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一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂.pdf

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一种 防治 鲫鱼 细菌性 败血症 中药 复方 制剂
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摘要
申请专利号:

CN201310528009.5

申请日:

20131031

公开号:

太阳城集团CN103585288A

公开日:

20140219

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K36/708,A61P31/04 主分类号: A61K36/708,A61P31/04
申请人: 信阳农业高等专科太阳城集团,田海军
发明人: 田海军,伦峰,林伟,彭新亮,吴红梅
地址: 464000 河南省信阳市羊山新区信阳农业高等专科太阳城集团
优先权: CN201310528009A
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201310528009.5

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂,包括下列中药原料按重量百分比配比制成:茵陈18-22%、地锦草18-22%、大黄18-22%、黄芩8-12%、白术8-12%、党参8-12%、板蓝根8-12%。经临床鱼病防治试验及安全性评价显示其对鲫鱼细菌性败血症安全有效。

权利要求书

太阳城集团1.一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂,其特征在于,包括下列中药原料按重量百分比配比制成:茵陈18-22%、地锦草18-22%、大黄18-22%、黄芩8-12%、白术8-12%、党参8-12%、板蓝根8-12%。2.根据权利要求1所述的一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂,其特征在于,包括下列中药原料按重量百分比配比制成:茵陈20%、地锦草20%、大黄20%、黄芩10%、白术10%、党参10%、板蓝根10%。

说明书

技术领域

本发明涉及中药制剂,具体涉及一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂。 

背景技术

太阳城集团随着水产养殖集约化程度的提高,养殖水环境的逐渐恶化,病害问题已经越来越严重,特别是由细菌感染引起的传染性疾病表现得尤为突出,其中细菌性败血症是目前发病率最高、造成损失最大的疾病。细菌性败血症俗称暴发性出血病,是由温和气单胞菌等细菌感染引起。鱼类细菌性败血症是危害水产养殖的主要疾病之一,用中草药防治鱼病具有价廉、绿色、环保、无药物残留等优点,符合无公害水产养殖的要求。目前用中草药防治水产动物细菌性败血症的研究大多是体外抑菌试验及药敏试验,只有陈学年等人做了中草药生药粉末药饵防治鲫鱼败血病的试验。对于中草药提取物添加制成药饵对鱼病的防治试验还未见报道。 

所以进行了中草药复方提取液添加药饵对鲫鱼细菌性败血症的防治试验,为水产养殖生产提供防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂,已经是一个值得研究的问题。 

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足,本发明提供了一种利用多味中草药防治鲫鱼细菌性败血症中草药提取复方制剂。 

本发明的目的是这样实现的: 

太阳城集团一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂,包括下列中药原料按重量百分比配比制成:茵陈18-22%、地锦草18-22%、大黄18-22%、黄芩8-12%、白术8-12%、党参8-12%、板蓝根8-12%;

太阳城集团包括下列中药原料按重量百分比配比制成:茵陈20%、地锦草20%、大黄20%、黄芩10%、白术10%、党参10%、板蓝根10%。

积极有益效果:本发明公开了一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂,该制剂由茵陈、地锦草、大黄、黄芩、白术、党参、板蓝根等七味中药原料组成。经临床鱼病防治试验及安全性评价显示其对鲫鱼细菌性败血症安全有效。 

说明书附图

图1为血清谷丙转氨酶测定结果图;

图2为血清谷草转氨酶测定结果图;

图3为血清胆固醇测定结果图;

图4为血清甘油三酯测定结果图;

图5为血清总蛋白测定结果图;

图6为血清白蛋白测定结果图;

图7为血清球蛋白测定结果图;

图8为血清白球比测定结果图;

太阳城集团图9为血清肌酐测定结果图;

图10为血清尿素氮测定结果图;

太阳城集团图11为血清尿酸测定结果图;

图12为血清胆红素测定结果图;

太阳城集团图13为血清肌酸磷酸激酶测定结果图;

图14为血液红细胞变化规律示意图;

太阳城集团图15为血液白细胞变化规律示意图;

太阳城集团图16为 血液血红蛋白变化规律示意图;

太阳城集团图17为白细胞中的淋巴细胞变化规律示意图;

图18为对照组血液中的粒细胞比例示意图。

具体实施方式

太阳城集团下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明: 

太阳城集团一种防治鲫鱼细菌性败血症的中药复方制剂,包括下列中药原料按重量百分比配比制成:茵陈18-22%、地锦草18-22%、大黄18-22%、黄芩8-12%、白术8-12%、党参8-12%、板蓝根8-12%;

