脏缺失为特征的敲除小鼠中移植作为多能细胞的如上制作的小鼠iPS细胞,研究肾脏是否发育。

太阳城集团作为以肾脏缺失为特征的敲除小鼠,使用Sall1敲除小鼠(由熊本大学发生医学研究中心、西中村隆一先生提供)。Sall1基因是果蝇(Drosophila)的前后方位点特异性同源异型基因spalt(sal)的小鼠同系物,由非洲爪蟾的前肾管诱导实验可知:其是提示对肾的发育重要的、编码1323氨基酸残基的蛋白的3969bp的基因(Nishinakamura,R.等人,Development,第128卷,第3105-3115页,2001、东大浅岛研究室)。有报道称:在小鼠体内,该Sall1基因除了在肾脏中表达外,还在中枢神经、耳胞、心脏、肢芽、肛门中表达(Nishinakamura,R.等人,Development,第128卷,第3105-3115页,2001)。

太阳城集团该Sall1基因的敲除小鼠(与C57BL/6系统回交(回交)、分析)通过缺失Sall1基因的外显子2以后,缺失了分子内存在的所有10个锌指结构域,该缺失的结果,输尿管芽没有嵌入后肾间叶中,认为发生了肾脏形成初期的异常(正常个体、Sall1敲除小鼠)。

太阳城集团实验中使用的Sall1敲除小鼠的基因型判定,进行与图5所示的宿主小鼠的基因型判定方法相同的操作来进行。采集小鼠骨髓细胞,利用流式细胞仪分选GFP阴性的造血干/前体细胞(c-Kit+,Sca-1+,Linage标记-:KSL细胞),向96孔板的每孔中加入1个细胞。将其在添加细胞因子的条件下培养12天,形成集落,从中提取基因组DNA,用于基因型判定。需要说明的是,作为确认胚泡互补的确立的证据(或许由于器官是空的(=敲除(KO)),所以才进行确认)的实验,为了慎重起见通过基因型分析来确认是KO,进行来自单细胞的基因型判定。

太阳城集团基因型判定中使用的引物如下。

用于鉴定所注入的胚的来源(即宿主)的正向引物:

突变体检测用:AAG GGA CTG GCT GCT ATT GG(SEQ ID NO:12)

太阳城集团野生型检测用:GTA CAC GTT TCT CCT CAG GAC(SEQ ID NO:13)

用于鉴定所注入的胚的来源(即宿主)的反向引物:

太阳城集团突变体检测用:ATA TCA CGG GAT GCC AAC GC(SEQ ID NO:14)

太阳城集团野生型检测用:TCT CCA GTG TGA GTT CTC TCG(SEQ ID NO:15)。

按照该方法来制作时,由于是异型之间的交配,所以按照孟德尔遗传定律,预想该仔的野生型∶异型∶KO=1∶2∶1。因此,为了特定其中的KO个体,如此地使用骨髓细胞进行基因型分析,特定其基因型(图6)。可知:#3的小鼠是Sall1同型KO小鼠。

太阳城集团可以确认:通过进行这样的基因型确定,能够确定嵌合个体中的基因型。

太阳城集团研究通过上述基因型确定确定为同型接合体(Sall1(-/-))或异型接合体(Sall1(+/-))的、出生后1天的小鼠产仔个体的肾脏形成时,可以显示:在异型接合体(Sall1(+/-))中有肾脏形成,而在同型接合体(Sall1(-/-))中,肾脏完全没有形成。

太阳城集团使Sall1基因敲除小鼠的异型接合体个体(Sall1(+/-))的雄性与雌性交配,利用子宫回流法采集胚泡期受精卵。如此操作得到的胚泡期受精卵的基因型,预想其以同型接合体(Sall1(-/-))∶异型接合体(Sall1(+/-))∶野生型(Sall1(+/+))=1∶2∶1的比率出现。

通过微量注射,向采集的胚泡期受精卵中注入上述的GFP标记的iPS细胞,每个胚泡注入15个细胞,之后放回临时代理(ICR小鼠、从日本エスエルシ-株式会社购入)的子宫中。

在通过上述基因型确定确认为同型接合体(Sall1(-/-))的新生仔的嵌合个体中,可以确认:肾脏存在于后腹膜区。在荧光实体显微镜下观察这些形成的肾脏时,可以确认GFP的阳性所见(图6)。这表明:在同型接合体(Sall1(-/-))中,肾脏只来自移植到胚泡期受精卵的内腔中的小鼠iPS细胞。另一方面,在异型接合体(Sall1(+/-))的个体中,肾脏由来自异型接合体(Sall1(+/-))的个体的细胞和来自移植的iPS细胞的细胞的嵌合构成,所以在GFP的荧光以及来自使用抗GFP抗体的免疫组织化学的荧光的两者中均得到阳性的细胞图像,由此可以确认。

