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钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素药物方法.pdf

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表面 制备 纳米 羟基 磷灰石 负载 霉素 药物 方法
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摘要
申请专利号:

CN201510155416.5

申请日:

20150402

公开号:

CN104707170B

公开日:

20170630

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A61K31/436,A61L27/06,A61L27/32,A61L27/54 主分类号: A61K31/436,A61L27/06,A61L27/32,A61L27/54
申请人: 山东大学齐鲁医院
发明人: 刘超,张东,万熠,刘宏,刘少华,董建勇,王滕,张蕊,马保金
地址: 250014 山东省济南市历下区文化西路107号
优先权: CN201510155416A
专利代理机构: 济南圣达知识产权代理有限公司 代理人: 杨琪;崔苗苗
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法律状态
申请(专利)号:

CN201510155416.5

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明提供了钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素药物方法,包括如下步骤:1)预处理:将钛种植体打磨抛光,分别用水和乙醇超声清洗、吹干备用;2)酸蚀:将上述钛种植体用不同的酸进行二次酸蚀,清洗烘干;3)碱热:将上述钛种植体于预定温度下进行碱热处理,清洗烘干,得活化后钛种植体;4)HAp矿化:采用Kokubo矿化法在活化后钛种植体上沉积羟基磷灰石,制备钛/羟基磷灰石复合涂层;5)雷帕霉素载入:用雷帕霉素溶液对上述钛/羟基磷灰石复合涂层进行超声浸渍处理,制得负载雷帕霉素的钛材。该制备方法操作简单、产率高、易于大规模生产。

权利要求书

1.一种钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素药物方法,其特征在于,包括如下步骤:1)预处理:将钛种植体打磨抛光,分别用水和乙醇超声清洗、吹干备用;2)酸蚀:将上述钛种植体用不同的酸进行二次酸蚀,清洗烘干;3)碱热:将上述钛种植体于预定温度下进行碱热处理,清洗烘干,得活化后钛种植体;4)HAp矿化:采用Kokubo矿化法在活化后钛种植体上沉积羟基磷灰石,制备钛/羟基磷灰石复合涂层;5)雷帕霉素载入:用雷帕霉素溶液对上述钛/羟基磷灰石复合涂层进行超声浸渍处理,制得负载雷帕霉素的钛材;步骤1)中,所述的钛种植体为钛片或钛棒;步骤2)中,所述酸蚀的具体步骤为:将钛种植体放入摩尔比为0.11:0.09的氢氟酸和硝酸混合溶液中,室温下处理10min,清洗干净;然后,将其放入摩尔比为2.9:4.5的盐酸和硫酸混合液中,80℃下酸蚀20min;最后,将上述处理的钛种植体放到体积比为1:1的98wt%的HSO和30wt%的HO混合溶液中,室温下处理60min,水洗、吹干;步骤3)中,所述碱热处理条件为:100℃下反应24h;步骤4)的具体操作步骤为:制备矿化液,并按照Vs=Sa/10的比例加入SBF,矿化太阳城集团为2-4周,取出,冷冻干燥,备用;所述矿化液的成份为NaCl8.035重量份,NaHCO0.355重量份,KCl0.225重量份,KHPO·3HO0.231重量份,HCl1.4235重量份,CaCl0.292重量份,NaSO,0.072重量份,Tris6.118重量份,HCl0-1.825重量份;步骤5)的具体步骤为:将雷帕霉素溶液加入盛有钛/羟基磷灰石复合涂层的培养孔板中,浸没,在超声清洗机中超声10s后,置于室温装载12h,取出后PBS冲洗3次,自然风干后,重新浸入雷帕霉素溶液中,整个过程重复3次,最后干燥后得到负载雷帕霉素的钛材;所述雷帕霉素溶液的浓度为10mg/mL。2.权利要求1所述的钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素的方法制备的负载雷帕霉素的钛材。3.权利要求2所述的负载雷帕霉素的钛材在制备人造骨骼中的应用。

