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一种呼吸道归巢SIRNA雾化纳米给药系统及其制备方法.pdf

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一种 呼吸道 归巢 SIRNA 雾化 纳米 系统 及其 制备 方法
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201110040542.8

申请日:

20110218

公开号:

CN102178957A

公开日:

20110914

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K48/00,A61K9/12,A61K47/48,A61P11/00 主分类号: A61K48/00,A61K9/12,A61K47/48,A61P11/00
申请人: 广州医学院,呼吸疾病国家重点实验室,天津大学
发明人: 徐军,罗永峰,刘文广,翟欣昀,孙鹏
地址: 510182 广东省广州市东风西路195号
优先权: CN201110040542A
专利代理机构: 广州知友专利商标代理有限公司 代理人: 刘小敏
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201110040542.8

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统,该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料,包裹干扰目标致病基因的siRNA制成。本发明还公开了上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法。本发明公开的给药系统可用于运送干扰目标致病基因的siRNA,以发挥RNA干扰作用,抑制致病基因复制,能够在活体内运送siRNA靶向肺呼吸道上皮,是以沉默靶基因为目的发挥相应药效作用的非病毒运送系统。

权利要求书

太阳城集团1.一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统,其特征在于,该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料,包裹干扰目标致病基因的siRNA制成。2.根据权利要求1所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统,其特征在于,所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的粒径在65~85nm范围之间。3.根据权利要求1所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统,其特征在于,所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1~5∶1。4.一种权利要求1~3任一权利要求所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其特征在于,其包括以下步骤:(I)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解,配制得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液,然后加入干扰目标致病基因的siRNA混合复合,沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液;(II)将所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液置于超声雾化装置中,进行雾化成雾滴,得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒,即本发明的给药系统。5.根据权利要求4所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其特征在于,所述步骤(I)中所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1~5∶1。6.根据权利要求5所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其特征在于,所述的步骤(II)中超声雾化处理的功率115KHz~140KHz范围之间。7.一种权利要求1~3任一权利要求所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其特征在于,其包括以下步骤:(1)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解,配制得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液,然后进行超声雾化处理,收集超声雾化所得的雾滴;(2)在步骤(1)中收集的雾滴中加入干扰目标致病基因的siRNA进行复合,沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒,即得到本发明的给药系统。8.根据权利要求7所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1~5∶1。9.根据权利要求8所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其特征在于,所述的步骤(1)中超声雾化处理的功率115KHz~140KHz范围之间。

说明书



技术领域

本发明涉及一种给药系统,尤其是涉及一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统。本发明同时还涉及上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法。

背景技术

RNA干扰(interfering RNAs,RNAi)是基因治疗研究最具应用前景的一个领域。就生物普遍规律而言,RNAi可使任何一种基因沉默,同时,由于RNAi介导基因沉默的高特异、高效和简易性,在一些由病原体入侵如病毒感染或基因突变引起的疾病治疗方面具有显见的临床应用前景。已有研究表明,用SARS冠状病毒某些结构蛋白基因的siRNA,可抑制感染SARS冠状病毒恒河猴肺内的病毒复制。另外,利用siRNA特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在静寂或休眠状态,有望达到抗肿瘤作用。RNA干扰也能应用于气道炎症性疾病的治疗,Shao等研究表明,用siRNA特异性抑制人气道上皮胞NCI-H292中的TGFα可以导致GFR表达的降低并减少气道上皮黏液的分泌(ShaoMX,NakanagaT,NadelJA.Cigarette smoke induces MUC5ACmucin overproduction via tumor necrosis factor-α-converting enzyme in human airwayepithelial(NCI-H292)cells.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2004,287(2):L420-L427)。然而,siRNA在体内易被核酸酶降解,因而它的稳定性差、且半衰期短、缺乏靶向性,需要结合载体系统进行基因的递送。目前常用的基因递送方法主要分为两类,即病毒载体和非病毒载体导入技术,其中,病毒载体转染效率高,是目前体内基因治疗的主要工具。然而,尽管病毒载体具有很高的转染效率,但其存在免疫原性和潜在致瘤性等安全性隐患。非病毒载体主要有脂质体、阳离子高聚物等,但非病毒基因载体因缺少病毒载体天然的基因递送机制,转染效率低下,极大地限制了其实际应用。因此,如何将siRNA安全有效运送到病变靶器官,进入靶细胞充分有效发挥RNA干扰作用,成为目前临床应用siRNA治疗的瓶颈问题。

太阳城集团壳聚糖是近年来发展起来的一种新型非病毒基因转运载体,也是唯一的一种天然阳离子多糖。它具有良好的生物相容性,生物可降解性,安全性好。然而,同其他非病毒载体一样,壳聚糖自身跨越细胞膜屏障能力较低,需要对其进行修饰,以提高其跨膜能力。细胞穿膜肽(cell penetrating peptide,CPP)是一类能携带大分子物质进入细胞,具有穿膜能力的短肽。Wender等发现,精氨酸在细胞穿膜肽的跨膜中起到关键的作用,其特征基团胍基是促进跨膜的核心因素(Wender P.A,Mitchell D.J,Pattabiraman K,et al.Thedesign,synthesis,and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake:peptoid moleculartransporters,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97:13000-13008)。本发明发明人前期已成功合成了胍基化壳聚糖,且证实该修饰方法能明显提高天然壳聚糖体外细胞转染DNA核酸的能力。胍基修饰简单无毒,经胍基修饰后的壳聚糖生理PH环境下能充分溶解。

