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用于治疗炎性疾病和病症的方法.pdf

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用于 治疗 性疾病 病症 方法
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201210311130.8

申请日:

20110111

公开号:

CN103083669A

公开日:

20130508

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K45/00,A61K38/08,A61K38/10,A61P29/00,A61P17/06,A61P25/00,A61P19/02,A61P21/04,A61P37/02,A61P3/10,A61P11/06,A61P11/00,A61P1/16,A61P13/12,A61P17/00,A61P27/02,A61P1/00,A61P17/04 主分类号: A61K45/00,A61K38/08,A61K38/10,A61P29/00,A61P17/06,A61P25/00,A61P19/02,A61P21/04,A61P37/02,A61P3/10,A61P11/06,A61P11/00,A61P1/16,A61P13/12,A61P17/00,A61P27/02,A61P1/00,A61P17/04
申请人: 希尔洛有限公司
发明人: 利奥拉·布赖曼-维克斯曼,塔玛·滕宁鲍姆,尤瓦尔·萨吉夫,马里纳·加尔茨贝因,伊弗雷姆·布雷纳,摩西·本-哈莫,利亚特·哈默
地址: 以色列耐斯兹敖那
优先权: 61/293,794,61/405,509
专利代理机构: 北京品源专利代理有限公司 代理人: 杨生平;钟锦舜
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201210311130.8

授权太阳城集团号:

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法律状态类型:

摘要

本公开内容提供使用PKC同工型调节剂治疗炎性疾病和病症的组合物和套件及其用途。

权利要求书

太阳城集团1.一种用于治疗受治疗者体内炎性疾病或病症的套件,所述套件包括:a)PKCα、PKCε或PKCη的抑制剂;和b)用于向所述受治疗者施用所述PKC抑制剂的说明书。2.根据权利要求1所述的套件,其中所述抑制剂是多肽。3.根据权利要求2所述的套件,其中所述多肽长度上在5和20个氨基酸之间。4.根据权利要求3所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被肠道外施用、皮下施用、静脉内施用、局部施用、口服施用、经粘膜施用、经直肠施用、经肺施用、经鼻施用或经耳施用。5.根据权利要求3所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被每天、每周、每两周或每月施用。6.根据权利要求1所述的套件,其中所述炎性疾病或病症选自由银屑病,多发性硬化症,风湿性关节炎,骨关节炎,系统性红斑狼疮,桥本甲状腺炎,重症肌无力,糖尿病I或II型,哮喘,炎性肺损伤,炎性肝损伤,炎性肾小球损伤,特应性皮炎,变应性接触性皮炎,刺激性接触性皮炎,脂溢性皮炎,干燥综合征,角结膜炎,葡萄膜炎,炎性肠病,克罗恩病,溃疡性结肠炎,关节、皮肤或肌肉的炎性疾病,急性或慢性特发性炎性关节炎,肌炎,脱髓鞘疾病,慢性阻塞性肺疾病,间质性肺疾病,间质性肾炎和慢性活动性肝炎组成的组。7.PKCα、PKCε或PKCη抑制剂在用于治疗炎性疾病或病症的药物的制造中的用途。8.根据权利要求7所述的用途,其中所述抑制剂是多肽。9.根据权利要求8所述的用途,其中所述多肽长度上在5和20个氨基酸之间。10.根据权利要求9所述的用途,其中所述多肽被肠道外施用、皮下施用、静脉内施用、局部施用、口服施用、经粘膜施用、经直肠施用、经肺施用、经鼻施用或经耳施用。11.根据权利要求9所述的用途,其中所述多肽被以约0.1至约10000微克每千克,优选地约0.1至约1000微克每千克以及更优选地约1.0至约50微克每千克的剂量施用。12.根据权利要求9所述的用途,其中所述多肽被每天、每周、每两周或每月施用。13.根据权利要求7所述的用途,其中所述炎性疾病或病症选自由银屑病,多发性硬化症,风湿性关节炎,骨关节炎,系统性红斑狼疮,桥本甲状腺炎,重症肌无力,糖尿病I或II型,哮喘,炎性肺损伤,炎性肝损伤,炎性肾小球损伤,特应性皮炎,变应性接触性皮炎,刺激性接触性皮炎,脂溢性皮炎,干燥综合征,角结膜炎,葡萄膜炎,炎性肠病,克罗恩病,溃疡性结肠炎,关节、皮肤或肌肉的炎性疾病,急性或慢性特发性炎性关节炎,肌炎,脱髓鞘疾病,慢性阻塞性肺疾病,间质性肺疾病,间质性肾炎和慢性活动性肝炎组成的组。14.一种用于治疗受治疗者体内炎性疾病或病症的套件,所述套件包括:a)PKCδ的活化剂;和b)用于向所述受治疗者施用所述PKCδ的活化剂的说明书。15.根据权利要求14所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被肠道外施用、皮下施用、静脉内施用、局部施用、口服施用、经粘膜施用、经直肠施用、经肺施用、经鼻施用或经耳施用。16.PKCδ的活化剂在用于治疗炎性疾病或病症的药物的制造中的用途。17.根据权利要求16所述的用途,其中所述多肽被肠道外施用、皮下施用、静脉内施用、局部施用、口服施用、经粘膜施用、经直肠施用、经肺施用、经鼻施用或经耳施用。18.根据权利要求16所述的用途,其中所述多肽被以约0.1至约10000微克每千克,优选地约0.1至约1000微克每千克以及更优选地约1.0至约50微克每千克的剂量施用。19.根据权利要求16所述的用途,其中所述炎性疾病或病症选自由银屑病,多发性硬化症,风湿性关节炎,骨关节炎,系统性红斑狼疮,桥本甲状腺炎,重症肌无力,糖尿病I或II型,哮喘,炎性肺损伤,炎性肝损伤,炎性肾小球损伤,特应性皮炎,变应性接触性皮炎,刺激性接触性皮炎,脂溢性皮炎,干燥综合征,角结膜炎,葡萄膜炎,炎性肠病,克罗恩病,溃疡性结肠炎,关节、皮肤或肌肉的炎性疾病,急性或慢性特发性炎性关节炎,肌炎,脱髓鞘疾病,慢性阻塞性肺疾病,间质性肺疾病,间质性肾炎和慢性活动性肝炎组成的组。20.一种用于治疗受治疗者体内瘙痒的套件,所述套件包括:a)PKC的抑制剂;和b)用于向所述受治疗者施用所述PKC抑制剂的说明书。21.根据权利要求20所述的套件,其中所述抑制剂是PKCα、PKCε或PKCη的抑制剂。22.根据权利要求21所述的套件,其中所述抑制剂是多肽。23.根据权利要求3或22所述的套件,其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:1-5、14-19、26、27的氨基酸序列及其生理学上可接受的盐,或者所述多肽选自SEQ ID NO:6-13、20、21、28和29。24.根据权利要求23所述的套件,其中所述多肽包括N端修饰、C端修饰或其组合,优选地,所述多肽是N-酰化的。并且更优选地,所述多肽是N-豆蔻酰化的或N-棕榈酰化的。25.根据权利要求20所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被口服施用。26.根据权利要求3或20所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被以约0.1至约10000微克每千克的剂量施用。27.PKC抑制剂在用于治疗瘙痒的药物的制造中的用途。28.根据权利要求27所述的用途,其中所述抑制剂是PKCα、PKCε或PKCη的抑制剂。29.根据权利要求28所述的用途,其中所述抑制剂是多肽。30.根据权利要求9或29所述的用途,其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:1-5、14-19、26、27的氨基酸序列及其生理学上可接受的盐,或者所述多肽选自SEQ ID NO:6-13、20、21、28和29。31.根据权利要求30所述的用途,其中所述多肽包括N端修饰、C端修饰或其组合,优选地,所述多肽是N-酰化的。并且更优选地,所述多肽是N-豆蔻酰化的或N-棕榈酰化的。32.根据权利要求29所述的用途,其中所述说明书指明所述多肽被口服施用。33.根据权利要29所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被以约0.1至约10000微克每千克的剂量施用。34.一种用于治疗受治疗者体内瘙痒的套件,所述套件包括:a)PKCδ的活化剂;和b)用于向所述受治疗者施用所述PKCδ的活化剂的说明书。35.根据权利要求14或34所述的套件,其中所述抑制剂是多肽。36.根据权利要求35所述的套件,其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:33-30的氨基酸序列及其生理学上可接受的盐,或者所述多肽选自SEQ ID NO:34-37。37.根据权利要求36所述的套件,其中所述多肽包括N端修饰、C端修饰或其组合,优选地,所述多肽是N酰化的。并且更优选地,所述多肽是N豆蔻酰化的或N棕榈酰化的。38.根据权利要求35所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被口服施用。39.根据权利要求35所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被以约0.1至约10000微克每千克的剂量施用。40.根据权利要求35所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被每天、每周、每两周或每月施用。41.PKCδ的活化剂在用于治疗瘙痒的药物的制造中的用途。42.根据权利要求16或41所述的用途,其中所述抑制剂是多肽。43.根据权利要求42所述的用途,其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:33-30的氨基酸序列及其生理学上可接受的盐,或者所述多肽选自SEQ ID NO:34-37。44.根据权利要求43所述的用途,其中所述多肽包括N端修饰、C端修饰或其组合,优选地,所述多肽是N-酰化的。并且更优选地,所述多肽是N-豆蔻酰化的或N-棕榈酰化的。45.根据权利要求42所述的用途,其中所述多肽被口服施用。46.根据权利要42所述的用途,其中所述多肽被以约0.1至约10000微克每千克的剂量施用。47.根据权利要求42所述的用途,其中所述多肽被每天、每周、每两周或每月施用。48.一种由SEQ ID NO:3组成的分离的多肽或者其生理上可接受的盐,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。49.根据权利要求48所述的多肽,其中所述多肽是SEQ ID NO:12。50.一种药物组合物,所述药物组合包含:a)由SEQ ID NO:3组成的多肽或其生理学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的;和b)药学上可接受的载体。51.根据权利要求50所述的药物组合物,其中,所述多肽是SEQ ID NO:12。52.由SEQ ID NO:3组成的多肽或其生理学上可接受的盐在用于治疗炎性疾病或病症的药物的制造中的用途,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。53.根据权利要求52所述的用途,其中所述多肽是SEQ ID NO:12。54.一种包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的分离的多肽或者其生理上可接受的盐。55.根据权利要求54所述的多肽,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。56.根据权利要求54所述的多肽,其中所述多肽是SEQ ID NO:10或13。57.一种药物组合物,所述药物组合包含:a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽或者其生理上可接受的盐;和b)药学上可接受的载体。58.根据权利要求57所述的药物组合物,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。59.根据权利要求57所述的药物组合物,其中所述多肽是SEQ ID NO:10或13。60.包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽或者其生理上可接受的盐在用于治疗炎性疾病或病症的药物的制造中的用途。61.根据权利要求60所述的用途,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。62.根据权利要求60所述的用途,其中所述多肽是SEQ ID NO:10或13。63.一种由选自SEQ ID NO:30-33的氨基酸序列组成的分离的多肽或者其生理上可接受的盐。64.根据权利要求63所述的多肽,其中所述多肽是SEQ ID NO:34-37。65.一种药物组合物,所述药物组合包含:a)由选自SEQ ID NO:30-33的氨基酸序列组成的多肽或者其生理上可接受的盐;和b)药学上可接受的载体。66.根据权利要求65所述的药物组合物,其中,所述多肽是SEQ ID NO:34-37。67.由选自SEQ ID NO:30-33的氨基酸序列组成的多肽或者其生理上可接受的盐在用于治疗炎性疾病或病症的药物的制造中的用途。68.根据权利要求67所述的用途,其中所述多肽是SEQ ID NO:34-37。69.一种用于治疗受治疗者体内多发性硬化症的套件,所述套件包括:a)PKCα、PKCε或PKCη的抑制剂;和b)用于向所述受治疗者施用所述抑制剂的说明书。70.根据权利要求69所述的套件,其中所述抑制剂是多肽。71.根据权利要求70所述的套件,其中所述多肽由选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:26的氨基酸序列及其生理学上可接受的盐组成,或者所述多肽选自SEQID NO:6或SEQ ID NO:28,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。72.根据权利要求70所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被静脉内、皮下或腹膜内施用。73.根据权利要求70所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被以约0.001至约50微克每千克的剂量施用。74.根据权利要求70所述的套件,其中所述说明书指明所述多肽被每天、每周、每两周或每月施用。75.根据权利要求70所述的套件,其中对所述受治疗者的治疗导致减少数目的对比增加的病灶。76.根据权利要求70所述的套件,其中所述受治疗者患有复发-缓解型多发性硬化症或继发进展型多发性硬化症。77.PKCα、PKCε或PKCη的抑制剂在用于治疗多发性硬化症的药物的制造中的用途。78.根据权利要求77所述的用途,其中所述抑制剂是多肽。79.根据权利要求78所述的用途,其中所述多肽由选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:26的氨基酸序列及其生理学上可接受的盐组成,或者所述多肽选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:28,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。80.根据权利要求78所述的用途,其中所述所述多肽被静脉内、皮下或腹膜内施用。81.根据权利要求78所述的用途,其中所述所述多肽被以约0.001至约50微克每千克的剂量施用。82.根据权利要求78所述的用途,其中所述多肽被每天、每周、每两周或每月施用。83.根据权利要求77所述的用途,其中对所述受治疗者的治疗导致减少数目的对比增加的病灶。84.根据权利要求77所述的用途,其中所述受治疗者患有复发-缓解型多发性硬化症或继发进展型多发性硬化症。

