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一种氯喹与长春新碱的药物组合.pdf

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一种 氯喹 长春新碱 药物 组合
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201510378133.7

申请日:

20150629

公开号:

CN104906099A

公开日:

20150916

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A61K31/475,A61P35/00,A61K31/4706 主分类号: A61K31/475,A61P35/00,A61K31/4706
申请人: 杭州泛普生物科技有限公司
发明人: 陈希
地址: 310000 浙江省杭州市萧山区建设一路中栋国际大厦1706室
优先权: CN201510378133A
专利代理机构: 浙江永鼎律师事务所 代理人: 王梨华
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201510378133.7

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种氯喹与长春新碱的药物组合,包括氯喹、长春新碱,其中氯喹含量为2-40μM,长春新碱含量为10nM,或者氯喹含量为5-50μM,长春新碱含量为20nM;两种剂量的氯喹与长春新碱可协同杀伤、抑制包括视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤在内的多种儿童实体肿瘤,可作为化疗药物使用。本发明与常规用药量相比,用量少,毒性低;杀伤、抑制视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤的效果显著。

权利要求书

太阳城集团1.一种氯喹与长春新碱的药物组合,其特征在于,包括氯喹、长春新碱,氯喹化学式为,长春新碱化学式为,2.根据权利要求1所述的一种氯喹与长春新碱的药物组合,其特征是,所述的药物组合中,氯喹含量为2-40μM,长春新碱含量为10-100nM。3.根据权利要求1所述的一种氯喹与长春新碱的药物组合,其特征是,所述的药物组合中,氯喹含量为5-50μM,长春新碱含量为10nM。

说明书

技术领域

本发明涉及药物技术领域,尤其是涉及一种氯喹与长春新碱的药物组合。

背景技术

目前儿童肿瘤比较多发,通常采用手术或化疗治疗,比如儿童视网膜母细胞瘤的治疗方式主要是手术摘除眼球和局部化疗,其中摘除眼球的方法虽然可根治肿瘤,但由于付出代价高昂,已逐渐被淘汰,化疗成为主要的方法,细胞毒性的药物是目前各类儿童实体肿瘤的主流化疗方法;化疗方案局限于传统细胞毒性药物长春新碱、卡铂、环磷酰胺,长春新碱(vincristine,VCR)最为常用,微管抑制剂长春新碱具有广谱抗肿瘤作用,但毒副作用较高;溶酶体抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)是一种弱碱,作用于溶酶体,可抑制溶酶体酸性环境对细胞内各类蛋白和细胞器的降解,在临床上用于治疗疟疾,由于发现氯喹可以抑制自噬,一种细胞自我降解的生理机制和代谢途径,而自噬对肿瘤细胞存活通常具有促进作用,故氯喹被用于各类恶性肿瘤的实验性治疗和临床实验,包括乳腺癌,黑色素瘤,肝癌,胰腺癌等多种成人高度恶性肿瘤。

发明内容

本发明是为了降低化疗用药量和毒性,增加化疗效果,提供一种用量少,毒性低,效果显著的氯喹与长春新碱的药物组合。

为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:一种氯喹与长春新碱的药物组合,包括氯喹、长春新碱,二者化学式分别为:

本方案通过细胞系体外培养和细胞活力实验,发现溶酶体抑制剂氯喹(CQ)与化疗药物微管抑制剂长春新碱(VCR)可协同杀伤、抑制多种儿童实体肿瘤,包括视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤;其中,微管抑制剂长春新碱造成肿瘤细胞有丝分裂障碍,而溶酶体抑制剂氯喹造成肿瘤细胞细胞代谢障碍,二者合力致肿瘤细胞凋亡。

太阳城集团作为优选,所述的药物组合中,氯喹含量为2-40μM,长春新碱含量为10nM。氯喹与长春新碱单用可以抑制HXO-Rb44细胞,两种药物效果强于单用,并可以促进细胞凋亡;低剂量的药物对细胞自噬无抑制作用,但仍可以抑制肿瘤细胞生长和促凋亡。

作为优选,所述的药物组合中,氯喹含量为5-50μM,长春新碱含量为20nM。单独使用氯喹可抑制肾母细胞瘤细胞G401增殖并诱导凋亡,而5μM以上的氯喹联用长春新碱可显著提高抑制肾母细胞瘤细胞G401增殖并诱导凋亡的效果。

太阳城集团因此,本发明具有如下有益效果:(1)与常规用药量相比,本方案用量少,毒性低;(2)杀伤、抑制视网膜母细胞瘤和肾母细胞瘤的效果显著。

附图说明

图1是本发明针对视网膜母细胞瘤效果示意图一。

图2是本发明针对视网膜母细胞瘤效果示意图二。

图3是本发明针对肾母细胞瘤效果示意图。

太阳城集团图4是本发明针对视网膜母细胞瘤机制图片,包括HRP化学发光法显影自噬相关蛋白条带图片。

太阳城集团图5是本发明不同含量组合针对视网膜母细胞瘤的HRP化学发光法显影蛋白条带示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的描述。

