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一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法.pdf

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一种 PEG 苜蓿 组织 再分 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610082224.0

申请日:

20160205

公开号:

CN105660404A

公开日:

20160615

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01H4/00,A01H1/06 主分类号: A01H4/00,A01H1/06
申请人: 齐齐哈尔大学
发明人: 李波,贾秀峰,赵宇佳,徐婉玉,马赫,陈雪梅
地址: 161006 黑龙江省齐齐哈尔市建华区文化大街42号
优先权: CN201610082224A
专利代理机构: 哈尔滨市松花江专利商标事务所 代理人: 侯静
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201610082224.0

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法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,本发明属于生物技术育种领域,它为了解决现有常规育种方法得到的苜蓿抗旱性较差,移栽成活率不高的问题。苜蓿愈伤组织再分化的方法:一、经NaN3诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织置于MS固体培养基中继代培养;二、块状愈伤组织接种到含有NAA和6-BA的芽分化MS培养基上进行培养,得到分化出芽的苜蓿组织;三、再将出芽的苜蓿组织放入生根培养基中培养,得到分化出根的苜蓿组织;四、苜蓿幼苗的驯化与移栽。本发明抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法简便易行,移栽成活率达到90%以上,并通过此愈伤组织再分化的方法获得抗旱育种材料。

权利要求书

1.一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于是通过下列步骤实现:一、将经NaN诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织接种于MS固体培养基中,在23~25℃下培养,每日光照射12h,1000Lx光照强度,培养18~22d完成1次继代,重复继代培养多次,得到继代培养后的愈伤组织;二、将步骤一得到的继代培养后的愈伤组织分割成块状,然后接种到含有NAA和6-BA的芽分化MS培养基上,在温度为23~25℃,每日光照射16h,2000~4000Lx光照度的条件下进行培养,得到分化出芽的苜蓿组织;三、将分化出芽的苜蓿组织在分芽处切断成两段,分段后移接到以1/2MS或MS为基本培养基的生根培养基上,在温度为23~25℃,1000~2000Lx的光照度,每天光照16h的条件下在培养瓶中进行培养,得到分化出根的无菌苗;四、当分化出根的无菌苗长到2~3cm并有4~5条粗壮根系时,在培养室内将培养瓶口打开,进行2~5d的炼苗,然后挑选株高为4~5cm,并有4~5条粗壮根系的幼苗移栽到营养土中进行培养,完成抗PEG苜蓿愈伤组织的再分化;其中步骤二所述的芽分化MS培养基为MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂;当步骤三所述的生根培养基以1/2MS为基本培养基时,生根培养基为1/2MS+0.15mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L琼脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭;当步骤三所述的生根培养基以MS为基本培养基时,生根培养基中含有0.05~0.10mg/LNAA、1.0~1.5mg/LIBA、0~2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L琼脂、0.5g/L的活性炭和15ml铁盐母液,其中所述的铁盐母液是将2~3gFeSO·7HO和3~4gNa-EDTA溶于1L去离子水中得到的。2.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于步骤一所述的经NaN诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织按下列步骤实现:将苜蓿愈伤组织分割成块状,然后转入含有浓度为200mg/LNaN的液体诱变培养基中进行振荡培养,静止1h后得到诱变后的愈伤组织,再将诱变后的愈伤组织转入含有8mmol/L的L-Hyp和质量百分含量为30%PEG的含PEG的MS培养基中进行培养,存活的愈伤组织再转入MS固体培养基中培养,依次在含PEG的MS培养基和MS固体培养基上培养进行交替筛选。3.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于步骤一所述的MS固体培养基为MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2,4-D+30g蔗糖+0.8%琼脂,pH=5.8。4.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于步骤二继代培养后的愈伤组织分割成0.5cm的块状。5.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于将步骤二得到的分化出芽的苜蓿组织再转入壮芽培养基中进行培养,壮芽培养基为:MS+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂。6.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于步骤三所述的铁盐母液是将2.78gFeSO·7HO和3.73gNa-EDTA溶于1L去离子水中得到的。7.根据权利要求6所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于步骤三的生根培养基为MS+1.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+2.00mg/L6-BA+15ml铁盐母液+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭。8.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于步骤三在温度为23~25℃,2000~4000Lx的强光照度,每天光照16h的条件下在培养瓶中进行培养22~28d。9.根据权利要求1所述的一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法,其特征在于步骤四幼苗移栽到营养土中在环境湿度为70%~80%的条件下进行培养。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术育种领域,具体涉及一种抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法。

