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一种缩短鱼类性成熟周期的方法.pdf

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一种 缩短 鱼类 性成熟 周期 方法
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摘要
申请专利号:

CN201511000770.7

申请日:

20151225

公开号:

CN105494205A

公开日:

20160420

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A01K61/00 主分类号: A01K61/00
申请人: 武汉百瑞生物技术有限公司
发明人: 刘汉勤,侯昌春,陈丽慧,徐江
地址: 430070 湖北省武汉市东湖新技术开发区珞狮南路517号明泽大厦13楼
优先权: CN201511000770A
专利代理机构: 北京汇泽知识产权代理有限公司 代理人: 程殿军;张瑾
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201511000770.7

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种缩短鱼类性成熟周期的方法,是以待缩短性成熟周期的鱼种为供体鱼,将从供体鱼分离获得的精原干细胞注射入三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔性腺,当三倍体黄颡鱼发育至性成熟后,雌性黄颡鱼会产生供体鱼卵子,雄性黄颡鱼会产生供体鱼精子,供体鱼卵子与供体鱼精子结合,孵化鱼苗,即为供体鱼子代,所述供体鱼为斑鳠或长臀鮠。该方法大大缩短了目标供体鱼的性成熟周期,解决了长周期鱼类的培育亲本技术和人工繁殖技术难题,降低养殖成本,同时也有利于保护野生资源。

权利要求书

太阳城集团1.一种缩短鱼类性成熟周期的方法,其特征在于,以待缩短性成熟周期的鱼种为供体鱼,将从供体鱼分离获得的精原干细胞注射入三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔性腺,当三倍体黄颡鱼发育至性成熟后,雌性黄颡鱼会产生供体鱼卵子,雄性黄颡鱼会产生供体鱼精子,供体鱼卵子与供体鱼精子结合,孵化鱼苗,即为供体鱼子代;所述供体鱼为斑鳠或长臀鮠。2.根据权利要求1所述的缩短鱼类性成熟周期的方法,其特征在于,分离精原干细胞的方法为:将性成熟的供体鱼精巢剪碎,用胶原蛋白酶和胰蛋白酶处理后除去杂质,获得的细胞悬液使用梯度浓度的percoll分离液通过密度梯度离心法进行分离,分离产物中A型精原细胞数量占比达到95%以上即可;percoll分离液为percoll原液用0.85%(w/v)氯化钠或1.5MPBS稀释成的多个浓度梯度的溶液。3.根据权利要求1或2所述的缩短鱼类性成熟周期的方法,其特征在于,所述三倍体黄颡鱼仔鱼为受精卵发育至第8~13天的仔鱼。

说明书

技术领域

本发明涉及一种缩短鱼类性成熟周期的方法。

背景技术

近年来,由于过度捕捞和水质污染,很多生长周期长的野生鱼类栖息地环境遭到严重破坏,资源量急剧下降,能达到性成熟的野生鱼亲本越来越少。

斑鳠(MystusguttatusLacdpdde)属鲇形目,鲿科,鳠属,是一种广泛分布的大型肉食性经济鱼类,其肉质鲜嫩,享有“淡水之王”的美誉,一般收购价每千克70-130元。斑鳠第一次性成熟为6~8龄。

长臀鮠(Cranoglanisbouderius(Richardson))属鲇形目,长臀鮠科,长臀鮠属,又称白骨鱼、牛毛鱼、盔鲇,属中国特有鱼类,仅分布于珠江流域西江水系,属易危鱼类,需3~4年达性成熟。

太阳城集团对于性成熟太阳城集团长的鱼类,养殖的困难在于无法获得数量足够多的亲本,鱼苗量小。如上所述的斑鳠和长臀鮠,虽然在广东、广西等地有人养殖,但人工繁殖技术和亲本的限制,未能批量获得人工繁殖的鱼苗,各地养殖的苗种多数来源于从江河捕捞的野生苗,数量有限,养殖规模较小。

发明内容

为了解决现有技术中对于生长周期长,性成熟太阳城集团一年以上的鱼类人工养殖效率低,生产成本高的问题,本发明提供了一种缩短鱼类性成熟周期的方法。能够有效缩短目标鱼类的性成熟周期,提高养殖效率,降低生产成本。

太阳城集团本发明提供的缩短鱼类性成熟周期的方法,其是以待缩短性成熟周期的鱼种为供体鱼,将从供体鱼分离获得的精原干细胞注射入三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔性腺,当三倍体黄颡鱼发育至性成熟后,雌性黄颡鱼会产生供体鱼卵子,雄性黄颡鱼会产生供体鱼精子,供体鱼卵子与供体鱼精子结合,孵化鱼苗,即为供体鱼子代;所述供体鱼为斑鳠或长臀鮠。