说明书

公开内容背景

技术领域

太阳城集团本公开内容一般涉及治疗疾病的方法并且更具体地涉及炎性疾病和病症的治疗。

背景技术

炎症的起始从炎性响应开始并且导致嗜中性粒细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞以及其他免疫细胞的活化。这可导致涉及炎性细胞因子和介质(例如白介素、TNFα和前列腺素)的局部或系统炎性级联。这一复杂的炎性介导的级联触发整体范围的响应,例如细胞趋化和内皮损伤并且导致从天然和获得性免疫系统补充另外的细胞。

皮肤作为机体内和环境之间重要的界限而起作用,防止与可能有害的病原体接触。在抗原/病原体侵入的例子中,炎性响应常常被诱导以除去抗原。这一响应导致主要由T细胞、多形核细胞和巨噬细胞组成的真皮渗入。

炎性响应不是必然与外界刺激相关或者可以由无害的环境物质导致(如果发生过敏)。在这两种情况中,没有适当控制的致炎性细胞因子的过表达导致通常为局部或系统炎症的标志的炎症,以及各种炎性疾病和病症。炎症与各种病症例如湿疹和皮肤炎相关,包括例如特应性皮炎,脂溢性皮炎,出汗障碍性湿疹,钱币状湿疹,瘀滞性皮炎,过敏性皮炎,银屑病,瘙痒症,多发性硬化症,皮肤炎症,瘢痕性类天疱疮,硬皮病,化脓性汗腺炎,中毒性表皮坏死松解症,痤疮,骨炎,移植物抗宿主病(GVHD),坏疽性脓皮症(pyroderma gangrenosum)和白塞氏综合征。

并不意外地,致炎性细胞因子的过量产生与许多炎性和自身免疫性疾病有关联。例如,促进Th17细胞的存活和增殖的细胞因子(例如TNFα和白介素(IL)-23)的分泌与银屑病高度相关,而IL-6除了其作为致炎性细胞因子的一般作用外还是\Th17发育所需要的。其他细胞因子像IL-12和IP-10是引发剂并且参与银屑病和其他自身免疫性疾病的代表性的Th1通路。白介素5(IL-5),增加嗜酸性粒细胞的产生的一种细胞因子,在哮喘中过表达,导致哮喘支气管粘膜中嗜酸性粒细胞的累积(过敏性炎症的标志)。白介素4(IL-4)和白介素13(IL-13)是在炎性肠病和哮喘中存在的平滑肌过度收缩的已知的介质。另外,如下文进一步讨论的,炎性细胞因子已经显示,以实例的方式,与银屑病、多发性硬化症、关节炎、局部缺血、感染性休克和器官移植排斥有关。

相似地,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是粒细胞和巨噬细胞系群落的成熟的调节剂并且已经作为关键因子与许多炎性和自身免疫性疾病相关。例如抑制GM-CSF分泌的抗体已经显示可改善自身免疫性疾病。

因此,如本文中所讨论的,减少致炎性细胞因子分泌和调节免疫调节剂的治疗的开发通常在缓和局部和系统炎症以及许多炎性和/或自身免疫性疾病上是有益的。种种证据指明PKC的同工型的调节剂在获得这些结果上是有用的。

太阳城集团若干项体内研究,通过皮肤相关细胞(例如角质化细胞、树状突细胞和T辅助细胞)作为参与银屑病和其他自身免疫性炎性疾病的发病机制的炎性响应的发展中的关键参与者,已经显示T辅助(Th)17细胞的参与以及细胞因子例如白介素和TNFα的分泌。如本文所用的,体内(“在生物体内”的拉丁文)是使用与部分的或死亡的生物体或者体外(“在玻璃制品内”例如在试管或有盖培养皿中)受控的环境相对的整体的、活的生物体的实验。促进Th17细胞存活和增殖的细胞因子(例如TNFα和白介素(IL)-23)的分泌同样作为这些疾病的关键的主要细胞因子调节剂起作用(Fitch等人(2007)Curr Rheumatol Rep.9:461-7)。反过来真皮中的Th17细胞减少IL-17A和IL-22的分泌。IL-22,特别地,导致角质化细胞过度增殖并且增加银屑病中的炎性响应(Fitch等人(2007)Curr Rheumatol Rep9:461-7)。

蛋白激酶C(PKC)家族代表催化磷酸从ATP向蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基的共价转移的一组磷脂依赖性酶。该家族目前被认为由属于3个不同的类别(其以它们经由钙离子的活化和其他因素为基础)的至少12个单独的同工型组成。PKC家族由至少十个成员组成,通常分为三个亚组:传统的、新型的和非典型的PKC(图1)。特殊的辅助因子需求、组织分布和细胞区室化表明每个同工型的不同的功能和特定信号传递的调谐。因此,特定刺激可通过由它们的因子调节的同工型特定PKC信号导致不同的响应,例如:在特定的生物学背景下的表达、定位和/或磷酸化状态。PKC同工型由各种细胞外信号活化,并且反过来调节细胞蛋白包括受体、酶、细胞骨架蛋白和转录因子的活性。因此,PKC家族在细胞信号处理(包括细胞增殖、分化、存活和死亡的调节)中起到中枢作用。

皮肤中高度富含的PKCα是表皮中主要的常规的Ca2+响应的PKC同工型并且最初仅cPKC在体内和体外的角质化细胞中被检测到(Dlugosz等人(1992)Biomed Pharmacother46:304;Wang等人(1993)J Cancer Res Clin Oncol119:279-287)。因此,PKCα已经被提出作为Ca2+诱导的分化中的关键参与者(Denning等人(1995)Cell Growth Differ6:149-157;Dlugosz等人(1992)Biomed Pharmacother46:304)。在表皮中存在和主要限制于基底上层(Denning 等人(2004)Int J Biochem Cell Biol36:1141-1146),PKCα参与细胞周期的停止并主要与角蛋白细胞骨架和桥粒的细胞-细胞间连接有关(Jansen等人(2001)Int J Cancer93:635-643;Tibudan等人(2002)J Invest Dermatol.119:1282-1289)。因此,当暴露于传统PKC活化剂TPA(12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯)时,棘突的标记被抑制,PKCα被认为很大程度上导致了作为TPA活化的结果的从棘突至粒状分化的转化(Dlugosz和Yuspa(1993)J Cell Biol120:217-225;Lee等人(1998)J Invest Dermatol111:762-766;Matsui等人(1992)J Invest Dermatol99:565-571;Punnonen等人(1993)J Invest Dermatol 101:719-726)。事实上,通过反义寡核苷酸阻滞PKCα活性或其合成似乎消除了粒状标记并且使棘突标记像K1和K10复原。同样,显性负相PKCα的实现似乎复原(晚期)棘突标记外皮蛋白(Deucher等人(2002)J Bio1 Chem 277:17032-17040)。因此,皮肤癌中的不完全的分化(Tennenbaum等人(1993)Cancer Res3:4803-4810;Tomakidi等人(2003)J Pathol200:298-307)与升高的PKCα活性有关,同样在体外肿瘤细胞中观察到(Dlugosz等人(1992)Biomed Pharmacother 46:304;Yang等人(2003)J Cell Physiol.195:249-259)。然而,正常人类角质化细胞中PKCα的过表达未显示改变它们的分化模式(Deucher等人(2002)J Biol Chem277:17032-17040)。PKCα对迁移过程中β1整联蛋白的细胞运输和膜补充的影响(Ng等人(1999)EMBO J 18:3909-3923)可很好地促进伤口表皮细胞再生和肿瘤细胞入侵。

太阳城集团转基因小鼠中PKCα的过表达已经显示减少显著的炎性响应,增加嗜中性粒细胞浸润相关的表皮加厚和浮肿,微型多发性脓肿,和炎性细胞因子和趋化因子(例如TNFα、MIP-2、COX-2或巨噬细胞炎性蛋白(MIP))的显著增加。这些结果将PKCα牵涉到表皮炎性响应中(Wang和Smart(1999)J Cell Sci 112:3497-3506)。用TPA(一种PKCα活化剂)处理似乎导致表皮增生、内表皮的炎症和大量细胞凋亡(Cataisson等人(2003)J Immunol 171:2703-2713;Jansen等人(2001)Int J Cancer93:635-643)。此外,近来PKC同工酶选择性敲除和转基因小鼠中的体内研究显示在免疫系统中各个PKC具有突出不同的功能。这些基因分析,与生化研究一起,似乎表明PKC调节的信号通路在免疫响应的许多方面中起到重要的作用。例如,PKC家族的成员在T细胞信号通路中显得至关重要。特别地,PKCα,同种型似乎决定体内效应子中淋巴细胞特有的性质。PKCα还被讨论参与巨噬细胞活化并且似乎显示参与肥大细胞信号传导(Cataisson等人(2005)J Immunol174:1686-1692)。因此,PKC同种型是获得性免疫中得有效的药物靶。

炎性疾病的一个实例是银屑病。有太阳城集团导致银屑病发展的基本病理的两种主要的假设。第一种认为银屑病主要是皮肤细胞的过度生长和再生的病症。第二种假设认为银屑病是免疫介导的病症,其中皮肤细胞的过度再生对由免疫系统产生的因子来说是继发的。因此,银屑病的大多数药物靶向疾病的一种要素,皮肤细胞的过度增殖状态,或银屑病斑块中存在的皮肤炎性响应。

太阳城集团近来的数据支持两条通路都通过皮肤细胞和免疫环境(包围环境、周围、位置和/或背景)之间的交互作用成为疾病的病理基础的观点。传统基因组连锁分析已经确认了与发育银屑病的趋势有关的不同染色体上的名为银屑病敏感性1至9(PSORS 1至PSORS 9)基因座的九个基因座(基因座(loci))。在这些基因座中,若干个基因被表征并且发现编码在表皮细胞中表达的蛋白,例如角膜连锁蛋白,其在表皮的粒状和角质化层中表达并且在银屑病中被上调。在其他的方面,其他银屑病关联基因编码参与免疫系统的调节的蛋白,其中表征的例如表达白介素-12B的染色体5q上的IL12B(Frank等人(2009)NEngl J Med361:496-509)。

太阳城集团炎性疾病的另一个实例是多发性硬化症(MS)。MS是CNS的慢性并不可预知的炎性疾病,其可影响脑和脊髓(其通常影响青壮年)(Hafler等人(2005)Immunol Rev204:208-31)。其目前被认为是青壮年的最常见的神经系统疾病,并且通常在20和40的年龄之间发作,具有与男性相比以几乎两倍的可能性在女性中出现的趋势。

太阳城集团在MS中,髓鞘,环绕并且保护神经细胞的材料,和/或其用于生产的能力被损害,这被称为“脱髓鞘”。这一损害具有减缓或阻塞脑和身体之间的太阳城集团的影响,导致随MS观察到的症状。脑和/或脊髓中弥散的区域中的脱髓鞘和瘢痕化或其他损伤被认为是所述疾病的特征(Beeton等人(2007)Journal of Visualized Experiments 594-604)。这些损伤似乎在CNS中改变了神经传导并且诱导随脱髓鞘的斑块的位置而变化的致残性神经功能缺损(Beeton等人(2007)Journal of Visualized Experiments 594-604)。其临床征兆和症状是可变的并且取决于其影响的CNS的部分,并且可包括运动、感觉、自律和认知障碍(Noseworthy等人(2000)N Engl J Med 343:938-52)。

太阳城集团MS的一些常见的症状包括:1)不可抗拒的疲倦感;2)平衡-行走和协调困难;3)视觉问题-复视和失明;4)手和脚的麻木和麻刺感;5)疼痛-轻微和严重两种;肌力损失;6)肌肉僵硬和痉挛;7)情绪不稳-抑郁和焦躁;8)记忆障碍和精神不易集中;语言障碍(The National MS Society Web Site)。

