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含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物及其制备方法.pdf

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FK506 化合物 FKBP 蛋白 二聚体 药物 组合 及其 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610576947.6

申请日:

20160720

公开号:

CN106074367A

公开日:

20161109

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A61K9/08,A61K47/42,A61K31/436,A61P37/08,A61P27/02 主分类号: A61K9/08,A61K47/42,A61K31/436,A61P37/08,A61P27/02
申请人: 中山大学中山眼科中心
发明人: 陈伟蓉,陈林,林浩添,刘奕志
地址: 510060 广东省广州市越秀区先烈南路54号
优先权: CN201610576947A
专利代理机构: 广州科粤专利商标代理有限公司 代理人: 刘明星
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201610576947.6

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物及其制备方法。本发明的含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物中FK506与hFKBP12a蛋白以物质的量比1:1的比例结合,溶剂为pH6~8的PBS缓冲液。本发明中FK506的内源性结合蛋白hFKBP12a蛋白与FK506形成的二聚体,可极大增强FK506在水溶液中的溶解性,从而增强FK506水溶液的药效和储存太阳城集团。

权利要求书

1.一种药物组合物,其特征在于,含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体和含水的液体赋形剂,所述的FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体是以FK506类化合物作为活性成分,以FKBP蛋白作为载体,所述的FK506类化合物为FK506、EP184162、EP315978、EP323042、EP423714、EP427680、WO91/13889、WO91/19495、EP484936或EP532088;所述的FKBP蛋白为hFKBP12a蛋白或其变体、同系物或衍生物,所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述的FK506类化合物为FK506,所述的FKBP蛋白为hFKBP12a蛋白,所述的含水的液体赋形剂为PBS缓冲液,其pH为6~8,渗透压为260~320mOsm/L。3.根据权利要求2所述的药物组合物,其特征在于,所述的FK506与hFKBP12a蛋白的物质的量比为1:1~2。4.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述的PBS缓冲液的pH为7.5。5.根据权利要求1所述的药物组合物,其特征在于,所述的药物组合物还含有羧甲纤维素、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯醇、聚维酮、聚乙二醇、黄原胶、泊洛沙姆、卡波姆、玻璃酸钠和/或丙三醇作为增粘剂,还含有硫柳汞和/或苯扎溴铵作为防腐剂和抑菌剂。6.权利要求3所述的药物组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将FK506溶于有机溶剂中,制备成FK506溶液;(2)将hFKBP12a蛋白溶于pH6~8、渗透压为260~320mOsm/L的PBS缓冲液中,制备成hFKBP12a蛋白溶液,所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示;(3)使用步骤(2)制备的hFKBP12a蛋白溶液稀释步骤(1)制备的FK506溶液,控制混合溶液中FK506与hFKBP12a蛋白的物质的量比为1:1~2,搅拌均匀,以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体,由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液;(4)去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂,得到的去除有机溶剂的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液即为所要制备的药物组合物。7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)的有机溶剂为DMSO、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙酸乙酯或乙醚;所述的步骤(4)的去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂,是采用离心机溶液置换、透析或凝胶过滤层析的方法进行去除。8.权利要求1所述的药物组合物用于制备免疫抑制剂中的用途。9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的免疫抑制剂为滴眼液。10.权利要求1所述的药物组合物用于提高FK506在水溶液中的溶解度、提高FK506药效、降低游离FK506的副作用中的用途。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域,具体涉及含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物及其制备方法。

背景技术

他克莫司(Tacrolimus)又名FK506,分子式为C44H69NO12,分子量为804,由日本藤泽制药有限公司从筑波山的土壤的链霉菌属(Streptomyces tsukubaensis)中分离出的发酵产物,其化学结构属23元大环内酯类抗生素。为一种强力的新型免疫抑制剂,主要通过抑制白介素-2(L-2)的释放,全面抑制T淋巴细胞的作用。其免疫抑制效果极强,较同类药物环孢素A(CsA)相比强100倍。近年来,作为肝、肾移植的一线用药,已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明,其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)和免疫性眼病,如过敏性结膜炎、角膜移植等疾病中也发挥着重要的作用。

FK506结构式如下:

