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一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法.pdf

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一种 提高 菊花 体细胞 再生 效率 培养 方法
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摘要
申请专利号:

CN201210070183.5

申请日:

20120316

公开号:

太阳城集团CN102524080A

公开日:

20120704

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01H4/00 主分类号: A01H4/00
申请人: 北京农业生物技术研究中心
发明人: 黄丛林,张秀海,吴忠义,罗昌,程曦,梁宏霞,于子婷,李春华
地址: 100097 北京市海淀区曙光花园中路9号市农林科学院生物中心
优先权: CN201210070183A
专利代理机构: 北京国林贸知识产权代理有限公司 代理人: 李桂玲;孔祥玲
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法律状态
申请(专利)号:

CN201210070183.5

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明属于组织培养技术领域,特别涉及一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,该方法将菊花的茎段外植体培养成为无菌苗后,再取叶盘外植体于诱导培养基,进行体细胞胚诱导培养,得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。本发明仅采用一种诱导培养基即可直接诱导叶盘外植体得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚,菊花体细胞胚再生效率高,遗传稳定,操作简便;在体细胞胚诱导培养中先进行暗培养再进行光照培养,明显提高再生效率;避免使用激动素(KT)配制培养基,降低了培养成本。

权利要求书

1.一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:该培养方法包括以下步骤:Ⅰ、消毒处理:A、选取菊花的茎段外植体,进行表面消毒处理;该表面消毒处理为:先将所述的茎段外植体用自来水冲洗,再放入吐温溶液中浸泡,得到表面消毒的茎段外植体;B、将所述的表面消毒的茎段外植体转入超净台中,用酒精溶液浸泡,再用NaClO溶液浸泡,最后用灭菌的蒸馏水冲洗,得到灭菌后的茎段外植体;Ⅱ、无菌苗培养:将所述的灭菌后的茎段外植体转入生根培养基,进行无菌苗培养,得到无菌苗;Ⅲ、体细胞胚诱导培养:将所述的无菌苗的叶片剪成叶盘外植体,转入诱导培养基,进行体细胞胚诱导培养,得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。2.根据权利要求1所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:步骤Ⅱ中,所述的生根培养基是以MS基本培养基成分中的大量元素减为原来的1/2、其他成分不变,得到的1/2MS培养基为基础,添加α-萘乙酸 (NAA)0.1mg/L;步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2-3.5mg/L。3.根据权利要求1或2所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)3mg/L。4.根据权利要求1或2所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2mg/L。5.根据权利要求1或2所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.8mg/L。6.根据权利要求1或2所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)3.2mg/L。7.根据权利要求1或2所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为8-12天。8.根据权利要求7所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养的温度为25°C;所述的光照培养中,光/暗周期为16h/8h。 9.根据权利要求1或2所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:所述的叶盘外植体源于苗龄18-20天的所述的无菌苗顶部第1-5片叶片。10.根据权利要求1或2所述的提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,其特征在于:所述的菊花的品种为 “神马”。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明属于组织培养技术领域,特别涉及一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,该方法将菊花的茎段外植体培养成为无菌苗后,再取叶盘外植体于诱导培养基,进行体细胞胚诱导培养,得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。 

背景技术

太阳城集团菊花是中国的传统名花之一,在中国已有两千多年的栽培历史;同时也是世界重要的四大鲜切花之一。切花菊 ‘神马’(Chrysanthemum morifolium Tzvel.)是1987年在日本静冈县滨松市特种园艺所培育成功的白色秋菊品种, 从每年10月到次年5月一直在日本白菊市场上占有主导地位(邱美欢等,2008)。‘神马’的再生频率比较低,徐清燏(2005)用‘神马’叶片做外植体,不定芽诱导率为18.5%。孙庆春(2009)研究‘神马’叶片再生频率达到61.7%,再生频率依然不高。

