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ETV2 及其 用途
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摘要
申请专利号:

CN201680024200.8

申请日:

20160303

公开号:

CN108024522A

公开日:

20180511

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A01K67/00,A01K67/027,C12N15/00,C12N15/09 主分类号: A01K67/00,A01K67/027,C12N15/00,C12N15/09
申请人: 明尼苏达大学董事会
发明人: D·J·加里,M·G·加里,T·拉斯穆森,N·小谷野中川
地址: 美国明尼苏达州
优先权: 62/127,330
专利代理机构: 北京派特恩知识产权代理有限公司 代理人: 景鹏;姚开丽
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法律状态
申请(专利)号:

CN201680024200.8

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法律状态类型:

摘要

太阳城集团本文描述了产生表达人ETV2基因的嵌合非人动物的方法,包括:a)生成ETV2无效的非动物细胞,其中非人ETV2基因的两个拷贝都携带防止在所述非人动物中产生功能性ETV2蛋白的突变;b)通过体细胞核转移创建ETV2无效的非人胚泡,所述体细胞核转移包括将a)的所述ETV2无效的非人动物细胞的核融合到去核的非人卵母细胞中,并激活所述卵母细胞分裂,从而形成ETV2无效的非人胚泡;c)将人干细胞引入b)的ETV2无效的非人胚泡;以及d)将来自c)的所述胚泡植入假孕替代非人动物中,以生成表达人ETV2的嵌合非人动物。

权利要求书

1.一种非人动物细胞或胚泡,其中基因组在ETV2基因的两个等位基因中都携带突变,从而所述非人动物细胞或胚泡缺乏功能性ETV2蛋白。2.如权利要求1所述的非人动物或胚泡,其中所述突变是ETV2基因缺失。3.如权利要求1或2所述的非人动物细胞或胚泡,其中所述非人动物细胞或胚泡是猪、牛、马或山羊。4.嵌合非人动物或胚泡,其表达人ETV2并缺乏所述非人动物ETV2的表达。5.如权利要求4所述的嵌合非人动物,其中所述非人动物表达选自白细胞、红细胞、血小板或其组合的人血细胞。6.如权利要求4所述的嵌合非人动物,其中所述嵌合非人动物表达人内皮。7.如权利要求4-6中任一项所述的嵌合非人动物,其中所述非人动物是猪、牛、马或山羊。8.一种产生表达人ETV2基因的嵌合非人动物的方法,包括:a)生成ETV2无效的非人动物细胞,其中非人ETV2基因的两个拷贝都携带防止在所述非人动物中产生功能性ETV2蛋白的突变;b)通过体细胞核转移创建ETV2无效的非人胚泡,所述体细胞核转移包括将来自a)的所述ETV2无效的非人动物细胞的细胞核融合到去核的非人卵母细胞中,并激活所述卵母细胞分裂,从而形成ETV2无效的非人胚泡;c)将人干细胞引入b)的所述ETV2无效的非人胚泡;以及d)将来自c)的所述胚泡植入假孕替代非人动物,以生成表达人ETV2的嵌合非人动物。9.一种在非人动物中产生人血细胞或血管和/或人源化血细胞或血管的方法,包括:a)生成ETV2无效的非人动物细胞,其中非人ETV2基因的两个等位基因都携带防止产生功能性ETV2蛋白的突变;b)通过体细胞核转移创建ETV2无效的非人胚泡或桑椹胚,所述体细胞核转移包括将来自a)的所述ETV2无效的非人动物细胞的细胞核融合到去核的非人卵母细胞中,并激活所述卵母细胞分裂,从而形成ETV2无效的非人胚泡;c)将人供体干细胞引入b)的所述ETV2无效的非人胚泡;以及d)将来自c)的所述胚泡或桑椹胚植入假孕替代非人动物,从而生成表达人血细胞或血管和/或人源化血细胞或血管的非人动物。10.如权利要求8或9所述的方法,其中所述非人动物是猪、牛、马或山羊。11.如权利要求8或9所述的方法,其中所述人供体干细胞是组织特异性干细胞、多能干细胞、专能成体干细胞、诱导多能干细胞或脐带血干细胞(UCBSC)。12.如权利要求9所述的方法,其中所述提供干细胞的供体是所产生的人源化组织或器官的受体。13.如权利要求9所述的方法,其中由成纤维细胞生成所述人诱导多能干细胞。14.一种非人动物,其由权利要求8或9产生。15.一种子代非人动物,其由权利要求8或9的方法生成的两个非人动物交配所产生,其中所述子代非人动物表达人ETV2,其中所述子代非人类的基因组携带所述非人动物ETV2基因的纯合缺失。16.如权利要求15所述的子代非人动物,其中所述非人动物是猪、牛、马或山羊。17.如权利要求9所述的方法,其中所述血细胞是人诱导多能干细胞衍生的或人脐带血干细胞-衍生的白细胞、红细胞和/或血小板。

说明书

优先权声明

本申请要求2015年3月3日提交的美国临时专利申请第62/127,330号的优先权权益,据此要求该临时申请的优先权权益,并通过引用将该临时申请全部并入本文。

序列表

太阳城集团此文件通过引用在本文并入了电子序列表文本文件,该文本文件通过EFS-Web以电子格式提交。该文本文件称为“1552048.txt,”,12,288个字节,并且创制于2016年3月1日。

背景技术

血液是人体的主要器官。其由细胞和血浆组成。细胞部分包括红细胞、白细胞和血小板。血浆成分由水和溶解的化合物,尤其是如蛋白、糖或电解质组成。

血液的形成开始于原肠胚形成的过程中。第一造血谱系出现于卵黄囊的血岛中。造血前体细胞的分化受遗传程序的调节。最近证明,该遗传程序的关键因子是基因Ets变异基因2(Etv2)(Stem cells.2012August;30(8):1611-1623.doi:10.1002/stem.1131)。小鼠Etv2基因的除去导致卵黄囊丧失造血谱系和内皮谱系。Etv2基因在Etv2-突变体中的强制过表达恢复了血液谱系和内皮谱系。Genesis 2013Jul:51(7):471-480.Doi:10.1002/dvg.22396。

血液障碍可影响红细胞的产生(即贫血)、白细胞的增殖(即白血病)或血小板的凝固(即凝血病)。捐赠的血液用于治疗这些不同的障碍。红细胞用于治疗患有与镰状细胞贫血病、地中海贫血、再生障碍性贫血、白血病或癌症有关的慢性贫血的患者。血小板用于控制经历外科手术的患者的出血。目前,人血液的唯一来源就是人供体。

发明概述

本发明基于猪中Etv2基因缺失导致在造血内皮(hematoendothelial)发育前期步骤造血谱系和内皮谱系的消融这一新发现。本发明生成了缺乏猪Etv2基因(并因此缺乏猪血管和血液)的猪胚泡。通过将人干细胞如Etv2基因阳性iPS细胞注射到突变的猪(缺乏Etv2)胚泡,本发明生成了衍生自人干细胞如iPS细胞的人或人源化血液和血管。每年,超过300,000名美国人经历冠状动脉旁路移植术,并且会从使用这类工程化的冠状血管中获益。