太阳城集团包括下列中药原料按重量百分比配比制成:茵陈20%、地锦草20%、大黄20%、黄芩10%、白术10%、党参10%、板蓝根10%。

复方中药制剂防治鲫鱼细菌性败血症的机理是:1.抗炎。复方提取液的总黄酮有效成分能够通过抑制可诱导的一氧化氮合酶,减少毛细血管内皮细胞释放一氧化氮,调节花生四烯酸(AA)的代谢,抑制前列腺素E2(PGE2)和白三烯(LTC4)的合成,其中以黄芩素和黄芩甙作用最强,而且存在量效关系。炎症组织中前列腺素E2(PGE2)和白三烯(LTC4)等炎性介质成分减少后,毛细血管通透性下降,白细胞游出减少,蛋白渗出亦随之减少,导致炎症反应减轻,组织肿胀程度下降。2.杀菌解毒。复方中的黄酮类、蒽醌类和有机酸类等有效成分具有强烈的抑菌作用,对消除细菌毒素对组织的损伤具有很好的效果。细菌内毒素可以引起发热、可诱发氧衍生自由基引起脂质过氧化损伤,造成亚细胞及组织损害,造成器官损伤代谢失调,可引起血微循环障碍导致弥散性血管内凝血(DIC)现象等。黃芩具有清热解毒作用,通过降低脑脊液环磷酸腺苷(cAMP)含量而拮抗细菌内毒素致热活性,邓则明证实黄芩的抗自由基作用是通过提高线粒体、溶酶体等内源性超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶等酶的活性而加速清除的,地锦草所含的黄酮类有效成分也具有清除和抑制羟基自由基的作用,黄芩和地锦草还具有止血、改善血管微循环,直接破坏内毒素的作用。 

  实验如下: 

1.材料和方法

1.1试验材料

太阳城集团1.1.1试验鱼   健康鲫鱼,规格一致,尾重35±1g。

1.1.2试验用菌液  试验用致病菌为温和气单胞菌(Aeromonas Sobria),菌种由本校微生物实验室提供。 

1.1.3药饵  用乙醇回流提取法提取中草药复方的总有效成分,按照0%、0.5%、2%、生药2%的添加量制作成药饵。 

1.1.4 养殖池  普通玻璃缸,1m×0.4m×0.6m,保证24小时充氧,水温13-15℃,每天换水1/3。 

试验方法

太阳城集团1.2.1试验设计  试验采用随机区组设计,选取细菌浓度梯度(0.5亿/毫升和1亿/毫升)和药饵浓度(0、0.5%、2%及生药2%)两个因素及不同的水平,并且设空白对照组。具体分组见表1。试验前鲫鱼先暂养2周,接着投喂药饵1周,然后注射不同浓度的温和气单胞菌病原菌进行人工感染。试验养殖条件按照常规方法进行。

太阳城集团1.2.2药饵防治率记录  发病后每天记录各试验组死鱼尾数,连续记录一周。死亡率结果采用方差分析和t检验。 

太阳城集团1.2.3 血液生化指标测定   注射后第4天,第15天取注射细菌浓度0.5亿/毫升,药饵浓度0%、0.5%、2%、生药、对照5组试验鱼,每组取6-9条鱼采血(3-4ml),加入抗凝剂,注意不要溶血,用日本产7020血液自动生化分析仪检测血液生化指标。各组养殖条件及取血尽量保持一致。 

1.2.4血液生理指标测定 按照常规方法在注射后第4天,第9天,第15天,第21天,第27天对5组每组取鱼采血进行红细胞、白细胞计数,白细胞分类计数,血红蛋白测定。 

1.2.5中草药的急性毒性试验  先经过预备试验,每尾鲫鱼胸腔注射0.1ml复方中草药液,找出使鲫鱼全部存活的最大浓度(Dm)和全部死亡的最小浓度(Dn),再在这两个浓度之间按照等对数间距设两个浓度,试验设一次重复。 

.结果

太阳城集团 2.1 不同细菌浓度和药饵添加量时各组的死亡率

太阳城集团经过t检验,在0.5亿/毫升及在1亿/毫升菌液浓度下,药饵组2%和生药组与0%药饵组之间差异显著,药饵0.5%与0%药饵组差异不显著,药饵2%和生药组之间不显著。 