植物体细胞胚发生是植物界存在的一种普遍现象。植物体细胞胚发生(somatic embryogenesis)是指体细胞在特定条件下,未经性细胞融合而通过与合子胚类似的发育途径形成新个体的形态发生过程。经体细胞胚发生过程形成的类似合子胚的结构称为胚状体或体细胞胚。近年来太阳城集团观赏花的体细胞胚的研究比较多,在牡丹(周仁超等2001;周秀梅等2008;Bouza等1994),月季(郭丽娟等2007;Dohm等2001;Kim等2003),仙客来(卞福花2008;Takejiro等1995;Traud等2005),梅花(宁国贵等2010;Cheong等2004;Tanaka等2000),地被菊(蒋细旺等2007;蒋细旺等2008)等花卉品种已有报道。但是,国内外文献中尚无太阳城集团切花菊‘神马’体细胞胚的研究的报道。高效 ‘神马’体细胞胚再生技术的建立是通过转基因技术改良‘神马’花卉品质的基础。  

太阳城集团中国专利申请《一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法》(申请号:201010267217.0,公开号:CN101983555A)公开了一种诱导菊花体细胞胚间接发生的方法,该方法包括从外植体中诱导出胚性愈伤组织,再将其连续转接到两种不同的培养基中诱导体细胞胚的间接分化,得到菊花稳定的再生植株;该方法应用的菊花品种为“玉人面”、“铺地金”、“紫研”。该方法采用两种不同的培养基诱导体细胞胚的间接分化,步骤较繁琐,体细胞胚再生效率有限,且容易影响再生植株的遗传稳定性;该方法的胚性愈伤组织分化培养基中添加有价格昂贵的激动素(KT),配制培养基的成本高,不利于开展大规模的组织培养工作。

所以,在改良花卉品质的科研工作中需要一种直接诱导体细胞胚生长的、提高体细胞胚再生效率、成本低廉的“神马”菊花组织培养方法。

发明内容

本发明提供一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,该方法将菊花的茎段外植体培养成为无菌苗后,再取叶盘外植体于诱导培养基,进行体细胞胚诱导培养,得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,该培养方法包括以下步骤:

Ⅰ、消毒处理: 

太阳城集团A、选取菊花的茎段外植体,进行表面消毒处理;该表面消毒处理为:先将所述的茎段外植体用自来水冲洗,再放入吐温溶液中浸泡,得到表面消毒的茎段外植体;

B、将所述的表面消毒的茎段外植体转入超净台中,用酒精溶液浸泡,再用NaClO溶液浸泡,最后用灭菌的蒸馏水冲洗,得到灭菌后的茎段外植体;

Ⅱ、无菌苗培养:

太阳城集团将所述的灭菌后的茎段外植体转入生根培养基,进行无菌苗培养,得到无菌苗;

Ⅲ、体细胞胚诱导培养:

将所述的无菌苗的叶片剪成叶盘外植体,转入诱导培养基,进行体细胞胚诱导培养,得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。

优选地,步骤Ⅱ中,所述的生根培养基是以MS基本培养基成分中的大量元素减为原来的1/2、其他成分不变,得到的1/2MS培养基为基础,添加α-萘乙酸 (NAA)0.1mg/L;

优选地,步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2-3.5mg/L。

太阳城集团优选地,步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为8-12天。

优选地,步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养的温度为25°C,光/暗周期为16h/8h,光照强度为2000-2500lx。 

优选地,所述的叶盘外植体源于苗龄18-20天无菌苗顶部第1-5片叶片。

太阳城集团优选地,所述的菊花的品种为“神马”。

太阳城集团本发明与已有技术相比具有如下优点:

本发明仅采用一种诱导培养基直接诱导叶盘外植体得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚,菊花体细胞胚再生效率高,遗传稳定,操作简便;本发明在体细胞胚诱导培养中先进行暗培养再进行光照培养,明显提高再生效率;本发明避免使用激动素(KT)配制培养基,降低了培养成本。

附图说明

太阳城集团图1:叶盘外植体的生成体细胞的胚的过程中倒置显微镜下的体细胞胚切片的相片。

太阳城集团图2:叶盘外植体的生成体细胞胚的过程中外部形态变化的相片。

图3 :叶盘外植体生成体细胞胚的过程中内部细胞形态变化的相片。

具体实施方式

实施例1:

一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法,该培养方法包括以下步骤:

Ⅰ、消毒处理: 