实施例1,一种氯喹与长春新碱的药物组合,包括氯喹、长春新碱,其中氯喹含量为2-40μM,长春新碱含量为10nM。

具体实施过程是,

视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞培养于1640培养基(含10%胎牛血清),生长状态良好时接种于96孔板,加入药物培养24小时,通过CCK-8法检测细胞相对数目,计算细药物对细胞的抑制率;

太阳城集团细胞系和培养方法:视网膜母细胞瘤细胞系HXO-Rb44,此细胞为悬浮细胞,用含10%胎牛血清的1640培养基培养于37℃孵箱,含5%二氧化碳和饱和水蒸气;

主要试剂:氯喹(CQ),长春新碱(VCR);40%丙烯酰胺凝胶贮存液,Tris碱,TEMED,SDS,蛋白酶抑制剂,蛋白上样标准品,CCK8试剂盒,BCA试剂盒和HRP化学放光检测试剂盒;

太阳城集团抗体:一抗包括LC3,GAPDH,p62,caspase 3;抗鼠与抗兔HRP偶联二抗;

细胞活力实验:将视网膜母细胞瘤细胞HXO-Rb44以1×10∧4个/孔的密度接种于96孔板,加入药物后继续培养24小时,然后加入CCK8试剂,用酶标仪读取405nm吸光度,根据读数做出细胞抑制曲线;

统计分析:每种药物剂量重复5次,每次4个复孔,结果以平均值±标准误表示,在2-40μM区间,氯喹可以协同长春新碱(10nM)对肿瘤细胞的抑制效果,药物联用对肿瘤细胞抑制率显著提高,如图1、图2所示,同时,通过等辐射分析,证明两个药物对肿瘤细胞的抑制确为协同作用;

免疫杂交(Western blotting)实验:细胞用药物处理后离心、PBS洗涤后,用预冷的RIPA缓冲液(加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)消化,BCA法进行蛋白定量后,用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,每孔上样20μg的蛋白,用适当的抗体进行免疫杂交后,HRP化学发光法显影蛋白条带,如图4所示,两种药物联用(CQ 5μM,VCR 10-20nM)可显著提高凋亡标记蛋白caspase 3片段的水平,而对自噬相关蛋白LC3与p62的水平影响不大。

太阳城集团实施例2,一种氯喹与长春新碱的药物组合,包括氯喹、长春新碱,其中氯喹含量为5-50μM,长春新碱含量为20nM;

具体实施过程是,

肾母细胞瘤G401细胞培养于McCoy5A培养基(含10%胎牛血清),生长状态良好时,接种于96孔板。加入长春新碱、氯喹共同培养24小时,然后通过CCK-8法检测细胞相对数目,计算药物对细胞的抑制率;

细胞系和培养方法:肾母细胞瘤G401,此细胞为贴壁细胞,用含10%胎牛血清的McCoy5A培养基培养于37℃孵箱,含5%二氧化碳和饱和水蒸气;

主要试剂:氯喹(CQ),长春新碱(VCR);40%丙烯酰胺凝胶贮存液,Tris碱,TEMED,SDS,蛋白酶抑制剂,蛋白上样标准品,CCK8试剂盒,BCA试剂盒和HRP化学放光检测试剂盒;

太阳城集团抗体:一抗包括LC3,GAPDH,p62,caspase 3;抗鼠与抗兔HRP偶联二抗;

太阳城集团细胞活力实验:将肾母细胞瘤G401细胞以1×10∧4个/孔的密度接种于96孔板,加入药物后继续培养24小时,然后加入CCK8试剂,用酶标仪读取405nm吸光度。根据读数计算细胞相对数目,做出药物对细胞的抑制曲线;

太阳城集团统计分析:每种药物剂量重复5次,每次4个复孔,结果以平均值±标准误表示,5-50μM氯喹可以抑制肾母细胞瘤G401,但效果很快达到饱和,20nM长春新碱可抑制G401细胞,加入5-50μM氯喹后,抑瘤作用产生协同和叠加,联用的抑瘤率显著高于单用,如图3所示,其中X轴为氯喹作用浓度(μM),Y轴为抑瘤率(%),曲线一为氯喹单独作用效果,曲线二为氯喹添加长春新碱组合作用效果;

免疫杂交(Western blotting)实验:细胞用药物处理后离心、PBS洗涤后,用预冷的RIPA缓冲液(加入蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)消化,BCA法进行蛋白定量后,用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,每孔上样20μg的蛋白,用适当的抗体进行免疫杂交后,HRP化学发光法显影蛋白条带,如图5所示;有效抑制G401细胞的药物单用与联用条件下(VCR 20nM,CQ 5μM),凋亡相关蛋白caspase 3片段均明显升高,20nM VCR诱导细胞凋亡能力强于5μM CQ;而两种药物联用后,caspase 3片段水平比药物单用组进一步显著上升,提示细胞凋亡水平增加;同时,20nM VCR与5μM CQ对细胞自噬也产生一定影响,自噬受到抑制,体现为自噬底物LC3-II和p62水平增加,药物组合使用组更加明显;与HXO-Rb44细胞中观察到的现象相比,两种药物对两种肿瘤细胞均有诱导凋亡的作用,而对自噬调节的作用不同,药物作用后肾母细胞瘤G401细胞中自噬水平发生改变,而视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞自噬水平未发生改变。

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