表1不同药饵浓度和不同细菌浓度时的死亡情况 

太阳城集团                       表2    方差分析

2.2 血液生化指标测定结果

太阳城集团血液生化指标中反映肝脏功能状态的有:谷丙转氨酶,谷草转氨酶,甘油三酯,胆固醇,总蛋白,白蛋白,球蛋白,白球比。当肝脏细胞受到损伤时血清转氨酶会升高,其它指标会下降。反映肾功能状态的有:尿素氮,肌酐,尿酸。反映心肌功能的有肌酸磷酸激酶。

谷丙转氨酶第二次测定结果比第一次上升,第一次测定结果0%药饵组比对照组下降,其他药饵组比0%药饵组上升;第二次测定结果所有数据接近(见图1)。        

谷草转氨酶第二次测定结果比第一次升高,第一次测定0%药饵组比对照下降,其他药饵组比0%药饵组升高;第二次0%药饵组比对照组上升,其他药饵组比0%药饵组相同或略低(见图2)。             

太阳城集团血清胆固醇测定结果第一次0%药饵组比对照下降,其他组升高;第二次0%药饵组比对照升高,其他组相同或下降(见图3)。

太阳城集团血清甘油三酯第二次测定结果比第一次升高,第一次测定0%药饵组比对照下降,其他药饵组比0%药饵组接近或上升;第二次0%药饵组比对照组上升,其他药饵组比0%药饵组上升或接近(见图4)。 

血清总蛋白第一次测定0%药饵组比对照下降,其他药饵组比0%药饵组上升,0.5%药饵组例外;第二次测定结果所有组接近(见图5)。 

血清白蛋白第一次测定0%药饵组比对照下降,其他药饵组比0%药饵组上升,0.5%药饵组例外下降;第二次测定结果0%药饵组比对照下降,其它药饵组比0%药饵组略下降(见图6)。   

血清球蛋白第一次测定0%药饵组比对照下降,其他药饵组比0%药饵组上升,0.5%药饵组例外下降;第二次测定结果所有组数值接近(见图7)。           

血清白球比第一次测定0%药饵组比对照下降,其他药饵组比0%药饵组相同,0.5%药饵组例外上升;第二次测定结果试验组比对照组低(见图8)。

太阳城集团血清肌酐第一次测定0%药饵组比对照上升,其他药饵组比0%药饵组相近或下降;第二次测定结果0%药饵组比对照组高,其它药饵组比0%药饵组略高,生药组例外降低(见图9)。 

血清尿素氮第一次测定0%药饵组比对照上升,其他药饵组比0%药饵组下降;第二次测定结果0%药饵组比对照组低,其它药饵组比0%药饵组高,生药组例外相同(见图10)。 

太阳城集团血清尿酸第一次测定0%药饵组比对照上升,其他药饵组比0%药饵组上升,0.5%药饵组例外下降;第二次测定结果0%药饵组比对照组 

高,其它药饵组比0%药饵组高,生药组低例外(见图11)。

  

太阳城集团血清胆红素第一次测定0%药饵组比对照下降,其他药饵组比0%药饵组上升,0.5%药饵组例外下降;第二次测定结果0%药饵组比对照组低,其它药饵组比0%药饵组高, 0.5%药饵组例外相同(见图12)。

血清肌酸磷酸激酶第一次测定0%药饵组比对照上升,其他药饵组比0%药饵组下降;第二次测定结果0%药饵组比对照组高,其它药饵组比0%药饵组低, 生药药饵组例外升高(见图13)。 

细菌感染并投喂药饵后血液生理指标:

太阳城集团血液红细胞变化规律:如图14所示,各药饵组红细胞在不同病程太阳城集团中呈现上升的过程,各药饵组红细胞数量比同期对照组红细胞数量少,与0%药饵组相比,其他药饵组红细胞数量要高于0%药饵组同期红细胞数量。

血液白细胞变化规律:如图15所示,各试验组经历了先下降后略上升的过程,以病程最初第4天最高,15天左右试验组白细胞数量降低到对照组以下。与0%药饵组相比,其他药饵组变化的幅度要小。 

 血液血红蛋白变化规律:如图16所示,试验组血红蛋白在病程中呈现上升的过程。各药饵组血红蛋白数量比同期对照组血红蛋白数量少,与0%药饵组相比,其他药饵组血红蛋白数量要高于0%药饵组同期血红蛋白数量。 

太阳城集团白细胞中的淋巴细胞变化规律:如图17所示,各药饵组血液淋巴细胞在白细胞中的比例在病程中呈现上升的过程。第4天0%药饵组淋巴细胞所占比例最低,其他药饵组淋巴细胞所占比例高于0%药饵组但是都低于对照组。 