本发明利用三倍体诱导技术将精原细胞引入三倍体性腺发育环境来完成供体配子的发育成熟,缩短供体鱼配子产生太阳城集团。

最后分化出来到底是精子还是卵子,跟受体鱼有关系,如果受体鱼是雌性三倍体,出来的就是卵子,如果受体鱼是雄性三倍体,出来的就是精子。我们采用供体的是精原细胞,本身就有X和Y两种染色体。受体是不育的,可是有性腺发育的环境,供体参与受体胚胎的生殖系形成,并可遗传给后代。

简单的说,精原干细胞移植到三倍体鱼中,如果是雌性三倍体受体,就产生含供体X染色体的卵子,如果是雄性三倍体受体,就产生含供体X和Y的精子。

优选地,上述缩短鱼类性成熟周期的方法中,分离精原干细胞的方法为:将性成熟的供体鱼精巢剪碎,用胶原蛋白酶和胰蛋白酶处理后除去杂质,获得的细胞悬液使用梯度浓度的percoll分离液通过密度梯度离心法进行分离,分离产物中A型精原细胞数量占比达到95%以上即可;

percoll分离液为Percoll原液用0.85%(w/v)氯化钠或1.5MPBS稀释成的多个浓度梯度的溶液。

精原细胞可分为A、B两型,A型是精原细胞的干细胞,经有丝分裂增殖,部分A型精原细胞保留干细胞功能,即还未分化的精原细胞,B型是已经分化的精原细胞。选择A型精原细胞获得两种成熟配子的成功率更高。

优选地,上述缩短鱼类性成熟周期的方法中,所述三倍体黄颡鱼仔鱼为受精卵发育至第8~13天的仔鱼。根据黄颡鱼性腺分化的特点,黄颡鱼一般在孵化13天开始性腺分化,所以受体鱼一定要在性腺分化以前移植成功率最高,选择最早8天是由于仔鱼个体稍大一点,移植时操作比较方便及成活率高。

太阳城集团与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

本发明利用黄颡鱼一年即可性成熟的特点以及三倍体黄颡鱼性腺微环境内分泌体系适宜配子发育的特点,将其它鱼类的配子干细胞移植到三倍体黄颡鱼性腺中促进其发育成熟,一年即可获得成熟的供体鱼精子和卵子,大大缩短了供体鱼性成熟周期,可以批量获得供体鱼鱼苗,提高了养殖效率,同时降低了养殖成本。

附图说明

图1是本发明缩短鱼类性成熟周期的方法技术路线示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1缩短长臀鮠性成熟周期

1.分离长臀鮠精原干细胞

取II—Ⅲ期长臀鮠的精巢剪刀剪碎,用0.2%(w/v)胶原蛋白酶加5%(w/v)胰蛋白酶溶于PBS中,溶解分离1小时(28.5℃),然后用60微米筛网过滤,除去大的杂质,并用PBS洗涤,细胞团块最后悬浮于1mLPBS中,备用。

将2毫升待分离的细胞悬液小心铺于梯度溶液顶部,然后800转/分,离心30分钟。离心结束后,细胞按其自身的比重沉降在不同密度的界面上,呈白色细盘状,用针头仔细吸取上层细胞,然后移至圆锥形试管。PBS洗两次,1000转离心10分钟,去上清收集底部细胞。收集到的细胞悬浮于30微升PBS中进行检查A型精原细胞达到95%以上即可。

2.制备不育黄颡鱼

采用静水压机或冷处理方法,诱导三倍体黄颡鱼(不育)产生。

太阳城集团当胚胎发育至原肠中期时,随机取样30~50颗发育正常的原肠胚进行混合胚胎染色体制片,统计黄颡鱼染色体数,二倍体2n=52;三倍体3n=78。

太阳城集团3.将精原干细胞显微注射到不育黄颡鱼仔鱼腹腔

以三倍体黄颡鱼为受体鱼,在受精至发育13天期间注射长臀鮠的精原干细胞,具体步骤如下:

太阳城集团(1)受体鱼麻醉:用MS-222或0.01%对氨基苯酸乙酯,苯佐卡因(ethylp-aminobenzoate)将受体实验鱼轻微麻醉。

(2)细胞上样:将提取的A型精原细胞装入30微升的玻璃针管中,操作过程中注意避免将玻璃针头弄断,样品装好后放在冰袋上,备用。

太阳城集团(3)受体鱼苗注射:采用显微注射装置,将细胞悬浮液注射到受体鱼苗腹腔(气鳔前端上方或气鳔后上方),注射前将细胞悬浮液预先加入等量台昐蓝染色,显示玻璃针和腹腔移入物,操作过程中尽量避免对鱼体损伤。