为了进一步提高胍基化壳聚糖向细胞转运核酸物质的能力,依据配体与受体相结合的原理,发明人的中国专利申请CN 101781373A中公开了一种沙丁胺醇接枝胍基化壳聚糖及其制备方法,是将临床药用β2肾上腺受体激动剂沙丁胺醇(气道解痉抗炎制剂)接枝到胍基化壳聚糖分子上构成沙丁胺醇接枝胍基化壳聚糖,并通过体外细胞研究证实该载体能够进一步提高细胞的基因转染效率。但是由于人体或动物体内环境复杂,因此仅在体外直接转染培养的细胞证明该载体有较好的基因转染效率,并不意味着体内应用的可行性。

载体粒径是基因微粒分散递送系统的重要参数,它的大小与物理特点除了会影响载体微粒在靶细胞表面的吸附和摄取以外,还会影响在细胞内复合物从内涵体成功逃逸、核酸物质的释放等过程。而纳米粒径的均匀度是纳米载体的另一个重要参数,粒径的分布宽,表示在任一局部范围内分布的纳米粒均较少,所以无论最适粒径是多少,即使该纳米载体的最适转染粒径接近平均粒径,但因在平均粒径附近的纳米粒的比例小,大部分颗粒的粒径远离平均粒径,或者太大,或者太少,所以能有效对基因进行转染的载体比例并不多。从图9的a中可见,先前的沙丁胺醇胍基化壳聚糖(Sal-胍基化壳聚糖)的粒径大小分布不均匀,且Sal-胍基化壳聚糖与核酸物质复合后的粒径较小,约在20~60nm范围之间,粒径分布离散度大,说明有利于细胞转染的最适合粒径Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的比例少(图10)。而如何实现壳聚糖纳米载体体内运送核酸物质导入目标器官组织和细胞,是siRNA介导基因沉默临床应用需要解决的关键科学问题。

太阳城集团采用吸入给药方式是治疗呼吸道疾病的临床有效的给药方式,可以实现靶向目标器官。但吸入药气雾的颗粒大小只有在4~6um之间,才能使药物雾滴在肺内沉积从而发挥药效。相对于临床其它吸入方式,超声雾化吸入更加简单易行。该吸入方式通过采纳一个超声雾化装置将水溶性药液在高频振荡的作用下,形成由4~6um超微粒子构成的气雾吸入治疗。但问题是高频振荡会对核酸物质的结构造成破坏,因此在临床难以采纳吸入治疗模式进行呼吸系统疾病小分子RNA干扰治疗。

发明内容

本发明的第一个目的在于通过提供一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统,该给药系统可用于运送干扰目标致病基因的siRNA,以发挥RNA干扰作用,抑制致病基因复制,能够在活体内运送小分子RNA(siRNA)靶向肺呼吸道上皮,是以沉默靶基因为目的发挥相应药效作用的非病毒运送系统。

本发明的第二个目的是提供上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法。

太阳城集团本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的:一种呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统,该给药系统以经超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖为载体材料,包裹干扰目标致病基因的siRNA制成。

沙丁胺醇胍基化壳聚糖(Sal-胍基化壳聚糖)中具有β2肾上腺能受体配体沙丁胺醇,即具有了归巢装置,对于呼吸道上皮细胞,平滑肌细胞及肥大细胞等具有靶向效果。而在超声雾化处理前,Sal-胍基化壳聚糖的粒径较小,粒径分布离散度大,粒径大小及分布都很不理想,且最适粒径Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的比例少,致使人体内靶器官的细胞的摄取量少,难以发挥有效的RNA干扰作用。经过本发明人的研究发现无论是单独的Sal-胍基化壳聚糖纳米粒还是Sal-胍基化壳聚糖与核酸物质复合纳米粒,经过超声雾化处理后,其粒径都会出现相应的增大。经超声雾化物理修饰后的Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的粒径较超声雾化前大,粒径分布离散度小,且最适粒径Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的比例多。经实验证明,siRNA与经超声雾化处理后的Sal-胍基化壳聚糖纳米载体复合,形成在体内可被靶器官细胞高效摄取的结构形式(具体讲就是能在体内特异地被肺内气道上皮细胞摄取的结构形式),继而能从内涵体充分释放出来,发挥RNA干扰治疗作用。可见,经超声雾化处理后的Sal-胍基化壳聚糖与核酸物质构成的复合雾化纳米能进一步提高细胞对核酸物质的摄取与基因转染效率。

太阳城集团本发明的所述的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的粒径在65~85nm范围之间。