太阳城集团FK506目前临床上应用的剂型主要为口服胶囊、注射液、外用眼膏和滴眼液四种。其中,滴眼液是治疗眼部疾病中最常用、最直接和最有效的方法。由于FK506在水溶液中溶解性极差,估计最大溶解度低于10μM,严重影响其达到有效的药物浓度。此外,FK506水溶液中稳定性差,容易发生异构化,转化为其他两种无免疫抑制功能的异构体。因此,提高FK506在水中的溶解度和稳定性,进而提高其药效,一直是临床和基础研究中亟待解决的问题。

人类FKBP12是一类具有脯氨酸异构酶活性的FK506内源性结合蛋白。hFKBP12可与进入体内的FK506结合,形成FK506/FKBP12二聚体,该二聚体进而与钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin)结合,从而阻断免疫反应的发生。

发明内容

太阳城集团本发明根据FK506/hFKBP12a蛋白二聚体在水溶液中具有极好的溶解性的特性,设计和制备新型FK506的水溶液制剂,提供了一种含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物,其是利用药物-蛋白二聚体制备新型的FK506医用药剂,其中的FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体具有极好的溶解性,可解决目前单纯FK506水溶液制剂存在的如下缺点:一、水溶液中溶解度低,FK506在水中最大溶解性低于10μM;二、稳定性差,易发生异构化,生成两种无免疫抑制功能的分子。本发明的含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物可用于眼科及其他领域。

一种药物组合物,含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体和含水的液体赋形剂,所述的FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体是以FK506类化合物作为活性成分,以FKBP蛋白作为载体,所述的FK506类化合物为FK506、EP184162、EP315978、EP323042、EP423714、EP427680、WO91/13889、WO91/19495、EP484936或EP532088;所述的FKBP蛋白为hFKBP12a蛋白或其变体、同系物或衍生物,所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列C末端有His-tag、N末端有V5-tag。

太阳城集团FK506可被其他自然存在或人工合成的FK506类似物所代替,该FK506类似物可以同hFKBP12a蛋白(或其他的可与FKB506相结合的FKBP同源蛋白)结合且具备相应的药理学作用。FK506有许多衍生物、拮抗剂、激动剂与同型物都是已知的,它们具有FK506的基本结构和至少一种生物学的性质。在许多专利中都叙述过这类化合物,例如EP184162、EP315978、EP323042、EP423714、EP427680、WO91/13889、WO91/19495、EP484936、EP532088等;FK506和这些化合物一起称作FK506类化合物。

hFKBP12a蛋白可以被其他的可与FKB506(或其他FK506类化合物)相结合的FKBP同源蛋白所代替。本发明所采用的hFKBP12a蛋白可以通过多种人工和酶促的方法进行修饰和改良,以提高其可溶性和在血浆中的生存期,并可改变其免疫原性。所述的改良包括但不仅限于聚乙二醇化、乙酰化和甲基化。可以对hFKBP12a蛋白结构中的FK506结合位点进行改良和修饰,以提高或减弱FK506和hFKBP12a蛋白的结合力、加速或减慢FK506/hFKBP12a蛋白二聚体中FK506的释放速度。本发明中,hFKBP12a蛋白、对其进行改良或修饰后得到的hFKBP12a蛋白以及其变体、同系物或衍生物统称为FKBP蛋白。

太阳城集团优选,所述的FK506类化合物为FK506,所述的FKBP蛋白为hFKBP12a蛋白,所述的含水的液体赋形剂为PBS缓冲液,其pH为6~8,渗透压为260~320mOsm/L(不含钙镁离子)。

优选,所述的FK506与hFKBP12a蛋白的物质的量比为1:1~2。所述的药物组合物中FK506与hFKBP12a蛋白以物质的量比1:1的比例结合,稍过量的hFKBP12a蛋白以确保绝大部分的FK605同hFKBP12a蛋白相结合形成二聚体。

优选,所述的PBS缓冲液的pH为7.5。

优选,所述的药物组合物还含有羧甲纤维素、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯醇、聚维酮、聚乙二醇、黄原胶、泊洛沙姆、卡波姆、玻璃酸钠和/或丙三醇作为增粘剂。