太阳城集团(4)检查供体鱼A型精原细胞是否成功注射进受体鱼:注射后4~6星期,随机取5条受体鱼用PBS(pH8.2)洗涤,取出性腺样品制成细胞悬浮液,先检查细胞分散程度,然后制作冰冻切片用荧光显微镜观察供体细胞分布。

(5)早期成活率统计:鱼苗显微注射一个月后,统计其成活率,并作好相关记录。

4.培育能产可受精的长臀鮠卵子或精子的不育黄颡鱼

在繁殖季节前期进行强化培育注射了供体A型精原细胞的三倍体黄颡鱼,当受体实验鱼达到性成熟后,按常规催产方法进行人工催产、授精、孵化鱼苗,各组鱼苗分开养殖,8~10天后分析其遗传背景,确定获得长臀鮠。

太阳城集团实施例2缩短斑鳠性成熟周期

1.在斑鳠雄鱼精巢中分离精原干细胞:

太阳城集团取Ⅲ期斑鳠的精巢剪刀剪碎,用胶原蛋白酶0.2%(w/v)加胰酶5%(w/v)溶于PBS中,溶解分离1小时(28.5℃),然后用60微米筛网过滤,除去大的杂质,并用PBS洗涤,细胞团块最后悬浮于1mlPBS中,备用。

太阳城集团将2毫升待分离的细胞悬液小心铺于梯度溶液顶部,然后800转/分,离心30分钟。离心结束后,细胞按其自身的比重沉降在不同密度的界面上,呈白色细盘状,用针头仔细吸取上层细胞,然后移至圆锥形试管。PBS洗两次,1000转离心10分钟,去上清收集底部细胞。收集到的细胞悬浮于30微升PBS中进行检查A型精原细胞达到95%以上即可。

上述梯度溶液,即不同浓度梯度的percoll分离液铺层,具体方法为用长针头注射器分别吸取不同浓度梯度的percoll工作液,每个梯度吸取1~1.5毫升,按密度从大到小的顺序,由管底向上一层一层的依次叠加(注意不得破坏二梯度间的界面,当相邻两层percoll比重相差不大时,可将小针头斜面紧贴管壁任其自然流下),最后铺成6层界面清晰的不连续密度梯度。

太阳城集团上述不同浓度梯度的percoll分离液,即percoll原液用0.85%氯化钠(或1.5MPBS)稀释成20%、25%、30%、35%、40%、60%六个浓度梯度的溶液。

太阳城集团2.静水压机法诱导三倍体黄颡鱼

采用静水压机处理方法,诱导三倍体黄颡鱼(不育)产生。常规授精方法获得黄颡鱼受精卵,受精太阳城集团为2~5min时;设置静水压力500~700kg/cm;持续施压处理太阳城集团3~6min,受精和静水压处理时的水温为25~26℃。

太阳城集团当胚胎发育至原肠中期时,随机取样30~50颗发育正常的原肠胚进行混合胚胎染色体制片,统计黄颡鱼染色体数,二倍体2n=52;三倍体3n=78。

3.将斑鳠的精原干细胞显微注射到不育黄颡鱼仔鱼腹腔

将步骤1获得的斑鳠A型精原干细胞注射到受精之后第8天的三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔,具体步骤如下:

(1)受体鱼麻醉:用0.01%对氨基苯酸乙酯将受精之后第8天的三倍体黄颡鱼仔鱼腹腔轻微麻醉。

太阳城集团(2)细胞上样:将提取的A型精原细胞装入30微升的玻璃针管中,操作过程中注意避免将玻璃针头弄断,样品装好后放在冰袋上,备用。

太阳城集团(3)受体鱼苗注射:在解剖镜下,利用显微注射装置,控制微量注射器与细玻璃针将细胞悬浮液小心的注射到三倍体黄颡鱼鱼苗腹腔(气鳔前端上方),注射前将细胞悬浮液预先加入等量台昐蓝染色,显示玻璃针和腹腔移入物,操作过程中尽量避免对鱼体损伤。

太阳城集团(4)检查供体鱼A型精原细胞是否成功注射进受体鱼:注射后4~6星期,随机取5条受体鱼用PBS(pH8.2)洗涤,取出性腺样品制成细胞悬浮液,先检查细胞分散程度,然后制作冰冻切片用荧光显微镜观察供体细胞分布。

太阳城集团(5)早期成活率统计:鱼苗显微注射一个月后,统计其成活率,并作好相关记录。

4.三倍体黄颡鱼产生可育的斑鳠精子或卵子

太阳城集团在繁殖季节前期进行强化培育注射了斑鳠A型精原细胞的三倍体黄颡鱼,当三倍体黄颡鱼达到性成熟后,雌性受体鱼会产生卵子,雄性受体鱼会产生精子。按常规催产方法进行人工催产、授精、孵化鱼苗,各组鱼苗分开养殖,8~10天后分析其遗传背景,确定可获得斑鳠子代。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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