太阳城集团本发明所述的干扰目标致病基因的siRNA即特异性干扰入侵病毒基因、或干扰导致炎症或肿瘤病的基因的siRNA,如SARS冠状病毒某些结构蛋白基因的siRNA、流感病毒A型保守区域编码基因的siRNA、肝炎病毒的siRNA,以及肿瘤相关基因的siRNA或突变基因的siRNA等。干扰目标致病基因的siRNA可根据具体目标致病基因的结构按常规方法设计筛选制备即可。

本发明中的所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1~5∶1。

本发明的第二个目的可以通过以下技术措施来实现的:一种上述呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其包括以下步骤:

(I)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解,配制得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液,然后加入干扰目标致病基因的siRNA混合复合,沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液;

太阳城集团(II)将所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液置于超声雾化装置中,进行雾化成雾滴,得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒,即本发明的给药系统。

太阳城集团当所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液接触到超声雾化装置的雾化片时,可瞬间雾化成雾滴,即所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液的超声雾化处理在瞬间即完成,以避免长太阳城集团的高频振荡破坏沙丁胺醇胍基化壳聚糖的结构。

本发明所述步骤(I)中所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1~5∶1。

太阳城集团所述的步骤(II)中超声雾化处理的功率115KHz~140KHz范围之间。

作为本发明的另一种可行的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备方法,其具体操作是:

太阳城集团(1)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解,配制得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液,然后进行超声雾化处理,收集超声雾化所得的雾滴;

太阳城集团(2)在步骤(1)中收集的雾滴中加入干扰目标致病基因的siRNA进行复合,沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒,即得到本发明的给药系统。

太阳城集团所述步骤(1)中沙丁胺醇胍基化壳聚糖溶液的超声雾化处理采用超声雾化装置,当沙丁胺醇胍基化壳聚糖溶液接触到超声雾化装置的雾化片时,可瞬间雾化成雾滴,即所述沙丁胺醇胍基化壳聚糖的超声雾化处理在瞬间即完成,以避免长太阳城集团的高频振荡破坏沙丁胺醇胍基化壳聚糖的结构。

太阳城集团本发明所述步骤(1)中所述的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1~5∶1。

所述的步骤(1)中超声雾化处理的功率115KHz~140KHz范围之间。

以下结合试验进行阐述本发明与现有技术相比的有益效果:

(1)本发明通过对沙丁胺醇胍基化壳聚糖进行超声雾化处理,再与核酸物质构成的复合雾化纳米给药系统,能进一步提高细胞对核酸物质的摄取与基因转染效率。

将沙丁胺醇胍基化修饰的壳聚糖纳米按比例与siRNA复合,利用荧光染料YOYO1标记核酸,体外和体内实验均发现:沙丁胺醇胍基化修饰能增加细胞对壳聚糖核酸复合物的内吞(图2,图3),沙丁胺醇胍基化壳聚糖纳米按比例与靶向绿色荧光蛋白(GFP)的siRNA复合后,经与培养细胞共孵育,能够迅速被细胞(一个稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株)吞饮,并随即从内涵体释放,有效介导该siRNA特异性的干扰作用,降低细胞GFP的表达水平(图4,图5)。同时,该干扰作用也在动物体内得到验证(图6)。

Beta肾上腺素能受体,是G-蛋白质偶合受体(GPCRs)超级家族之一,具有7个跨膜区,分为β1,β2和β3三种亚型,其中β2受体广泛分布于平滑肌和肺组织内。GPCRs和相应的配体结合以后,能诱发网格蛋白所介导的配体/受体复合物的内化作用,拥有相应受体的细胞会增加对接枝有β2受体配体的载体特异性摄取。由于293细胞能表达一定水平的β2受体,而16HBE细胞不表达,通过对这两种细胞进行转染实验比较证实:在拥有β2受体的293细胞较之不表达β2受体的16HBE细胞,Sal-胍基化壳聚糖纳米载体的基因转染效率要明显高于单纯胍基化壳聚糖载体(图7)。沙丁胺醇胍基化壳聚糖与siRNA复合雾化纳米粒经气道内给药以后,可见降低GFP转基因小鼠肺内结构细胞GFP的表达水平最为有效(图8)。因此从体内外实验可以证明,沙丁胺醇胍基化壳聚糖核酸纳米粒具有体内靶向呼吸道上皮运送核酸物质,发挥干扰siRNA的治疗能力。

本发明通过采用超声雾化对沙丁胺醇胍基化壳聚糖进行物理修饰后,使得沙丁胺醇胍基化壳聚糖纳米粒和沙丁胺醇胍基化壳聚糖与核酸复合纳米粒的粒径较超声雾化处理前大,而且纳米粒的粒径分布离散度明显减小,最适粒径纳米粒的比例增多,均匀性显著增加(参见图9和图10),证明超声雾化效应能够进一步优化沙丁胺醇胍基化壳聚糖纳米载体。

而经超声雾化处理后沙丁胺醇胍基化壳聚糖的胞内转运siRNA的能力优于未经超声雾化处理的沙丁胺醇胍基化壳聚糖(参见图12和图13),以上实验结果说明本发明的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的结构形式为在体内可被靶器官细胞高效摄取的结构形式,并能从内涵体充分释放出来发挥RNA干扰治疗作用。