说明书

技术领域:

太阳城集团本发明属于生物医药领域,具体涉及钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素药物方法。

背景技术:

目前医用种植体材料中,钛合金材料应用最为广泛,与其他材料相比,其具有高强度、高韧性、耐腐蚀的优点。医用钛合金种植体的表面形貌对细胞和细胞外基质的相互联系起着重要的作用,对种植体-骨结合的发生起着关键的作用。越来越多的处理方法被应用于种植体表面,例如大颗粒喷砂、酸蚀、激光蚀刻等,这些方法得到的表面形貌大多在微米级,主要通过机械嵌合作用增强成骨细胞的功能,进而促进种植体-骨结合,如今微米形貌已经被广泛研究并应用于临床领域。然而有研究表明微米级表面形貌在促进成骨细胞分化的同时,也抑制了成骨细胞的增殖,导致较少的骨生成量,最终影响种植体-骨结合的效果。

随着种植体表面处理技术的进步,纳米级形貌与细胞间关系的研究已成为相关领域研究的热点。羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HAp)是一种与人体硬组织成份类似的生物活性陶瓷材料,具有良好的生物相容性、生物活性和骨传导性,HAp在植入体内后可以和人体自然骨形成牢固的化学键结合,相态稳定,安全无毒,同时对组织无刺激和排斥作用。随着纳米技术的发展和推广,纳米级HAp成为现在研究的热点之一:纳米级HAp较普通型有更强的生物活性;更加有利于改善骨植入体的力学性能;更有利于骨组织的整合,同时骨传导性能、溶解性能和力学性能也有所提高;对有机生命体不存在物理损伤;有负载药物并缓释的作用;另外还对肿瘤细胞有一定的抑制作用。

雷帕霉素是一种常用抗肿瘤药物,研究表明对成骨,尤其是成骨早期有一定促进成骨分化作用,负载于纳米级HAp上可以缓释局部形成稳定浓度,达到促进成骨的作用。

发明内容:

太阳城集团为解决上述问题,本发明提供了一种钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素药物的方法。

本发明采用如下技术方案:

太阳城集团一种钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素的方法,包括如下步骤:

太阳城集团1)预处理:将钛种植体打磨抛光,分别用水和乙醇超声清洗、吹干备用;

2)酸蚀:将上述钛种植体用不同的酸进行二次酸蚀,清洗烘干;

3)碱热:将上述钛种植体于预定温度下进行碱热处理,清洗烘干,得活化后钛种植体;

太阳城集团4)HAp矿化:采用Kokubo矿化法在活化后钛种植体上沉积羟基磷灰石,制备钛/羟基磷灰石复合涂层;

太阳城集团5)雷帕霉素载入:用雷帕霉素溶液对上述钛/羟基磷灰石复合涂层进行超声浸渍处理,制得负载雷帕霉素的钛材。

优选的是,步骤1)中,所述的钛种植体为钛片或钛棒。

太阳城集团优选的是,步骤2)中,所述酸蚀的具体步骤为:将钛种植体放入摩尔比为0.11:0.09的氢氟酸和硝酸混合溶液中,室温下处理10min,清洗干净;然后,将其放入摩尔比为2.9:4.5的盐酸和硫酸混合液中,80℃下酸蚀20min;最后,将上述处理的钛种植体放到体积比为1:1的98wt%的H2SO4和30wt%的H2O2混合溶液中,室温下处理60min,水洗、吹干。

优选的是,步骤3)中,所述碱热处理条件为:100℃下反应24h。

优选的是,步骤4)的具体操作步骤为:制备simulated body fluid(SBF)矿化液,所述矿化液的成份为NaCl 8.035重量份,NaHCO3 0.355重量份,KCl 0.225重量份,K2HPO4·3H2O 0.231重量份,HCl 1.4235重量份,CaCl20.292重量份,Na2SO4,0.072重量份,Tris 6.118重量份,HCl 0-1.825重量份;并按照样品暴露面积Vs/SBF=10的比例加入SBF,矿化太阳城集团为2-4周,取出,冷冻干燥,备用。

