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一种高黄酮含量杭白菊的培育方法.pdf

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一种 黄酮 含量 白菊 培育 方法
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摘要
申请专利号:

CN201210028301.6

申请日:

20120209

公开号:

CN102524075A

公开日:

20120704

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01H4/00,A01H1/06,A01H1/04 主分类号: A01H4/00,A01H1/06,A01H1/04
申请人: 浙江大学
发明人: 舒小丽,张琳琳,张宁,沈晓霞,叶红霞,吴殿星
地址: 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号
优先权: CN201210028301A
专利代理机构: 杭州求是专利事务所有限公司 代理人: 韩介梅
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法律状态
申请(专利)号:

CN201210028301.6

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明涉及一种高黄酮含量杭白菊的培育方法,步骤包括:取杭白菊的子叶为外植体,诱导愈伤组织,继代培养至成倍增殖期,暗条件预培养,进行农杆菌共培养转化,转移到筛选培养基进行3轮筛选,取抗性愈伤组织诱导分化成苗,对抗性植株进行标记基因组织化学染色和筛选基因分子检测,鉴定含目的基因查耳酮合酶基因CHS插入序列的分化小苗,对入选的转基因植株进行花瓣中总黄酮含量检测,选留总黄酮含量高于10%的转基因植株,继续种植评价黄酮含量的表达稳定性,繁殖总黄酮含量稳定高于10%的优良株系。本发明的高黄酮含量杭白菊,可发展新型保健食品添加剂和营养强化剂。

权利要求书

1. 一种高黄酮含量杭白菊的培育方法,包括以下步骤:1)取杭白菊的子叶为外植体,接种至诱导培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织; 2)将诱导形成3周的愈伤组织,转移至继代培养基,继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期; 3)将成倍增殖的愈伤组织,在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天;4)将经过预培养的愈伤组织,在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟,之后弃去菌液,用无菌滤纸吸干,接种于共培养基上,在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天;5)将上述共培养愈伤组织,洗净、晾干后,转移到筛选培养基,在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周,收集新长出的抗性愈伤组织,转移至新的筛选培养基上,再进行连续2轮继代筛选,每隔3周转继1次;6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织,转移至分化培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗,对抗性植株进行组织化学染色和分子检测,选留含目的基因插入序列的的转基因植株,所说的目的基因插入序列是指目的基因查耳酮合酶基因CHS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列,目的基因查耳酮合酶基因CHS片段长960bp;7)取入选的转基因植株,田间种植测定花瓣中总黄酮含量,选留总黄酮含量高于3%的转基因植株;8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系,评价黄酮含量的表达稳定性,繁殖总黄酮含量稳定高于3%的优良株系,为培育的高黄酮含量杭白菊。2. 根据权利要求1所述的高黄酮含量杭白菊的培育方法,其特征在于所说的诱导培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。3. 根据权利要求1所述的高黄酮含量杭白菊的培育方法,其特征在于所说的继代培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。4. 根据权利要求1所述的高黄酮含量杭白菊的培育方法,其特征在于所说的共培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、乙酰丁香酮1mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。5. 根据权利要求1所述的高黄酮含量杭白菊的培育方法,其特征在于所说的筛选培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。6. 根据权利要求1所述的高黄酮含量杭白菊的培育方法,其特征在于所说的分化培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA4mg/L、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。7. 根据权利要求2-6所述的高黄酮含量杭白菊的培育方法,其特征在于所说的MS基本培养基为KNO 1900mg、(NH)NO 1650mg、CaCl·2HO 440mg、MgSO·7HO 370mg、KHP0 170mg、MnSO·4HO 22.3mg、ZnSO·7HO 8.6mg、FeSO·7HO 27.8mg、NaMoO·2H2O 0.25 mg、CuSO·5HO 0.025mg、CoCl·6HO 0.025mg、Na-EDTA·2H2O 37.3mg、HBO 6.2mg、KI 0.83mg、肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.5mg和甘氨酸2mg。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明涉及一种杭白菊的培育方法,尤其是提高黄酮含量的杭白菊的培育方法。

背景技术

太阳城集团杭白菊为菊科植物菊的干燥头状花序,栽培历史悠久,据有关史料记载,迄今至少已有360余年之久,系“浙八味”地道药材之一。杭白菊含有木犀草素-7-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-β-D-葡萄糖苷、金合欢素-7-β-D-葡萄糖苷等多种黄酮类有效成分,抗氧化作用优良,具有“清热散风、平肝明目”之功效。早期研究发现表明,杭白菊具有解热、抑菌、抗流感病毒、抗心血管、抗炎等作用,近年来国内外有研究显示杭白菊具有抗氧化、抗肿瘤、抗爱滋等作用。目前,加工生产企业主要提取分离菊花总黄酮,因此,选育高黄酮含量的杭白菊新品种成为育种的主要方向。

发明内容

正是在上述背景下,本发明的目的是提出一种高黄酮含量杭白菊的培育方法,以获得高黄酮含量杭白菊,进行类黄酮的开发,用于食品和医药工业。

本发明的高黄酮含量杭白菊的培育方法,包括以下步骤:

1)取杭白菊的子叶为外植体,接种至诱导培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织;

 2)将诱导形成3周的愈伤组织,转移至继代培养基,继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期;

太阳城集团 3)将成倍增殖的愈伤组织,在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天;

4)将经过预培养的愈伤组织,在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟,之后弃去菌液,用无菌滤纸吸干,接种于共培养基上,在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天;