A、选取菊花的茎段外植体,进行表面消毒处理;该表面消毒处理为:先将所述的茎段外植体用自来水冲洗,再放入体积比为0.1%的吐温溶液中浸泡20 min,得到表面消毒的茎段外植体;

太阳城集团所述的菊花的品种为市售的“神马”;

太阳城集团所述的茎段外植体的选取方式为:选取菊花未开花植株上部幼嫩枝段,将该枝段剪掉叶片,以两个节间为一个单位截取长度为2-3cm,优选为2.5cm,作为所述的茎段外植体;

B、将所述的表面消毒的茎段外植体转入超净台中,用体积比为70%的酒精溶液浸泡1-3 min,再用体积比为10% 的NaClO溶液浸泡15-20 min,最后用灭菌的蒸馏水冲洗干净,得到灭菌后的茎段外植体;在上述用NaClO溶液浸泡过程中,可以进行震荡,以便NaClO溶液与所述的表面消毒的茎段外植体充分接触;

Ⅱ、无菌苗培养:

将所述的灭菌后的茎段外植体转入生根培养基,进行无菌苗培养,得到无菌苗;灭菌后的茎段外植体需要在转入之前将两端经消毒处理后变褐色的部位剪掉;所述的无菌苗培的养温度为25°C,光/暗周期为16h/8h,光照强度为2000-2500lx; 

太阳城集团所述的生根培养基是以MS基本培养基成分中的大量元素减为原来的1/2、其他成分不变,得到的1/2MS培养基为基础,添加α-萘乙酸 NAA 0.1mg/L;

太阳城集团Ⅲ、体细胞胚诱导培养:

太阳城集团将所述的无菌苗的叶片剪成叶盘外植体,转入诱导培养基,进行体细胞胚诱导培养,得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚。

所述的叶盘外植体源于苗龄18-20天的所述的无菌苗顶部第1-5片叶片;

太阳城集团所述的叶盘外植体的规格为1-10 mm×1-10mm ,优选为5 mm×5 mm,所述的叶盘外植体的背面叶脉处被解剖刀轻轻划有2-3道切口;所述的叶盘外植体将其近轴面接触所述的诱导培养基;

所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2-3.5mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA2-3.5mg/L)。

所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为8-12天。

步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养的温度为25°C;所述的光照培养的光/暗周期为16h/8h,光照强度为2000-2500lx。 

本实施例中,体细胞胚发生率为81%-92%,每个叶盘外植体产生的体细胞胚平均数为8-11 个。

计算方法为:

体细胞胚发生率=形成体细胞胚的叶盘数量/叶盘总数量×100%;

太阳城集团体细胞胚平均数=体细胞胚总数量/形成体细胞胚的叶盘数量;

太阳城集团本实施例所述的MS基本培养基组成为:

大量元素:     

硝酸钾(KNO3):190  mg/L,硝酸铵(NH4NO3):1650 mg/L,硫酸镁(MgSO4·7H2O):370 mg/L,磷酸二氢钾(KH2PO4):170 mg/L,氯化钙(CaCl2·2H2O):440 mg/L;

微量元素:

太阳城集团硫酸锰(MnSO4·H2O):16.9 mg/L,硫酸锌(ZnSO4·7H2O):8.6 mg/L,硼酸(H3BO3):6.2 mg/L,碘化钾(KI):0.83 mg/L,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O):0.25 mg/L,硫酸铜(CuSO4·5H2O):0.025 mg/L,

氯化钴(CoCl2·6H2O):0.025 mg/L;

铁盐:

太阳城集团二水合乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA):37.3 mg/L,硫酸亚铁(FeSO4·4H2O):27.8 mg/L;

有机:

太阳城集团甘氨酸:2.0 mg/L,盐酸吡哆醇 :0.5 mg/L,盐酸硫胺素 :0.1 mg/L,

烟酸 :0.5 mg/L,肌酸 :100 mg/L;

糖类:蔗糖: 30 g/L;

琼脂:6.4g/L;

所述的MS基本培养基的pH值为5.8。

本实施例中的生根培养基和诱导培养基,均需要于117°C进行高压灭菌17 min。

本实施例中,选取所述的菊花体细胞胚进行鉴定:

太阳城集团选取步骤Ⅲ中不同发育阶段的所述的胚性愈伤组织和菊花体细胞胚,切成2 mm3的块状,再进行FAA固定处理、注射器抽气处理、梯度酒精脱水处理,石蜡浸透包埋处理,得到厚度约8-10μm的切片,再将所述的切片进行染色和脱蜡处理、封片处理,得到切片标本成品,再进行观察鉴定体细胞胚。

具体步骤如下:

A、取材:选取不同发育阶段的胚性愈伤组织,将其切成2mm3的块状的材料;

B、固定:将上述切好的材料立即放入盛有FAA固定液(福尔马林 5ml,乙酸 5ml,70%乙醇 90ml)的小玻璃瓶中,注射器抽气约30min,固定24h,得到固定后的材料;

C、脱水:用70%、85%、95%的酒精溶液、无水酒精逐级脱水,每次2h,无水酒精置换两次,以上脱水用酒精用量为所述的固定后的材料的4-5倍,得到脱水后的材料;

太阳城集团D、透明: 透明剂选用二甲苯,步骤如下:2/3纯酒精+1/3二甲苯(2h),1/3纯酒精+2/3二甲苯(2h),二甲苯(2h,两次),得到透明的材料;

E、浸蜡:将所述的透明的材料倒去一部分二甲苯,向盛有材料的小坩埚中加满蜡屑,1小时后再添加新的蜡屑,然后将盛有所述的透明的材料和蜡屑的小坩埚放入37℃的恒温箱中过夜,至石蜡不再继续熔化为止,调节恒温箱温度为58℃,待石蜡完全熔化后倒去,换三次新鲜的纯蜡,每次停留2-5h,使停留在组织内的二甲苯被石蜡完全取代,得到浸蜡的材料;

太阳城集团F、包埋:准备一把镊子,一个解剖针,一个酒精灯及打火机,放在恒温箱的旁边,准备好包埋用的纸盒(用较硬而光滑的纸折成);包埋时将融化的石蜡连同所述的浸蜡的材料一并倾入纸盒内,再将纸盒加满融化的石蜡,然后将镊子在酒精灯上烧热,趁热迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列好,待石蜡稍微凝固后,将纸盒平放入冷水中,使其很快能凝固(若有气泡,可用镊子把气泡烫去);待石蜡凝固后将其取出晾干,得到包埋的材料备用。

太阳城集团G、切片:用铲式切片机将所述的包埋的材料进行切片处理,得到厚度约为9μm的石蜡切片;

太阳城集团H、粘片:将彻底洗净的载玻片涂上一小滴蛋白贴剂用手指将粘贴剂均匀涂抹在载玻片上,加几滴蒸馏水,用针或解剖刀将所述的石蜡切片轻轻放在液面上,所述的石蜡切片的光面朝下,然后将载玻片放在36-40℃的烫片箱上,待所述的石蜡切片受热完全展平后用吸水纸吸取多余水分,经烤干后,再放入36-40℃的温箱中继续烘烤1-2d,得到已干的玻片标本;

太阳城集团I、脱蜡和染色:将所述的已干的玻片标本,插入盛有二甲苯的染色缸中,先脱蜡10-15min,得到脱蜡的玻片标本;然后进行染色处理,得到染色的玻片标本;

所述的染色处理,采用番红一固绿二重染色法:

太阳城集团a. 染色液配方:番红:番红1g,70%酒精: 100ml;

固绿:固绿 1g,95%酒精 100ml;

b. 二重染色步骤:将所述的脱蜡的玻片标本依次在以下溶液中浸泡:1/2二甲苯+1/2纯酒精(3-5min)、纯酒精(3-5min) 、95%酒精 (3-5min) 、85%酒精(3-5min) 、70%酒精(3-5min) 、番红(2-24h)、85%酒精(0.5-1min)、95%酒精(0.5-1min)、固绿(0.5-1min)、无水酒精(约1min)、l/2无水酒精+l/2二甲苯(约2min) 、二甲苯(约3min)、二甲苯(5-30min),得到染色的玻片;