优选的是,步骤5)的具体步骤为:将雷帕霉素溶液加入盛有钛/羟基磷灰石复合涂层的培养孔板中,浸没,在超声清洗机中超声10s后,置于室温装载12h,取出后PBS冲洗3次,自然风干后,重新浸入雷帕霉素溶液中,整个过程重复3次,最后干燥后得到负载雷帕霉素的钛材。

太阳城集团优选的是,所述雷帕霉素溶液的浓度为10mg/mL。

太阳城集团上述任一的钛材表面制备纳米级羟基磷灰石层负载雷帕霉素的方法制备的负载雷帕霉素的钛材。

上述的负载雷帕霉素的钛材在制备生物活性材料中的应用。

上述的负载雷帕霉素的钛材在制备人造骨骼中的应用。

本发明的有益效果:

1.本发明的方法为:钛+酸蚀+碱热+HAp涂层+药物,一方面,HAp涂层的矿化方式不同,酸蚀+碱热更利于Kokubo法中矿化液的沉积及矿化;另一方面,首次将雷帕霉素负载于材料促进成骨,获得了显著地效果,亦为本方法的最大创新。

太阳城集团2.本发明各处理步骤的优点:

太阳城集团预处理:建立钛种植体表面处理的基础条件。

酸蚀:是对钛种植体表面的粗处理,一方面可以去除表面污染物,获得清洁和均匀的表面,二是可以获得微米级的粗糙结构和纳米级孔洞,这些微纳复合结构可以为后续的碱热处理和HAp矿化提供一个有利于离子聚集和成核的微环境,促进HAp涂层在钛片表面快速生成。微纳结构的存在增大了钛片的比表面积,为矿化涂层的生成提供了更多的黏附位点。

碱热:是对钛种植体表面的细处理,在酸蚀微纳结构基础上形成更多纳米级结构,其有利于HAp的矿化。

HAp矿化:酸蚀和碱热作为HAp矿化的预处理,在钛片表面生成微纳复合结构,提高了钛片的表面能,为矿化涂层的生成提供一个有利的条件。相对于酸蚀和碱热,纳米级HAp与骨有更佳的生物相容性;Kokubo法中矿化液模拟了人体血浆的各种成份比例,预实验表明在单纯酸蚀或单纯碱热的钛种植体表面,矿化效果差,但酸蚀+碱热后矿化效果佳。

雷帕霉素:相对于酸蚀和碱热,纳米级HAp涂层有更强的负载并缓释药物的作用,雷帕霉素有着潜在的促进成骨作用(但未被广泛研究及报道),该方法的推广必将加速其作用机制的研究。

附图说明

图1本发明制备流程图

图2各种处理钛片表面拓扑结构。酸蚀后的钛片表面形成了微米级的沟壑样外貌,碱热使钛片表面形成大量纳米级凹坑外貌及纳米花三维结构(利于HAp矿化)外貌,酸蚀+碱热钛片表面相对单独碱热生成了更多的纳米花结构。

图3MC3T3细胞成骨分化因子(Collagen I、OCN、Runx2)mRNA表达,在HAp矿化组明显高于其他对照组。

太阳城集团图4HAp涂层钛片与钛棒,表面成份定性为HAp

图5种植手术步骤

图6影像学观察种植体和BIC

具体的实施方式

实施例1

太阳城集团羟基磷灰石(HAp)在光滑钛合金表面的矿化能力较差,流程(见图1)为首先利用酸蚀和水热氧化技术在光滑钛合金表面形成有利于纳米级HAp矿化的微纳结构(包括微米级沟壑、纳米级凹坑和三维纳米花结构,见图2),再利用Kokubo矿化技术实现HAp在钛材的矿化。具体步骤为:

预处理:实验使用TC4钛合金,TC4的化学成分见表1。将线切割之后的钛片(长10mm,宽10mm,高2mm)备用于体外实验,钛棒(长4mm,直径2mm)备用于体内试验;经600#,800#,1200#砂纸打磨后,用绒布抛光,将抛光之后的样品放入水和无水乙醇中分别超声清洗15min,吹干备用。

太阳城集团表1 TC4的化学成分

酸蚀:将工件放入冷却至室温的氢氟酸(0.11mol/L HF)和硝酸(0.09mol/L HNO3)混合溶液(2mL 40%HF和4mL 66%HNO3,加入1000mL水)处理10min,迅速用大量纯水清洗干净,用盐酸(2.9mol/L HCl)和硫酸(4.5mol/L H2SO4)混合液(配500mL:125mL H2SO4,121mL HCl,254mL水)80℃酸蚀20min;然后,将前面处理的工件放到体积比为1:1的98%的H2SO4和30%的H2O2混合溶液中,室温下处理60min。处理完后直接用大量水洗,吹干。

碱热:上述尺寸的钛片和钛棒放置在装有20mL 10M NaOH溶液的聚四氟乙炼内衬中,装入高压釜中。然后将高压釜放入100℃烘箱中反应24h,反应完毕后,自然冷却至室温,将釜芯内的的钛材取出并用超纯水清洗,吹干,备用。

太阳城集团HAp矿化:采用Kokubo矿化法(Abe Y,kokubo T,Yamamuro T.J mater Sci-mater M,1900,1(4):233~238),矿化液成份(NaCl 8.035g,NaHCO30.355g,KCl 0.225g,K2HPO4·3H2O 0.231g,1.0M·HCl 39mL,CaCl20.292g,Na2SO4,0.072g,Tris 6.118g,1.0M·HCl 0-5mL)与血浆接近,并按照样品暴露面积Vs/SBF=10的比例加入矿化液(simulated body fluid,简称:SBF),矿化太阳城集团为2-4周,取出,冷冻干燥,备用。

雷帕霉素载入:将10mg雷帕霉素(Sigma)溶于1mL双蒸水中配成10mg/mL,备用。将10mg/mL雷帕霉素溶液加入盛有钛材的培养孔板中,浸没钛材,在超声清洗机中超声10s后,置于室温装载12h,取出后PBS冲洗3次,自然风干后,重新浸入10mg/mL雷帕霉素溶液中,整个过程重复3次,最后干燥后得到的钛材为装载完毕者。

表2 Kokubo矿化液(SBF)与血浆成份对比

太阳城集团表3 SBF矿化液配制方法

1.涂层特性分析

酸蚀后的钛片表面形成了微米级的沟壑样外貌,碱热使钛片表面形成大量纳米级凹坑外貌及纳米花三维结构(利于HAp矿化)外貌,酸蚀+碱热钛片表面相对单独碱热生成了更多的纳米花结构。各种处理钛片表面拓扑结构如图2所示。

2.成骨特性分析

太阳城集团MC3T3-E1小鼠前成骨细胞系在钛片(分三组:均经过雷帕霉素装载)上培养3天时,提取mRNA,RT-PCR检测成骨细胞中转录因子(Collagen I、OCN、Runx2)在mRNA水平上的表达变化如图3所示。

3.种植体-骨结合效果分析,

将钛材制作成钛棒(长4mm,直径2mm),处理方式同钛片,将其通过外科手术方式植入大鼠胫骨骨骺端,在第4周、8周、12周时取出,做硬组织切片,染色后检测并观察种植体-骨结合率(BIC),雷帕霉素+HAp涂层钛棒的BIC在各个太阳城集团点均高于对照组,如图6所示。

上述虽然结合对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

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