太阳城集团如图18所示,对照组血液中的粒细胞比例在不同病程太阳城集团几乎呈一条直线,各药饵组血液中的粒细胞在白细胞中的比例在第四天最高,以后呈现下降趋势,第15天后各药饵组与对照组相近。与0%药饵组相比,其他药饵组变化的幅度要小。 

  

太阳城集团 2.4中草药提取液对鲫鱼的急性毒性试验结果:

太阳城集团按照寇氏法计算得出复方提取液24hLC50=1.207g/ml, 48hLC50=1.101g/ml,安全剂量0.785g/kg。

太阳城集团中草药复方提取液对鲫鱼急性毒性试验结果 

3.分析讨论

太阳城集团 3.1复方总有效成分提取液药效机理

复方提取液对肝脏、肾脏和心肌的炎症损伤具有恢复作用,分析其机理是:1.抗炎。复方提取液中的黄酮类有效成分能够通过抑制可诱导的一氧化氮合酶,减少毛细血管内皮细胞释放一氧化氮,调节花生四烯酸(AA)的代谢,抑制前列腺素E2(PGE2)和白三烯(LTC4)的合成,其中以黄芩素和黄芩甙作用最强,而且存在量效关系。炎症组织中前列腺素E2(PGE2)和白三烯(LTC4)等炎性介质成分减少后,毛细血管通透性下降,白细胞游出减少,蛋白渗出亦随之减少,导致炎症反应减轻,组织肿胀程度下降。2.杀菌解毒。复方中的黄酮类、蒽醌类和有机酸等有效成分具有强烈的抑菌作用,对消除细菌内毒素对组织的损伤具有很好的效果。细菌内毒素可以引起发热、可诱发氧衍生自由基引起脂质过氧化损伤,造成亚细胞及组织损害,造成器官损伤代谢失调,可引起血微循环障碍导致弥散性血管内凝血(DIC)现象等。黃芩具有清热解毒作用,通过降低脑脊液环磷酸腺苷(cAMP)含量而拮抗细菌内毒素致热活性,邓则明证实黄芩的抗自由基作用是通过提高线粒体、溶酶体等内源性超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶等酶的活性而加速清除的,地锦草所含的黄酮类成分也具有清除和抑制羟基自由基的作用,黄芩和地锦草还具有止血、改善血管微循环,直接破坏内毒素的作用。

不同浓度药饵防治效果比较:     

太阳城集团2%药饵组和生药组药效显著,0.5%药饵组药效不明显。总起来说在两种浓度菌液感染下,2%药饵组的药效都比较显著。

试验组病鱼的血液生化指标变化分析:

反映肝脏功能的血液生化指标变化分析:转氨酶称氨基转移酶,在健康鱼类血液中的转氨酶活力很小,肝组织中的转氨酶活力高。肝脏损伤后肝组织中的转氨酶就会释放入血液中,引起血清转氨酶升高。血清中的白蛋白全部由肝细胞制造,而球蛋白则由肝脏内网状内皮系统细胞所产生,当肝脏有实质性病变时,白蛋白减少,白球比的显著变化反映肝脏的慢性炎症。甘油三酯是机体贮存能量的形式,肝脏是合成胆固醇和甘油三酯的主要场所。当肝脏有实质性病变时合成功能就降低。米瑞芙(1993)研究得出鲢鱼患败血病后总蛋白、白蛋白、球蛋白是减少的,甘油三酯增加(不显著),胆固醇没多大变化,血清转氨酶显著增高。吴垠(1998)研究得出中国对虾患爆发性流行病后总蛋白、白蛋白是减少的,甘油三酯增加,血清转氨酶显著增高。此次试验结果鲫鱼患细菌性败血病后测得转氨酶略降低,甘油三酯和胆固醇下降,其它肝功能指标变化相同。分析血清转氨酶降低的原因是发病初期肝脏损伤并不严重,肝组织中的转氨酶还没有释放到血清中,血液中的氨基酸代谢降低,甘油三酯和胆固醇下降说明了肝脏损伤、合成功能下降,还与病鱼不摄食有关。投喂药饵组比0%药饵组第一次测定转氨酶增加,改变了病鱼转氨酶的下降。总的来说,药饵组的病鱼指标变化与0%药饵组相反,说明药饵改善了肝组织的炎症损伤,使肝功能恢复到接近对照组水平。