太阳城集团本文描述了ETV2敲除猪或其他动物如牛或山羊的开发,作为用于产生临床应用的个性化人/人源化血液和血管的宿主。生成血液的祖细胞还生成代表血管内衬的内皮。在缺少内皮的情况下,没有血管,并且发育的胚胎是不能存活的。除了充当用于治疗心血管疾病和造血疾病的人/人源化组织的新来源之外,人源化猪还会充当研究人谱系再生和对药物应答的大型动物模型。发现Etv2作为传统心血管转录因子和造血内皮转录因子以及信号传导级联的靶标,已证明Etv2调节造血内皮谱系的特化和分化。此外,已经注意到Etv2变异小鼠胚胎是不能存活的,并且缺少内皮/血管谱系和造血谱系。利用基因编辑技术,进一步确立ETV2变异猪胚胎缺乏造血谱系和内皮谱系。基于这些结果,Etv2是发育过程中造血内皮谱系的主调节剂。本文描述了人源化遗传修饰生物替代物的工程化。

太阳城集团一实施方案提供了非人动物细胞或胚泡,其中基因组在ETV2基因的两个等位基因中都携带突变,从而使得非人动物细胞或胚泡缺乏功能性ETV2蛋白。在一实施方案中,突变是缺失ETV2基因。在另一实施方案中,非人动物细胞或胚泡是猪、牛、马或山羊。

一实施方案提供了表达人ETV2且缺乏非人动物ETV2表达的嵌合非人动物或胚泡。在一实施方案中,非人动物表达选自白细胞、红细胞、血小板或其组合的人血细胞。在另一实施方案中,嵌合非人动物表达人内皮。在一实施方案中,非人动物是猪、牛、马或山羊。

一实施方案提供了用于产生表达人ETV2基因的嵌合非人动物的方法,包括a)生成ETV2无效的非人动物细胞,其中非人ETV2基因的两个拷贝都携带防止在所述非人动物中产生功能性ETV2蛋白(通过自身或与其他基因一起)的突变;b)通过体细胞核转移创建ETV2无效的非人动物胚泡,所述体细胞核转移包括将来自a)的所述ETV2无效的非人动物细胞的细胞核融合到去核的非人卵母细胞中,并激活所述卵母细胞分裂,从而形成ETV2无效的非人胚泡;c)将人干细胞引入b)的ETV2无效的非人胚泡;以及d)将来自c)的所述胚泡植入假孕替代非人动物中,以生成表达人ETV2的嵌合非人动物。

太阳城集团另一实施方案提供了在非人动物中产生人和/或人源化血液或血管的方法,包括a)生成ETV2无效的非人动物细胞,其中非人ETV2基因的两个等位基因都携带防止产生功能性ETV2蛋白的突变;b)通过体细胞核转移创建ETV2无效的非人胚泡或桑椹胚,所述体细胞核转移包括将来自a)的所述ETV2无效的非人动物细胞的细胞融合到去核的非人卵母细胞中,并激活所述卵母细胞分裂,从而形成ETV2无效的非人胚泡;c)将人供体干细胞引入b)的ETV2无效的非人胚泡;以及d)将来自c)的所述胚泡或桑椹胚植入假孕替代非人动物中,从而生成表达人和/或人源化血细胞或血管的非人动物。在一实施方案中,血细胞是人诱导多能干细胞或人脐带血干细胞衍生的白细胞、红细胞和/或血小板。

太阳城集团在一实施方案中,非人动物是猪、牛、马或山羊。在另一实施方案中,人供体干细胞是组织特异性干细胞、多能干细胞、专能成体干细胞、诱导多能干细胞或脐带血干细胞(UCBSC)。在一实施方案中,提供干细胞的供体是所产生的人源化组织或器官的受体。在另一实施方案中,由成纤维细胞形成人诱导多能干细胞。

一实施方案提供了利用本文所述方法产生的非人动物。另一实施方案提供了由本文所述方法生成的两个非人动物交配产生的子代非人动物,其中所述子代非人动物表达人ETV2,其中所述子代非人类的基因组携带所述非人动物ETV2基因的纯合性缺失。在一实施方案中,非人动物是猪、牛、马或山羊。

一实施方案提供了基因敲除猪细胞或胚泡,其中基因组包含ETV2基因的缺失,从而使得猪细胞或胚泡缺乏功能性ETV2蛋白,其中猪细胞或胚泡对缺失而言是纯合的。在一实施方案中,在ENSSSCG00000002906中提供了野生型猪(野猪(Sus scrofa))ETV2(ets变体2)的序列。在另一实施方案中,如下提供了预测的sus scrofaets变体2(ETV2)mRNA和蛋白的序列:

太阳城集团MDLWNWDEASPQEVPLGNRLSGLEGAEFDFYFPELALPGDRLTA

ETYWKTGSSSLSVPGIPQPDWVSALPNPEAPWGAEPVPQALPWSGDWTDLPYSGSVPW

太阳城集团SRVSQALGSGCLDFQGPIQLWQFLLELLHDGTRSSCIRWTGNSREFQLCDPKEVARLW

太阳城集团GERKRKPGMNYEKLSRGLRYYYRRDIVLKSGGRKYTYRFGGRVPGLAYPDRMGDGQGA

太阳城集团ATQ(SEQ ID No:21)

太阳城集团一实施方案提供了ETV2突变猪(缺乏Etv2)。在另一实施方案中,嵌合ETV2突变猪表达选自白细胞、红细胞、血小板或其组合的人或人源化血细胞组成的组,以及人或人源化内皮。

一实施方案提供了用于产生ETV2突变猪的方法,包括:a)生成ETV2无效的猪细胞;b)通过体细胞核转移(SCNT)创建ETV2无效的猪胚泡,所述体细胞核转移(SCNT)包括将来自a)的所述ETV2无效的猪细胞的细胞核融合到去核的猪卵母细胞中,并激活所述卵母细胞分裂,从而形成ETV2无效的猪胚泡;c)将人干细胞引入猪ETV2无效的胚泡。

另一实施方案提供了用于在猪中产生人或人源化血细胞和人或人源化内皮的方法,包括:a)生成ETV2无效的猪细胞;b)通过体细胞核转移(SCNT)创建ETV2无效的猪胚泡,所述体细胞核转移(SCNT)包括将来自a)的所述ETV2无效的猪细胞的细胞核融合到去核的猪卵母细胞中,并激活所述卵母细胞分裂,从而形成ETV2无效的猪胚泡;c)将人干细胞引入b)的所述猪ETV2无效的胚泡(囊胚腔)中,以及d)将来自c)的所述胚泡植入假孕/替代猪中,从而生成具有人/人源化血细胞和人/人源化内皮的猪(将人干细胞添加到基因编辑的胚泡中)。在一实施方案中,血细胞和内皮是人-iPS-干细胞或人脐带血干细胞衍生的白细胞、红细胞血细胞和/或内皮。

制备针对每个受体的免疫复合物而言是个体化的人或人源化组织和器官,会是有用的。如本文所公开的,通过以下方式这么做是可能的,利用大型动物作为宿主,编辑其基因组以敲除或弱化负责靶器官生长和/或分化的基因,并用供体干细胞接种在胚泡阶段或受精卵阶段的该动物,以补充丢失的用于器官的生长和发育的遗传太阳城集团。结果是获得了其中补充的组织(人/人源化器官)匹配供体的基因型和表型的嵌合动物。这类器官可以在一个世代中制备,并且干细胞可以从患者自身采集或生成。如本文所讨论的,这样做是可能通过同时编辑细胞的多基因来实现的(参见例如WO 2015/168125,通过引用将其并入本文)。利用靶向核酸酶和同源定向修复(homology directed repair,HDR)模板,可以靶向脊椎动物细胞或胚胎中用于编辑的多基因。