太阳城集团将iPS细胞移植到同型接合体(Sall1(-/-))胚泡期受精卵中的结果,在所得的肾脏的组织学分析中,在蹄腔内可以观察到包含红细胞的成熟功能肾小球、成熟肾小管结构,可以确认:在使用抗GFP抗体的免疫组织化学分析中,这些成熟细胞几乎都是GFP阳性。

太阳城集团由以上结果可以确认:在利用上述方法制作的嵌合Sall1敲除小鼠(Sall1(-/-))中,产仔个体中形成的肾脏由移植到Sall1敲除小鼠(Sall1(-/-))胚泡期受精卵的内腔中的iPS细胞形成。

太阳城集团(实施例3:毛缺失小鼠系统中的毛发育)

太阳城集团毛,使用来自裸鼠的胚泡,向其中移植作为多能干细胞的上述生产的小鼠iPS细胞,研究毛是否发育。

(使用的小鼠)

使用的小鼠是裸鼠,从日本SLC株式会社获取。使用的裸鼠是在向近交系DDD/1系统小鼠中导入BALB/c裸鼠的nu基因时制作的、繁殖效率良好且健壮的裸鼠。

太阳城集团使用显微操纵器,在显微镜下将小鼠iPS细胞注入胚泡中。该小鼠iPS细胞使用导入有GFP的iPS细胞。也可以使用与其同等的标记的小鼠iPS细胞等。将注入后的胚移植到临时代理的子宫中,得到产仔。

太阳城集团裸鼠是自然发病模型,虽然可见胸腺、毛的缺失,但对存活、繁殖没有任何影响,所以裸鼠之间可以交配。因此,产仔也全部是裸鼠,所以不必判定基因型。因此,也不必利用上述实施例那样的PCR中的检测进行确认。

用肉眼确认毛是否发育。这是通过本发明的方法使裸鼠长毛的实例。由该结果验证:生出的毛是GFP阳性的毛,即使使用小鼠iPS细胞,毛也可以再生。

(总结)

以上结果显示:利用本发明的方法,即使是小鼠iPS细胞,也可以再生毛。

太阳城集团(实施例4:胸腺缺失小鼠系统中的胸腺发育)

太阳城集团胸腺,使用来自裸鼠的胚泡,向其中移植作为多能细胞的上述生产的小鼠iPS细胞,研究胸腺是否发育。

(使用的小鼠)

太阳城集团使用的小鼠是裸鼠,从日本SLC株式会社获取。使用的裸鼠是向近交系DDD/1系统小鼠中导入BALB/c裸鼠的nu基因时制作的、繁殖效率良好且健壮的裸鼠。

(小鼠的维持程序和确认)

太阳城集团使用显微操纵器,在显微镜下将小鼠iPS细胞注入胚泡中。该小鼠iPS细胞导入有GFP。可以使用与其同等的标记的小鼠iPS细胞等。将注入后的胚移植到临时代理的子宫内,得到产仔。在本实施例中,如实施例3中所述,由于使用了裸鼠,所以不必通过PCR来确认。

太阳城集团为了显示胸腺是否发育,进行CD4阳性、CD8阳性T细胞的染色。若存在胸腺,则成熟T细胞被分化诱导,而当没有再生时,成熟T细胞没有被分化诱导,所以不存在胸腺。但是,若向裸鼠的胚泡中移入GFP标记的正常iPS细胞(BC,胚泡互补),则GFP阴性T细胞(来自宿主的裸鼠造血干细胞)以及GFP阳性T细胞(来自iPS细胞)两者均被分化诱导,所以在功能上也可以确认:胸腺由小鼠iPS细胞构建而成。

并且,为了显示裸鼠、野生型小鼠和嵌合的本发明的小鼠中的胸腺的发达,通过拍摄野生型小鼠的胸腺的普通照片以及照射荧光时的照片、裸鼠的胸腺的普通照片以及照射荧光时的照片、以上述方式进行胚泡互补而生产的嵌合小鼠的胸腺的普通照片以及照射荧光时的照片、对从该嵌合小鼠中取出的胸腺照射荧光的照片,进行确认。通过确认胸腺显现荧光,证明了其是来自小鼠iPS细胞的组织。

(总结)

以上结果表明:使用本发明的方法,即使是小鼠iPS细胞,也可以再生胸腺。

(实施例5)

太阳城集团在本实施例中,使用以胰脏缺失为特征的Pdx1敲除小鼠作为宿主动物,使用根据上述制备例制作的大鼠的iPS细胞(EGFP+)作为供体细胞,研究异种间的胚泡互补。