太阳城集团优选,所述的药物组合物还含有硫柳汞和/或苯扎溴铵作为防腐剂和抑菌剂。

所述的药物组合物的制备方法,包括以下步骤:

(1)将FK506溶于有机溶剂中,制备成FK506溶液;

(2)将hFKBP12a蛋白溶于pH6~8、渗透压为260~320mOsm/L的PBS缓冲液中,制备成hFKBP12a蛋白溶液,所述的hFKBP12a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;

(3)使用步骤(2)制备的hFKBP12a蛋白溶液稀释步骤(1)制备的FK506溶液,控制混合溶液中FK506与hFKBP12a蛋白的物质的量比为1:1~2,搅拌均匀,以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体,由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液;

(4)去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂,得到的去除有机溶剂的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液即为所要制备的药物组合物。

太阳城集团所述的步骤(1)的有机溶剂为DMSO、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙酸乙酯或乙醚。

太阳城集团所述的去除FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂,是采用离心机溶液置换、透析或凝胶过滤层析的方法进行去除。

太阳城集团本发明还提供所述的药物组合物用于制备免疫抑制剂中的用途。

太阳城集团优选,所述的免疫抑制剂为滴眼液。

太阳城集团本发明还提供所述的药物组合物用于提高FK506在水溶液中的溶解度、提高FK506药效、降低游离FK506的副作用中的用途。

制备得到的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体也可通过结晶等方法进一步纯化。FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的分子构成和结构可以通过X射线晶体解析的技术进行检测和验证。对于大规模批量生产而言,可抽取FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的样本进行结晶,并通过X射线晶体解析的技术检测FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的分子构成和结构,以确保产品质量。

上述步骤(3)和(4)制备的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体可以使用如PBS缓冲液在内的其他医用缓冲液浓缩,以利于储备和进一步应用。

太阳城集团发明者们发现,本发明的含有FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物具有以下优点:

(1)可以提高FK506在水溶液或其他医用FK506溶液中的溶解性。在角膜移植动物模型中,我们成功配置的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506在水溶液中的溶解度可以至少达到100μM,这将FK506在水溶液中的溶解度至少提高了10倍;而根据我们使用Nanodrop测定的hFKBP12a蛋白质储存液浓度的结果,理论上我们可以配制出浓度高达1.58mM的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体溶液,这将FK506在水溶液中的溶解度提高了约158倍。

(2)FK506同hFKBP12a蛋白结合后可以避免发生异构化,从而保持FK506结构的活化状态;

(3)可以通过蛋白质结构工程学的方法来进一步改善药物配方,从而改变FK506/hFKBP12a蛋白二聚体稳定性和其在血浆中的生存期;

(4)可以通过修饰和改变FKBP与FK506的结合位点,从而改变FK506/hFKBP12a蛋白二聚体中FK506的释放动力学特性;

(5)可以通过蛋白融合工程学的方法改进剂型,以提高药物的在人体组织中的靶向作用能力,如肿瘤组织等;

(6)基于热动平衡的原理,FK506/hFKBP12a蛋白二聚体可以同人体内源性FKBP进行交换,以产生理想的药学作用。本发明揭示了FK506同hFKBP12a蛋白结合后,在细胞水平和动物模型中都具有相应的药理学作用;而且较低浓度的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液(100μM)即可起到与市面上通用的较高浓度的FK506混悬液(质量分数0.05%,即621.89μM)相同或更好的抑制角膜植片免疫排斥反应的效果,还显著延长角膜植片生存期;此外,由于FK506非常昂贵,FK506在药物中的使用浓度大大降低将极大的减少药物成本;

(7)由于FK506/hFKBP12a蛋白二聚体具有极强的亲和力,这使得最终溶液中游离的FK506极少。同单纯的FK506的剂型相比,本发明可以极大程度地降低游离FK506的副作用和不良反应。