太阳城集团(2)本发明的超声雾化作用主要针对载体本身,与超声雾化处理及复合转染细胞的顺序关联不大,即先复合再超声雾化处理同样能提高细胞对核酸物质的摄取与基因转染效率。

无论沙丁胺醇胍基化壳聚糖纳米先经超声雾化处理再与核酸物质形成复合雾化纳米粒,还是沙丁胺醇胍基化壳聚糖纳米和核酸物质复合后再进行超声雾化,沙丁胺醇胍基化壳聚糖纳米的包裹均能有效保护核酸物质免受机械剪切力的降解破坏作用(图11),沙丁胺醇胍基化壳聚糖只要经超声雾化处理,就能明显增强对携载核酸物质的能力。

且其经过超声雾化的沙丁胺醇胍基化壳聚糖较之未经修饰的壳聚糖等载体的运送与转染基因的效率更高(图12,13)。因而,前述的两种制备顺序均能提高细胞对核酸物质的摄取与基因转染效率。

太阳城集团(3)本发明采用先将沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合再进行超声雾化处理的方式,更有利于简化给药系统的制备过程,更加适于临床给药操作,而且效果会更好。

经实验证明,无论是先对沙丁胺醇胍基化壳聚糖进行超声雾化处理再与干扰目标致病基因的siRNA进行复合,还是沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA复合后再进行超声雾化处理,所得的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米都有较高的细胞转染效率,说明了超声雾化的作用只对沙丁胺醇胍基化壳聚糖发生作用,并没有破坏siRNA的结构。但是沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA先混合复合再进行超声雾化处理,在进行超声雾化处理的同时雾化成可临床使用的雾滴,使得本发明的给药系统的制备过程更加简单,更加适于临床给药操作,而且效果更好。

附图说明

图1是荧光染料Yoyo1与载体结合情况。

A:yoyo1;B:yoyo1+Sal-胍基化壳聚糖;C:yoyo1+siRNA;D:yoyo1+siRNA+lipofectamine;E:yoyo1+siRNA+壳聚糖;F:yoyo1+siRNA+Sal-胍基化壳聚糖。单独Yoyo1(A)和Yoyo1载体混合物(B)在未结合核酸的情况下,均不显示荧光。当和核酸物质siRNA结合以后则发出强绿色荧光(C、D、E、F)

太阳城集团图2是各载体胞内转运核酸的情况。

A:Lipofectamine;B:壳聚糖;C:Sal-胍基化壳聚糖。图2A显示大部分细胞内都可见绿色荧光,图2B只见少量绿色荧光阳性细胞,图2C显示在Sal-胍基化壳聚糖载体组,绿色荧光阳性细胞的比例低于对照组,但单个细胞内荧光强度高于对照组。

图3是各种载体在小鼠肺部当中转运核酸的情况。

太阳城集团A,B,C:Lipofectamine;D,E,F:壳聚糖;G H,I:Sal-胍基化壳聚糖

A,D,G:yoyo1示踪;B,E,H:DAPI染色;C,F,I:绿色荧光(yoyo1)与蓝色荧光(DAPI)复合。

太阳城集团图A和图B显示,小鼠肺部基本上未观察到绿色荧光阳性的肺气道细胞。在Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合物组小鼠肺组织,其肺泡和气道上皮处均可见绿色荧光阳性的细胞,如图C。

图4是荧光显微镜显示各种载体携载小分子RNA在细胞内干扰GFP表达的情况。

太阳城集团A:Sal-胍基化壳聚糖与negative-control siRNA的复合物;B:天然壳聚糖与GFPsiRNA的复合物;C:Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA的复合物。

图B显示细胞的平均荧光强度稍弱于图A中阴性对照组中的细胞。Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA的复合物纳米能够显著减弱被转染细胞的平均荧光强度,图C所示其细胞荧光强度明显低于图A阴性对照组细胞。注:该细胞稳定表达GFP。

太阳城集团图5是流式细胞仪定量分析各种载体携载siRNA在细胞内干扰GFP表达的情况。

太阳城集团1:Sal-胍基化壳聚糖与negative-control siRNA复合纳米粒;

太阳城集团2:天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒(质量比:天然壳聚糖∶GFP siRNA=5∶1);

太阳城集团3:天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒(质量比:天然壳聚糖∶GFP siRNA=3∶1);

太阳城集团4:天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒(质量比:天然壳聚糖∶GFP siRNA=1∶1);

5:Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒(质量比:Sal-胍基化壳聚糖∶GFPsiRNA=5∶1);

6:Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒(质量比:Sal-胍基化壳聚糖∶GFPsiRNA=3∶1);

太阳城集团7:Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒(质量比:Sal-胍基化壳聚糖∶GFPsiRNA=1∶1);