一实施方案提供了在非人宿主动物中产生人源化组织的方法,包括:i)遗传编辑宿主细胞或胚胎中一个或多个负责期望的组织或器官生长和/或发育的基因;ii)通过将来自供体的有效量的干细胞注射到细胞、胚胎、受精卵或胚泡(例如人-猪胚泡)中补充宿主丧失的遗传太阳城集团,以创建嵌合动物;从而产生人源化组织或器官(以便通过使用细胞(例如干细胞)互补产生嵌合动物)。

在一实施方案中,干细胞是人诱导多能干细胞(iPS细胞)或人脐带血干细胞。在一实施方案中,由成纤维细胞或任何成体细胞或体细胞(例如人细胞)形成人iPS细胞。在一实施方案中,通过用TALENS(基因:ETV2ENSSSCG00000002906)进行基因编辑,创建ETV2无效的猪细胞。

进一步描述了产生嵌合猪的方法和由本发明的嵌合猪产生组织的方法。一实施方案提供了由本文所述方法生成的两头猪交配所产生的子代猪,其中所述子代猪表达人ETV2,其中所述子代猪的基因组包含猪ETV2基因的纯合性缺失。

附图简要说明

太阳城集团图1A-D:Etv2是造血谱系和内皮谱系的主调节剂。(A)在E8.5,采集Etv2突变和野生型同窝出生仔畜胚胎,切片,并通过苏木精-伊红染色和利用内皮粘蛋白(endomucin)抗体(α-内皮粘蛋白)免疫组织化学进行分析。在此阶段,在野生型胚胎中形成主要心脏静脉(primary heart vein,PHV)、背主动脉(dorsal aorta,DA)以及心内膜(endocardium,End),而Etv2突变小鼠缺乏这些结构。抗-内皮粘蛋白染色确定了在突变胚胎中缺乏的血管(箭头)和心内膜(箭头)。(B)利用来自E 8.5的Etv2野生型(Wt)胚胎、杂合(Het)胚胎以及突变胚胎的卵黄囊进行的甲基纤维素集落形成测定。注意到Etv2野生型动物和Etv2杂合动物具有相似的集落形成活性,而Etv2突变卵黄囊细胞却没有。(C)改造稳定转染的ES细胞系,以便以强力霉素(Dox)-诱导型方式表达Etv2。将ES细胞分化4天,并且通过添加Dox诱导Etv2。诱导5天后,流式细胞术分析证明在Etv2诱导后造血谱系(CD45+)和内皮谱系(PECAM+或Tie2+)显著增加。(D)Etv2诱导第3天到第6天后,EBs的集落形成活性。注意Etv2诱导后增加的造血活性。空心柱(open bar):未诱导,实心柱(filled bar):Dox诱导。

图2.Etv2在中胚层谱系特化中提议的作用。

图3A-G.Etv2而非Flk1能够营救Etv2突变ESCs/EBs的内皮表型和造血表型。FACS定量分析表明,Etv2和Flk1能够营救Flk1-/-ESCs/EBs的内皮分化(A),但是只有Etv2能营救Etv2-/-ESCs/EBs(B)。用造血标志物获得了相同的结果(数据未显示)。图版(C)显示了Etv2和Flkl谱系和营救研究的总结。Gata2在物理上相互作用并且扩大Etv2活性。(D)Etv2-Gata2构建体的示意图。Etv2和Gata2通过2A肽序列连接,并且等同表达。通过核糖体跳跃机制,将融合构建体翻译成两种蛋白即Etv2和Gata2。Etv2和Gata2在EBs中的共表达导致造血和内皮谱系分化增加(E-F)。从EB的第3天到第4天用强力霉素(+Dox)处理EBs或不处理(-Dox),并在第6天收获,用于FACS分析。经鉴别造血谱系为c-Kit+/CD41+细胞群(E),并且将内皮谱系表示为Flk1+/CD31+(F)。图版G突出显示了内皮谱系和造血谱系中Etv2的上游调节剂和下游靶标。

图4A-B.TALEN-介导的ETV2敲除。(A)三重PCR测定(three-tiered PCR assay)用来检测基因编辑。由引物a-d进行的扩增显示存在等位基因缺失。为了区分杂合克隆和纯合克隆,用引物a-b和c-d扩增野生型等位基因。只有当a-d产物存在且a-b、c-d产物不存在时,克隆才能视为对等位基因缺失来说是纯合的。(B)符合这些条件的克隆用绿框图起来。

太阳城集团图5A-H.猪ETV2的丧失概述了小鼠Etv2突变表型。处于相同发育阶段的野生型E18.0猪胚胎(A)和(B)ETV2敲除胚胎。插图显示了尿囊的放大视图。注意到在突变体中缺乏血管丛形成的异常整体形态(插图)。分别对A和B所示胚胎的切片(C-H)——尿囊(C,D)、心脏水平(E,F)以及躯干水平(G,H)的以下物质进行染色:Tie2,即内皮标志物;Gata4,即心脏谱系标志物;以及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),即核复染剂。野生型尿囊被Tie2阳性内皮内衬高度血管化,并且含有血液(C,箭头),而突变体缺乏这些群体(D)。心内膜、主静脉(CV)以及背主动脉(DA)在野生型胚胎(E、G)中清晰可见。相比之下,ETV2无效的胚胎完全缺乏这些结构,尽管存在Gata4(绿色)标记的心脏先祖和肠(分别为F和H)。比例尺:1000μm(A、B)、200μm(A、B中的插图)、100μm(C-H)。

太阳城集团图6A-H.用野生型ES细胞互补Etv2突变小鼠胚胎。用10-15EYFP标记的野生型ES细胞注射通过使Etv2-/+小鼠与Etv2dFl/+小鼠杂交获得的胚泡。在E10.5收获胚胎,并进行基因分型。A、B:胚胎的全覆式落射荧光图像(whole-mount epifluorescence image)显示了野生型ES细胞子代的分布。C-H:分别是A、B所述胚胎的心脏(心室)切片。图版显示EYFP(C,D)、内皮粘蛋白(E、F)免疫组织化学以及重叠图(G、H)。比例尺:1000μm(A、B)以及100μm(C-H)。

太阳城集团图7A-C.Etv2突变细胞和野生型ES细胞的共分化。通过悬滴法单独分化(前两行)或混合并共分化(底端行)7AC5标记、否则EYFP标记的野生型ES细胞和Etv2突变ES细胞(Etv2-/-)。在第4天解离细胞,并分析细胞表面标志物。注意EYFP阴性Etv2突变细胞并不有助于内皮谱系和造血谱系,这表明存在来自野生型ES细胞的最小旁分泌作用。

