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一种胰蛋白酶抑制剂及其应用.pdf

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一种 胰蛋白酶 抑制剂 及其 应用
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摘要
申请专利号:

CN201410106501.8

申请日:

20140320

公开号:

CN104922682A

公开日:

20150923

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K47/36,A61K47/48,A61K38/00,C12N9/76 主分类号: A61K47/36,A61K47/48,A61K38/00,C12N9/76
申请人: 中国科学院大连化学物理研究所
发明人: 马小军,吕岩,于炜婷,吕国军,赵姗,张建斌,王冰
地址: 116023 辽宁省大连市中山路457号
优先权: CN201410106501A
专利代理机构: 沈阳科苑专利商标代理有限公司 代理人: 马驰
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201410106501.8

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明涉及一种胰蛋白酶抑制剂,其特征在于所述的胰蛋白酶抑制剂主要成分为海藻酸盐或其衍生物;与传统胰蛋白酶抑制剂相比,本发明优势在于抑酶效率高,成本低,原料丰富,制备简单,无毒副作用,生物稳定性好,更适合作为蛋白质与多肽类药物制剂中的抗酶解辅料。

权利要求书

1.一种胰蛋白酶抑制剂,其特征在于:所述的胰蛋白酶抑制剂主要成分为海藻酸盐及其衍生物中的一种或二种以上,海藻酸盐或其衍生物在胰蛋白酶抑制剂中的质量分数为10-100%。2.按照权利要求1所述的胰蛋白酶抑制剂,其特征在于:所述的海藻酸盐包括海藻酸的钠盐、铵盐和钾盐中的一种或两种以上的混合盐;所述海藻酸盐衍生物包括丙烯酸酯海藻酸盐、聚乙二醇海藻酸盐、丙烯酰胺海藻酸盐和乙酸乙烯酯海藻酸盐中的一种或两种以上的混合盐。3.按照权利要求1所述的胰蛋白酶抑制剂,其特征在于:所述海藻酸盐的平均分子量介于10kDa至1000kDa之间。4.按照权利要求1所述的胰蛋白酶抑制剂,其特征在于:所述海藻酸盐中的古罗糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)两种单体的平均摩尔比,即G/M介于0.1-10之间。5.一种权利要求1、2、3、4或5所述胰蛋白酶抑制剂的应用,其特征在于:将权利要求1、2、3、4或5所述的抑制剂添加于蛋白质和/或多肽类药物的制剂中,用于保护蛋白质与多肽免于被胰蛋白酶降解。6.按照权利要求5所述的应用,其特征在于:所述的海藻酸盐或其衍生物可单独或与其他物质共同混合作为辅料用于制备蛋白质和/或多肽类药物的制剂;其中,所述的其它组分由水、氯化钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、甘露醇、蔗糖、乳糖、糊精、硬脂酸钠、木糖醇、可压性淀粉、微晶纤维素、聚羟甲基丙烯酸烷基酯、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羟甲基纤维素钠、大豆胰蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂和糜蛋白酶抑制剂中的一种或两种以上构成;海藻酸盐或其衍生物与蛋白质和/或多肽类药物可物理共混或共价接枝;海藻酸盐或其衍生物与其他材料共同混合的方式可物理共混或共价接枝。7.按照权利要求5所述的应用,其特征在于:将权利要求1、2、3或4所述的抑制剂应用于从液体中去除胰蛋白酶或胰蛋白酶原的目的;其实施的具体过程是:向1份体积的所述液体中加入0.01至2份体积的所述的抑制剂的水溶液,其中抑制剂的质量分数介于0.0000001%至10%之间,在0℃至15℃环境下,震荡孵育15min,最后高速离心(重力加速度介于1000g至15000g之间)弃去沉淀,上清液即为处理后的液体。8.按照权利要求5所述的应用,其特征在于:将权利要求1、2、3或4所述的抑制剂应用于从液体中收集胰蛋白酶或胰蛋白酶原的目的;其实施的具体过程是:向1份体积的所述液体中加入0.01至2份体积的所述的抑制剂的水溶液,其中抑制剂的质量分数介于0.0000001%至10%之间,在0℃至15℃环境下,震荡孵育15min,然后高速离心(重力加速度介于200g至12000g之间)弃去上清液,将沉淀震荡分散于0.01份至2份体积的分离液中,所述的分离液是NaCl,KCl,CaCl,NaCO3,NaSO,NaPO,聚乙烯亚胺和羧甲基纤维素钠中的一种或两种以上混合物的水溶液,所述分离液的浓度介于0.1%至3%之间,最后用0.22μm至1.2μm的滤膜过滤,收集滤液即为所得。9.按照权利要求7或8所述的应用,其特征在于:所述的液体包括动物肠液,动物胰腺分泌液,动物组织提取液,植物组织提取液,微生物发酵液,酶反应器废液以及由上述六种中任一或两种以上的混合为原料进行预处理后得到的产物,其中所述的预处理包括机械粉碎、离心和过滤操作中的一种或两种以上。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶抑制剂,具体是一种以海藻酸盐或其衍生物为主体的胰蛋白酶抑制剂。