进行性残疾是大多数患有MS的患者的命运,尤其是当包括了25年的远景时。一半的MS患者在疾病发作15年内需要拐杖行走。MS是中青年成人中神经功能障碍的主要原因,并且直到最近十年,还没有已知有益的治疗。MS因为非特异性的临床表现而难以诊断,其导致高度结构化的诊断标准的开发,包括若干技术进步,其由MRI扫描、诱发电位和脑脊液(CSF)研究组成。诊断标准通常依赖于在不同太阳城集团发生的中枢白质中的散在病灶(scattered lesions)并且没有被其他病因学例如传染、血管病症或自身免疫性病症解释的一般原则。

MS被广泛认为是一种自身免疫性疾病,由此,未知的一种或多种试剂触发T细胞介导的炎性发作,导致CNS(中枢神经系统)组织的脱髓鞘(Weiner等人(2004)Arch Neurol 61:1613-1615)。自身免疫性反应靶向髓磷脂的证据有力但是不是决定性的。有例如在淋巴细胞或髓磷脂吞噬不存在的情况下早期多发性硬化损伤中伴随小神经胶质细胞活化的原发少突胶质细胞凋亡的描述(Manuel等人(2006)Brain)。

MS被典型地报道为具有四种疾病模式:复发-缓解型MS(RRMS)、原发进展型MS(PPMS)、进展复发型多发性硬化症(PRMS)和继发进展型MS(SPMS)。估计50%患有RRMS的患者将在10年内发展SPMS,而高达90%的RRMS患者将最终发展SPMS。疾病的每种模式可表表现为轻微、中等或严重。患有RRMS的人表现出确定的恶化的神经机能的发作。这些发作之后是部分或完全的恢复期(缓和),期间不发生疾病发展,(约85%的人最初诊断患有RRMS)。PPMS由从开始缓慢恶化的神经机能表征,没有明显的复发或缓解(约10%的人被诊断为PPMS)。在SPMS中,在RRMS的初始期之后,许多人发展继发进展型疾病过程,其中疾病更加稳定地恶化(约50%的患有RRMS的人在10年内发展这一形式的疾病)。在PRMS中,人们从开始经历稳定恶化的疾病症状,但过程中伴有恶化的神经机能的清楚的发作,同时疾病似乎进行而没有缓解(5%)(The National MS Society web site)。

尽管试图减少疾病活性和疾病进展的若干种治疗是可获得的但是目前没有对于MS的治愈。四类六种药物在美国被批准用于治疗MS。FDA批准的疾病治疗包括下列:干扰素类、IIFN-β-1a(和)和IIFN-β-1b乙酸格拉默(一种多肽)、那他珠单抗和米托蒽醌(一种细胞毒素剂)。其他药物已经被使用,具有不同程度的成功,包括糖皮质激素、甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、静脉注射用(IV)免疫球蛋白。现有的批准的治疗的好处是在MS中相对缓和复发速度和防止残疾。

(干扰素β1a)是由生物技术工艺(其产生与人体中存在的相同的干扰素β)制造的药物。据报道每周皮下给药三次(来自FDA批准的的处方太阳城集团)。

(干扰素β1a)是由生物技术工艺(其产生与人体中存在的相同的干扰素β)制造的药物。据报道每周肌肉注射一次(来自FDA批准的的处方太阳城集团)。

(干扰素β1b)是由生物技术工艺(其补充与人体中存在的相同的干扰素β)制造的药物。据报道每隔一天皮下注射(来自FDA批准的的处方太阳城集团)。

(乙酸格拉默)是模拟髓磷脂碱蛋白的合成蛋白。尽管机制没有完全了解,但这一药物似乎通过作为髓磷脂诱饵起作用来阻止髓磷脂损害T细胞。据报道每天皮下注射一次(来自FDA批准的的处方太阳城集团)。

太阳城集团 (那他珠单抗)是实验室生产的单克隆抗体。它被设计以阻碍来自血液的可能有害的免疫细胞从血流,穿过“血脑屏障”进入脑和脊髓的运动。据报道每四周通过静脉输液给药一次(来自FDA批准的约处方太阳城集团)。

(米托蒽醌)属于称为抗肿瘤剂的普通组药物。它已经被用于治疗某些形式的癌症。它据报道通过抑制T细胞、B细胞和巨噬细胞(它们被推定会导致攻击髓鞘)的活性在MS治疗中起作用。(来自FDA批准的的处方太阳城集团)。

太阳城集团现有的对于组合炎性疾病的治疗通常不能提供靶向发病机制的多个要素的多要素方法。例如,对于自身免疫性疾病的许多治疗包括靶向疾病的单一要素,通过阻止细胞增殖或通过抑制免疫响应以阻止炎症。因此,有对于提供通过靶向并调节PCK同工型活性来靶向炎性疾病发病机制的多个要素的有效治疗的强烈需要。能够选择性抑制或活化特定PKC同工型的特异性靶向的治疗是必需的,并且将提供靶向炎性疾病发病机制的多个要素的治疗方法,同时保持低水平的副作用,例如当局部施用时。因此,如本文所讨论的,减少致炎性细胞因子的分泌和/或通过PKC同工型调节剂控制免疫调节剂的治疗的开发将在缓和一般局部和系统的炎症以及许多炎性和/或自身免疫性疾病上是有益的。

发明内容

太阳城集团本公开内容涉及治疗通过向受治疗者施用PKC的调节剂例如PKCε或PKCη的抑制剂或PKCδ的活化剂来治疗炎性疾病和病症。

太阳城集团因此,在一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内炎性疾病或病症的方法。所述方法包括向受治疗者施用PKC的抑制剂,由此治疗受治疗者体内的炎性疾病或病症。在示例性的实施方案中,所述抑制剂是选择性地抑制PKCα、PKCε或PKCη的多肽,例如SEQ ID NO:1-29的多肽。

在另一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内炎性疾病或病症的方法。所述方法包括向受治疗者使用PKCδ的活化剂,由此治疗受治疗者体内的炎性疾病或病症。在不同的实施方案中,所述活化剂是选择性地活化PKCδ的多肽,例如SEQ ID NO:30-37的多肽。

在另一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内瘙瘁症的方法。所述方法包括向受治疗者施用PKC的抑制剂,由此治疗受治疗者体内的瘙瘁症。在不同的实施方案中,所述抑制剂是PKCα、PKCε或PKCη的抑制剂。在示例性的实施方案中,所述抑制剂是选择性地抑制PKCα、PKCε或PKCη的多肽,例如SEQ ID NO:1-29的多肽。

太阳城集团在另一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内瘙瘁症的方法。所述方法包括向受治疗者施用PKCδ的活化剂,由此治疗受治疗者体内的瘙瘁症。在不同的实施方案中,所述活化剂是选择性地活化PKCδ的多肽,例如SEQ ID NO:30-37的多肽。

在另一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内多发性硬化症的方法。所述方法包括向受治疗者施用PKCα、PKCη、PKCε或PKCε的抑制剂,由此治疗受治疗者体内的多发性硬化症。在示例性的实施方案中,所述抑制剂是选择性地抑制PKCα或PKCη的多肽,例如SEQ ID NO:1-13和26-29的多肽。

在不同的方面中,本公开内容提供用于进行本公开内容的方法的套件。在一个实施方案中,所述套件包括PKC的抑制剂,例如PKCα、PKCε或PKCη的抑制剂或PKCδ的活化剂,以及施用所述抑制剂或活化剂的说明书。

太阳城集团在另一个方面中,本公开内容提供SEQ ID NO:3的分离的多肽或者其生理上可接受的盐,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。示例性的实施方案中,所述多肽是SEQ ID NO:12。

太阳城集团本公开内容还提供了包含SEQ ID NO:3的多肽或其生理学上可接受的盐和药学上可接受的载体的药物组合物,其中所述多肽是N-豆蔻酰化的。

在另一个方面中,本公开内容提供包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的分离的多肽或其生理学上可接受的盐。在示例性的实施方案中,所述分离的多肽是SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13的多肽。

本公开内容还提供了包括分离的多肽(其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列)或其生理学上可接受的盐的药物组合物。

在另一个方面中,本公开内容提供选自SEQ ID NO:30-33的分离的多肽或其生理学上可接受的盐。在示例性的实施方案中,所述分离的多肽是SEQ ID NO:34-37的多肽。

本公开内容还提供了包括分离的多肽(其包含SEQ ID NO:30-33的氨基酸序列)或其生理学上可接受的盐的药物组合物。

附图说明

图1是描述同工型的PKC家族的不同成员的图像表示。

图2是描述调节表征银屑病的角质化细胞结构完整性的PKCα的抑制的一系列图像表示。皮肤组织被石蜡包埋并且用苏木精和曙红(H&E)一般组织学染料或用于各种皮肤层的不同标记(包括用于基底层的角蛋白14(K14)、用于棘层的角蛋白1(K1),用于角质化细胞迁移的角蛋白6(K6)和用于角质化细胞增殖的PCNA)染色。结果证实PKCα抑制之后皮肤性质的正常化(左列是野生型(WT),右列是PKCα敲除)。

图3是用IMQ治疗后将在不同的敲除的小鼠中的起鳞的严重度与对照相比较的直方图。

太阳城集团图4是显示用IMQ治疗后与对照相比较敲除小鼠中起鳞的一系列图像表示。

太阳城集团图5是显示丝聚蛋白(Fil)、兜甲蛋白(Lor)和角蛋白1(K1)的表达的一系列图像表示。

图6A-B是体外和体内评估角质化细胞增殖的一系列图像和图解表示。图6A是显示PCNA表达的图像表示。图6B是将用HO/02/10处理的PCNA阳性细胞的百分比与对照比较的直方图。

图7是显示丝聚蛋白(Fil)、兜甲蛋白(Lor)、角蛋白1(K1)、PCNA和角蛋白14(K14)的表达的一系列图像表示。

图8是显示不同肽PKCα抑制剂的角质化细胞中蛋白表达数据的概述的图解表示。

图9是将用HO/02/10处理的皮肤样品的破裂压力与对照比较的直方图。

太阳城集团图10是比较对受伤后4和9天后B57BL/6J小鼠体内HO/02/10对皮肤伤口的抗炎效果的直方图。

图11是比较用HO/02/10处理的脾细胞中的细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图12是显示在皮肤的血管中的基底角质化细胞和上皮细胞中ICAM表达的一系列图像表示。

图13是显示在皮肤的血管中的基底角质化细胞和上皮细胞中ICAM表达的一系列图像表示。

图14是比较在伤口边缘显示阳性ICAM-1染色的小鼠的百分比的直方图。

太阳城集团图15是比较Iba-1阳性染色细胞的每个域中细胞数目的直方图。

图16A-B是显示角质化细胞中MAC-2表达的一系列图像和图解表示。图16A是显示MAC-2表达的一系列染色。图16B是将MAC-2阳性染色细胞的每个域中细胞数目与对照比较的直方图,每mL1、10和100微克P KCα抑制剂(从左边)。

太阳城集团图17A-D是比较在用HO/02/10处理的LPS活化的角质化细胞中的细胞因子分泌的一系列直方图。图17A比较IL-6、IL-1α,和GM-CSF的分泌。图17B比较G-CSF的分泌。图17C比较MIP-2的分泌。图17D比较KC的分泌。

太阳城集团图18A-C是比较在用HO/02/10处理的LPS活化的巨噬细胞中的细胞因子分泌的一系列直方图。图18A比较G-CSF、KC和MIP-2的分泌。图18B比较IL1α(直方图对的左边)和TNFα(直方图对的右边)的分泌。图18C比较IL1β(直方图对的左边)和IL12(直方图对的右边)的分泌。

图19是比较用肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图20是比较用肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图21A-B是比较用肽PKCα抑制剂处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。图21A比较ILIA的分泌。图21B比较IL-6的分泌。

太阳城集团图22A-B是比较用肽PKCα抑制剂处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。图22A比较G-CSF的分泌。图22B比较GM-CSF的分泌。

图23A-B是比较用肽PKCα抑制剂处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。图23A比较MIP-2的分泌。图23B比较IP-10的分泌。

太阳城集团图24A-B是比较用肽PKCα抑制剂处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。图24A比较IL-1A的分泌。图24B比较IL-6的分泌。

太阳城集团图25A-B是比较用肽PKCα抑制剂处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。图25A比较TNFα的分泌。图25B比较IP-10的分泌。

太阳城集团图26A-B是比较用肽PKCα抑制剂处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。图26A比较G-CSF的分泌。图26B比较GM-CSF的分泌。

太阳城集团图27A-B是比较用肽PKCα抑制剂处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。图27A比较KC的分泌。图27B比较MIP-2的分泌。