A.使用的动物

作为以胰脏缺失为特征的敲除小鼠,与实施例1同样,使用了Pdx1基因敲除小鼠的异型接合个体(Pdx1(+/-))、以及通过小鼠iPS细胞使胰脏得到补偿的同型接合个体(Pdx1(-/-):建立者)。

B.大鼠iPS细胞的制备

太阳城集团1)用于制作大鼠iPS细胞的载体的构建

自5’侧起向慢病毒载体CS-CDF-CG-PRE的多克隆位点中依次插入来自pTRE-Tight(clontech)的TRE、泛素C启动子、来自pTet-on advanced(clontech)的tTA、来自pIRES2EGFP(clontech)的IRES2EGFP。小鼠Oct4、Klf4和Sox2分别通过来自病毒的F2A、T2A连接,插入到上述慢病毒载体的TRE与泛素C启动子之间,制作载体(LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G)。

2)大鼠iPS细胞的建立

太阳城集团将传代数为5以内的Wistar大鼠胎儿成纤维细胞(E14.5)细胞接种在0.1%明胶包被的皿中,用DMEM、15%FCS、1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(SIGMA)进行培养。在接种第二天,向培养液中加入使用LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G载体制作的慢病毒,对细胞进行病毒感染。24小时后交换培养基,重新接种在进行了丝裂霉素C处理的MEF上,用添加1μg/ml强力霉素、1000U/ml大鼠LIF(Millipore)的DMEM、15%FCS、1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺进行培养。第二天交换培养基,每隔1天交换在无血清培养基N2B27培养基(GIBCO)中添加了1μg/ml的强力霉素、1000U/ml大鼠LIF(Millipore)的培养基,从第7天起添加抑制剂(2i;3mM CHIR99021(Axon)、1mM PD0325901(Stemgent)、3i;2i+2mM SU5402(CalbioChem))。挑选第10天以后出现的集落,重新接种在MEF饲养层(feeder)上。对于如此操作而建立的riPS细胞,每3~4天使用一次胰蛋白酶-EDTA进行传代维持,之后将其移入非人哺乳动物的胚泡中。

C.异种间的胚泡互补

使雄性Pdx1(-/-)小鼠与雌性Pdx1(+/-)小鼠交配,利用子宫回流法采集受精卵。使采集的受精卵在体外发育至胚泡期,在显微镜下通过微量注射向得到的胚泡中注入上述EGFP标记的大鼠iPS细胞,每个胚泡注入10个细胞。将其移植到疑似妊娠临时代理(ICR小鼠、从日本エスエルシ-株式会社购入)的子宫中,妊娠期满开腹,分析所得的新生儿。

在荧光实体显微镜下观察EGFP荧光时,由体表的EGFP表达可知:新生儿个体编号#1、#2、#3是嵌合小鼠。将它们开腹时,在#1、#2中可见一样表达EGFP的胰脏。另一方面,#3的胰脏虽然部分性地呈现EGFP的表达,但为马赛克状。此外,虽然#4和#1~3是同腹仔,但未见体表的EGFP荧光,开腹时缺失胰脏,由此可知是非嵌合的Pdx1(-/-)小鼠(图10)。

太阳城集团另外,从这些新生儿中摘出脾脏,将从中制备的血细胞用抗小鼠或大鼠的CD45的单克隆抗体染色,利于流式细胞仪进行分析。其结果,在个体编号#1~3中同时确认到小鼠CD45阳性细胞和大鼠CD45阳性细胞,所以确认它们是夹杂有来自宿主小鼠和大鼠iPS细胞的细胞的小鼠-大鼠异种间嵌合个体。并且,由于大鼠CD45阳性细胞组分中的细胞几乎全部呈现EGFP荧光,所以大鼠CD45阳性细胞是来自用EGFP标记的大鼠iPS细胞的细胞(图10)。

太阳城集团并且,作为确认确立胚泡互补的证据(或许由于器官是空的(=敲除(KO)),所以才进行确认)的实验,为了慎重起见通过来自单细胞的基因型分析,确认个体编号#1~#3的宿主小鼠的基因型为KO,使用上述流式细胞仪,从分析的脾脏样品中回收小鼠CD45阳性细胞,提取基因组DNA,将其用于基因型判定。

用于基因型判定的引物如下:

太阳城集团来自所注入的胚的细胞鉴定用正向引物:

太阳城集团突变型、野生型通用:ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG(SEQ ID NO:16)

太阳城集团来自所注入的胚的细胞鉴定用反向引物:

突变体检测用:TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC(SEQ ID NO:17)

野生型检测用:TGT GAG CGA GTA ACA ACC(SEQ ID NO:18)。

太阳城集团其结果,在#1和#2中只确认到突变型(mutant)的谱带,在个体编号#3中,检测到突变型和野生型(wild type)两者的谱带。由此可知:在#1和#2中,宿主小鼠的基因型为Pdx1(-/-);而在个体编号#3中,宿主小鼠的基因型为Pdx1(+/-)(图10A)。由该结果可知:在本来不该形成胰脏的Pdx1(-/-)小鼠即#1、#2中,通过应用以大鼠iPS细胞为供体的异种间胚泡互补技术,成功地在小鼠个体内构建了大鼠的胰脏。

太阳城集团(实施例6:使用小鼠以外的动物的例子)

太阳城集团在本实施例中证实:即使在使用小鼠以外的动物的情况下,也可以制造器官。在小鼠以外的种中,具有嵌合形成能的多能干细胞的建立,同样可以通过根据上述制备例生产iPS细胞,之后生产嵌合,按照实施例1来实施。

这里,例如也可以用大鼠、猪、牛和人代替小鼠,按照实施例1生产iPS细胞。

太阳城集团例如,在本实施例中,作为小鼠以外的例子,即使是可以制作基因改变动物的动物种(大鼠(转基因)、猪(转基因、敲除)、牛(转基因、敲除),预想也可以参照实施例1进行同样的实验。

太阳城集团由此,可以进行致死性基因改变建立者大鼠、猪、牛等的制造。

这样,即使在使用大鼠、猪、牛的情况下,也可以按照实施例1进行同样的实验。

太阳城集团如上所述,虽然使用本发明的优选的实施方案来例示本发明,但本发明理解为:应该只根据权利要求书来解释其范围。在本说明书中,引用的专利、专利申请和文献,理解为与其内容本身具体地记载在本说明书中一样,其内容应作为对本说明书的参考而引用。

序列表自由文本

太阳城集团SEQ ID NO:1为Oct3/4用正向引物、Fw(mOct3/4-S1120):CCC TGG GGA TGC TGT GAG CCA AGG

SEQ ID NO:2为Oct3/4用反向引物、Rv(pMX/L3205):CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA

太阳城集团SEQ ID NO:3为Klf4用正向引物、Fw(Klf4-S 1236):GCG AAC TCA CAC AGG CGA GAA ACC

太阳城集团SEQ ID NO:4为Klf4、Sox2、c-Myc用反向引物、Rv(pMXs-AS3200):TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG

SEQ ID NO:5为Sox2用正向引物、Fw(Sox2-S768):GGT TAC CTC TTC CTC CCA CTC CAG

SEQ ID NO:6为c-Myc用正向引物、FW(c-Myc-S1093):CAG AGG AGG AAC GAG CTG AAG CGC

SEQ ID NO:7为来自所注入的胚的细胞鉴定用正向(Fw)引物:ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG

太阳城集团SEQ ID NO:8来自所注入的胚的细胞鉴定用反向1(Rv1)引物:TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC

太阳城集团SEQ ID NO:9来自所注入的胚的细胞鉴定用反向(Rv2)引物:TGT GAG CGA GTA ACA ACC

SEQ ID NO:10转基因检测用正向(Fw)引物:TGA CTT TCT GTG CTC AGA GG

太阳城集团SEQ ID NO:11转基因检测用反向(Rv)引物:CAA TGA TGG CTC CAG GGT AA

SEQ ID NO:12来自所注入的胚的细胞(突变体)检测用正向引物:AAG GGA CTG GCT GCT ATT GG

SEQ ID NO:13来自所注入的胚的细胞(野生型)检测用正向引物:GTA CAC GTT TCT CCT CAG GAC

太阳城集团SEQ ID NO:14来自所注入的胚的细胞(突变体)反向引物:ATA TCA CGG GAT GCC AAC GC

SEQ ID NO:15来自所注入的胚的细胞(野生型)检测用反向引物:TCT CCA GTG TGA GTT CTC TCG

SEQ ID NO:16来自所注入的胚的细胞检测用正向引物(突变体 野生型通用):ATT GAG ATG AGA ACC GGC ATG

SEQ ID NO:17来自所注入的胚的细胞(突变体)检测用反向引物:TTC AAC ATC ACT GCC AGC TCC

SEQ ID NO:18来自所注入的胚的细胞(野生型)检测用反向引物:TGT GAG CGA GTA ACA ACC

太阳城集团本文
本文标题:利用IPS细胞和胚泡互补的器官再生法.pdf
链接地址:http://zh228.com/p-7006869.html
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