注:该细胞稳定表达GFP;*P<0.05。

图6是荧光显微镜显示Sal-胍基化壳聚糖在小鼠体内介导RNA干扰的情况。

太阳城集团Neg:Sal-胍基化壳聚糖与negative-control siRNA复合纳米粒;CS:天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒;Sal-Gua-CS:Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒。

太阳城集团其中,Neg和CS组小鼠肺组织切片可见气道上皮细胞和肺泡上皮细胞均强表达绿色荧光蛋白。与之相比,给予Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒处理的小鼠肺组织,GFP表达水平显著下降。

注:该小鼠为GFP转基因小鼠。

图7是两种载体分别在HEK293细胞和16HBE细胞中的效率的条形图。

A:HEK293细胞,流式细胞仪检测;B:16HBE细胞,显微镜下计数平均每个视野当中表达绿色荧光蛋白的细胞数量。*v.s.Chitosan P<0.01

图8是荧光显微镜显示Sal-胍基化壳聚糖在小鼠体内靶向介导RNA干扰的情况。

CS:天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒;Gua-CS:胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒;Sal-Gua-CS:Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒。

CS组小鼠肺组织切片可见气道上皮细胞和肺泡上皮细胞均强表达绿色荧光蛋白。与之相比,给予胍基化壳聚糖与GFP siRNA的复合纳米粒处理的小鼠肺组织,GFP表达水平有所下降,而给予Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA的复合纳米粒处理的小鼠肺组织,GFP表达水平下降更为明显。

太阳城集团图9是沙丁胺醇胍基化壳聚糖和DNA复合雾化纳米给药系统超声雾化前和超声雾化后透视电镜图;

太阳城集团a:Sal-胍基化壳聚糖;b:Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合纳米粒;

c:超声雾化处理后的Sal-胍基化壳聚糖;d:超声雾化处理后的Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合雾化纳米粒。

图10是沙丁胺醇胍基化壳聚糖和DNA复合雾化纳米给药系统超声雾化处理前和超声雾化处理后纳米粒径的分布图。

chi/DNA:超声雾化处理前的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和DNA复合纳米粒;

A(chi/DNA):超声雾化处理后的沙丁胺醇胍基化壳聚糖和DNA复合纳米粒;

太阳城集团超声雾化处理前,Sal-胍基化壳聚糖及Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合纳米粒的粒径较小,分布范围较宽;超声雾化处理后其粒径有所增大,粒径分布范围变窄,均匀度较前明显改善。

*P<0.01;其中的小方框代表粒径分布。

图11是裸DNA以及DNA按不同形式与Sal-胍基化壳聚糖载体复合后的电泳图;

太阳城集团Lane 1和Lane 2:裸DNA;Lane 3:Sal-胍基化壳聚糖与DNA的复合物;

Lane 4:超声雾化后的裸DNA;Lane 5:裸DNA超声雾化后与Sal-胍基化壳聚糖的复合物;Lane 6:单独超声雾化后的裸DNA与单独超声雾化后的Sal-胍基化壳聚糖的复合物;Lane 7:DNA与Sal-胍基化壳聚糖的复合物经超声雾化的产物;

太阳城集团Lane4、Lane5和Lane6均显示裸DNA受超声雾化明显的机械剪切作用而被降解,产物成带状分布;Lane7显示载体包裹DNA后再进行超声雾化及雾化,复合物完整地滞留在加样孔中。

太阳城集团图12是超声雾化对各载体复合物转染效率的影响(HEK293细胞)。

1.Sal-胍基化壳聚糖与DNA(pEGFP-N2质粒)复合纳米粒组;

2.Sal-胍基化壳聚糖与超声雾化后的裸DNA的复合纳米粒组;

3.超声雾化后Sal-胍基化壳聚糖与超声雾化后的裸DNA的复合纳米粒组(Sal-胍基化壳聚糖和裸DNA分别超声雾化后再复合);

4.超声雾化Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合雾化纳米粒组(Sal-胍基化壳聚糖先进行超声雾化处理,再与DNA复合);

5.Sal-胍基化壳聚糖与DNA的复合雾化纳米粒组(Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合后再超声雾化处理收集的雾滴)。

太阳城集团*v.s group 1,P<0.01.

太阳城集团图13是Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合物超声雾化前后转染效率的变化(16HBE细胞);

Gua:Sal-胍基化壳聚糖与DNA(pEGFP-N2质粒)复合纳米粒组;

太阳城集团Aerosol:Sal-胍基化壳聚糖与DNA(pEGFP-N2质粒)复合雾化纳米粒组;

*P<0.01。

具体实施方式

太阳城集团以下通过实施例进行说明本发明提供的呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的制备与应用,实施例仅用于说明本发明的目的,并不限制本发明的保护范围。

实验例一:Sal-胍基化壳聚糖纳米体内转运核酸的能力

主要实验材料

天然壳聚糖纳米粒:美国Sigma公司

太阳城集团Sal-胍基化壳聚糖:按照《沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用》(申请号:200910245193.6)中所述方法制备