反映肾脏功能的血液生化指标变化分析:尿素、尿酸、肌酐是蛋白质代谢产物,均经过肾小球过滤而排于尿中,虽然每天摄食含氮物多少不同,但是血液中非蛋白氮含量维持在一定的水平。当肾脏功能受损后,血液中的非蛋白氮就会升高,尤其以尿酸增高显著。米瑞芙(1993)研究得出鲢鱼患败血病后尿素、尿酸、肌酐显著增加。此次试验结果由肾功能指标柱形图可以看出,感染后只投喂饲料的病鱼肾功能指标上升,肾功能受损,投喂药饵的病鱼与投喂0%药饵组的比较,肾功能指标下降。说明药饵改善了肾脏的受损状态。 

胆红素是血红蛋白分解的产物,间接胆红素不容易通过肾排泄,是肝胆疾病和血液疾病的一个检测指标。造成其上升的因素有:(1)溶血,红细胞大量破坏,过多的血红蛋白分解产生胆红素;(2)肝实质细胞损伤,肝细胞不能正常的把血液中的胆红素转化和清除;(3)胆汁排泄受阻;(4)饥饿状态。造成其下降的因素则相反。米瑞芙(1993)研究得出鲢鱼患败血病后血清胆红素显著增加。此次试验结果由胆红素指标柱形图可以看出,感染后只投喂饲料的病鱼胆红素下降,这与病鱼贫血,血红蛋白减少有关。投喂药饵组的病鱼相对则增加,药饵起了止血、改善血液微循环、减轻了细菌毒素对造血器官损伤的作用。 

太阳城集团心肌功能指标变化分析:肌酸磷酸激酶催化ADP(二磷酸腺苷)和肌酸磷酸生成肌酸+ATP(三磷酸腺苷),很多细胞都含有该酶,但是只有心肌和骨骼肌的肌酸磷酸激酶数量能改变血清中肌酸磷酸激酶的含量。心肌细胞受损或通透性增高时就会将该酶释放到血液中,骨骼肌严重出血,肌纤维的变性与坏死及明显的病理改变,也是血清肌酸磷酸激酶升高的原因。米瑞芙(1993)研究得出鲢鱼患败血病后肌酸磷酸激酶显著增加。此次试验结果由肌酸磷酸激酶指标柱形图可以看出,感染后只投喂饲料的病鱼指标显著上升,心肌功能受损,投喂药饵的病鱼与投喂非药饵组的比较,肌酸磷酸激酶指标下降,说明药饵改善了心肌的受损状态。 

试验组病鱼的血液生理指标变化分析: 

红细胞:影响鱼类血液中红细胞数量的因素很多。例如溶解氧的多少、运动强度、性腺发育的成熟度、饵料质量、机体功能状态等,都会使红细胞的数量发生变化。本实验溶解氧充足,而且每天投喂相同质量的饵料,实验过程中其他条件完全一致。因此,病鱼的造血功能状态是唯一影响血液红细胞数量的因子。注射病原菌后,试验组的红细胞的数量下降,病鱼的造血器官受损,出现贫血症状,药饵组病鱼的红细胞在病程中上升,说明病鱼贫血症状出现好转并逐渐恢复。

太阳城集团白细胞:与空白组比较,0%药饵组病鱼白细胞经历了一个先剧烈上升再回落又略升高的过程,在疾病初期,注射后4天,白细胞剧烈上升属于细菌感染引起的免疫反应,再过一周后,白细胞开始下降,半个月后白细胞比空白对照组低,以后又开始缓缓回升;药饵组病鱼的白细胞变化差异要小一些,在15天以后,药饵组病鱼比0%药饵组白细胞数目多,说明药饵组病鱼的机体非特异性免疫功能状态好一些,药饵有了一定的治疗效果;由于细菌性感染而患出血性败血症的病鱼,其白细胞数目有显著的改变,但细胞是增加还是减少,文献报道很不一致,史成银等认为可能与疾病的病程有关,这在Klontz等的研究中也有报道。血红蛋白也是逐渐上升的,说明病鱼的运输氧气功能增强,呼吸功能增强,机体代谢增强;粒细胞在白细胞中的比例在疾病的早期是比较大的,这与细菌感染炎症引起非特异性免疫应答,吞噬作用大大增强有关,随后是逐步下降的,淋巴细胞的比例相应的升高,单核细胞的比例没有多大变化。 

中草药提取液的急性毒性试验:

试验结果按照中草药急性毒性试验毒性标准判定其为低毒性(1.5g/kg<LD50<5g/kg)。所以该复方提取物可以作为药饵添加。

  

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