背景技术

胰蛋白酶是小肠主要蛋白酶,将蛋白质水解为肽,进而分解为氨基酸。它由胰腺分泌首先进入十二指肠(小肠最上端),是小肠中浓度最高的蛋白水解酶。胰蛋白酶抑制剂是指可竞争性或非竞争性抑制胰蛋白酶活性的一类物质。目前已经商品化的胰蛋白酶抑制剂主要分为两类,一类来源于动物,主要从牛胰脏、人尿液中分离得到,另一类来源于植物,主要从大豆等植物的种子中分离得到。上述两类胰蛋白酶抑制剂都属于蛋白质,通过与胰蛋白酶活性位点的牢固结合发挥非竞争性抑制作用,优势是结合常数高,专属性强,缺陷是分离提纯工艺繁琐,成本高,抑制剂本身稳定性差易失活,进入人体易导致生理代谢紊乱等毒性与副作用。

由于传统胰蛋白酶抑制剂的上述优势和缺陷,目前商品化胰蛋白酶抑制剂在医药领域中的应用是直接发挥治疗作用,主要用于急性胰腺炎的治疗,防止过早激活的胰蛋白酶对脏器的损伤;另外也应用在心脏外科手术中,抑制创伤所导致的从心肌细胞中漏出的酶,防止其对凝血反应的影响所导致的出血并发症,研究证明大剂量的胰蛋白酶抑制剂能减少术后出血量的40%~50%。另外亦有研究证实胰蛋白酶抑制剂可用于防止和抑制肿瘤转移,因为肿瘤细胞通过类胰蛋白酶破坏周围组织,形成通道离开原发位。

由于蛋白与多肽类药物的高疗效和低毒副作用,近年来备受关注,可惜由于蛋白质类物质普遍存在的生物稳定性差,易被胃肠道内蛋白酶水解破坏的缺陷导致的生物利用度差,限制了该类药物的广泛应用。添加蛋白酶抑制剂与蛋白质和多肽类药物一起给药,是科研工作者很早就开始研究的手段,例如1998年Andreas等(A.Bernkop-Schnurch and A.Scerbe-Saiko,Synthesis and in vitro evaluation of chitosan-EDTA-protease-inhibitor conjugates which might be useful in oral delivery,1998.15(2):p.187-196),就将胰蛋白酶抑制剂,糜蛋白酶抑制剂和弹性蛋白酶抑制剂共价接枝到一种药用高分子辅料上,制备出一种新型抗酶解辅料,用于蛋白和多肽类口服制剂的制备,取得很好的治疗效果。但是2000年以后这类研究已基本没有,应用实例更是没有。主要因为这类胰蛋白酶抑制剂的成本问题、生物毒性问题和自身稳定性问题的限制,使得传统胰蛋白酶抑制剂作为抗酶解药用辅料的应用受到严重限制。