G、封片: 把所述的染色的玻片标本从二甲苯中取出,用干净的纱布擦去切片材料四周多余的二甲苯,然后滴上一小滴中性树胶,盖上载玻片,得到封好的玻片标本;

太阳城集团K、贴标签、干封与保存:在所述的封好的玻片标本的左端贴上标签,注明材料名称和制作日期,然后平放于50℃左右的温箱中烤数天即可干固,得到玻片标本成品。

太阳城集团L、照相:在光学显微镜下观察各个时期的切片,并照相。

Ⅳ、将所述的菊花体细胞胚分化成的芽转入所述的生根培养基进行培养,得到的“神马”菊花小植株;所述的芽高度为2-3 cm,苗龄为叶盘外植体培养后的60-70天;本实施例中,95-98%的芽均能培养成为完整的“神马”菊花再生植株;

在植物细胞学的研究中,传统的器官发生要经过脱分化过程,并且很多品种脱分化后的愈伤组织不能正常再分化,而体胚的发生与合子胚发生相类似的过程,通过与合子胚发生相似的途径(经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶期胚阶段)形成胚状体从而发育成完整植株,保证了遗传稳定性,同时体胚的直接发生比间接发生需要太阳城集团短,细胞发生无性系变异的可能性较小,遗传会更加稳定。单个外植体上可以产生多个体胚,同时还有次级体胚的出现,不仅增加体胚的数量,同时能为种植保存提供有利条件。以体细胞胚为基因转化受体可以发挥其单细胞起源,高产、遗传稳定的优势,能够满足转基因花卉的商业化生产,具有很高的应用前景。

太阳城集团本实施例中,仅采用一种诱导培养基即可直接诱导叶盘外植体得到胚性愈伤组织和所述的菊花体细胞胚,菊花体细胞胚再生效率高,遗传稳定。

太阳城集团中国专利申请201010267217.0记载的,菊花体细胞胚间接发生的方法中,胚性愈伤组织分化培养基中添加有激动素(KT)1-2mg/L,得到体细胞胚。但是,激动素(KT)价格较昂贵,为降低培养成本,在实际的生产过程中需要代之以其他的较廉价的植物激素。而且,“神马”菊花的生理特性与“玉人面”、“铺地金”、“紫研”不同,需要针对性更强的诱导培养基产生体细胞胚。在本实施例的对比试验中,诱导培养基以MS基本培养基为基础,分别添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D):1.0mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L,激动素(KT):1.0mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L,观察不同浓度的2,4-D与KT激素配比对体细胞胚发生的影响时发现,外植体形成愈伤组织后诱导出大量的根产生,不能产生体菊花细胞胚。 所以,激动素(KT)不适用于“神马”菊花体细胞胚的诱导,本实施例中采用MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA 2-3mg/L的诱导培养基能够提高体细胞胚的发生率。

实施例2:

本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

太阳城集团本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)3mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA3mg/L)。

步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为10天。

本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为92.22%,体细胞胚平均数为10.55个。

Ⅲ步骤中,将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,结果如下:

1、观察切片标本成品的结果:

如图1所示,在倒置显微镜下观察上述切片标本成品表明,所述的叶盘外植体培养7天后,表面细胞小且紧密排列(图1-A),观察表明,从叶片愈伤组织中可以明显看到两种不同的细胞,一种是细胞小,细胞质浓,细胞核大,在切片中染色较深(图1-B-b),这些细胞多分布在愈伤组织的外层及内部邻近组织中,具有旺盛的分裂能力。根据邱瑾等(1997)将该类细胞质浓,细胞核大,染色深,就有旺盛分裂能力的细胞定义为胚性细胞;另一种细胞较大,细胞质稀,切片中染色较浅(图1-B-a),此类细胞称为非胚性细胞。胚性细胞与非胚性细胞共同存在于胚性愈伤组织中。胚性细胞在分裂的过程中,有的是单个胚性细胞经多次分裂形成细胞较小、胞质浓厚的胚性细胞团(图1-C),有的是多个胚性细胞组合在一起发生不均等分裂,一个大的细胞团中可以发现几个小的细胞团(图1-D),最终发育成合生体植株。外植体培养30天后,胚性细胞团继续发育形成早期的球形胚(图1-E,1-F),球形胚具有清晰的轮廓,细胞具有分生组织状态,与母体维管束联系逐渐减少。进一步培养后球形胚进行横向与纵向分裂形成心形胚(图1-G)和鱼雷胚。鱼雷胚继续发育成子叶胚(图1-H),子叶胚与周围其他组织的联系越来越疏松,可以看到明显的“Y”型微管组织。