太阳城集团图8A-C.野生型大鼠ES细胞营救Etv2突变小鼠ES细胞的内皮潜能。通过EB形成诱导野生型小鼠ES细胞(A)、Etv2突变小鼠ES细胞(B),或比例为1∶1的Etv2突变小鼠ES细胞和野生型大鼠ES细胞(C)分化。注意,野生型小鼠ES生成以血管样结构(A)排列的、突变EBs(B)所缺失的CD31+细胞。与野生型大鼠ES细胞的共分化恢复了CD31+群(C)。

太阳城集团图9A-B.嵌合人-猪胚泡。(A)在ICM中具有hUCBSCs的胚泡。注意,胚泡正开始孵化。(B)在ICM中具有DiI-标记的hiPSCs的胚泡。注意临近孵化的胚泡具有DiI-标记的hiPSCs。ZP:透明带;ICM:内细胞团。

具体实施方式

太阳城集团本文描述了ETV2敲除(或ETV2敲除联合其他基因敲除)动物如猪的发育,作为产生临床应用或临床前应用的个性化人/人源化血液或血管的宿主。除了充当用于治疗心血管疾病和造血疾病的人/人源化组织的新来源之外,人源化动物如猪还会充当研究人谱系再生或对药物应答的大型动物模型。

血液疾病和心血管疾病都是常见且致命的(1-3)。这些疾病都是慢性的、使人衰弱的,并且是致命的,它们需要新疗法。血液和心血管的发育程序具有许多重叠的特征,因为两者都是侧板中胚层衍生物(lateral plate mesodermal derivatives),并且都受转录因子、信号传导级联以及细胞外线索的交叉网络调节。最近的研究提出,造血内皮谱系具有共同的祖先。Etv2/Etsrp71/ER71是传统心血管和造血内皮转录因子和信号传导级联的靶标,包括Mesp1、Flk1/Creb以及Nkx2-5。已经证明,Etv2调节造血内皮谱系的特化和分化(4-17)。另外,Etv2突变小鼠胚胎是不能存活的,并且扰乱中胚层(造血和内皮)谱系发育(9,10)。本文所述的数据支持ETV2突变猪胚胎也是不能存活的,并且缺乏造血谱系和内皮谱系。基于所述结果,Etv2是发育过程中造血内皮谱系的主调节剂。本文描述了作为产生临床应用的个性化人血液和血管的宿主的ETV2敲除猪。这种人源化大型动物模型会是再生医学的重要资源,并且会充当生成个性化的人源化猪器官的平台。这种策略能对慢性心血管疾病和造血疾病的新兴疗法以及移植产深远影响。除了充当用于治疗心血管疾病和造血疾病的人组织的新来源之外,人源化猪还会充当研究人谱系再生和对药物应答的大型动物模型。

定义

太阳城集团在描述和请求保护本发明时,会依据下述定义使用下述术语。除非另有说明,本文所用的所用科技术语都与本发明所述技术领域的普通技术人员所理解的具有相同的含义。与本文所述等同或相似的任何方法和材料都可以用于实践或检验本发明。下文为基(radical)、取代基以及范围所列的具体值和优选值仅用于说明;它们不排斥为基和取代基定义的其他值,或为基和取代基定义的范围内的其他值。

太阳城集团本文所用冠词“a(一个/种)”和“an(一个/种)”是指一个/种或多个/种,即不止一个/种所述冠词的受词。举例来说,“一个/种要素”表示一个/种要素或不止一个/种要素。

本文所用术语“约”表示大约(approximately)、在……附近、大致或约(around)。当术语“约”与数值范围联用时,其通过扩展边界高于和低于所述数值而修饰范围。通常,术语“约”在本文中用于修饰低于和高于所述值20%方差的数值。

太阳城集团术语“分离的”表示一个或多个因子、一个细胞或数个细胞,其不与体内的一个或多个因子、一个或多个细胞结合的一个或多个因子、一个或多个细胞组分结合。

太阳城集团“细胞”包括来自脊椎动物的细胞,例如哺乳动物,包括人。或者受试者是脊椎动物,例如哺乳动物,包括人。哺乳动物包括但不限于人、农场动物、运动动物和伴侣动物。术语“动物”包括狗、猫、鱼、沙鼠、豚鼠、仓鼠、马、兔、猪、小鼠、猴(例如猿、大猩猩、黑猩猩或猩猩)、大鼠、绵羊、山羊、牛和鸟。

太阳城集团术语“猪(pig)”、“猪(swine)”以及“猪(porcine)”交换使用,并且是表示不考虑性别、大小或品种的相同类型动物的上位概念。

太阳城集团转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)是通过将TAL效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而生成的人工限制酶。这些程序能使用于基因组原位编辑的有效、程序化的特异性DNA切割成为可能。转录激活因子样效应物(TALEs)是以序列特异性方式结合DNA的蛋白。通过将这样的TALE融合到核酸酶(例如FokI内切核酸酶)中,制备高度特异性的DNA“剪刀”(这些分子经改造可以结合任何DNA序列)。本文所用的术语TALEN是广义的,并且包括可以在没有来自另一TALEN的帮助下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也用于指一对被改造成用于在同一个位点共同合作来切割DNA的一对TALENs中的一个或两个成员。共同合作的TALENs可以被称为左TALEN和右TALEN,其指DNA的偏手性。

一旦TALEN基因得以组装,它们便被插入质粒中;然后用质粒转染表达基因产物并且基因产物进入其细胞核以接触基因组的靶细胞。TALEN可用于通过诱导双链断裂(DSB)和任选地插入货物/预选基因来编辑基因组,这些细胞对修复机制作出应答。以这种方式,它们可以用于校正基因组中例如引起疾病的突变。

基因工程,包括基因编辑,可以通过技术人员可用的任何方法进行,例如通过使用靶向内切核酸酶、同源定向修复(HDR)、TALEN、CRISPR(例如CAS9/CRISPR)、重组酶融合分子、合成猪人造染色体、兆核酸酶、锌指或基于rAAV的基因编辑系统(例如,敲除所需的靶基因)。此外,可以将多种核酸引入细胞,用于敲除目的,用于灭活基因(例如干扰RNA(shRNA、siRNA、dsRNA、RISC、miRNA))或表达基因。

体细胞核转移(SCNT)是用于由体细胞和卵细胞创建活胚胎的实验室技术。体细胞核移植的过程涉及两种不同的细胞。第一个是雌配子,被称为卵(ovaum)(卵(egg)/卵母细(oocyte))。第二个是体细胞,指人体的细胞。皮肤细胞、脂肪细胞和肝细胞只是几个例子。取出并丢弃供体卵细胞的细胞核,使其解除编程。也取出体细胞的细胞核,但是保留它,去核的体细胞被丢弃。剩下的是单独的体细胞核和去核的卵细胞。然后通过将体细胞核喷射到“空”卵中使它们融合。在插入卵后,体细胞的细胞核被宿主卵细胞重新编程。现在含有体细胞细胞核的卵受到休克刺激开始分裂。卵现在是能存活的,并能够产生含有只是来自一个亲本的所有遗传太阳城集团的成体生物体。发育将正常发生,并且在许多有丝分裂分裂之后,该单细胞形成与最初生物体(即,克隆)具有相同基因组的胚泡(具有约100个细胞的早期胚胎)。然后可以通过破坏这种克隆胚胎来获得干细胞,用于治疗性克隆,或者在生殖克隆的情况下,将克隆胚胎植入到宿主母体(假孕/替代物)中用于进一步发育,并使其足月分娩。