背景技术

太阳城集团紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上广泛分布且享有盛誉的优良牧草,被称为“牧草之王”,不仅能改良土壤,还可以增加优质蛋白质,是发展优质高效畜牧业的物质基础,也是人类有益健康与保健的食用植物之一。

太阳城集团我国苜蓿产业的发展严重受到种质资源的限制,缺乏适应不同地区苜蓿品种的种子,为了满足现代化畜牧业发展的需要,扩大苜蓿的种植面积,培育、繁殖适应不同生境条件不同使用目的的苜蓿品种,已成为发展我国苜蓿产业的主要问题之一。

太阳城集团中国苜蓿育种通常采用选择育种、杂交育种、雄性不育系育种、生物技术辅助育种、航天育种等方法。各种方法均有应用,应用较多的是选择育种和杂交育种。我国目前已选育出的苜蓿新品种均采用了常规育种技术和方法(引种选择、鉴定筛选、杂交育种)。国内育成的品种都是采用传统的常规育种技术和方法育成的,普遍采用的是引种驯化、人工选择、杂交育种、诱变育种、鉴定筛选等育种方法,而细胞诱变、细胞融合、杂种胚培养等细胞工程现代生物技术在牧草育种中的应用几乎还是空白。利用现代植物组织培养等生物技术选育出的品种尚未见报道。目前,我国登记的品种当中没有单纯应用生物技术育成的品种。较多的研究集中于抗性基因的转化与基因表达,以提高苜蓿的抗性。选育适应干旱、严寒、沙化、盐碱化等不同生态条件的苜蓿品种对保护生态环境、充分利用国土资源、满足市场对草饲性畜产品的需求有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有常规育种方法得到的苜蓿抗旱性较差,移栽成活率不高的问题,而提供对干旱具有抗性的苜蓿愈伤组织再分化成芽和根的方法。

本发明抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法按下列步骤实现:

太阳城集团一、将经NaN3诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织(茎段为外植体)接种于MS固体培养基中,在23~25℃下培养,每日光照射12h,1000Lx光照强度,培养18~22d(天)完成1次继代,重复继代培养多次,得到继代培养后的愈伤组织;

二、将步骤一得到的继代培养后的愈伤组织分割成块状,然后接种到含有NAA和6-BA的芽分化MS培养基上,在温度为23~25℃,每日光照射16h,2000~4000Lx光照度的条件下进行培养,得到分化出芽的苜蓿组织;

三、将分化出芽的苜蓿组织在分芽处切断成两段,分段后移接到以1/2MS或MS为基本培养基的生根培养基上,在温度为23~25℃,1000~2000Lx的光照度,每天光照16h的条件下在培养瓶中进行培养,得到分化出根的无菌苗;

四、当分化出根的无菌苗长到2~3cm并有4~5条粗壮根系时,在培养室内将培养瓶口打开,进行2~5d的炼苗,然后挑选株高为4~5cm,并有4~5条粗壮根系的幼苗移栽到营养土中进行培养,完成抗PEG苜蓿愈伤组织的再分化;

太阳城集团其中步骤二所述的芽分化MS培养基为MS+2.0mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2mg/LNAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂;

太阳城集团当步骤三所述的生根培养基以1/2MS为基本培养基时,生根培养基为1/2MS+0.15mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L琼脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭;

当步骤三所述的生根培养基以MS为基本培养基时,生根培养基中含有0.05~0.10mg/LNAA、1.0~1.5mg/LIBA(吲哚丁酸)、0~2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L琼脂、0.5g/L的活性炭和15ml铁盐母液,其中所述的铁盐母液是将2~3gFeSO4·7H2O和3~4gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶于1L去离子水中得到的。

本发明抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法简便易行,所使用的愈伤组织易获得胚性愈伤组织,在筛选的芽和根的分化培养基上易成苗,移栽成活率高,不受季节的限制,且使用的化学诱变剂具有高效、无毒、便宜及使用安全等优点,可通过此方法获得抗旱育种材料。研究和建立该种植物的愈伤组织诱导、分化培养和植株再生,对建立该种苜蓿植物完善的组培体系和苜蓿抗逆性育种基础材料的获得具有其现实意义。

附图说明

图1为实施例通过愈伤组织再分化得到的苜蓿苗的实物图。

具体实施方式

太阳城集团具体实施方式一:本实施方式抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法按下列步骤实现:

一、将经NaN3诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织(茎段为外植体)接种于MS固体培养基中,在23~25℃下培养,每日光照射12h,1000Lx光照强度,培养18~22d(天)完成1次继代,重复继代培养多次,得到继代培养后的愈伤组织;