太阳城集团MEM培养基:美国Gibico公司

胎牛血清:杭州四季青公司

太阳城集团质粒抽提试剂盒:美国Promega公司

Lipofectamin 2000(核酸转染试剂):美国Invitrogen公司

太阳城集团siRNA:美国AMBION公司

Yoyo1(荧光染料,用于标记核酸物质):美国Invitrogen公司

实验方法

太阳城集团1.Sal-胍基化壳聚糖纳米向细胞内转运核酸

太阳城集团1.1取1ug的siRNA和Yoyo1荧光染料避光复合,2小时以后分别与天然壳聚糖、Sal-胍基化壳聚糖和Lipofectamine2000(对照品)按1∶3(siRNA∶载体)的质量比进行复合,所述的复合是指天然壳聚糖、Sal-胍基化壳聚糖和Lipofectamine2000等载体包裹siRNA的过程,而天然壳聚糖和Sal-胍基化壳聚糖都带正电荷,而siRNA带负电荷,混合后天然壳聚糖和Sal-胍基化壳聚糖会对siRNA进行包裹。半小时以后在激光共聚焦显微镜观察各复合物Yoyo1的荧光强度。

太阳城集团1.2取HEK293细胞以2×105cell/孔浓度接种于24孔板,常规培养于37℃、5%CO2孵箱中,待细胞密度达到60~70%时分别用上述制备的各种载体与核酸物质的复合物进行转染(siRNA1ug/孔)。24小时以后在共聚焦显微镜下观察荧光指示剂Yoyo1在细胞内分布的情况。

2.Sal-胍基化壳聚糖纳米在体内转运核酸

2.1取siRNA和Yoyo1荧光染料避光复合,2小时以后分别与天然壳聚糖、Sal-胍基化壳聚糖和Lipofectamine 2000(对照品)按1∶3(siRNA∶载体)的质量比进行复合半小时。经气管将各种载体/核酸物质复合物注射入小鼠肺部(siRNA 2ug/每只小鼠),6小时以后处死小鼠,分离肺脏冷冻包埋进行组织冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光染料yoyo1在肺内细胞的分布情况。

实验结果

1.单独的Yoyo1、Yoyo1与载体混合物在未结合核酸物质siRNA的情况下,基本看不到荧光。当Yoyo1和核酸物质siRNA结合以后,马上发出强的绿色荧光,但大部分呈丝絮样分布。加入载体以后,大部分荧光物质呈颗粒状分布,小部分聚集成团,参见图1。激光共聚焦显微镜观察三种载体向细胞导入siRNA的能力,显示:在Lipofectamin2000组(对照品组:脂质体),几乎所有细胞内都可见绿色荧光(见图2A),在Sal-胍基化壳聚糖载体组,绿色荧光阳性细胞的比例虽然低于对照脂质体组,但单个细胞内荧光强度高于对照组(见图2C),提示单个细胞摄取的siRNA量较对照组增多。在天然壳聚糖载体组只可见少量绿色荧光阳性细胞(见图2B)。

太阳城集团2.在各实验组小鼠肺组织,激光共聚焦显微镜显示:给予Lipofectamin 2000与siRNA复合纳米粒的小鼠肺基本上未观察到绿色荧光阳性的肺气道细胞,提示转染离体细胞的核酸转染试剂Lipofectamin脂质体并不能有效地把siRNA在体内转运入小鼠肺部细胞(见图3A、D和G)。未经过修饰的天然壳聚糖纳米载体同样不能有效在体内转运核酸物质siRNA(见图3B、E和H)。相反,在Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合物组的小鼠肺组织,其肺泡和气道上皮处均可见绿色荧光阳性的细胞(见图3C、F和I)。表明经气管给予Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合纳米粒能在体内被小鼠肺的细胞有效摄取。

结论:Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合纳米粒能有效将siRNA转运入体外培养的细胞,并能在活体状态下经气道在体内转运siRNA至肺内细胞。

实验例二:Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合纳米粒在活体内发挥RNA干扰作用

主要实验材料

Sal-胍基化壳聚糖:按照《沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用》(申请号:200910245193.6)中所述方法制备

天然壳聚糖纳米粒:美国Sigma公司

太阳城集团绿色荧光蛋白(GFP)siRNA:美国AMBION公司

Negative Control siRNA:美国AMBION公司

太阳城集团GFP稳定表达HEK293细胞株:本实验室筛选和培养

EGFP转基因小鼠:赛业生物技术有限公司。EGFP转基因小鼠为C57BL/6背景,表达方式为全身表达。EGFP基因构建在pCAGGS载体上,该载体具有鸡β-actin启动子、CMV增强子。

超声雾化头(AeronebLab Nebulizer):美国Aerogen公司

微量雾化器:美国Penn-Century公司

实验方法

1.Sal-胍基化壳聚糖介导RNA干扰的作用(体外培养的细胞)

太阳城集团Sal-胍基化壳聚糖按与Negative Control siRNA 3∶1的质量比复合半小时;天然壳聚糖与GFP siRNA按5∶1,3∶1和1∶1的质量比复合半小时;Sal-胍基化壳聚糖与GFPsiRNA按5∶1,3∶1和1∶1的质量比复合半小时。接种HEK293细胞(稳定表达GFP))以2×105cell/孔浓度于24孔板,将Sal-胍基化壳聚糖与Negative Control siRNA复合纳米粒、天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒以及Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒分别添加至接种细胞的孔内(1ug的siRNA/孔)。24小时以后激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞GFP表达的改变,同时用流式细胞仪定量检测各组细胞GFP的平均荧光强度。