“嵌合体”指由遗传上不同的细胞构成的单个生物体。

太阳城集团“人源化”指从非人动物收获的器官或组织,所述非人动物的蛋白序列和基因补体比非人宿主更类似人的蛋白序列和基因补体。

“器官”是指在结构单元中连接起来提供共同功能的组织的集合。本文所用的“组织”是指来自相同起源的、一起执行特定功能的相似细胞的集合。

无效纯合(nullizygous)生物体携带同一基因的两个突变或缺失的等位基因。突变/缺失的等位基因都完全丧失功能或等位基因“无效”,因此纯合无效的(homozygous null)和无效纯合是同义词。

基因敲除(缩写:KO)是一种基因技术,其中生物体的等位基因都被无效(从生物体“敲除”)。术语敲除、灭活和破坏在本文中互换使用,表示改变靶位点,从而消除或大大降低基因表达产物。也被称为敲除生物体或简单地称为敲除。该术语还指像在“敲除”基因中一样创建这类的生物体的方法。该技术本质上与基因敲入相反。

太阳城集团术语基因是广义的,是指表达产生功能产物的染色体DNA。基因具有等位基因。基因编辑可以是单等位基因或双等位基因。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”等可以具有美国专利法赋予它们的含义,可以表示“包括(includes)”、“包括(including)”等。如本文所用,“包括(including)”或“包括(includes)”等是指包括但不限于包括。

太阳城集团需要外生器官(exogenic organ)生产以符合器官移植要求。

目前,晚期器官衰竭的唯一确定疗法是移植。移植的限制因素是供体器官可用性。数十万患者可能从这种疗法中受益,但由于其伴随的病,不是合适的移植体候选者。因此,与尸体或活体相关的捐赠器官严重短缺。此外,器官移植需要还具有有害副作用的终生免疫抑制。本文描述了人源化组织在猪中的生成,人源化组织会作为移植器官的无限来源,并为心血管疾病和造血疾病的治疗提供范式转换平台。

对异种移植具有浓厚兴趣。例如,通过胚泡互补方法在小鼠中产生大鼠胰腺(27)。在这些研究中,用野生型(Wt)大鼠(rPSC)的多能干细胞注射Pdx1胚泡突变体,Pdx1是胰腺发育的主调节基因(27)。将rPSC注射的胚泡转移到替代小鼠母鼠(mouse dam)中,产生具有由大鼠细胞构成的功能性胰腺的小鼠嵌合体。这些研究强调了生成缺乏关键发育调节因子的胚泡从而使胚胎完全缺乏靶器官的重要性。然后,这些突变宿主为健康供体干细胞定殖(populate)和生成供体来源的器官提供发育“小生境”。胚泡互补策略还在啮齿动物中产生了诸如肾脏、胸腺和肝脏等器官,并且最近在猪中产生了胰腺(28-31)。

太阳城集团使用基因编辑平台或技术人员可获得的任何方法,可以突变各种发育基因以生成器官缺陷动物,例如猪,随后可以利用胚泡互补以生成外源器官。

太阳城集团Etv2(ENSSSCG00000002906)是内皮谱系和造血谱系的主调节基因

之所以使Etv2基因座突变以生成内皮缺陷和造血缺陷型猪胚胎,有几个原因。首先,本发明人已经证明,在小鼠中,Etv2是内皮发育和造血发育的主调节基因(7-9)。使用遗传谱系追踪策略,证明表达Etv2的细胞产生内皮谱系和造血谱系(9,10)。第二,进行了全基因缺失策略,其证明Etv2突变小鼠胚胎由于缺乏内皮谱系和造血谱系而是不能存活的(图1A,B)(8)。使用转录组分析,确定Tie2在不存在Etv2时受到显著异常调节(7,8)。此外,使用转基因技术和分子生物学技术(转录测定、EMSA、ChIP和诱变),证实Spi1、Tie2和Lmo2是Etv2的直接下游靶标(7,8,11)。第三,Etv2在分化的ES/EB系统中的强制过表达显著增加了内皮谱系群和造血谱系群,表明Etv2是具有控制会诱导两个谱系的分子级联能力的单一因子(图1C,D)(8)。

太阳城集团第四,中胚层谱系特化限定了Etv2的功能作用,Etv2上游的分子途径及其下游靶也受到限定。野生型(Wt)小鼠和Etv2突变小鼠的微阵列分析揭示,在Etv2突变体中,心脏特异性转录物被过分提呈,这表明Etv2抑制心脏谱系的分化(9)。为了支持这一发现,Etv2的过表达抑制ES/EB细胞中的心脏分化,同时诱导内皮程序和造血程序。根据这些研究中,在中胚层谱系的特化中,Etv2的作用被定义为内皮分化和造血分化的必要和充分因子以及心脏分化的抑制剂(图2)(9)。

图2总结了有关涉及Etv2的分子途径的几个关键性发现。首先,确定Flk1和Etv2的遗传层级(12)。使用Flk1突变体和Etv2突变体ES细胞,两者都无法生成造血谱系和内皮谱系,并测试这些表型是否可以通过Etv2或Flk1的过表达获得营救。结果表明,Flk1突变体ESC/EBs的内皮潜能和造血潜都能被Etv2和Flk1两者营救,但是Etv2突变体表型仅被Etv2营救而不被Flk1营救。这个发现表明,(1)Etv2位于Flk1的基因下游,(2)Etv2的下调是Flk1突变体表型的原因。因此,在内皮祖细胞中建立了Flk1→Etv2层级。其次,Gata2被认为是Etv2功能的辅因子(图3D-F)(11)。通过在ES细胞中以1∶1的化学计量过表达Gata2和Etv2,证明与Etv2单独相比,造血分化和内皮分化都得到增强。Gata2本身并未增强分化,这表明它作为Etv2功能的放大器。第三,最近在小鼠和斑马鱼方面的研究表明,Etv2调节进一步控制内皮谱系和造血谱系特化的谱系限制微RNAs(microRNAs)(数据未显示)。总之,定义了上游因子和下游因子,以及与Etv2相互作用以促进造血谱系和内皮谱系分化的辅因子(图3G)。

这些结果和其他结果支持Etv2在猪模型中是基因编辑候选者,因为研究预测Etv2突变动物会完全缺乏内皮谱系和造血谱系,并为人类干细胞定殖提供小生境。本文所述的组合物和方法会产生将被人内皮细胞布满或定殖的血管系统,使其成为移植的理想组织。此外,在猪替代模型中会产生人类血液。

Etv2与其他基因不同的第五个原因来自异种移植研究。虽然种间互补和随后的外生器官移植的验证原理的研究已经是成功的,但是注意到服务于这些器官的血管是宿主衍生的(1,2)。考虑到血管表面在器官排斥中的重要性,特别是异种移植的猪组织的超急性排斥,这些发现引起了极大关注(13)。事实上,大多数外生器官的发育需要内皮谱系的人源化。Etv2是用于此目的的理想候选者。

太阳城集团人源化大型动物模型将是再生医学的重要资源,并作为制备个性化器官的平台。该策略可以改变目前慢性心血管疾病和造血疾病以及移植的临床实践范例。到目前为止,已经在小鼠和大鼠之间(27,29)以及猪和猪之间(31)进行了外生器官移植;但是人源化器官在大型动物模型中的发育未有成功报道。通过引用将美国临时申请序列号62/247,092并入本文。