图28是显示用HO/02/10处理之后炎性阶段期间T细胞向真皮和表皮的渗入的下调的一系列图像和图解表示。图28A是使用抗CD3抗体的一系列染色。

太阳城集团图28B是对CD3阳性染色细胞的每个域中的细胞的数目比较的直方图。

太阳城集团图29是显示使用肽PKCα抑制剂MPDY-1的处理对不同细胞类型的效果的概述的图解表示。

太阳城集团图30是显示HO/02/10对银屑病相关通路的整体效果的概要的图解表示。

图31A-B是显示用HO/02/10处理之后炎性阶段期间嗜中性粒细胞向真皮和表皮的渗入的下调的一系列图像和图解表示。图31A是使用嗜中性粒细胞特异性抗体的染色。图31B是比较嗜中性粒细胞特定阳性染色细胞的每个域中的细胞的数目的直方图。

图32是用Ser176/180抗体染色的SDS PAGE的图像表示。

图33是显示随处理的太阳城集团过程的EAE得分的图解表示。

太阳城集团图34是显示随处理的太阳城集团过程的EAE得分的图解表示。

太阳城集团图35是显示随处理的太阳城集团过程的EAE得分的图解表示。

太阳城集团图36是显示随处理的太阳城集团过程的EAE得分的图解表示。

太阳城集团图37是显示随处理的太阳城集团过程的EAE得分的图解表示。

图38是用于点刺试验模型以评估MPDY-1对瘙瘁症的效果的组胺的作用机制的图像表示。

太阳城集团图39是显示用组胺注射并且用或不用MPDY-1处理的受治疗者的前臂的图像表示。

图40是显示用组胺注射并且用或不用MPDY-1处理的受治疗者的前臂的图像表示。

太阳城集团图41是显示用组胺注射并且用或不用MPDY-1处理的受治疗者的前臂的图像表示。

图42是显示用组胺注射并且用或不用MPDY-1处理的受治疗者的前臂的图像表示。

太阳城集团图43是在PKCα抑制剂MPDY-1和PKCδ活化剂DAP-1(SEQ ID NO:34)的体外免疫测试中收集的数据的表(未显示所有数据)。

图44是在用TNFα和抑制剂处理的角质化细胞中细胞因子分泌的PKCδ活化剂DAP-1(SEQ ID NO:34)的结果的列表概述。

太阳城集团图45是显示比较用LPS或TNFα和不同PKCε抑制剂处理的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图46是显示比较用LPS或TNFα和不同PKCε抑制剂处理的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图47是显示比较用LPS或TNFα和不同PKCε抑制剂处理的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图48是显示比较用LPS或TNFα和不同PKCε抑制剂处理的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图49是在用LPS或TNFα和抑制剂处理的角质化细胞中细胞因子分泌的各种PKCε抑制剂的结果的列表概述。

太阳城集团图50是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图51是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图52是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图53是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图54是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图55是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图56是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图57是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图58是比较用包括MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO.7)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ ID NO:9)和PPDY(SEQ ID NO:10)的肽PKCα抑制剂处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图59是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图60是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图61是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图62是比较用肽PKCα抑制剂AWOT-1(SEQ ID NO:7)处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图63是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图64是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图65是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图66是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图67是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图68是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图69是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图70是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的TNFα活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图71是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图72是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图73是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图74是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图75是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图76是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图77是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图78是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和AIP-2(SEQ ID NO:8)处理的IL-17A活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

太阳城集团图79是比较用肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)和PDY-1(SEQ ID NO:13)处理的LPS活化的角质化细胞中细胞因子分泌的直方图。

图80是用LPS、TNFα或IL-17A和抑制剂处理的角质化细胞中细胞因子分泌的不同的PKCα抑制剂的结果的列表概述。

具体实施方式

本公开内容是以PKC同工型的调节剂可作为对炎性疾病和病症的有效治疗施用的原始发现为基础的。PKC同工型参与皮肤细胞以及免疫系统的许多组件的主要细胞过程使得它成为治疗炎性病理的可能的靶。本文显示的数据,证实PKC家族同工型调节与炎症和炎性疾病有关的皮肤和免疫细胞中的活化过程。

太阳城集团应当理解的是这一公开内容不限于所描述的特定的组合物、方法和实验条件,像这样的方法和条件可以变化。还应当理解的是本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的而并非旨在限制,本公开内容的范围将仅限于所附的权利要求。

太阳城集团参照附图和所附的描述可更好的理解根据本公开内容的方法的原理和操作。

如本说明书和所附的权利要求中所使用的,除非上下文明确指出,单数形式的名词和“该”包括复数引用。因此,例如,对“该方法”的引用包括一种或多种方法和/或当阅读本公开内容等时对于本领域中的那些技术人员来说显而易见的本文描述的类型的步骤。

除非另外说明,本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属的领域中一名技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料可被用于本公开内容的实行或测试,但现在描述一些优选的方法和材料。

如本文所用的,术语“受治疗者”是指哺乳动物受治疗者。就此而论,预想哺乳动物的目中的任何动物的治疗。这些动物包括但不限于马、猫、犬、兔、小鼠、山羊、绵羊、非人类灵长类和人类。因此本公开内容的方法预期在兽医学应用以及人类用途中使用。

本文中受治疗者的“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施两者。需要治疗的那些包括已经患有炎性疾病或病症的那些以及其中炎性疾病或病症有待被预防的那些。因此,受治疗者可以已经被诊断患有炎性疾病或病症或可以对炎性疾病或病症易感染或敏感。

太阳城集团如本文所用的,“炎性疾病或病症”预期包括具有与PKC家族同工型调节有关的病因学的任何疾病和病症。这些疾病包括但不限于瘙瘁,皮肤炎症,银屑病,多发性硬化症,风湿性关节炎,骨关节炎,系统性红斑狼疮,桥本甲状腺炎,重症肌无力,糖尿病I或II型,哮喘,炎性肺损伤,炎性肝损伤,炎性肾小球损伤,特应性皮炎,变应性接触性皮炎,刺激性接触性皮炎,脂溢性皮炎,干燥综合征,角结膜炎,葡萄膜炎,炎性肠病,克罗恩病,溃疡性结肠炎,关节、皮肤或肌肉的炎性疾病,急性或慢性特发性炎性关节炎,肌炎,脱髓鞘疾病,慢性阻塞性肺疾病,间质性肺疾病,间质性肾炎和慢性活动性肝炎。

太阳城集团炎性疾病或病症的“症状”是受治疗者经历的并且指示炎性疾病或病症的的任何病态的现象或在结构、功能或感觉上从正常的偏离。

太阳城集团表达“有效的量”是指对预防、缓解或治疗炎性疾病或病症有效的PKC同工型的抑制剂或活化剂(例如SEQ ID NO:1-37的多肽)的量。这些有效的量通常将导致炎性疾病或病症的征象、症状和/或其他指示的改善。例如,在皮肤炎症中,有效的量导致肿胀和/或炎症的减少和/或发红的清除。对于瘙瘁症,有效的量可导致发红和/或瘙瘁的清除。对于MS,有效地量可导致减少复发率、预防残疾、减少脑MRI损伤的数目和/或体积,改善25步定时行走、延长疾病进行的太阳城集团等等。

如本文所用的,本文所用的术语“PKC同工型”涵盖所有的PKC同工型,包括PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCε、PKCη、PKCCζ、PKCγ、PKCθ和PKCλ。

短语“调节PKC同工型的表达和/或活性”涉及增加或减少PKC同工型的表达和/或活性。表达的增加导致PKC同工型的产生增加。

太阳城集团本文中术语“活化剂”被用于描述增加PKC同工型的表达和/或活性的分子。本文中术语“抑制剂”被用于描述抑制PKC同工型的表达和/或活性的分子。除了别的之外,磷酰基转移区、假底物结构域、佛波酯结合序列和磷酸化位点可以是用于调节同工酶特异性PKC活性的靶。

PKC同工型的“假底物区”或自体抑制结构域本文中被定义为实质上不具有可磷酸化的残基的激酶的底物的共有序列。假底物结构域位于调节区,与底物识别基序十分相似,其封闭识别位点并且防止磷酸化。因此PKC同工型的抑制性肽(例如本公开内容的多肽)通过用丙氨酸(A)替代丝氨酸(S)或苏氨酸(T)的可磷酸化的残基来获得。PKCδ是已知的具有能够使同工型在C2结构域、PKCδ的保守结构域2上活化的另外的结合位点的仅有的PKC同工型。

太阳城集团PKC是调节角质化细胞增殖、迁移和分化的主要的信号通路。已知许多PKC同工型在皮肤组织中表达并且它们的表达/活性似乎在细胞增殖和/或细胞迁移和/或细胞分化中起作用。然而,特异性地调节它们的表达和活性以实行炎性疾病的治疗是之前未知的并且在本公开内容中被证实。

太阳城集团总之,本文显示的结果证实调节不同PKC同工型的表达和/或活性在炎症和炎性疾病的治疗中是有效的。

太阳城集团因此,在一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内炎性疾病或病症的方法。所述方法包括向受治疗者施用PKC的抑制剂,由此治疗受治疗者体内的炎性疾病或病症。在示例性的实施方案中,所述抑制剂是选择性地抑制PKCα、PKCε或PKCη的多肽,例如SEQ ID NO:1-29的多肽。

如实施例中所公开的,PKC同工型抑制剂的施用已经显示在各种不同的皮肤细胞类型(不仅仅是皮肤细胞,即在其他组织中存在并且有活性的巨噬细胞)中减少致炎性细胞因子、趋化因子和Th1细胞因子的分泌。此外,PKC同工型的施用减少活化的因子(例如角质化细胞和内皮细胞上的ICAM-1和巨噬细胞上的mac-2)的表达。此外,PKCα抑制剂已经发现在皮肤炎症的治疗中有效并且使银屑病的炎性皮肤模型中的炎性症状减弱。如实施例中所进一步讨论的,PCK同工型的抑制剂的作用的机制已经被阐明,显示它们作为对炎性疾病和病症的有效治疗的用途。例如,PCK同工型的肽抑制剂已经显示:1)通过减少终末分化使表皮分化标记表达正常化;2)减弱不正常的过度增殖;3)调节皮肤结构并增加皮肤强度;和/或4)如所概述的,通过在炎性过程的不同步骤中差别地影响不同细胞类型的补充和活化下调炎症,例如,图30中。

同样,如实施例中所公开的,PKCδ的活化剂同样已经显示减少各种不同皮肤细胞类型中致炎性细胞因子的分泌。因此,在另一个方面中,本公开内容通过向受治疗者施用PKCδ的活化剂,由此治疗受治疗者体内炎性疾病或病症,提供了治疗受治疗者体内炎性疾病或病症的方法。在不同的实施方案中,活化剂是选择性地活化PKCδ的多肽,例如SEQ ID NO:30-37的多肽。

太阳城集团此外,如实施例中所公开的,PKCα抑制剂和PKCη抑制剂的施用已经发现减弱MS的症状。同样地,在另一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内多发性硬化症的方法。所述方法包括向受治疗者施用PKCα或PKCη的抑制剂,由此治疗受治疗者体内的多发性硬化症。

太阳城集团此外,PKC同工型抑制剂的施用已经发现在瘙痒症的治疗中有效。同样地,在另一个方面中,本公开内容提供治疗受治疗者体内瘙瘁症的方法。所述方法包括向受治疗者施用PKC的抑制剂,由此治疗受治疗者体内的瘙瘁症。

实施例和附图显示表明PKCδ的活化剂抑制主要致炎性细胞因子(例如IL-1,IL-6和TNFα)分泌的能力的数据。多种PKC同工型抑制剂显示相似的数据,包括PKCα,PKCε和PKCη。如实施例中所示,包含本公开内容的PKC抑制剂和活性剂的制剂,已经显示抑制主要致炎性细胞因子的分泌。就瘙痒症而言,不受特定理论的限制,人们相信,减少致炎性剂的水平防止了附近血管中内皮细胞的活化,并因此向银屑病斑块补充嗜中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞。而且,TH1和Th17细胞显示通过特定细胞因子的分泌而与银屑病的发病机制有关联,其似乎分别增强炎症或促使角质化细胞过量增殖。上文提及的促炎性细胞因子对于这些Th17细胞的发育(Mangan等人(2006)Nature 441:231-234;Bettelli等人(2006)Nature 441:235-238)和Th1细胞活性来说是必需的。经由PKC抑制剂和活化剂降低它们的分泌显示它们在炎性病症和银屑病的有效治疗中的用途。