太阳城集团(图1中,A为愈伤组织边缘;B为愈伤组织内部;C为愈伤组织表面;D为多个胚性细胞形成的细胞团;E为愈伤组织表面的球形胚;F为内源生球形胚;G为内源生心形胚;H为成熟胚状体。)

太阳城集团2、外部形态特征的变化:

如图2、图3所示,所述的叶盘外植体接种到培养基2天后,有轻微卷曲;接种10天后叶片膨大,切口边缘有薄壁细胞形成(图2-A);15天后,愈伤组织继续增大(图2-B),40天后在体式显微镜下可以明显观察到球形胚(图3-A)、心形胚(图3-B);50天后可以用肉眼观察到成熟的体细胞胚(图2-C),在体式显微镜下可以观察到成熟的子叶胚(图3-D),同时还能观察到一些合生体细胞胚(图3-C)。60天后成熟体细胞胚可以生长出高度为2 cm的芽(图2-D),当芽高2-3 cm时可以转入生根培养基继续培养为完整植株(图2中,A为叶盘外植体培养10天后,B为叶盘外植体培养15天后,C为叶盘外植体培养50天后,D为叶盘外植体培养60天后) 。

实施例3:

本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

太阳城集团本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA 2mg/L)。

步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为10天。

太阳城集团本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为81.11%,体细胞胚平均数为8.31个。Ⅳ步骤中,按照实施例1中的方法将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,可以得到与实施例2中相似的结果。

实施例4:

本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.2mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA2.2mg/L)。

步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为12天。

本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为61.82%,体细胞胚平均数为6.63个。Ⅳ步骤中,按照实施例1中的方法将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,可以得到与实施例2中相似的结果。

实施例5:

本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

太阳城集团本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.4mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA2.4mg/L)。

太阳城集团步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为8天。

太阳城集团本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为60.19%,体细胞胚平均数为6.40个。Ⅳ步骤中,按照实施例1中的方法将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,可以得到与实施例2中相似的结果。

实施例6:

本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.6mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA 2.6mg/L)。

步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为9天。

本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为75.15%,体细胞胚平均数为8.13个。Ⅳ步骤中,按照实施例1中的方法将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,可以得到与实施例2中相似的结果。

实施例7:

太阳城集团本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

太阳城集团本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.8mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA 2.8mg/L)。

太阳城集团步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为11天。

本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为79.03%,体细胞胚平均数为8.67个。Ⅳ步骤中,按照实施例1中的方法将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,可以得到与实施例2中相似的结果。

实施例8:

太阳城集团本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)3.2mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA 3.2mg/L)。

步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为10天。

本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为89.12%,体细胞胚平均数为9.58个。Ⅳ步骤中,按照实施例1中的方法将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,可以得到与实施例2中相似的结果。

实施例9:

本实施例是在实施例1基础上的优选方案;本实施例的外植体材料、培养方法、生根培养基、培养条件均同实施例1。

本实施例的步骤Ⅲ中,所述的诱导培养基是以MS基本培养基为基础,添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)3mg/L,6-苄基腺嘌呤(6-BA)3.0mg/L(简写为:MS+2,4-D 3.0 mg/L+6-BA 3.0mg/L)。

步骤Ⅲ中,所述的体细胞胚诱导培养中,先进行暗培养,再进行光照培养;所述的暗培养的太阳城集团为12天。

太阳城集团本实施例中,共选用了300个叶盘外植体进行体细胞胚的诱导培养,体细胞胚发生率为68.24%,体细胞胚平均数为8.44个。Ⅳ步骤中,按照实施例1中的方法将所述的愈伤组织和菊花体细胞胚进行鉴定,可以得到与实施例2中相似的结果。

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本文标题:一种提高菊花体细胞胚再生效率的培养方法.pdf
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