以下实施例旨在进一步说明本发明的某些特别优选的实施方案,并非意图以任何方式限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

母猪/小母猪(gilt):母家猪(8-12个月龄)将被用作胚胎移植受体,并根据许可的IACUC方案,在预期的妊娠和分娩期间作为常规家猪得到照顾和维护。

同期发情和授精:在发情期的第11-22天会给予母猪混合到早晨饲料中的6.8mL Matrix(四烯雌酮2.2mg/mL),以使动情期同步。在Matrix最后一天以及4天后会给予律胎素(lutalyse)(2cc)。将在给予Matrix结束后的第6天开始,每天两次检查母猪的发情。首次检测到发起后,将用选择的公猪的精液给母猪授精高达三次。使用多普勒超声或具有线性5mHz换能器的经腹超声,在妊娠的第23-90天之间检查母猪的妊娠。两种形式的超声波都是侵入性的,不会对母猪或胎儿造成伤害。可以从妊娠小母猪/母猪身上采集血液样品,以应兽医要求或出于遗传分析确定是否存在任何疾病。

太阳城集团胚胎转移:通过外科手术将重建的克隆胚胎转移到不同步的受体雌性猪的子宫中。对于手术胚胎转移,用以下组合诱导麻醉:氯胺酮(2mg/kg)、替来他明(tiletamine)/唑拉西平(0.25mg/kg)、赛拉嗪(1mg/kg)和阿托品(0.03mg/kg;全部来自Iowa Veterinary Supply)。对于手术的其余期间,用异氟烷或七氟醚(5%诱导,维持在1-4%以保持在手术平面)维持全身麻醉。在仰卧时,对受体进行无菌手术准备,并且进行尾侧腹切口以暴露和检查生殖道,包括子宫、输卵管和卵巢。通常,使用5.5英寸导管(Iowa Veterinary Supply)将150-200个重建的克隆胚胎放置在输卵管的峡部中。将子宫放回腹腔,将受体动物缝合并置入术后恢复。在妊娠期间,借助具有连接的3.5MHz跨腹探针的Aloka 500超声扫描仪用实时超声检查证实妊娠(Aloka Co.,Ltd.,Wallingford,CT)并监测妊娠。维持受体畜作为正常妊娠母猪。对于仔猪生产,允许接受自然分娩,或在妊娠第118天之前通过剖腹产接生。必要时可提供初乳喂养和强化新生儿支持,包括Nurtinger饲养单元(Nurtinger rearing unit)。

ETV2敲除猪胚胎缺乏造血谱系和内皮谱系

太阳城集团以前的研究已经证明,Etv2在小鼠的血管发生和造血中发挥作用,因为缺乏Etv2的胚胎在大约E9.5时是致命的,没有血管和血液(7-10)。为了检查ETV2(ENSSSCG00000002906)在猪中的作用,使用猪成纤维细胞中基因侧翼的两个TALEN对去除整个ETV2编码序列(图4)。

1)ETV2缺失策略

TALENs:

太阳城集团ETV2 5-2(从5′到3′)

左:CTGGCCGGAAATCCCC(SEQ ID NO:1)

右:GGGCTGCACCAGGCT(SEQ ID NO:2)

ETV2 3-2(从5′到3′)

左:GATCCCAAGTCACACC(SEQ ID NO:3)

右:CCCCTAAGGGTCCTG(SEQ ID NO:4)

太阳城集团2)HDR缝合模板(stitching template):该模板以可预测的方式融合5’和3’TALEN诱导的断裂。其还增加恢复缺失等位基因的效能。

HR寡核苷酸

太阳城集团 GGATCCaacagacacaggacccttaggggacctactgtgtgttcactg(SEQ ID NO:5)

加下划线的小写字母=从ETV2 3.2切割位点右侧42nt的同源性,

粗体大写字母=从ETV2 5.2切割位点左侧42nt的同源性

加下划线的大写字母=插入的BamHI位点

从ETV2 5’NJ F1到ETV2 3’NJ R1的全序列:当缺失等位基因利用上述模板进行修复/融合时,这是预测的PCR产物。

tgaagcagccccagaacttcctcctcaaagccctcgaaggggaaaacagcctggtggaagatcccaggtcgaccaaccaacccccaccatatcccccgcaggccccctgcggattgtgaGGATCCtgtggtgggccatgcagaggaatcaaattcagtagccactggcctgcctgctttgtgcctgccctgtactgggacttgtacatgaaacagacacaatcaataactttcgaatttacccactgtgtccccctttgagaggactcaagattccaaagagggcttactgtgtaccctccctgtgccggggccatcagcgaattagacctggtgcttgcccccccagtcacctattctgttttcctacttcaagctaagggccatagaacttagatcccaaggaaagtctaccctgttctgggaacaactgagcgctta(SEQ ID NO:6)

3)筛选引物:

太阳城集团ssETV2 5′NJ F1:TGAAGCAGCCCCAGAACTTC(SEQ ID NO:7)

ssETV2 5′NJ R1:TGGCCTCCAGTGTCCTTTTC(SEQ ID NO:8)

太阳城集团ssETV2 3′NJ F1:TAGCCTATCCCGACCGCAT(SEQ ID NO:9)

太阳城集团ssETV2 3′NJ R1:TAAGCGCTCAGTTGTTCCCA(SEQ ID NO:10)

在完全除去基因时,该方法的效率高达15%;对于ETV2基因缺失而言,基因分型克隆的79/528是纯合的。使用ETV2纯合敲除成纤维细胞克隆进行核克隆(体细胞核转移;SCNT),以生成转移到替代母猪的ETV2无效的胚胎。克隆效率为29%。

在E18.0收获并分析胚胎(图5)。在E18.0时,野生型(Wt)胚胎血管化,在尿囊中具有发育良好的血管丛(图3A),并具有血液发育的证据(图5C)。相比之下,ETV2KO胚胎显示出明显的发育缺陷。尽管两个胚胎都处于24体节阶段(图5B),但相对于Wt胚胎,ETV2KOs生长延迟,且缺乏血液谱系和血管谱系(图7C-H)。ETV2KO胚胎缺乏在Wt胚胎中明显发育的主静脉、背主动脉和心脏内膜(图5E-H)。

图1和图5的结果反映了类似的表型,并且表明ETV2的功能在小鼠和猪间是保守的。这些数据进一步表明,人们可以将多个突变引导到猪基因组中,以支持会在多种细胞类型中人源化的嵌合器官的生长。

作为使ETV2缺失的替代方案,可以将突变输入到基因中,例如移码突变,其中所创建的任何蛋白会是非功能性的。例如:

1)移码KO等位基因:在本实施例中,在外显子3和早熟的终止密码子中产生移码。

1)TALENs:

ETV2 3.1(从5′到3′)

左:TCATCCTTATCTGTCC(SEQ ID NO:11)

右:GCGGAGACCCAGTCC(SEQ ID NO:12)

ETV2 3.3(从5′到3′)

左:TACCGAACCCAGAAG(SEQ ID NO:13)

右:ACTGTGGGAGACACTCA(SEQ ID NO:14)