2.Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合纳米粒在小鼠体内介导RNA干扰的作用

太阳城集团Sal-胍基化壳聚糖与Negative Control siRNA按3∶1的质量比复合半小时,得到Sal-胍基化壳聚糖与Negative Control siRNA复合纳米粒;天然壳聚糖与GFP siRNA按3∶1的质量比复合半小时,得到天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒;Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA按3∶1的质量比复合半小时,得到Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒;再应用超声雾化头(Lab Nebulizer)分别对三种复合纳米粒进行超声雾化,然后用10ml玻璃离心管连接雾化头的雾化液出口,收集雾滴(形成的气雾滴直径分布约4~6微米,适合临床雾化治疗)。实验采纳稳定表达GFP的转基因小鼠(体内各脏器组织均表达绿色荧光蛋白),利用Penn-Century公司的微量雾化装置将收集的各种复合物纳米通过气道内雾化的方式分别给予GFP转基因小鼠,每天一次,每次100ul(含2ug的siRNA),连续3天,第4天处死小鼠,冷冻包埋进行冰冻切片,激光共聚焦显微镜观察各处理因素对小鼠肺组织GFP表达的影响。

结果

太阳城集团1.激光共聚焦显微镜与流式细胞仪检测示:天然壳聚糖与GFPsiRNA复合纳米粒转染体外培养的稳定表达GFP的HEK293细胞,可以轻度下调细胞的平均荧光强度;相比之下,超声雾化后的Sal-胍基化壳聚糖与GFPsiRNA复合纳米粒能够显著减弱被转染细胞的平均荧光强度,表明超声雾化后的Sal-胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒能将GFP siRNA有效转运带入细胞内,并发挥RNA干扰的作用,降低细胞内GFP的表达水平。(见图4和图5)。

2.激光共聚焦显微镜观察肺组织切片显示:给予Sal-胍基化壳聚糖与GFPsiRNA复合纳米粒的小鼠肺组织GFP的表达水平较之阴性对照或天然壳聚糖与GFPsiRNA复合纳米粒处理显著下降(见图6)。

结论:经超声雾化处理的Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合纳米粒能在活体状态下经气道在肺内发挥有效的RNA干扰作用。

太阳城集团实验例三:Sal-胍基化壳聚糖与核酸的复合纳米粒活体状态下靶向性转运核酸进行RNA干扰的能力

材料及方法

主要实验材料

胍基化壳聚糖:按照《沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用》(中国专利申请,申请号:200910245193.6)中所述方法制备。

沙丁胺醇(Sal):美国Sigma公司。

Sal-胍基化壳聚糖纳米载体:按照《沙丁肢醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用》(中国专利申请,申请号:200910245193.6)中所述方法制备。

16HBE细胞(人支气管上皮细胞株):英国南安普顿(Southampton)大学Steven.Holgate教授惠赠。

pEGFP-N2质粒:美国Clontech公司。

太阳城集团绿色荧光蛋白(GFP)siRNA:美国AMBION公司。

太阳城集团GFP转基因小鼠:同实验例二。

太阳城集团超声雾化头(Lab Nebulizer):美国Aerogen公司。

太阳城集团微量雾化器:美国Penn-Century公司。

方法

太阳城集团1、由于HEK293细胞能够表达β2受体,而16HBE细胞不表达β2受体,首先在体外培养细胞比较了未接枝β2受体激动剂沙丁胺醇的胍基化壳聚糖与接枝沙丁胺醇的胍基化壳聚糖(Sal-胍基化壳聚糖)在向上述两种细胞转染核酸的不同能力。

取HEK293细胞以2×105cell/孔浓度接种于24孔板,常规培养于37℃、5%CO2孵箱中,待细胞密度达到60%-70%的时候进行转染,实验分两组,单纯胍基化壳聚糖转染组和Sal-胍基化壳聚糖转染组,分别以5∶1的质量比与pEGFP-N2质粒复合后进行转染(1ug的质粒/孔)。24小时换液一次,转染后72小时,流式细胞仪计算并比较胍基化壳聚糖与pEGFP-N2质粒复合纳米粒和Sal-胍基化壳聚糖与pEGFP-N2质粒复合纳米粒在HEK293细胞被成功转染pEGFP-N2质粒的阳性细胞比例。与此同时,比较了荧光显微镜下胍基化壳聚糖与Sal-胍基化壳聚糖在不表达β2受体的16HBE细胞转染pEGFP-N2效率的不同(按照表达绿色荧光蛋白细胞数/平均每个视野细胞数测算)。