在不同的实施方案中,PKC同工型的抑制剂是PKC的假底物区的抑制剂并且是多肽,而PKC同工型的活化剂同样是多肽。术语“多肽”、“肽”或“蛋白”在本文可交换使用,以指明一系列彼此通过相邻残基的α氨基和羧基基团之间的肽键连接的线性氨基酸残基。

太阳城集团在不同的实施方案中,可使用的肽PKC活化剂和抑制剂的实例包括但不限于如表1中所示的SEQ ID NO:1-5、14-19、26、27和30-33的肽或其生理学上可接受的盐,以及显示具有特定的修饰或末端的保护基团的表1的SEQ ID NO:6-13、20-25、28、29、34-37的肽。

表1:PKC同工型抑制剂和活化剂肽

太阳城集团在不同的实施方案中,肽PKC抑制剂或活化剂通常包含6和12个之间的氨基酸,但是在长度上可以更长或更短。在不同的实施方案中,肽PKC抑制剂或活化剂长度上可在6至45、6至40、6至35、6至30、6至25、6至20、6至15,或6至10个氨基酸的范围内。在一个实施方案中,肽包括6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。

在不同的实施方案中,肽PKC抑制剂活化剂可以是N-酰化的,优选地被来自C12-C20脂肪酸的酰基基团(例如C14酰基(豆蔻酰基)或C16酰基(棕榈酰基))酰化。

通常,肽PKCα抑制剂包括常见的基序序列Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala(SEQID NO:1)。可选择地,在另一个实施方案中,PKCα抑制剂包括常见的基序序列Thr-Leu-Asn-Pro-Gln-Trp-Glu-Ser(SEQ ID NO:5)。

太阳城集团当通过确切的序列或基序序列定义肽PKC抑制剂和活化剂时,所属领域技术人员将理解,具有相似序列的肽可具有相似的功能。因此,具有基本上相同的序列或具有与表1中的PKC抑制剂或活化剂基本上同一或相似序列的肽会被涵盖。如本文所使用的,术语“基本上相同的序列”包括一类肽,所述肽包含与SEQ ID NO:1-37定义的序列具有至少60+%(意指百分比六十或更高),优选地70+%,更优选地80+%和最优选地90+%、95+%或98+%的序列同一性,并且抑制或活化PKC同工型活性。

两个多肽是基本上同一的进一步的指示是一条肽与第二条肽免疫交联反应。因此,当例如两条肽仅因保守取代而不同时,多肽通常与第二条多肽基本上同一。

就蛋白或肽而言,术语“保守取代”用于反映基本上没有改变分子活性(例如抗微生物活性)的氨基酸取代。通常保守的氨基酸取代包括一种氨基酸取代具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的另一种氨基酸。下列六组每组包含彼此为典型的保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)苏氨酸(T);2)天门冬氨酸(D)谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。

太阳城集团术语“氨基酸”以其最广义被使用,包括天然存在的氨基酸以及包含氨基酸类似物的非天然存在的氨基酸。由这一广义来看,所属领域的技术人员将知道本文对氨基酸的引用包括,例如天然存在的成蛋白的(L)-氨基酸、(D)-氨基酸、化学修饰的氨基酸例如氨基酸类似物、天然存在的非成蛋白的氨基酸例如正亮氨酸,和具有本领域中已知为氨基酸的特征的性质的化学合成的化合物。如本文所用的,术语“成蛋白的”表明氨基酸可通过代谢途径掺入细胞中的蛋白中。

太阳城集团在两条多肽序列的情况下,术语“同一性”或百分比“同一性”是指,如使用序列比对算法或通过目测测量,当以最大一致性比较和比对时,相同或者具有特定的百分比的相同的氨基酸残基的两条或更多条序列或子序列。

太阳城集团短语“基本上同一的”在两个多肽的情况下是指,如使用序列比对算法或通过目测测量的,当以最大一致性比较和对比时,具有至少60+%,优选地80+%,最优选地90-95+%的氨基酸序列同一性的两条或更多条序列。

如本领域中熟知的,例如可通过Smith & Waterman((1981)Adv Appl Math2:482)的局部同源性算法,通过Needleman & Wunsch((1970)J Mol Biol48:443)的同源性比对算法,通过Pearson & Lipman((1988)Proc Natl Acad Sci USA85:2444)的对相似性方法的探索,通过经由目测的这些算法的计算机实现,或其他有效的方法,进行用于比较的序列的最佳比对。

肽PKC抑制剂或活化剂可具有修饰的氨基酸序列或非天然存在的末端修饰。对肽序列的修饰可包括,例如氨基酸的加入、缺失或取代,条件是通过这些修饰产生的肽保留PKCα抑制活性。另外,肽可以具有游离末端或具有氨基保护(例如N-保护的)和/或羧基保护(例如C-保护的)末端的结构式存在。保护基团包括:(a)芳香族聚氨酯类保护基团,其包括苄氧羰基、2-氯代苄氧羰基、9-芴甲氧羰基、异烟肼氧羰基和4-甲氧基苄氧羰基;(b)脂肪族聚氨酯类保护基团,其包括叔丁氧羰基、叔戊氧羰基、异丙氧基羰基、2-(4-联苯基)-2-丙氧羰基、烯丙氧基羰基和甲基磺酰基乙氧基羰基(methylsulfonylethoxycarbonyl);(c)环烷基聚氨酯类保护基团,其包括金刚烷氧羰基、环戊氧羰基、环己氧羰基、异冰片氧基羰基;(d)酰基保护基团或磺酰基保护基团。另外的保护基团包括苄氧羰基、叔丁氧羰基、乙酰基、2-丙基戊酰基、4-甲基戊酰基、叔丁基乙酰基、3-环己基丙酰基、正丁烷磺酰基、苄基磺酰基、4-甲基苯磺酰基、2-萘磺酰基、3-萘磺酰基和1-樟脑磺酰基。

在不同的实施方案中,肽PKC同工型抑制剂和活化剂可通过任何适合的方式施用,包括局部的、肠胃外的、皮下的、腹膜内的、肺内的、鼻内的、静脉内的和/或病灶内的施用,以便治疗受治疗者。然而,在示例性的实施方案中,肽被配制用于局部施用,例如以液体、霜剂、凝胶、软膏、泡沫喷雾等等。

通过例如将具有所期望的纯度的PKC同工型抑制剂或活化剂与任选地药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂(参见,例如Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药学),第16版,Osol,A编辑(1980))混合来制备根据本公开内容使用的PKC同工型抑制剂或活化剂的治疗制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂是在所使用的剂量和浓度对受体是无毒性的,并且可包括缓冲液例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸;抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵,氯己双铵,氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵,苯酚、丁基或苄基醇,对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯,儿茶酚,间苯二酚,环己醇,3-戊醇和间甲酚);低分子量(小于约10个残基)多肽;蛋白,例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、双糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂例如EDTA;糖类例如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇;成盐反离子,例如钠;金属配合物(例如,锌-蛋白复合物)和/或非离子表面活性剂,例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

太阳城集团在示例性的实施方案中,PKC同工型抑制剂或活化剂是以霜剂配制的。因为PKC酶的活性,PKC同工型的抑制剂和活化剂对于皮肤炎症和其他炎性疾病的局部治疗来说是理想的,可被特异地靶向。特定的PKC酶的抑制或活化通过以较低的浓度选择性地调节PKC同工型而不影响其它的PKC同工型的能力来获得。

局部施用的示例性的制剂公开于实施例4中,其中肽MPDY-1(SEQ ID NO:6)被配制为用于局部施用的霜剂。然而,本领域技术人员应当理解的是可进行制剂的变化而保留霜剂的必需的特征,例如粘度、稳定性、非毒性等等。同样,本领域技术人员应认可的是制剂可被用作本公开内容的肽PKC抑制剂或活化剂中的任一种的载体。

太阳城集团在另一个实施方案中,制品,例如包含对实行本公开内容的治疗方法有用的材料的套件被提供。在不同的实施方案中,所述套件包括PKC同工型活化剂或抑制剂,即如本文所公开的肽PKC同工型抑制剂或活化剂,和用于向受治疗者施用所述活性剂或抑制剂的说明书。

太阳城集团术语“说明书”或“包装说明书”用来意指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书,其包含太阳城集团适应征、用法、剂量、施用、禁忌症、与所述包装的产品组合的其他治疗产品和/或太阳城集团使用这些治疗产品的警告等等的太阳城集团。

如本文所公开的,PKCα的抑制剂可被配制用于施用的特定路线。像这样,套件可包括一种制剂,所述制剂含有被包含在适当容器(例如,诸如管、瓶、管形瓶、注射器等等)中的PKCα的抑制剂。所述容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。所述容器装有或含有对治疗炎性疾病有效的组合物,并且可具有无菌的存取口(例如所述容器可以是静脉用溶液袋或具有可被皮下注射针头穿刺的塞子的管型瓶)。所述制剂中的至少一种组分是PKC同工型的抑制剂或活化剂。标签或包装说明书指示,所述组合物按照太阳城集团给药的量和间隔的特别指导用于治疗遭受炎性疾病痛苦的受治疗者体内的炎性疾病来提供包括PKC同工型的抑制剂或活性剂的制剂。所述制品可进一步包括从商业和使用者立场所期望的其他材料,包括其他的缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。

应当理解的是,对于需要治疗的任何特定的受治疗者给药的特定的剂量水平和频率可变化,并且将取决于各种因素,包括所使用的PKC同工型抑制剂或活化剂的活性、所述化合物的新陈代谢稳定性和作用的长度、年龄、体重、健康情况、性别、饮食、施用的方式和太阳城集团、特定病况的严重度和经历治疗的宿主。然而通常,剂量将大约为对于特定PKC同工型抑制剂或活化剂的施用的已知方法来说是典型的。本领域的技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。确切的制剂和剂量可由各个医师考虑患者的病况而选择((Fingl等人"The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗的药理学基础)",第1章,第1页(1975))。

因此,根据待被治疗的病况的严重度和反应性,给药可以是单次或重复的施用,伴随持续几天至几星期的治疗的过程或直到实现治愈或获得病症的减少。

在不同的实施方案中,当PKC同工型抑制剂或活化剂是肽时,以在组合物中0.001μg/ml和100μg/ml之间的浓度提供所述肽。例如,浓度可以在0.001μg/ml和100μg/ml、0.01μg/ml和50μg/ml、0.01μg/ml和10μg/ml、0.01μg/ml和1μg/ml以及0.01和0.5μg/ml之间。

太阳城集团在一个给药程序中,所述方法包括局部地向受治疗者施用肽PKC同工型抑制剂或活化剂,例如作为霜剂。所述肽以从约1μg/ml至约1000μg/ml、1μg/ml至约500μg/ml、1μg/ml至约100μg/ml、1μg/ml至约10μg/ml或者10μg/ml至约100μg/ml的浓度局部应用。每天至少施用一次所述肽直到病况被治疗。

在另一个给药程序中,所述方法包括向受治疗者经肠道外施用、皮下施用或静脉内施用肽PKC同工型抑制剂或活化剂。所述肽以从约1μg/ml至约1000μg/ml、1μg/ml至约500μg/ml、1μg/ml至约100μg/ml、1μg/ml至约10μg/ml或者10μg/m1至约100μg/ml的浓度应用。至少每天、每周、每两周或每月一次施用所述肽直到病况被治疗。

提供下列实施例以进一步说明本公开内容的实施方案,但是并不意为限制范围。尽管它们是可被使用的那些中的典型,但是可替代地使用本领域技术人员已知的其他操作、方法或技术。

实施例1

太阳城集团 PKCα的抑制调节表征炎性皮肤病症银屑病的角质化细胞结构完整性

太阳城集团PKCα的抑制显示调节表征银屑病的角质化细胞结构完整性。皮肤组织被石蜡包埋并且用H&E(苏木精和曙红)一般组织学染料或用于各种皮肤层的不同标记(包括用于基底层的角蛋白14(K14)、用于棘层的角蛋白1(K1),用于角质化细胞迁移的角蛋白6(K6)和用于角质化细胞增殖的PCNA)染色。结果证实PKCα抑制之后皮肤性质的正常化(图2)。

实施例2

用于经由银屑病模型评估炎症的体内和离体治疗的模型

之前已经使用多种动物模型研究银屑病,但是这些模型中没有一种足以充分地模拟以过度的皮肤产生、新血管的形成和严重的免疫功能失调为特征的人类疾病病理。通常,要被看作是有用的银屑病的模型,所述模型必须与银屑病共有某些组织病理学特征,表现出相似的发病机制和/或疾病机制,并且相似地响应于用于治疗所述疾病的治疗剂。现有的模型表现出若干种表征,包括棘层肥厚、改变的表皮分化、血管化作用的增加和白细胞/T细胞侵润。然而,在现有的小鼠模型中,没有多少响应于现有的药物和治疗。像这样,现有的模型被用于开发新的体外、离体和体内模型以评估在下列实施例中使用的银屑病治疗。