附图说明

图1为FK506/hFKBP12a蛋白二聚体在NFAT-GFP HeLa细胞系中免疫抑制图;其中DMSO(上排左图)为DMSO(二甲基亚砜)处理组(DMSO终浓度为0.1%),I(下排左图)为离子霉素处理组(离子霉素终浓度为3μM),FKBP(上排中图)为hFKBP12a蛋白水溶液处理组(hFKBP12a蛋白终浓度为1.2μM),FKBP+I(下排中图)为hFKBP12a蛋白水溶液和离子霉素处理组(hFKBP12a蛋白终浓度为1.2μM、离子霉素终浓度为3μM),FK506+I(上排右图)为FK506水溶液和离子霉素处理组(FK506终浓度为1.2μM、离子霉素终浓度为3μM),FKBP+FK506+I(下排右图)为FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液和离子霉素处理组(FK506/hFKBP12a蛋白二聚体终浓度为1.2μM、离子霉素终浓度为3μM)。

太阳城集团图2为术后第14日FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液在大鼠同种异体角膜移植模型中抗免疫排斥反应的眼前段照相;A:100μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液组;B:质量分数0.05%FK506混悬液组;C:PBS阴性对照组。

图3为100μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液在大鼠同种异体角膜移植模型中抗免疫排斥反应的生存分析图;100μM FK506/FKBP、0.05%FK506和PBS分别表示100μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液组、质量分数0.05%FK506混悬液组和PBS阴性对照组。

太阳城集团图4为使用Nanodrop测定hFKBP12a蛋白质储存液的浓度,A为中山眼科中心国家重点实验室的美国Nanodrop超微量分光光度计(ND2000),用于测定蛋白质、核酸和脱氧核酸的浓度,具有高度灵敏性;B为测定hFKBP12a蛋白浓度的结果,浓度(mg/ml)C计算为所测得的A280/Abs,其中hFKBP12a蛋白的Abs值为0.642。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。

以下实施例中所用的实验仪器:德国Beckman超速离心机、美国奥豪斯分析天平(DV114C)、美国Nanodrop超微量分光光度计(ND2000)、美国密理博3000MWCO蛋白质离心分子筛(15ml,3kD)。

以下实施例中所用的药品来源:所用hFKBP12a蛋白来自北京康乐卫士生物公司,FK506来自美国Sigma公司、福建科瑞生物制药公司,DTT来自美国Sigma公司,DMSO来自美国Sigma公司,PBS(pH=7.5,渗透压260-320mOsm/L)来自美国Sigma公司。

太阳城集团上述的来自北京康乐卫士生物公司的hFKBP12a蛋白是使用大肠埃希菌或者其他真核细菌诱导和表达重组hFKBP12a蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示),并利用已建立的蛋白质纯化方法得到实验所需的高纯度的hFKBP12a蛋白。hFKBP12a蛋白的摩尔质量约为12000g/mol,即12kD,C末端加入His-tag、N末端加入V5-tag后其分子量约为15.5kD。

实施例1

FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液的制备方法如下:

(1)使用分析天平精密称取FK506粉末4mg溶解于0.2ml纯DMSO中,制备成20mg/ml(即约25mM)的FK506的DMSO溶液;

(2)使用pH7.5的PBS缓冲液(渗透压320mOsm/L)将高纯度的hFKBP12a蛋白稀释制备成0.1mM的hFKBP12a蛋白溶液;

太阳城集团(3)使用上述步骤(2)中的hFKBP12a蛋白溶液(50ml)缓慢稀释步骤(1)中的FK506的DMSO溶液(0.2ml),缓慢均匀搅拌,以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体,由此得到50.2ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506同hFKBP12a蛋白的摩尔比为1:1,FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的终浓度为100μM。即将步骤(1)中20mg/ml(即25mM)的FK506的DMSO溶液用步骤(2)中的0.1mM的hFKBP12a蛋白溶液稀释了250倍,有机溶剂DMSO在该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的体积比为0.4%(v/v)。有机相中释放出来的FK506在稀释过程中会立即与hFKBP12a蛋白结合(Kd=0.4nM)。即使在稀释的10μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中,高达99.99%的FK506处在同hFKBP12a蛋白的结合状态;

太阳城集团(4)用pH7.5的PBS缓冲液将50.2ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液稀释至502ml,再使用15ml的分子筛离心管将该溶液浓缩至50.2ml(美国密理博3000MWCO蛋白质离心分子筛,离心机参数:4000g,40min)。经过此步骤的处理,FK506/hFKBP12a蛋白二聚体溶液中的有机溶剂DMSO得到去除。由此得到去除了有机溶剂的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液,可以用于储备或进一步应用。