二、将步骤一得到的继代培养后的愈伤组织分割成块状,然后接种到含有NAA和6-BA的芽分化MS培养基上,在温度为23~25℃,每日光照射16h,2000~4000Lx光照度的条件下进行培养,得到分化出芽的苜蓿组织;

三、将分化出芽的苜蓿组织在分芽处切断成两段,分段后移接到以1/2MS或MS为基本培养基的生根培养基上,在温度为23~25℃,1000~2000Lx的光照度,每天光照16h的条件下在培养瓶中进行培养,得到分化出根的无菌苗;

太阳城集团四、当分化出根的无菌苗长到2~3cm并有4~5条粗壮根系时,在培养室内将培养瓶口打开,进行2~5d的炼苗,然后挑选株高为4~5cm,并有4~5条粗壮根系的幼苗移栽到营养土中进行培养,完成抗PEG苜蓿愈伤组织的再分化;

太阳城集团其中步骤二所述的芽分化MS培养基为MS+2.0mg/L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)+0.2mg/LNAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+10g/L琼脂;

太阳城集团当步骤三所述的生根培养基以1/2MS为基本培养基时,生根培养基为1/2MS+0.15mg/LNAA+30g/L蔗糖+30g/L琼脂+0.5g/L活性炭或1/2MS+0.05mg/LNAA+1.5mg/LIBA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭;

太阳城集团当步骤三所述的生根培养基以MS为基本培养基时,生根培养基中含有0.05~0.10mg/LNAA、1.0~1.5mg/LIBA(吲哚丁酸)、0~2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、30g/L琼脂、0.5g/L的活性炭和15ml铁盐母液,其中所述的铁盐母液是将2~3gFeSO4·7H2O和3~4gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶于1L去离子水中得到的。

太阳城集团本实施方式步骤一为愈伤组织的继代培养过程,步骤二进行愈伤组织芽的分化,步骤三进行愈伤组织根的分化,最后进行幼苗的驯化与移栽。

本实施方式利用植物组织培养技术对苜蓿茎段进行愈伤组织的诱导、叠氮化钠化学诱变和PEG-6000渗透模拟干旱胁迫,获得抗PEG的苜蓿愈伤组织。愈伤组织的分化是指愈伤组织在外界条件满足时,细胞再分化形成芽和根的分生组织,并由其发育成完整植株的过程。苜蓿愈伤组织的分化是建立苜蓿再生体系关键的一步。愈伤组织在多次继代培养、诱变处理、逆境胁迫处理后严重影响其再分化的能力,在适宜的离体培养条件下,通过外源激素的诱导,紫花苜蓿愈伤组织可以分化形成再生苗,通过组合试验设计,筛选出适宜的芽和根分化外源激素组合。

具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的经NaN3诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织按下列步骤实现:将苜蓿愈伤组织分割成块状,然后转入含有浓度为200mg/LNaN3的液体诱变培养基中进行振荡培养,静止1h后得到诱变后的愈伤组织,再将诱变后的愈伤组织转入含有8mmol/L的L-Hyp(L-羟脯氨酸)和质量百分含量为30%PEG的含PEG的MS培养基中进行培养,存活的愈伤组织再转入MS固体培养基中培养,依次在含PEG的MS培养基和MS固体培养基上培养进行交替筛选。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

太阳城集团具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一所述的MS固体培养基为MS+0.5mg/L6-BA(6-苄基氨基嘌呤)+2.0mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+30g蔗糖+0.8%琼脂,pH=5.8。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

本实施方式琼脂的百分含量指质量百分含量。

具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二继代培养后的愈伤组织分割成0.5cm3的块状。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

太阳城集团具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是将步骤二得到的分化出芽的苜蓿组织再转入壮芽培养基中进行培养,壮芽培养基为:MS+2.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三所述的铁盐母液是将2.78gFeSO4·7H2O和3.73gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶于1L去离子水中得到的。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

太阳城集团具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式六不同的是步骤三的生根培养基为MS+1.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+2.00mg/L6-BA+15ml铁盐母液+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。

太阳城集团本实施方式通过增加生根培养基中铁盐的含量,能够增加苜蓿组织的培养周期。

太阳城集团具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤三在温度为23~25℃,2000~4000Lx的强光照度,使苜蓿愈伤组织变绿,利于获得胚性愈伤组织,每天光照16h的条件下在培养瓶中进行培养22~28d。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤四幼苗移栽到营养土中在环境湿度为70%~80%的条件下进行培养。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