2)HDR模板:

ssETV2 3.1HR-KO

cctccctaaactcagcttcatccttatctgtcccagggatcTAA GCTTcacagccggactgggtctccgcattaccgaacccagaagct(SEQ ID NO:15)

太阳城集团 加下划线的小写字母=ssETV2 3.1切割位点

斜体大写字母=终止密码子

太阳城集团大写字母=插入的碱基

加下划线=插入的HindIII限制位点

太阳城集团ssETV2 3.3WT序列

cggactgggtctccgcattaccgaacccagaagctccatgggcgcgggtgagtgtctcccacagtaactggaggtttcgatt(SEQ ID NO:16)

加下划线的粗体大写字母=ssETV2 3.3切割位点

太阳城集团ssETV2 3.3HR-KO

cggactgggtctccgcattaccgaacccagaagctccatggGCTTggcgcgggtgagtgtctcccacagtaactggaggtttcgatt(SEQ ID NO:17)

加下划线的粗体小写字母=ssETV2 3.3切割位点

太阳城集团斜体大写字母=终止密码子

大写字母=插入的碱基

太阳城集团 加下划线=插入的HindIII限制位点

3)筛选引物:

太阳城集团ssETV2E3 F4:CACAACTCTCGTCCCGAACA(SEQ ID NO:18)

ssETV2E3 R4:GAACGGACCCCAAGTGAGAG(SEQ ID NO:19)

野生型小鼠ES细胞营救Etv2突变胚胎

在猪中生成人源化组织的基本假设是,注射的细胞会优先定殖于突变宿主的发育小生境,并产生缺失的细胞类型。作为原理论证研究并为了评估Etv2是否是理想的靶基因,用EYFP标记的野生型小鼠ES细胞补充小鼠Etv2突变胚泡(图6)。为了在野生型细胞存在下积极鉴别突变等位基因,培育了两种不同的Etv2突变系的半合子小鼠(未发表的数据)。在E10.5(比观察到的Etv2突变胚胎的致死晚一天)收集胚胎,进行基因分型,并检查EYFP阳性细胞的分布和内皮标志物即内皮粘蛋白。在Etv2半合子胚胎和Etv2突变胚胎中,野生型ES细胞成功整合到胚胎中(图6A,B)。免疫组织化学分析揭示,EYFP标记的野生型细胞随机分布到半合子动物的所有胚层的多种细胞类型(图6C、E、G),而在Etv2突变体中,大部分EYFP阳性细胞见于内皮谱系、心内膜谱系以及造血谱系(图6D、F、H)。数据支持所有内皮粘蛋白阳性内皮细胞都表达EYFP这一概念,表明它们是来自野生型ES细胞的衍生物(图6D、F、H)。Etv2突变胚胎还具有EYFP标记的Tie2阳性细胞,其血管内具有原始的血液样形态,这表明还营救了造血谱系(数据未显示)。

太阳城集团为了进一步证实这一发现,使用EYFP标记的野生型和Etv2突变ES细胞(8),使其分别或一起分化,并在分化的第4天利用FACS检查各系对造血谱系(CD41、CD45)和内皮谱系(CD31、Tie2)的贡献(图8)。野生型7AC5/EYFP细胞为99%EYFP阳性,产生4.54%内皮细胞、0.36%造血细胞(上排)。Etv2突变体细胞为EYFP阴性,不产生内皮细胞和造血细胞(中间排)。共分化EBs的分析揭示,EYFP阴性细胞对内皮谱系和造血谱系的贡献与Etv2突变ES细胞的贡献是难以区别的,并且EYFP阳性细胞以与单独培养的野生型细胞相似的效率生成内皮谱系和造血谱系(下排)。该结果表明,ES/EB共分化系统中“营救”的内皮谱系和造血谱系仅来自野生型ES细胞。这些结果提供了靶向猪ETV2以产生用于人源化内皮谱系和造血细胞谱系的宿主动物的理论基础。

大鼠胚胎干细胞营救Etv2突变小鼠胚胎体的内皮细胞群。

然后使用两种不同的物种测试Etv2无效的ES/EB互补是否可行。使用Etv2突变小鼠ES细胞和野生型大鼠ES细胞进行体外ES/EB互补测定(图7)(22)。通过将ES细胞铺板于超低附着平板上的分化培养基中,通过拟胚体(EB)形成诱导野生型或Etv2突变小鼠ES细胞分化。培养12天后,将EB固定、切片并进行内皮标志物CD31染色(8)。观察到强CD31+群布满野生型小鼠EB中血管样结构中(图7A),但在Etv2突变EB中没有观察到CD31+细胞(图7B)。相比之下,Etv2突变ES细胞和野生型大鼠ES细胞的共分化培养物显示具有强烈CD31表达的细胞块,这表明该共培养方法营救了CD31+群(图7C)。在小鼠-大鼠互补测定中的这一成功提供了概念验证和进一步推进猪-猪和人-人互补实验的理论基础。

人脐带血干细胞(hUCBSC)和hiPSC整合到猪孤雌生殖体(用电激活胚胎从而在不受精的情况下发育)的内细胞团(ICM)中。

为了评估生成人-猪嵌合体的策略的可行性,检查了hUCBSC和hiPSC整合到猪胚泡中并参与胚胎发育的能力。用电刺激卵母细胞生成猪孤雌生殖胚泡(42)。激活后6天,将9-12DiI或EdU(24hr(小时))-标记的hUCBSC或hiPSC注射到囊胚腔中。允许胚泡通过培养恢复两天,然后成像。在90%的猪胚泡的ICM中观察到标记的hUCBSC和hiPSC(图9A、B,显示了代表性的图像)。比较DiI分布与使用人细胞核抗原特异性抗体(HNA)的免疫组织化学,揭示了HNA抗体检测到注射的人干细胞(图9A,箭头)。注射了EdU标记的hiPSC的胚泡在收获前用BrdU进一步脉冲1小时,以检测增殖细胞。用EdU进行的双重标记揭示了注射的人类干细胞在注射48小时后继续增殖(图9B,箭头)。这些结果表明,人干细胞并入猪胚泡的ICM中,以及嵌合胚泡的发育进行到以准备植入子宫的孵化阶段。为了检测人类干细胞向猪孤雌生殖胚胎中的整合,将嵌合胚泡移植到假孕母猪中,并在E28分析胚胎。如先前所报道的(30),获得正常发育的胚胎,发现其中之一含有用HNA抗体染色的人细胞簇。这些结果支持并提供检查人干细胞群是否兼容和/或有助于ICM发育的快速测定。而且,孤雌单性生殖胚泡的植入提供了检查人类干细胞向发育中的胚胎整合和分化的高通量方法。该策略的一个显著优点是,猪卵母细胞作为食品生产的副产品可以大量获得,并且可以定期大量产生孤雌生殖胚胎。应当指出,孤雌生殖胚胎存活不超过8周,因此否定了不经意产生不想要的人-猪嵌合体的忧虑。

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太阳城集团参考各种具体和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而,应当理解,可以在其范围内进行许多变化和修改。所有引用的出版物、专利和专利文献旨在通过引用并入,如同通过引用单独并入。