按上述过程制备出的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液使FK506的溶解性得到明显提高。单纯FK506在水溶液中最大溶解度不足10μM,而参照本实施例中FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液的制备方法制备得到的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506在水溶液中的溶解度可以至少达到100μM,这将FK506在水溶液中的溶解度至少提高了10倍;配制较高浓度的hFKBP12a蛋白质储存液并使用Nanodrop测定(图4),如图4B中第18行结果所示,储存液中hFKBP12a蛋白浓度可达2.44mg/ml(计算公式为C=A280/Abs=1.567/0.642,Abs=0.642),换算单位后(除以hFKBP12a蛋白的分子量15.5kD)约为1.58mM。因此,理论上我们至少可配制浓度为1.58mM的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液,这将FK506在水溶液中的溶解度提高了约158倍。

太阳城集团此外,该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液也在体内和体外实验中取得了良好的免疫抑制效果。

在体外实验中,发明人通过使用NFAT-GFP的HeLa细胞系,验证了终浓度为1.2μM的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体可明显抑制Ca2+-Cn-NFAT免疫反应通路的激活。如图1所示,在NFAT-GFP HeLa细胞系中,绿色荧光部位为NFAT存在的位置,如果绿色荧光存在于细胞浆中,则未启动免疫反应。相反,如果细胞核为绿色,则表示NFAT进入细胞核引起免疫反应。如图1所示,在加入离子霉素(Ionomycin,I)后(图1中I组),引起HeLa细胞的免疫反应,大量NFAT进入细胞核使其呈现出绿色荧光;而在FK506+I组,由于FK506对Ca2+-Cn-NFAT信号通路的抑制作用,绿色荧光标记的NFAT停留在细胞浆中;在FKBP+FK506+I组,实验结果与FK506+I组相同,均在细胞浆中看到绿色荧光标记的NFAT。这表明在细胞水平,FK506/hFKBP12a蛋白二聚体同FK506,可有效阻断Ca2+-Cn-NFAT信号通路,从而抑制免疫反应的发生。

太阳城集团在体内试验中,100μM浓度的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液可在同种异体大鼠角膜移植模型中,30日内明显抑制角膜植片免疫排斥反应的发生,并且通过生存分析、病理学和免疫学实验多方面证实了其效果。在图2,我们可以看到100μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液组(图2A)同质量分数0.05%FK506混悬液组(图2B)相同在术后第14日,角膜透明、可清晰看到虹膜纹理、无明显水肿;角膜切片HE染色均表现为少量炎性细胞聚集、基质层无明显肿胀、各层结果完整;在免疫组化实验中,与免疫反应密切相关的IL-2在角膜组织中表达量较少。而PBS阴性对照组(图2C)则发生角膜排斥反应、出现角膜混浊、水肿,难以辨认瞳孔轮廓;角膜切片HE染色可以清楚看到大量炎症细胞聚集,角膜基质层肿胀、断裂;免疫组化实验可见角膜组织中表达大量的IL-2。这从形态学、病理学和免疫学三个层面证实了FK506/hFKBP12a蛋白二聚体在体内实验中抗角膜排斥反应的有效性。

图3为三组大鼠角膜植片的生存曲线,100μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液组和质量分数0.05%FK506混悬液组角膜植片生存期均明显优于PBS阴性对照组,并且100μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液组的角膜植片生存期明显优于质量分数0.05%FK506混悬液组的角膜植片生存期,p<0.05,具有统计学意义。

实施例2

(1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.22mg溶解于0.02ml无水乙醇中,制备成161mg/ml(即约200mM)的FK506的乙醇溶液;

太阳城集团(2)使用pH7.5的PBS缓冲液(渗透压280mOsm/L)将高纯度的hFKBP12a蛋白稀释制备成0.1mM的hFKBP12a蛋白溶液;