实施例一:本实施例抗PEG苜蓿愈伤组织再分化的方法按下列步骤实现:

一、将经NaN3诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织(茎段为外植体)接种于MS固体培养基中,在25℃下培养,每日漫射光照射12h,1000Lx光照强度培养20d(天)完成1次继代,重复继代培养2次,得到继代培养后的愈伤组织;

二、将步骤一得到的继代培养后的愈伤组织分割成0.5cm3块状,然后接种到含有不同比例NAA和6-BA的芽分化MS培养基(见表1)上,在温度为25℃,每日光照射16h,3000Lx光照度的条件下进行培养,得到分化出芽的苜蓿组织,然后再移接到壮芽培养基中进行培养,壮芽培养基为:MS+2.0mg/L的6-BA+30g/L的蔗糖+10g/L的琼脂;

太阳城集团三、将分化出芽的苜蓿组织在分芽处切断成两段,两段分别移接到不同生根培养基(见表2)上,在温度为25℃,1000Lx的光照度,每天光照16h的条件下在培养瓶中进行培养,得到分化出根的无菌苗,起初根生长较少,需要转接2-3次之后方才能长出足够多的根;

太阳城集团四、当分化出根的无菌苗长到2~3cm并有4~5条粗壮根系时,在培养室内将培养瓶口打开,进行2~5d的炼苗,然后挑选株高为4~5cm,并有4~5条粗壮根系的试管苗移栽到营养土中进行培养,完成抗PEG苜蓿愈伤组织的再分化。

太阳城集团本实施例首先选取子粒饱满的敖汉苜蓿种子,经0.1%升汞溶液消毒5min,用无菌水冲洗3~4次后将苜蓿种子置于MS固定培养基,在23±2℃的培养箱中培养一周后即得到无菌幼苗,然后将无菌幼苗从培养基中取出,置于无菌滤纸上,切成1cm的茎段,接种于MS固体培养基(MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L2,4-D+30g蔗糖+0.8%琼脂,pH=5.8)中,在25℃下培养,漫射光每日照射12h,选取生长了20d白色、松脆的愈伤组织。步骤一中经NaN3诱变和PEG胁迫处理后的苜蓿愈伤组织是将苜蓿愈伤组织分割成0.5cm3的均匀块体,转入NaN3200mg/L的液体培养基中,每瓶10块,70r/min振荡培养1h,静止1h后对存活的愈伤组织进行继代培养,诱变后的愈伤组织转入含L-Hyp8mmol/L和30%PEG(PEG-6000)的MS培养基(其它成分同诱导培养基)进行交替筛选,培养条件同前,存活的愈伤组织扩大培养。

表1不同6-BA和NAA配比芽分化

通过表1确定最佳生芽培养基为:MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+10g/L琼脂。若所需芽的数量很大时,需要扩大培养,可在芽分叉处将芽切开,移接到最适壮芽培养基上继续培养,期间注意更换培养基,否则芽可能因为营养成分耗尽褐变死亡。

太阳城集团本实施例步骤二愈伤组织在诱导生芽培养基上培养一段太阳城集团后,可以发现原来黄绿色的愈伤组织逐渐变绿,继续培养一段太阳城集团可以发现有的培养基上长出小芽。在芽移接过程中带有少量愈伤组织,有未生芽的愈伤组织可继续移接到生芽培养基继续诱导生芽。步骤三在生根过程中在培养基中加入活性炭,从而为生根制造黑暗环境。

本实施例步骤三芽移栽到生根培养基中培养一段太阳城集团后,观察发现有白色的根生出,起初根生长较少,需要转接2-3次之后方才能长出足够多的根,培养基不同配比下生根的情况见表2。生根培养基:MS+1.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+2.00mg/L6-BA+15mL铁盐母液+30g/L蔗糖+10g/L琼脂+0.5g/L活性炭为最适生根培养基,其中铁盐母液是将2.78gFeSO4·7H2O和3.73gNa2-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶于1L去离子水中得到的。培养出的幼苗不仅根长、多、壮,且培养周期长。本实施例幼苗移栽成活率能够达到90%以上。

太阳城集团表2不同配比激素的培养基中生根情况

下表显示诱变和未诱变的苜蓿叶片的脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性在诱变前后的差异显著,诱变后脯氨酸含量、可溶性糖含量、POD活性明显增高,表明分化的苜蓿幼苗抗旱能力的增强。

太阳城集团表3苜蓿叶片脯氨酸含量、可溶性糖含量和POD活性

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