序列表

<110> D·J·加里

M·G·加里

T·拉斯穆森

N·小谷野中川

明尼苏达大学董事会

<120> ETV2及其用途

<130> 600.938WO1

<150> US 62/127,330

太阳城集团<151> 2015-03-03

<160> 21

太阳城集团<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

太阳城集团<210> 1

太阳城集团<211> 16

太阳城集团<212> DNA

太阳城集团<213> 人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400> 1

ctggccggaa atcccc 16

太阳城集团<210> 2

<211> 15

太阳城集团<212> DNA

<213> 人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 2

gggctgcacc aggct 15

太阳城集团<210> 3

太阳城集团<211> 16

太阳城集团<212> DNA

太阳城集团<213> 人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 3

gatcccaagt cacacc 16

太阳城集团<210> 4

<211> 15

太阳城集团<212> DNA

<213> 人工序列

太阳城集团<220>

<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 4

cccctaaggg tcctg 15

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

太阳城集团<213> 人工序列

太阳城集团<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400> 5

太阳城集团cgtctgctga ccaggggtct ggccggaaat cccccttcct gtggatccaa cagacacagg 60

acccttaggg gacctactgt gtgttcactg 90

太阳城集团<210> 6

太阳城集团<211> 524

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 6

tgaagcagcc ccagaacttc ctcctcaaag ccctcgaagg ggaaaacagc ctggtggaag 60

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太阳城集团cacaatcaat aactttcgaa tttacccact gtgtccccct ttgagaggac tcaagattcc 360

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ttgccccccc agtcacctat tctgttttcc tacttcaagc taagggccat agaacttaga 480

tcccaaggaa agtctaccct gttctgggaa caactgagcg ctta 524

太阳城集团<210> 7

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<213> 人工序列

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<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 7

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太阳城集团<210> 8

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<223>合成的寡核苷酸

<400> 8

太阳城集团tggcctccag tgtccttttc 20

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太阳城集团<212> DNA

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太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

<400> 9

tagcctatcc cgaccgcat 19

<210> 10

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太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

<400> 10

taagcgctca gttgttccca 20

太阳城集团<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

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tcatccttat ctgtcc 16

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 12

太阳城集团gcggagaccc agtcc 15

<210> 13

太阳城集团<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 13

taccgaaccc agaag 15

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 14

太阳城集团actgtgggag acactca 17

太阳城集团<210> 15

太阳城集团<211> 90

太阳城集团<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 15

cctccctaaa ctcagcttca tccttatctg tcccagggat tctaagcttc acagccggac 60

太阳城集团tgggtctccg cattaccgaa cccagaagct 90

太阳城集团<210> 16

<211> 83

太阳城集团<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400> 16

cggactgggt ctccgcatta ccgaacccag aagctccatg gggcgcgggt gagtgtctcc 60

太阳城集团cacagtaact ggaggtttcg att 83

太阳城集团<210> 17

太阳城集团<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 17

太阳城集团cggactgggt ctccgcatta ccgaacccag aagctccatg gtaagcttgg cgcgggtgag 60

tgtctcccac agtaactgga ggtttcgatt 90

<210> 18

太阳城集团<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

太阳城集团<400> 18

cacaactctc gtcccgaaca 20

太阳城集团<210> 19

太阳城集团<211> 20

<212> DNA

太阳城集团<213> 人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>合成的寡核苷酸

<400> 19

gaacggaccc caagtgagag 20

太阳城集团<210> 20

太阳城集团<211> 1661

太阳城集团<212> DNA

太阳城集团<213> 野猪(Sus scrofa)

<400> 20

太阳城集团tgagtcattg gaaacaaata cagacatcat aacacttcac tcctaaatac ctgtttcata 60

accttataaa gatagcttcc atatcataat accattatca catctaagaa aatgactaat 120

tatctcatat tcagttcata ctctaatttc ctcatgtgcc taaactatga cagcatggaa 180

gggcatgatg gattctggag atgaagaaaa gtaggaggaa acgcacctca atttcccctt 240

tcataaagtc agggtaagac tagtacccac ttcctaagag aattaaacaa aggcccatgg 300

太阳城集团cacagttagt agcaagcaat gagccctcaa gaaatgttaa ccattattgt cactgttgtt 360

attgtttata ttgttgatgt tactgtctgc tgaagcagcc ccagaacttc ctcctcaaag 420

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ttatctgtcc cagggattcc acagccggac tgggtctccg cattaccgaa cccagaagct 1200

太阳城集团ccatggggcg cggaacccgt ccctcaggct cttccgtggt ccggagattg gacagacctg 1260

太阳城集团ccgtacagcg gctcggtccc ttggagccgg gtctcccagg ccctggggtc tggctgccta 1320

gatttccaag gtcccattca gctgtggcag ttcctcctgg agctgctcca cgacgggacg 1380

cgtagcagct gcatccgctg gacgggcaac agccgcgagt tccaactgtg cgaccccaaa 1440

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太阳城集团agccgaggcc tgcgttacta ctaccgccgc gacatcgtgc tcaagagcgg ggggcgcaag 1560

tacacgtacc gcttcggagg ccgagtgcca ggcctagcct atcccgaccg catgggggac 1620

ggacagggag cagcgaccca ataaaaatat ctggtcaagc c 1661

<210> 21

<211> 221

太阳城集团<212> PRT

<213> 野猪

太阳城集团<400> 21

Met Asp Leu Trp Asn Trp Asp Glu Ala Ser Pro Gln Glu Val Pro Leu

1 5 10 15

太阳城集团Gly Asn Arg Leu Ser Gly Leu Glu Gly Ala Glu Phe Asp Phe Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Leu Ala Leu Pro Gly Asp Arg Leu Thr Ala Glu Thr Tyr Trp

35 40 45

Lys Thr Gly Ser Ser Ser Leu Ser Val Pro Gly Ile Pro Gln Pro Asp

50 55 60

太阳城集团Trp Val Ser Ala Leu Pro Asn Pro Glu Ala Pro Trp Gly Ala Glu Pro

太阳城集团65 70 75 80

太阳城集团Val Pro Gln Ala Leu Pro Trp Ser Gly Asp Trp Thr Asp Leu Pro Tyr

85 90 95

Ser Gly Ser Val Pro Trp Ser Arg Val Ser Gln Ala Leu Gly Ser Gly

太阳城集团 100 105 110

Cys Leu Asp Phe Gln Gly Pro Ile Gln Leu Trp Gln Phe Leu Leu Glu

太阳城集团 115 120 125

太阳城集团Leu Leu His Asp Gly Thr Arg Ser Ser Cys Ile Arg Trp Thr Gly Asn

130 135 140

太阳城集团Ser Arg Glu Phe Gln Leu Cys Asp Pro Lys Glu Val Ala Arg Leu Trp

145 150 155 160

太阳城集团Gly Glu Arg Lys Arg Lys Pro Gly Met Asn Tyr Glu Lys Leu Ser Arg

165 170 175

Gly Leu Arg Tyr Tyr Tyr Arg Arg Asp Ile Val Leu Lys Ser Gly Gly

180 185 190

太阳城集团Arg Lys Tyr Thr Tyr Arg Phe Gly Gly Arg Val Pro Gly Leu Ala Tyr

195 200 205

Pro Asp Arg Met Gly Asp Gly Gln Gly Ala Ala Thr Gln

210 215 220

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