(3)使用上述步骤(2)中的hFKBP12a蛋白溶液(40ml)缓慢稀释步骤(1)中的FK506的乙醇溶液(0.02ml),缓慢均匀搅拌,以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体,由此得到40ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中FK506同hFKBP12a蛋白的摩尔比为1:1,FK506/hFKBP12a蛋白二聚体的终浓度为100μM。即将步骤(1)中161mg/ml(即200mM)的FK506的乙醇溶液用步骤(2)中的0.1mM的hFKBP12a蛋白溶液稀释了2000倍,有机溶剂乙醇在该FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的体积比为0.05%(v/v)。有机相中释放出来的FK506在稀释过程中会立即与hFKBP12a蛋白结合(Kd=0.4nM)。即使在稀释的10μM FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中,高达99.99%的FK506处在同hFKBP12a蛋白的结合状态;

太阳城集团(4)用pH7.5的PBS缓冲液将40ml FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液稀释至400ml,再使用15ml的分子筛离心管将该溶液浓缩至40ml(美国密理博3000MWCO蛋白质离心分子筛,离心机参数:4000g,40min)。经过此步骤的处理,FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中的有机溶剂乙醇得到去除。由此得到去除了有机溶剂的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液,可以用于储备或进一步应用。

实施例3

太阳城集团(1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.3mg,并溶于0.05ml纯DMSO中,得到80mM的FK506的DMSO溶液。

(2)按照MFK506:MhFKBP12a蛋白=1:1.6的比例,用pH7.5的PBS缓冲液溶解hFKBP12a蛋白制备0.2mM的hFKBP12a蛋白溶液32ml。

(3)将步骤(1)和步骤(2)中得到的溶液混合均匀以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体,由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液(其中FK506的浓度为0.125mM)。

太阳城集团(4)再使用PBS缓冲液(pH=7.5,渗透压260mOsm/L)将32ml的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液稀释至320ml,再使用15ml的分子筛离心管(离心机参数:4000g,40min)将该溶液浓缩至32ml。由此得到去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。

太阳城集团(5)将得到的去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液分装于洗净灭菌的滴眼液瓶中,密封包装。

实施例4

(1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.3mg,并溶于0.05ml纯DMSO中,得到80mM的FK506的DMSO溶液。

(2)按照MFK506:MhFKBP12a蛋白=1:2的比例,用pH7.5的PBS缓冲液溶解hFKBP12a蛋白制备0.25mM的hFKBP12a蛋白溶液32ml。

(3)将步骤(1)和步骤(2)中得到的溶液混合均匀以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体,由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液(其中FK506的浓度为0.125mM)。

太阳城集团(4)再使用PBS缓冲液(pH=7.5,渗透压280mOsm/L)将32ml的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液稀释至320ml,再使用15ml的分子筛离心管(离心机参数:4000g,40min)将该溶液浓缩至32ml。由此得到去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。

太阳城集团(5)在得到的去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中加入1.67g甲基纤维素,均匀搅拌直至溶解。

(6)然后将其分装于洗净灭菌的滴眼液瓶中,密封包装。

实施例5

太阳城集团(1)使用分析天平精密称取FK506粉末3.3mg,并溶于0.05ml纯DMSO中,得到80mM的FK506的DMSO溶液。

(2)按照MFK506:MhFKBP12a蛋白=1:1.6的比例,用pH7.5的PBS缓冲液溶解hFKBP12a蛋白制备0.2mM的hFKBP12a蛋白溶液32ml。

(3)将步骤(1)和步骤(2)中得到的溶液混合均匀以形成FK506/hFKBP12a蛋白二聚体,由此得到FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液(其中FK506的浓度为0.125mM)。

太阳城集团(4)再使用PBS缓冲液(pH=7.5,渗透压280mOsm/L)将32ml的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液稀释至320ml,再使用15ml的分子筛离心管(离心机参数:4000g,40min)将该溶液浓缩至32ml。由此得到去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液。

太阳城集团(5)在得到的去除了有机溶剂DMSO的FK506/hFKBP12a蛋白二聚体水溶液中加入1.0g羟丙甲纤维素,均匀搅拌直至溶解。

(6)然后在该溶液中加入硫柳汞0.004g,混匀。

太阳城集团(7)再将其分装于洗净灭菌的滴眼液瓶中,密封包装。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

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本文标题:含FK506类化合物/FKBP蛋白二聚体的药物组合物及其制备方法.pdf
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