体外模型

太阳城集团所开发的模型包括使用皮肤来源的细胞以及免疫细胞的细胞系和原代培养的细胞培养研究,利用构建体和工具以将STAT3和PKCα介导的信号通路过表达并失活。用于皮肤细胞增殖、迁移、分化、炎症和信号的研究的多种技术被使用,并且证明在研究银屑病发育的机制并且研究银屑病中PKCα抑制的治疗效果上是有用的。

体内模型

使用PKCα过表达和敲除小鼠模型。使用K5-PKCα转基因小鼠的角质化细胞中PKCα的过表达,显示表现出模拟病况(例如脓疱性银屑病)的严重的表皮内嗜中性粒细胞浸润和表皮的破裂。建立了通过皮下应用的体内研究的PKCα和DN两种形式的转基因小鼠。此外,PKCα敲除小鼠同样被用于研究PKCα失活对皮肤结构和功能的影响。

使用了STAT3过表达小鼠模型。用于银屑病的主要的小鼠模型中,就与人类银屑病的相似性而言,是其中Stat3在表皮角质化细胞中过表达的转基因小鼠。这些小鼠发生银屑病状表皮棘层肥厚并且具有主要是真皮中的CD4+和表皮中的CD8+的表皮淋巴细胞性浸润,所有都是与人类中的银屑病相似的特征。

作为用于皮肤炎症和过度增生的模型的创伤。开发了一种筛选方法学以检测并定量评估允许追踪不同皮肤区室中的表皮炎性响应并鉴定影响这一响应的试剂的创伤背景中皮肤损伤内的炎症。

离体模型

在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上移植的银屑病皮肤。为了测试离体治疗应用的目的,开发了在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上移植银屑病皮肤的技术。尽管这一技术一般用于皮肤肿瘤研究和血管生成实验,但是它被采用并用于银屑病研究。这一原创的方法允许新的药物直接用于人类银屑病皮肤,因此产生新的药物对于银屑病的治疗的更加临床相关的研究。移植后,使用形态学、组织学和生物化学分析,银屑病人类皮肤被用来确立不同制剂中的不同治疗的效用和时限。

实施例3

PKCα敲除小鼠中起鳞减弱

太阳城集团开发PKCα敲除小鼠模型并用于研究PKCα失活对皮肤结构和功能的影响。如图3和4中所示,在PKCα敲除小鼠中观察到起鳞的减弱。图3是显示与对照相比在PKCα敲除小鼠中平均起鳞严重度减少超过50%的直方图,证明PKCα的抑制是治疗银屑病的关键要求。这同样显示于图4中,其是比较不同小鼠中的起鳞的一系列照片。

实施例4

局部PKCα抑制剂制剂

开发了局部PKCα抑制剂制剂并评估在银屑病的治疗中的效力。以霜剂配制肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)(本文也称为HO/02/10),其组分示于表2中。

表2:MPDY-1霜基制剂

  成份   水   甘油   丙二醇   对羟基苯甲酸甲酯   苯氧乙醇   硬脂酸甘油酯SE   十六醇   角鲨烷(coscol)   PEG-40Stearath   蔗糖二硬脂酸酯   异丙基豆蔻酸酯   丁基化羟基甲苯   石蜡油   癸酸/辛酸三酸甘油酯   凡士林   对羟苯甲酸丙酯   MPDY-1

实施例5

PKCα抑制剂对体外表皮分化的影响

确定实施例4的制剂(HO/02/10)体外控制表皮分化。基底角质化细胞分化形成由K1/K10角蛋白表征的棘层,由兜甲蛋白/丝聚蛋白表征的颗粒层以及角质层。兜甲蛋白和丝聚蛋白丝的表达和结合上的缺陷与包括银屑病的各种免疫皮肤疾病相关。因此,评估HO/02/10在皮肤分化和增殖上的效果。如图5和6中所示,HO/02/10通过减少兜甲蛋白和丝聚蛋白的表达将皮肤增殖正常化(PCNA)(图6)并且调节皮肤分化,同时棘层保持不受影响(图5)。由于银屑病皮肤角质化细胞迅速分化产生粒状和主要的大量的角膜细胞(鳞屑),而棘层变薄,HO/02/10通过向正常表型改善皮肤特征而起作用将银屑病皮肤正常化。

太阳城集团图5显示HO/02/10控制体外表皮的粒状分化。将来源于C57BL/6J小鼠的角质化细胞在含有Ca2+的培养基中培养以诱导角质化细胞分化。之后将细胞在HO/02/10(1μg/ml)存在的条件下培养。收获细胞,在SDS PAGE凝胶上展开并且使用抗丝聚蛋白(Fil)、抗兜甲蛋白(Lor)和抗角蛋白1(K1)的抗体进行免疫印迹。

太阳城集团图6显示HO/02/10在体外和体内减少角质化细胞增殖。来自2天的Balb/c小鼠的原代小鼠角质化细胞在0.05mM Ca2+MEM培养基中生长5天以达到完全汇合(confluence)。在诱导分化之前应用HO/02/10处理(10-6M和10-5M)6小时。收获细胞,在SDS PAGE凝胶上展开并且使用抗PCNA抗体进行免疫印迹。结果示于图6A中。使8-10周大的C57B1ack小鼠经受上背部区域的全层创伤以诱导表皮重塑和分化。创伤之后,每天用HO/02/10(40-4000mg/kg/天的范围内)处理小鼠7天。在终点,将小鼠安乐死并且将上背部皮肤样品固定在4%的低聚甲醛溶液中,之后石蜡包埋并且制备切片。之后使用PCNA抗体使皮肤样品经历免疫组化染色。(n=18)。结果示于图6B。

图7和8显示使用MPDY-1(SEQ ID NO:6)的角质化细胞中另外的表达数据以及肽PKCα抑制剂AIP-1(SEQ ID NO:9)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AWOT-1(SEQ ID NO:7)和PPDY-1(SEQ ID NO:10)的数据。图7显示使用在用不同肽PKCα抑制剂处理的角质化细胞中使用抗PCNA、抗丝聚蛋白(Fil)、抗兜甲蛋白(Lor)、抗角蛋白1(K1)和抗角蛋白14(K14)抗体的免疫组化染色。图8代表对于不同的肽PKCα抑制剂角质化细胞中表达数据的概述。

为了测试皮肤强度和弹性,破裂室被用于测量皮肤样品破裂所需要的压力(皮肤弹性和耐久性的可测量的指示参数)。图9中的结果证实HO/02/10处理的皮肤表现出增强的皮肤强度。因此,PKCα的抑制可有益于银屑病皮肤,正如它显示的增强皮肤完整性并且防止银屑病斑块的破裂。

图9显示HO/02/10显著增强皮肤强度。将小鼠皮肤用HO/02/10处理14天并且随后经受破裂压力分析。破裂室装置由一端封闭并且经由控制阀和压强计与高压CO2容器相连的固定体积的金属圆筒组成。在室的另一端,安装可调节的支架以便在适当的地方固定并容纳所测试的皮肤组织。将气体逐渐释放至室中并且持续监测内部压强直到发生所测试的皮肤的破裂。

实施例6

PKC同工型抑制剂和活化剂对皮肤炎症的影响

太阳城集团开发了一种筛选方法以检测并定量评估创伤背景中皮肤损伤的炎症,其允许人们追踪不同皮肤区室中的表皮炎性响应并鉴定影响这一响应的试剂(作为初筛)。当下列三个病况中的两个是明显的时,认为炎性响应是严重的:(1)脓肿形成;(2)过量白细胞增加(固定域x200中>100个细胞);(3)血管中的高WBC/RBC比率,其中在固定域x200中显示血管中>20%的WBC含量。使用标记研究免疫响应的机理特征以鉴定特定免疫细胞的浸润和活化。这些标记的实例是:ICAM-1(作为活化的基底角质化细胞和内皮细胞的标记)、MAC-2(作为活化的巨噬细胞的标记)和CD3(T细胞标记)。使用这一定量方法,证明若干个动物模型中不同细胞类型和过程中的完整皮肤和皮肤损伤中HO/02/10和其他肽PCK抑制剂的强抗炎性作用是可能的。

下文代表性的结果证实,创伤后4和9天后B57BL/6J小鼠中HO/02/10对皮肤创伤的抗炎性效果(图10)。图10显示C57BL/6J小鼠中HO/02/10的剂量响应对炎症的影响。C57BL/6J小鼠的皮肤通过每天应用HO/02/10(4μg/kg/天)或(40μg/kg/天)(6只小鼠/组)来处理。处理是局部的应用。在创伤后4和9天后收集活检。从安乐死的动物提取组织以便通过组织学和免疫组化评估炎症。

HO/02/10同样显示降低来自LPS活化的脾细胞的致炎性细胞因子分泌。为了体外评估总体的抗炎效果,小鼠来源的原代脾细胞被用作免疫模型。脾细胞来源于C57BL/6J小鼠,将红血球溶解并且将细胞在96孔板中以每孔500,000个培养。加入LPS(用于IL-1和TNFα测试的1μg/ml,和用于IL-6测试的0.2ng/ml),并且用MPDY-1(1μg/ml)或PBS处理细胞。阴性对照样品中不加入LPS。2天后收集培养基并且使用ELISA定量所分泌的细胞因子的量。

太阳城集团图11,以及图17-27、43和50证实HO/02/10显著减少来自活化的角质化细胞的主要致炎性细胞因子(例如TNFα、IL-1和IL-6)的分泌的能力。特别地,IL-6显示对于参与银屑病的发病机制的TH17细胞的发育来说是必需的,并增强已证实的对IL-1和TNFα的影响。TNFα和IL-6是银屑病治疗的已知的靶。图11证实1μg/ml HO/02/10的影响。

太阳城集团HO/02/10还显示体内抑制基底角质化细胞和内皮细胞免疫活性。ICAM是允许粒细胞浸润至炎性损伤中的黏着分子。特别地,在皮肤中,基底角质化细胞在免疫活化时表达ICAM-1,其可增加嗜中性粒细胞和CD8-T细胞向表皮中的浸润,是银屑病的标志中的一种。因此,皮肤中HO/02/10对ICAM表达的影响通过体内创伤炎性背景中的免疫组化来检查。

观察到皮肤炎症中活化的角质化细胞和内皮细胞(ICAM-1染色)的下调。在C57BL/6J小鼠的上背部进行2cm的纵切。创伤后,将无菌衬垫缝合在小鼠的皮肤上。每天用HO/02/10处理动物(n=12)。创伤后五天,当炎性阶段达到其顶峰,小鼠被处死,将皮肤组织包埋到石蜡中并且用抗ICAM-1抗体进行免疫组化染色。

如图12中所示,HO/02/10显著减少皮肤的血管中基底角质化细胞和内皮的ICAM表达。这一影响显示为剂量依赖性的,在于10μg/ml施用时具有最大效果。

图13显示另外的染色,其显示皮肤炎症中活化的角质化细胞和内皮细胞(ICAM-1染色)的下调。如上文所述,在C57BL/6J小鼠的上背部进行2cm的纵切。创伤后,将无菌衬垫缝合在小鼠的皮肤上。每天用MPDY-1处理动物(n=6)。创伤后五天,当炎性阶段达到其顶峰,小鼠被处死,将皮肤组织包埋到石蜡中并且用抗ICAM-1抗体进行免疫组化染色。

图14是比较在伤口边缘都显示阳性ICAM-1染色的小鼠百分比的直方图。

太阳城集团MPDY-1对巨噬细胞浸润的影响同样通过Iba-1染色显示。Iba-1是巨噬细胞的一般标记。图15是比较显示Iba-1阳性染色的每个域中细胞数目的直方图。如上文所述,在C57BL/6J小鼠的上背部进行2cm的纵切。创伤后,将无菌衬垫缝合在小鼠的皮肤上。每天用MPDY-1处理动物(n=6)。创伤后五天,当炎性阶段达到其顶峰,小鼠被处死,将皮肤组织包埋到石蜡中并且用抗Iba-1抗体进行免疫组化染色。观察到MPDY-1对巨噬细胞浸润的剂量依赖性的影响。

太阳城集团MPDY-1对巨噬细胞活化的影响同样通过MAC-2染色显示。MAC-2是活化的巨噬细胞的特异性标记。图16显示一系列MAC-2染色和将显示MAC-2阳性染色的每个域中细胞数目比较的直方图。如上文描述的进行2cm的纵切。每天用特定浓度的DPBS-/-(对照)或MPDY-1处理动物(n=6)。5天后,用抗MAC-2抗体进行免疫组化染色。Bar1μm(*p(对照对比MPDY-110μg)=0.0028)。巨噬细胞的活化在MPDY-1处理之后被显著抑制。