5)将上述共培养愈伤组织,洗净、晾干后,转移到筛选培养基,在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周,收集新长出的抗性愈伤组织,转移至新的筛选培养基上,再进行连续2轮继代筛选,每隔3周转继1次;

6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织,转移至分化培养基,在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗,对抗性植株进行组织化学染色和分子检测,选留含目的基因插入序列的的转基因植株,所说的目的基因插入序列是指目的基因查耳酮合酶基因CHS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列,目的基因查耳酮合酶基因CHS片段长960bp;

太阳城集团7)取入选的转基因植株,田间种植测定花瓣中总黄酮含量,选留总黄酮含量高于3%的转基因植株;

8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系,评价黄酮含量的表达稳定性,繁殖总黄酮含量稳定高于3%的优良株系,为培育的高黄酮含量杭白菊。

本发明中,所说的诱导培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。

太阳城集团本发明中,所说的继代培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。

本发明中,所说的共培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、乙酰丁香酮1mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。

本发明中,所说的筛选培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA12mg、潮霉素25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。

太阳城集团本发明中,所说的分化培养基为MS基本培养基添加IAA0.3mg、6-BA4mg/L、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g,pH灭菌前5.7。

上述的MS基本培养基为(NH4)2NO3 1650mg、KNO3 1900mg、CaCl2·2H2O 440mg、MgSO4·7H2O 370mg、KH2P04 170mg、MnSO4·4H2O 22.3mg、ZnSO4·7H2O 8.6mg、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg、CuSO4·5H2O 0.025mg、CoCl2·6H2O 0.025mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、H3BO3 6.2mg、KI 0.83mg、肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.5mg和甘氨酸2mg。

本发明中,所说的农杆菌的菌株为EHA105,内含质粒pCAM1305,pCAM1305的T-DNA区域携带目的基因插入序列,包括目的基因查耳酮合酶基因CHS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因查耳酮合酶基因CHS片段长960bp,与35S和nos终止子共同构成表达框架。查耳酮合酶基因CHS是类黄酮生物合成中第一个关键酶,CHS的活性直接关系到类黄酮的合成,可以调控提高黄酮的含量。菌株为EHA10方便购买或赠送获得,在一般植物遗传实验室均有保存,参见文献吴关庭等,中国农业科学,2005,38(12):2395-2402。

上述的标记基因葡糖苷酸酶基因GUS的组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989, (6): 168-169,筛选基因抗潮霉素基因HPT的分子检测方法参见文献吴关庭等,中国农业科学,2005,38(12):2395-2402。

太阳城集团本发明中,所说的黄酮含量检测方法,以芦丁为标样的比色法在波长510nm处测定,参见文献杨美华,卢充伟,匡岩巍,等. 柱色谱-紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量. 中草药, 2004, 35(6): 688~690。

太阳城集团上述的稳定性是指入选杭白菊中黄酮含量在不同年份间(2年以上)、季节间(2季以上)以及地点间(2个地点以上)的含量变化不显著。

太阳城集团本发明培育的高黄酮含量的杭白菊,具有以下优点:

太阳城集团本发明首先利用查耳酮合酶基因CHS,通过调控类黄酮合成第一个关键酶的活性,显著提高黄酮的含量,培育出高黄酮含量杭白菊,进行高效生物提取,发展新型保健食品添加剂和营养强化剂,用于食品、医药领域。

附图说明

图1是本发明所用的查耳酮合酶基因CHS插入序列的载体构建示意图。

具体实施方式

以下通过具体实例进一步说明本发明。

实施例1:

太阳城集团以取杭白菊品种“迟小洋菊”的子叶为外植体,接种至诱导培养基,在25±1℃、光强3000勒克斯光条件下诱导形成愈伤组织;

取诱导形成3周的愈伤组织,转移至继代培养基,继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期;

取成倍增殖的愈伤组织,在25±1℃、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织

的预培养2天;

取经过预培养的愈伤组织(约400个培养皿,含2500块以上的愈伤组织),在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟,之后弃去菌液,用无菌滤纸吸干,接种于共培养基上,在25±1℃、避光的黑暗条件下共培养2天;

取上述共培养愈伤组织,洗净、晾干后,转移到筛选培养基,在25±1℃、避光的黑暗条件下培养6周,收集新长出的抗性愈伤组织(约420块愈伤组织),转移至新的筛选培养基上,再进行连续2轮继代筛选,每隔3周转继1次;

取3轮筛选后的抗性愈伤组织(约60块愈伤组织),转移至分化培养基,在25±1℃、光强3000勒克斯光条件下诱导分化成苗75株,对抗性植株进行标记基因GUS组织化学染色和筛选基因HPT分子检测,选留含目的基因查耳酮合酶基因CHS插入序列的转基因植株21株(目的基因插入序列的载体构建如图1所示)。 

取入选的转基因植株,田间种植后收获种子,进行叶片内黄酮含量检测,选留总黄酮含量高于10%的转基因植株7株,继续种植转基因株系;

太阳城集团2008-2010连续3年,分别在浙江杭州、临安、富阳三地三季评价黄酮含量的表达稳定性,繁殖总黄酮含量稳定高于10%的优良株系,最终培育高黄酮含量杭白菊2个:T-HBJ-1和T-HBJ-2,其花瓣中总黄酮含量分别为11.9%、10.3%,而原杭白菊的总黄酮含量仅为6.93%。

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