另一方面,迄今为止全球已发现约4000多种酶,在生物体中的酶远远大于这个数量,并且我们还在不断地发现新酶,这些酶绝大多数是从生物体内分离而得,在粗分离之后,提取液中除了我们所关心的酶之外,往往还存在许多生物体内丰度较高的其他酶,例如脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶等等,而我们所关心的酶相比之下通常浓度很低。为了除去其他酶更好的研究丰度较低的酶,传统方法是通过色谱柱,利用目的酶与其他酶在分子量、带电性、手性等理化性质上的差异进行分离纯化,然后分段收集。这种方法的优势是得到目的酶的纯度高,酶活保持性相对好,缺陷是产量低,成本高。

另一方面,胰蛋白酶主要来源是猪或牛的胰脏,为从这些组织的粗提取液中获得较纯的胰蛋白酶,传统工艺包括盐析分离、重结晶分离和柱层析等方法。

在利用胰蛋白酶从大分子蛋白制备短肽的酶反应工程中,若希望从废液中回收仍具有活性的胰蛋白酶,目前的方法是通过胰蛋白酶的固定化,提高酶的利用率。但这种方法在延长胰蛋白酶使用太阳城集团的同时,往往成本有所提高,酶活有所下降。

发明内容

太阳城集团本发明涉及以海藻酸盐及其衍生物作为胰蛋白酶抑制剂,可应用于作为蛋白质和多肽类药物制剂的抗酶解辅料的目的,弥补传统胰蛋白酶抑制剂的不足,也可应用于从液体中去除胰蛋白酶或胰蛋白酶原的目的,还可应用于从液体中收集胰蛋白酶或胰蛋白酶原的目的。

所述的胰蛋白酶抑制剂主要成分为海藻酸盐或其衍生物中的一种或二种以上,海藻酸盐及其衍生物在胰蛋白酶抑制剂中的质量比为10-100%。

太阳城集团海藻酸(Alginic acid)是由单糖醛酸线性聚合而成的多糖,单体为β-D-甘露醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)。M和G单元以M-M,G-G或M-G的组合方式通过1,4糖苷键相连成为嵌段共聚物。海藻酸的实验式为(C6H8O6)n。海藻酸盐的衍生物(derivative)是指海藻酸盐分子上的氢原子或羟基被其他原子或原子团取代而形成的较复杂产物。

太阳城集团本发明所涉及的胰蛋白酶抑制剂中有效成分的选择范围是全部海藻酸盐或其衍生物,进一步可限制为平均分子量介于10kDa至1000kDa之间,G/M介于0.1-10之间的海藻酸钾、海藻酸铵或海藻酸钠;其衍生物可限制为丙烯酸酯海藻酸盐、丙烯酰胺海藻酸盐或乙酸乙烯酯海藻酸盐,将能获得更好的抑酶效果。选自以上所述的海藻酸盐或其衍生物范围内的一种或两种以上的混合物可以单独或与其他材料通过物理混合或共价接枝的方式构成本发明所涉及的胰蛋白酶抑制剂。

太阳城集团海藻酸钠是一种天然多糖类高分子材料,首先它成本低廉制备简单,海藻酸钠的商业化生产始于1927年,现在全世界每年约生产30000吨,其中30%用于食品工业;其次它稳定性好,在人体生理环境下基本不降解;最后它生物相容性好,被FDA批准作为食品添加剂是安全的。在抑酶效率方面也十分出色,抑制相同浓度的胰蛋白酶,与商品化大豆胰蛋白酶相比,发挥相同抑酶活性仅需要低几个数量级浓度的抑制剂。

虽然在酶结合常数和酶专属性程度上,海藻酸盐与传统蛋白质类胰蛋白酶抑制剂存在较大差异,但该类胰蛋白酶抑制剂的发现,拓展了胰蛋白酶抑制剂在医药领域中的应用,为蛋白质与多肽类药物制剂的抗酶解方法提供了一种新思路。