太阳城集团如图32中所示MPDY-1同样显示以剂量依赖性方式显著降低角质化细胞中TNFα诱导的IKK活化。将小鼠原代角质化细胞生长4天以在低Ca+2MEM中完全汇合。TNFα诱导之前,如图中所描述的指定浓度的MPDY-1预处理细胞1小时。MPDY-1预处理之后,用TNFα 35 ng/ml培养细胞15分钟。通过加入冰冻的dPBS-/-中止反应并且在RIPA缓冲液中将角质化细胞均质化。使用磷酸化IKKa/b(Serl76/180抗体),样品经受SDS PAGE蛋白质印迹分析。使用MPDY-1的预处理以剂量依赖性方式显著降低角质化细胞中TNFα诱导的IKK活化,其中最低MPDY-1浓度(0.1mg/ml)显示最强的抑制,由此抑制NFKB活化。

如上文所讨论的,HO/02/10同样显示降低来自活化的角质化细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌。在近些年,发现免疫和皮肤组分都同样地对基于银屑病发病机制的周期起作用。自身皮肤细胞和免疫细胞(自身的和浸润的细胞两者)通过细胞-细胞相互作用和细胞因子分泌在炎性银屑病过程中相互作用。因此,检查HO/02/10对形成角质化细胞和免疫细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)两者的致炎性的、趋化的和免疫的通路相关的细胞因子的分泌的直接影响。图17和18中描绘的结果证实HO/02/10下调来自角质化细胞和巨噬细胞的免疫相关的细胞因子例如IL-6、IL-1a、GM-CSF、MIP-2和KC的分泌。

图17的结果显示HO/02/10对角质化细胞中细胞因子分泌的影响。角质化细胞来源于新生的C57BL/6J小鼠皮肤。将细胞在24孔板中培养5天。之后用DPBS-/-、LPS(100ng/ml)或HO/02/10(1μg/ml)+LPS(100ng/ml)处理细胞。48小时后收集含有所分泌的细胞因子的培养基并且使用Luminex系统分析。

图18的结果显示HO/02/10下调巨噬细胞中的细胞因子分泌。骨髓细胞来源于B6小鼠。将细胞在GM-CSF(20ng/ml)存在的条件下培养6天并且之后用DPBS-/-、LPS(100ng/ml)或HO/02/10+LPS(分别为1μg/ml和100ng/ml)处理细胞。

太阳城集团其他的肽PKCα抑制剂同样显示降低来自活化的角质化细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌。图19至23显示肽抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、MPDY-1 sh(SEQ ID NO:12)和PDY-1(SEQ ID NO:13)降低来自LPS和TNFα活化的角质化细胞的细胞因子分泌。图24至27显示肽抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、MPDY-1 sh(SEQ ID NO:12)和PDY-1(SEQ ID NO:13)降低来自IL-17A活化的角质化细胞的细胞因子的分泌。

表3概述根据HO/02/10的细胞因子作用和来源的结果。

太阳城集团表3:HO/02/10对受刺激的小鼠来源的细胞的影响

各种其他的PKCα抑制剂同样显示降低活化的角质化细胞中的细胞因子分泌。为了确定它们的影响,角质化细胞来源于新生的BALB/C小鼠皮肤。将细胞在24孔板上培养5天。之后用作为对照的PBS-/-培养细胞或用LPS、TNFα或IL-17刺激细胞。如所指示的加入PKCα抑制剂。48小时后收集包含所分泌的细胞因子的培养基并且使用ELISA分析。图50是细胞因子分泌的列表概述。PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)、AIP-2(SEQ ID NO:8)、AIP-1(SEQ IDNO:9)、AWOT(SEQ ID NO:7)和PPDY-1(SEQ ID NO:10)都显示在降低角质化细胞中的细胞因子分泌上有效。

HO/02/10同样显示减弱T细胞向皮肤的浸润。使用抗CD3特异性染色在体内研究HO/02/10对T细胞的浸润的影响。

太阳城集团如可在图28中所见的,HO/02/10下调炎性阶段期间T细胞对真皮和表皮的浸润。特别地,HO/02/10抑制T细胞向表皮的浸润,其表明同样表征银屑病斑块的另外的抗炎性性质。如上文描述的进行2厘米的纵切。用HO/02/10每天处理动物(n=12)。9天后使用抗CD3抗体进行免疫组化染色。图28B是比较CD3阳性染色的每个域的细胞的数目的直方图。1μg/ml和10μg/ml浓度时所述影响是统计学上显著的,其中1μg/ml处理显示比10μg/ml更强的影响。

HO/02/10同样显示减弱嗜中性粒细胞向皮肤的浸润(图31)。使用嗜中性粒细胞特异性染色在体内研究HO/02/10对嗜中性粒细胞浸润的影响。如上文描述的进行2厘米的纵切。用DPBS-/-(对照)或PKCα抑制剂以特定的浓度每天处理动物(n=6)。五天后,将小鼠处死,将皮肤组织包埋在石蜡中并进行对嗜中性粒细胞的免疫组化染色。尽管观察到剂量依赖性的趋势但是结果不是统计学上显著的。

太阳城集团PKCδ活化剂同样显示具有对角质化细胞和脾细胞的抗炎性影响。角质化细胞来源于新生BALB/C小鼠皮肤。将细胞在24孔板上培养5天。之后用作为对照的PBS-/-培养细胞或者用LPS或TNFα刺激细胞。加入PKCδ抑制剂DAP-1(SEQ ID NO:34)。48小时后收集包含所分泌的细胞因子的培养基并且使用ELISA分析。图43是显示用LPS刺激的脾细胞中细胞因子分泌的列表概述。图44是用TNFα刺激的角质化细胞中细胞因子分泌的列表概述。DAP-1显示显著地降低角质化细胞和脾细胞两者中炎性细胞因子分泌。

PKCε抑制剂同样显示具有对角质化细胞的抗炎性影响。角质化细胞来源于新生的BALB/C小鼠皮肤。将细胞在24孔板上培养5天。之后用作为对照的PBS-/-培养细胞或者用LPS或TNFα刺激细胞。加入PKCε抑制剂EPIP-1(SEQ ID NO:20)、EPIP-2(SEQ ID NO:21)或EPIP-4(SEQ ID NO:23)。48小时后收集包含所分泌的细胞因子的培养基并且使用ELISA分析。图45-48显示特定细胞因子分泌的结果而图49是不同PKCε抑制剂的细胞因子分泌的列表概述。若干PKCε抑制剂显示显著地降低角质化细胞中炎性细胞因子分泌。

太阳城集团总之,确定了PKC同工型抑制剂和活化剂的作用机制,表明它们作为对炎症和炎性疾病的有效治疗的用途。这些肽显示1)通过降低终末分化将表皮分化标记表达正常化;2)减弱不正常的过度增殖;3)调节皮肤结构并增加皮肤强度;和4)通过在炎性过程的不同步骤中的区别地影响不同细胞类型补充和活化下调炎症。

太阳城集团图30显示描述本公开内容的PKC同工型抑制剂和活化剂对皮肤炎性和银屑病的相关的通路的整体影响的概要。所述概要概述所述抑制剂和活化剂对皮肤中各种细胞类型和炎性阶段的抑制性作用。PKC同工型抑制剂和活化剂通过自身的皮肤免疫细胞抑制致炎性细胞因子(例如IL-1、IL-6和TNFα)的分泌。因此,获得内皮细胞和角质化细胞活化上的下降,导致ICAM-1表达、趋化因子分泌上的显著降低和粒细胞向炎症位点的浸润的减少,包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞。参与Th1和Th17通路(银屑病中两个重要的通路)的发育和进行的细胞因子同样被下调。

实施例7

太阳城集团 使用PKCα和PKCη抑制剂的多发性硬化症的治疗。

太阳城集团多发性硬化症的动物模型:由于CNS组织不容易取样,为了获得与疾病机制相关的太阳城集团,大量模型被开发并且通常用于文献中。这些模型据报道包括髓磷脂突变体,化学诱导的损伤、病毒和模拟MS的临床状态和病理的自身免疫性模型(Baker等人(2007)ACNR 6(6):10-12)。在这些模型中,实验性变应性脑脊髓炎(EAE)据报道是最常使用的MS的模型(Baker等人(2007)ACNR 6(6):10-12)。

多发性硬化症的自身免疫模型:实验性变应性脑脊髓炎(EAE)作为MS疾病和进展的模型显然受到了最多的关注,并且在通常用于检测MS的治疗策略中(Baker等人(2007)ACNR6(6):10-12)。

太阳城集团这一疾病模型显示MS的许多临床和组织学特性并且据报道由对在CNS中天然或人工表达的抗原自身免疫的诱导所导致(Lavi等人(2005)ISBN0-387-25517-6和Owens等人(2006)Adv Neurol 98:77-89)。对髓磷脂抗原敏化作用之后,动物似乎患病,以肢体麻痹为特点。这与血脑屏障机能障碍、单核细胞向CNS的浸润和导致受损神经传递的传导阻滞有关。

EAE是多基因的,其中易感性和临床过程似乎根据免疫抗原和正在被研究的动物的株系/物种而变化。MOG,小髓磷脂蛋白,似乎诱导C57BL/6小鼠中的慢性麻痹的EAE。EAE不是单个的模型,而是存在与MS的相似的变化的病理学程度的许多个模型(Lavi等人(2005)ISBN 0-387-25517-6)。

为了测试若干种PKC抑制剂对EAE小鼠的发育和临床病况的影响,使用下列实验性程序进行各种研究。特别地,评估了肽PKCα抑制剂MPDY-1(SEQ ID NO:6)和肽PKCη抑制剂MPE-1(SEQ ID NO:28)。

太阳城集团雌性的8-10周大的C57BL/6J小鼠被用于研究。组的总数目是7(n=7每组);动物的总数是49。麻醉后,用MOG35-55/CFA将小鼠免疫。用补充了300μg结核病(Mt)H37RA(Difco)的200g MOG35-55/CFA在侧腹部皮下(s.c.)免疫小鼠。在免疫时和48(小时)之后静脉注射(i.v.)百日咳毒素(PTX)。对二次免疫的需要以使用合成的MOG35-55肽的初步校准实验(20只小鼠)为基础确定(作为在治疗实验之前的校准程序进行)。

太阳城集团如下施用治疗。在免疫当天开始,通过i.p(腹膜内的)注射一周三次处理小鼠(200μl/注射)。

在49天的观察期6天/周进行临床观察和评分。在免疫之前和其后每周两次测定体重。如下文表4中所示,在取决于小鼠可定量的临床表现在0-6的等级上对活性EAE评分。

表4:EAE得分

  得分   损害   0   无损害   1   尾无力   2   尾无力和后肢轻瘫   3   ≥1个后肢轻瘫   4   整个后肢和后体轻瘫   5   后体轻瘫和前肢轻瘫   6   死亡

太阳城集团如表5中所示的处理小鼠的组。

表5:治疗方案

  组   治疗   1   DPBS-/-(对照)   2   CRAMP2mg/kg(CRAMP)   3   CRAMP0.2mg/kg(CRAMP)   4   MPDY-10.1mg/kg   5   MPDY-11mg/kg   6   MPE-10.1mg/kg   7   MPE-1mg/kg

图33-37中显示和概述结果。

如可从图33所见的,用MPDY-10.1mg/kg处理的小鼠在实验的第13天开始显示疾病迹象,比对照组晚两天。在实验的大多数天里,MPDY-10.1mg/kg组中的小鼠与对照组的小鼠相比显示更低的得分。而且,MPDY-10.1 mg/kg组和MPE-10.1 mg/kg组中没有小鼠在实验中死亡(得分6),而在所有其他组中,小鼠随太阳城集团过程死亡(对照组-第一只小鼠在实验的第34天死亡而另一只在第35天死亡)。所有小鼠死亡的概述提供于下表6中。

太阳城集团表6:治疗期间小鼠死亡的概述

  组   49天期间死亡的小鼠的数目   细节(天数)   1   2   34,35   2   2   23,44   3   2   27,38   4   0   5   2   16,38   6   0   7   4   20,33,37,35

在特定太阳城集团点来自图33-37的得分的概述示于表7中。

太阳城集团表7:特定太阳城集团点得分的概述

  组   初始当天   第18天的得分   第29天的得分   第37天的得分   对照   11(0.285)   3.000   2.357   2.857   CRAMP0.2mg/kg   10(0.571)   3.214   2.000   2.571   CRAMP2mg/kg   11(0.143)   2.643   2.643   2.143   MPDY-10.1mg/kg   13(1.000)   2.571   2.000   1.500   MPDY-11mg/kg   11(0.214)   3.143   3.286   3.071   MPE-10.1mg/kg   11(0.429)   2.857   1.929   1.429   MPE-11mg/kg   10(0.429)   3.071   4.286   4.286