因此本发明所涉及的胰蛋白酶抑制剂可应用于蛋白质或多肽类药物的制剂中,用于保护蛋白质与多肽免于被胰蛋白酶降解,海藻酸盐及其衍生物可单独或与其他材料共同混合作为蛋白质或多肽类药物的制剂。其中,海藻酸盐或其衍生物与蛋白或多肽类药物可物理共混或共价接枝;海藻酸盐或其衍生物与其他材料共同混合的方式可物理共混或共价接枝;

太阳城集团另一方面,还可将海藻酸盐或其衍生物应用于从液体中收集胰蛋白酶或胰蛋白酶原的目的。由于海藻酸钠带有较强的负电性,可以通过静电相互作用与带正电的胰蛋白酶形成复合物,这种复合物可以通过离心或过滤等方式很容易的去除或收集,达到将丰度较高的胰蛋白酶与目的酶分离的目的。分离得到的海藻酸盐-胰蛋白酶复合物,可以通过一定手段回收胰蛋白酶,达到胰蛋白酶的回收再利用目的。因此这一性质还可以利用在胰蛋白酶酶解反应器的废液处理中,提高胰蛋白酶的利用率。

利用本发明所涉及的胰蛋白酶抑制剂可以去除和收集胰蛋白酶或胰蛋白酶原的液体的选择范围是所有含有胰蛋白酶或胰蛋白酶原的液体,进一步可限制为动物肠液,动物胰腺分泌液,动物组织提取液,植物组织提取液,微生物发酵液,酶反应器废液以及由上述六种中任一或两种以上的混合为原料进行加工后得到的产物。可以获得更好的去除或收集效果。

附图说明

太阳城集团图1为胰岛素降解动力学曲线。

反应体系中均含有相同体积的水,相同浓度的胰岛素、钙离子和缓冲盐,pH均为7.6。图中横坐标是酶解太阳城集团,纵坐标是酶解体系中未被降解胰岛素浓度相对于反应开始时浓度的百分比。

曲线由上至下分别表示:空白对照——体系中不含其他物质时的胰岛素的降解曲线(□);实施例1——体系中还含有胰蛋白酶和海藻酸钠时胰岛素的降解曲线(Δ);对照例2——体系中还含有胰蛋白酶和大豆胰蛋白酶抑制剂时胰岛素的降解曲线(▽);对照例3——体系中还含有胰蛋白酶时胰岛素的降解曲线(○)。

具体实施方式

实施例1

太阳城集团(1)配制胰蛋白酶抑制剂:海藻酸钠水溶液,分子量500kDa,G/M=80:20,浓度0.12mg/ml;

(2)配制胰蛋白酶溶液5ml,溶液中成分为PBS,pH=7.6,其中含有CaCl20.2mg/ml、胰蛋白酶0.04mg/ml(所用胰蛋白酶购自阿拉丁试剂,比活力不小于3000IU/mg);

(3)配制胰岛素储备液:10mg/ml,溶于0.01M盐酸水溶液;

(4)向步骤(2)溶液中加入步骤(1)的胰蛋白酶抑制剂0.5ml,放入37℃恒温水浴里预热15min,然后加入步骤(3)配制的胰岛素储备液0.5ml,涡流混匀后立即开始计时,维持37℃反应2h,并且从0min开始每30min从体系中取样200μl立即与100μl酶解终止液(盐酸0.25mol/L)混合。所有样品保存于4℃待测;

(5)未分解胰岛素的检测:

太阳城集团体系中胰岛素的含量参考中国药典2010方法并略微改动,利用waters的高效液相色谱系统(HPLC),色谱柱为C18反相柱(250mm*4.6mm),检测器是紫外-可见光谱检测器,流动相为乙腈:水相=78:22,其中水相中含有0.2mol/L的硫酸钠,以及磷酸2.7ml/L并用乙醇胺调pH至2.3。检测流速1ml/min,温度40℃。胰岛素出峰太阳城集团为8min。最终结果以当前样品胰岛素峰积分面积与0时刻面积的百分比值(胰岛素未降解率)表示;

太阳城集团(6)检测结果显示,胰岛素加入到模拟肠液中后,在胰蛋白酶作用下,完整胰蛋白酶含量相对于开始时的比值随着降解太阳城集团延长而缓慢下降,在海藻酸钠的抑制下,2小时时酶解体系中约85%的胰岛素还是完整的。说明海藻酸钠胰蛋白酶抑制剂能抑制胰蛋白酶对胰岛素的降解,对胰岛素有很强的保护作用。酶解动力学曲线见附图1(Δ)。

对照例2

太阳城集团所使用的胰蛋白酶抑制剂是商品化胰蛋白酶(STI)的水溶液,STI购自阿拉丁(货号T113170),分子量24kDa,浓度0.12mg/ml。

太阳城集团按照与实施例1相同的降解评价与胰岛素检测方法,结果是商品化大豆胰蛋白酶抑制剂在与海藻酸钠相同的剂量时,对胰蛋白酶几乎没有抑制作用,2小时时酶解体系中仅有约13%的胰岛素是完整的,说明与本发明所述抑制剂相比,相同质量的商品化大豆胰蛋白酶抑制剂几乎没有抑酶效果。酶解动力学曲线见附图1(▽)。

对照例3

所使用的胰蛋白酶抑制剂是水。

按照与实施例1相同的降解评价与胰岛素检测方法,结果是在没有抑制剂作用下,2小时时酶解体系中仅有约12%的胰岛素是完整的,说明没有抑制剂时胰蛋白酶能够将绝大部分胰岛素降解破坏。酶解动力学曲线见附图1(○)。

实施例4

太阳城集团所使用的胰蛋白酶抑制剂是海藻酸钾的粉末,分子量800kDa,G/M=40:60,按照1毫克每毫升胰蛋白酶溶液进行投料。

按照与实施例1相同的降解评价与胰岛素检测方法,降解两小时时,胰岛素未降解率为92%

实施例5

所使用的胰蛋白酶抑制剂是海藻酸铵水溶液,分子量40kDa,G/M=20:80,浓度0.06mg/ml。

按照与实施例1相同的降解评价与胰岛素检测方法,降解两小时时,胰岛素未降解率为75%

实施例6

太阳城集团所使用的胰蛋白酶抑制剂是乙酸乙烯酯海藻酸钠水溶液,分子量35kDa,G/M=60:40,浓度1mg/ml。海藻酸钠分子上被乙酸乙烯酯取代的羟基占全部羟基数的比例约为5%。

按照与实施例1相同的降解评价与胰岛素检测方法,降解两小时时,胰岛素未降解率为45%

实施例7

太阳城集团所使用的胰蛋白酶抑制剂是海藻酸铵和海藻酸钠的物理混合物粉末,二者的质量比为2:8。其中海藻酸铵的分子量40kDa,G/M=20:80,海藻酸钠的分子量200kDa,G/M=70:30。胰蛋白酶抑制剂按照0.15毫克每毫升胰蛋白酶溶液进行投料。

太阳城集团按照与实施例1相同的降解评价与胰岛素检测方法,降解两小时时,胰岛素未降解率为75%。

实施例8

所使用的胰蛋白酶抑制剂是海藻酸钾,海藻酸钾通过共价接枝与胰岛素连接,所使用的海藻酸钾分子量20kDa,G/M=10:90,摩尔接枝比为海藻酸钾:胰岛素=2.7:1。产物海藻酸钾衍生的胰岛素水溶液,按照0.25mg/ml胰蛋白酶溶液进行投料。

按照与实施例1相同的降解评价与胰岛素检测方法,降解两小时时,海藻酸钾胰岛素未降解率为40%。

实施例9

从牛胰脏获得的蛋白酶的粗提液,其中含有大量胰蛋白酶,还含有α-糜蛋白酶和弹性蛋白酶,为了除去胰蛋白酶,研究其他酶,通过加入胰蛋白酶抑制剂除去胰蛋白酶。

胰蛋白酶去除方法:

配制胰蛋白酶抑制剂:海藻酸钠水溶液,分子量150kDa,G/M=60:40,浓度10mg/ml;

向牛胰脏粗提液中加入胰蛋白酶抑制剂,每100ml粗提液中加入1ml,在4℃下搅拌混匀2h(不要过于剧烈);

太阳城集团以6000g的加速度在4℃下离心15min;

上清液冷冻干燥即可得到α-糜蛋白酶与弹性蛋白酶的粗提物粉末,大量的胰蛋白酶已被除去,可以进行研究或者进一步精细纯化。

胰蛋白酶去除效率检测:

胰蛋白酶的酶活使用BAEE(N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐)法测定,方法参考中国药典(2010年版)。

去除胰蛋白酶之前提取液中胰蛋白酶酶活:A0=1254BAEE units/ml。

去除胰蛋白酶之后粉末溶于100ml PBS后,胰蛋白酶酶活:A1=119BAEEunits/ml。

去除效率=1-A1/A0x100%=90.5%

实施例10

在酶制剂的工业生产中,有时需要将除去的胰蛋白酶回收再利用。

去除的胰蛋白酶的回收方法:

将实施例7中离心得到的沉淀分散于100ml PBS中搅拌均匀;

加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液1ml(10mg/ml),并在4℃下搅拌1h;

以6000g的加速度在4℃下离心15min,上清液用0.22μm水系滤膜过滤一次;

收集滤液,即为胰蛋白酶的回收液。

太阳城集团胰蛋白酶回收液中胰蛋白酶酶活:A3=465BAEE units/ml。

回收率=A2/(A0-A1)x100%=41.0%

实施例11

太阳城集团本发明所涉及的胰蛋白酶抑制剂可与其他材料物理混合制成胰岛素口服液,按照以下成分列表所述量,于搅拌下依次加入原料,4℃下搅拌2h混匀后无菌过滤,低温脱气即得。

成分列表

注:其中海藻酸钠分子量为500kDa,G/M=80:20;

评价方法:

按照实施例1的酶解评价方法,将胰岛素口服制剂1ml直接加入模拟肠液中,在37摄氏度下降解2小时时,取样,并按照实施例1中的未降解胰岛素评价方法表征样品中胰岛素的未降解率,结果为72%。

实施例12

本发明所涉及的胰蛋白酶抑制剂可以共价接枝到其他药用辅料上,并用新的抗酶解辅料与蛋白质与多肽类药物物理混合后制成片剂。

太阳城集团海藻酸钾(20kDa,G/M=5:5)在氮气保护和60℃环境中,在催化剂作用下与羧甲基纤维素钠发生缩合反应,制成的新辅料在pH=3条件下过滤分离并水洗除去催化剂和未反应的小分子海藻酸钾。滤饼烘干后得到海藻酸钾共价接枝的羧甲基纤维素钠。

太阳城集团人参提取物片剂的制备方法如下:

按照成分列表所述量,将原料粉末混合研磨,过60目筛,压片。

成分列表

评价方法:

按照与实施例1相同的降解评价与检测方法,降解两小时时,人参提取物中未降解的总蛋白质含量为投料量的52%,而作为对照的缺乏海藻酸钾改性羧甲基纤维素钠材料的相同制剂,按照与实施例1相同的降解评价与检测方法,人参提取物中未降解的总蛋白质含量为投料量的12%。

上述所有实施例中选择胰岛素作为模型蛋白便于抗酶解评价与检测,本发明对胰蛋白酶抑制剂的保护对象没有特别限定,保护对象可以是任何需要保护的蛋白质或多肽类物质。

太阳城集团上述典型实施例在本发明的所有方面中是示例性的,而不是限定性的,因此本发明能够根据胰蛋白酶抑制剂的应用环境和抗酶解保护对象的理化性质进行典型实施例的多种变型,技术人员可从包含的描述中获得所述变型,所有这些变型被认为落入本发明的范围和精神内。

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