处理的第4和6组显示对疾病的临床症状的发展的抗性,包括直到实验的第49天都没有死亡。0.1μg/ml浓度的MPDY-1和MPE处理(第4组)减少EAE严重性并且使小鼠免受在对照动物中疾病的后期观察到的致死的EAE,因此导致在实验结束时(第42天)平均组得分(MPDY-1的1.93;MPE-1的2.00)减少至对照组得分的平均值(2.86)以下。在0.1μg浓度的MPDY-1处理导致与对照组相比EAE比较的发展的临床病况延迟两天。因此,MPDY-1和MPE表现显示为对MS的治疗有效的试剂。

实施例8

瘙痒症治疗的体内评估

开发了如图8中所示的利用组胺以评估瘙瘁症的点刺试验模型。用组胺溶液和安慰剂注射各个受治疗者的前臂。实施例4的制剂与不同浓度的MPDY-1一起被局部应用并且如图39-42中所示经太阳城集团过程后评估瘙痒症。

太阳城集团通过将一滴包含皮肤的可能的变应原的溶液放置在皮肤上并且一系列的擦伤或针头穿刺允许溶液进入皮肤,执行本试验。使用细针(例如26G一次性针头)使提取物进入皮肤(表皮)的外层。这一测试是无痛的,并且通常不引起流血因为针头仅擦伤皮肤的表面。如果皮肤出现红的隆起的瘁的区域(称为风团),它是对变应原的变应性反应的结果。这称为阳性反应。一滴提取物通过细针(例如26G一次性针头)引入。试验导致无不舒适的和最小的外伤以便对照和阴性实验仅显示穿刺的位点(如果有的话)。

太阳城集团26G针头被用于引入组胺贮液(Histatrol阳性对照组胺,1mg/ml,代码#HIST14999V,Trupharm)。在双盲的随机化的试验中,在健康的志愿者上进行测试。将制剂应用于前臂。选择并且标记三个治疗区域(从手肘至手腕的前臂的表面被横着分为近端、中部和远端的三部分);在下文的治疗之前穿刺所述区域。

用活性制剂以双盲方式处理一个区域,10分钟-标记为A。

用安慰剂以双盲方式处理一个区域,10分钟-标记为C。

在零点(T0),10、20、30分钟之后获取彩色照片。

处理后5和15分钟由受治疗者回答瘙瘁症问卷。

在一个研究中,用表8和9中所示的治疗测试受治疗者。

表8:点刺试验样品组

  左前臂   右前臂   受治疗者1   A5   C2   受治疗者1   A4   C1   受治疗者2   A2   C3   受治疗者2   A5   C2   受治疗者3   A4   C1   受治疗者3   A1   C3

表9:点刺试验治疗

  治疗   组   MPDY-11μg/ml   A1   MPDY-110μg/ml   A2   霜剂10ppm   A4   凝胶10ppm   A5   霜剂W/O活性材料   C1   凝胶W/O活性材料   C2   DPBS   C3

太阳城集团提供具有瘙痒症感觉形式的受治疗者并且以不同的太阳城集团间隔询问以指明从0(无响应)至4(不可控制的瘙瘁症)的感觉的瘙瘁症的水平。结果示于下文表10。

表10:结果

太阳城集团此外,如图39-42中明显的,与对照相比随太阳城集团过程MPDY-1的应用显著减弱了发红、炎症和瘙瘁症。

太阳城集团尽管本公开内容的对象已经用对上文实施例的引用来描述,但是应当理解的是修改和变化包含在本公开内容的精神和范围内。因此,本公开内容仅由所附权利要求所限制。

实施例9

将胰岛素和PKCα抑制剂组合避免由仅由胰岛素的治疗导致的不利的副作用。

通过切口在8-10星期大的C57BL小鼠的背部进行创伤并且用载体(PBS)对照或用1μM胰岛素(人体单组份胰岛素,Eli Lilly,USA)或1μM胰岛素与1μM的SEQ ID NO:6的PKCα抑制剂组合的混合物每天处理,共7天。创伤7天之后,将所有小鼠处死并且对处理的伤口的创伤开口处的表皮(增殖细胞核抗原PCNA)、血管生成、炎症、表皮细胞的增殖能力和重塑过程进行组织学的分析。

如表11中所示,仅有胰岛素的治疗导致与用PBS的对照(分别为60%和25%)相比在创伤区域中异常的血管生成的发生率上的大大增加。由于创伤愈合过程包括迅速增殖表皮细胞,这些增加的血管生成同样可能通过延迟正常肉芽组织的形成增加受损的创伤闭合的风险。另一方面,当胰岛素与SEQ ID NO:6的PKCα抑制剂组合时,在处理的创伤区域中没有观察到异常的血管生成。

表11:仅胰岛素和与PKCα抑制剂组合的胰岛素对创伤区域的血管生成的严重度的影响。

此外,仅胰岛素的治疗导致增加的炎症、表皮细胞的超常增生、表皮细胞的棘层的延迟的分化和增加的起鳞。当PKCα抑制剂与胰岛素组合时,没有观察到仅胰岛素治疗产生的不利的副作用中的任何一种。

太阳城集团实施例10PKCα抑制剂减少创伤炎症

创伤中,晚期并且严重的炎性响应可抑制愈合的过程,因此防止这样的炎症发展可促进创伤愈合过程。因此,在下列实验中测试了PKCα抑制剂HO/02和胰岛素对创伤炎症的影响。

太阳城集团通过切口在C57BL小鼠的背部进行创伤并且用下列每天处理,共7天:(i)PBS,对照;(ii)1μM的SEQ ID NO:6的PKCα抑制剂;(iii)1μM胰岛素(人体单组份胰岛素,Eli Lilly,USA);或(iv)1μMPKCα抑制剂和1μM胰岛素的混合物。创伤后七天,将所有小鼠处死并且在显微镜下观察所处理的创伤的炎症。在创伤区域中观察到的所得到的严重炎症发病率概述于表12中。

如表12中所示,当与对照相比时,向创伤施用PKCα抑制剂导致严重创伤炎症发病率的大大(33.3%)降低。单独的胰岛素在实验条件下没有抗炎性作用。

表12

太阳城集团   治疗   创伤中严重炎症的发病率(%)   PBS对照   60   PKCα抑制剂   40   胰岛素   56   PKCα抑制剂+胰岛素   50

这些结果表明PKCα抑制剂可被用于控制创伤的严重炎症的治疗。所证实的SEQ ID NO:6的PKCα抑制剂减少炎症的能力,连同其促进表皮闭合、真皮闭合和表皮细胞的空间分化的能力一起,使其成为创伤愈合的可能最有效的治疗剂。

太阳城集团实施例11.在STZ诱导的糖尿病小鼠中与PKCα抑制剂HO/02组合的胰岛素在创伤愈合中的效用

在麻醉的注射链唑霉素(STZ)(175mg/kg体重)的糖尿病的、注射柠檬酸盐缓冲液的(6只小鼠/组)非糖尿病的和未注射的(6只小鼠/组)C57BL/6J小鼠的上背部进行全层皮肤切口(20mm)。STZ注射后通过测量来自尾部静脉的葡萄糖水平进行周期性血糖监测。仅将表现出高于450mg/dl的血糖水平的小鼠纳入研究中。切口之后,通过直接向外科敷料应用PBS(7/6只小鼠/组)、胰岛素(0.1单位/ml)(6只小鼠/组)、SEQ ID NO:6的PKCα抑制剂(1μg/m1)(7/5只小鼠/组)或包含胰岛素和N-豆蔻酰化的SEQ ID NO:6的PKCα抑制剂的制剂(在本文中称为HO/03/03)(7/6只小鼠/组)每天处理STZ诱导的糖尿病创伤。创伤后9天收集活检。从安乐死的动物切下创伤以通过组织学和免疫组化评估伤口愈合参数。

太阳城集团通过角蛋白14染色评估伤口的表皮闭合。当观察到横过创伤缺口的完整的表皮染色时认为伤口闭合。当使用H&E染色在x100放大率的固定的域中两侧真皮边缘都可见时,认为真皮收缩。表皮分化通过角蛋白1染色评估。横过整个创伤缺口都表现出阳性染色的创伤被认为是分化的(K1阳性)。

太阳城集团如表13中所示,STZ诱导的糖尿病动物为伤口愈合受损的。在处理的糖尿病的、未处理的糖尿病的和非糖尿病的小鼠中,重要的创伤愈合参数的比较显示用制剂HO/03/03处理的组表现出协同的愈合作用。所述协同作用在包括表皮闭合(71%对比糖尿病对照中的17%p<0.05),表皮分化(28%对比0%)和真皮收缩(33%对比0%)的所有关键性的愈合阶段中都是明显的。

太阳城集团通过伤口两侧边缘处的皮下组织的存在(或不存在)评估皮下组织的机化。通过创伤床中成纤维细胞和胶原纤维的存在评估肉芽组织形成。当肉芽组织的连续层在创伤缺口中存在时,认为对于肉芽组织形成来说创伤是阳性的。此外,我们已经定义了3种表征糖尿病创伤中的严重炎症的特定的组织学参数:(i)创伤区域的脓肿形成,(ii)过度的白细胞增多(在固定的域(x200)中>100个细胞)和(iii)固定的域(x200)中显示的血管中高的白血球(WBC)/红血球(RBC)比率。当这些参数中的至少2个存在于创伤缺口处时,创伤被认为是严重发炎的。

太阳城集团表13:创伤后9天创伤愈合参数的组织学分析

*如上文所描述的进行愈合参数的定量分析。

太阳城集团结果表示为每组中创伤的百分比。

太阳城集团表14:创伤后9天创伤愈合参数的组织学分析

太阳城集团*如上文所描述的进行愈合参数的定量分析。

结果表示为每组中创伤的百分比。

如表14中所示,糖尿病动物在其他创伤愈合参数(例如创伤边缘处皮下组织的机化、炎症和肉芽组织形成)上表现出损害。如通过创伤缺口边缘处皮下组织的机化(43%对比25%)和肉芽组织形成(86%对比42%)所证明的糖尿病相关的受损的愈合参数通过使用制剂HO/03/03的治疗来修正。使用HO/03/03的治疗减少了创伤缺口中的炎性响应(28%对比67%)。配方试剂单独的愈合效用(胰岛素或SEQ ID NO:6的肽)仅表现出部分愈合作用。

上文概述的结果证实在多个愈合参数上制剂HO/03/03在克服糖尿病相关愈合损害上表现出协同作用。

实施例12.猪皮肤模型中与PKCα抑制剂HO/02组合的胰岛素在体内创伤愈合中的效用

太阳城集团在猪皮肤模型系统中进行了几个创伤愈合研究以进一步了解创伤愈合过程以及制剂HO/03/03的愈合作用。

在麻醉的雌性猪(5个月大,60-70kg)的背部进行全层的35-40mm的皮肤切口。在背部区域的两侧以距脊柱相同的距离进行十个对称的切口(总共20个创伤)。通过直接向创伤区域应用1m1PBS(10头每组)或包含胰岛素0.1单位和N-豆蔻酰化的SEQ ID NO:6的PKCα抑制剂1μg/ml的制剂(本文称为HO/03/03)(10头每组)每天处理创伤,一天两次。从创伤后第7和22天处死的动物切下创伤并且进行形态学、组织学和免疫组化评估。

太阳城集团如表15中所示,使用制剂HO/03/03的治疗通过在愈合的早期影响表皮迁移和肉芽组织形成加速了创伤愈合。而且,这些创伤是大的并且易于感染自环境病原体(动物没有保留在无菌条件下),然而HO/03/03表现出减弱了创伤缺口处的炎性响应由此促进愈合过程。

表15:创伤后7天猪中制剂HO/03/03的效用的组织学分析。

太阳城集团*结果表示为每组中创伤的百分比。

表16:创伤后22天猪中制剂HO/03/03的效用的组织学分析

太阳城集团*结果表示为每组中创伤的百分比。

太阳城集团当测试晚期愈合阶段时,HO/03/03处理的创伤还表现出加速的愈合。如表16中所示,在上皮闭合上没有注意到差别,但是在处理的创伤中真皮收缩和表皮分化显著更高。重要的是强调这些创伤在同一个动物上进行,由此有助于所述治疗的标记的愈合作用。

太阳城集团从上文概述的结果很容易理解,制剂HO/03/03促进猪皮肤模型中的加速的愈合,影响创伤愈合的早期以及晚期阶段中的愈合参数。

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