2、验证Sal-胍基化壳聚糖与pEGFP-N2质粒复合纳米粒在活体状态下通过归巢装置靶向气道细胞对siRNA干扰能力的影响。

天然壳聚糖、胍基化壳聚糖和Sal-胍基化壳聚糖分别与GFP siRNA按3∶1的质量比复合半小时,再应用超声雾化头(Lab Nebulizer)进行超声雾化,然后用10ml玻璃离心管连接雾化头的雾化液出口,收集雾滴(形成的气雾滴直径分布约4~6微米,适合临床雾化治疗)。实验采纳稳定表达GFP的转基因小鼠(体内各脏器组织均表达绿色荧光蛋白),利用Penn-Century公司的微量雾化装置将收集的三种复合物纳米通过气道内雾化的方式分别给予GFP转基因小鼠,每天一次,每次100ul(含2ug的siRNA),连续3天,第4天处死小鼠,冷冻包埋进行冰冻切片,激光共聚焦显微镜观察各处理因素对小鼠肺组织GFP表达的影响。

结果

太阳城集团1、荧光显微镜与流式细胞仪检测表明:在离体培养表达β2受体的HEK293细胞,Sal-胍基化壳聚糖纳米载体转染pEGFP-N2质粒的效率显著高于未接枝Sal的胍基化壳聚糖纳米载体,表达绿色荧光蛋白的细胞比例显著增加(见图7A)。而在不表达β2受体的16HBE细胞,有无Sal-归巢装置对载体转染质粒的效率没有明显影响。(见图7B)。这一结果可以证明胍基化壳聚糖接枝Sal的归巢修饰具有靶向性,可以提高具有β2受体的HEK293细胞对核酸的摄取能力。

2、激光共聚焦显微镜显示:活体给予天然壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒、胍基化壳聚糖与GFP siRNA复合纳米粒和Sal-胍基化壳聚糖GFP siRNA的复合纳米粒后,从各组小鼠肺组织切片可以看到:较之天然壳聚糖与GFPsiRN A复合纳米粒组或胍基化壳聚糖与GFPsiRNA复合纳米粒组,给予Sal-胍基化壳聚糖与GFPsiRNA复合纳米粒的小鼠肺组织荧光表达下降的程度最明显,表明siRNA干扰的效率最好。(见图8)。

结论:经过超声雾化处理的Sal-胍基化壳聚糖与siRNA复合纳米粒在活体状态下经鼻给予小鼠,具有靶向气道细胞转运小分子RNA,实现并提高了RNA干扰的能力。

实验例四:呼吸道归巢核酸雾化纳米粒的制备及其对核酸物质的转运效应

材料及方法

主要材料与装置

Sal-胍基化壳聚糖载体:按照《沙丁胺醇修饰胍基化壳聚糖与制备方法和应用》(中国专利申请,申请号:200910245193.6)中所述方法制备

太阳城集团pEGFP-N2质粒:美国Clontech公司

太阳城集团超声雾化头(Lab Nebulizer):美国Aerogen公司

实验方法

太阳城集团利用了频率为128KHz±10%的超声雾化头(Lab Nebulizer,由原装交流电源驱动改接成便携干电池驱动)对复合物纳米进行超声雾化。先将Sal-胍基化壳聚糖和pEGFP-N2质粒按质量比为5∶1的比例复合,再应用Aeroneb雾化头在128KHz±10%的频率下进行超声雾化,然后用10ml玻璃离心管连接雾化头的雾化液出口,收集雾滴(形成的气雾滴直径分布约4~6微米,适合临床雾化治疗),得到雾化纳米粒。

太阳城集团1、将收集的雾化纳米粒制备电镜标本进行透射电镜观察纳米粒径大小与分布的变化。

太阳城集团2、凝胶电泳进行DNA-凝胶阻滞实验观察雾化纳米中DNA的完整性以及壳聚糖纳米粒对核酸的包裹作用。电泳条件:1%琼脂糖凝胶60V电泳半小时,分为7个泳道,Lane1和Lane2为裸DNA,Lane3为Sal-胍基化壳聚糖与DNA的复合物,Lane4为单独雾化后的裸DNA,Lane5为单独雾化后的裸DNA与Sal-胍基化壳聚糖的复合物,Lane6为单独雾化后的裸DNA与单独雾化后的Sal-胍基化壳聚糖的复合物,Lane7为Sal-胍基化壳聚糖与裸DNA的复合物超声雾化的产物。

3、用收集的复合物雾化纳米粒进行细胞转染实验观察其包裹的核酸物质,即pEGFP-N2质粒的转染效率。

HEK293细胞以8×105/孔浓度接种于6孔板,常规培养于37℃、5%CO2孵箱,待细胞密度达到60-70%时进行转染。当细胞密度达到60%-70%的时候进行转染,转染HEK293细胞的实验分五个组:1.Sal-胍基化壳聚糖与DNA(pEGFP-N2质粒)复合纳米粒组;2.Sal-胍基化壳聚糖与超声雾化后的裸DNA复合纳米粒组;3.超声雾化后Sal-胍基化壳聚糖与超声雾化后的裸DNA的复合纳米粒组(Sal-胍基化壳聚糖和裸DNA分别超声雾化后再复合);4.超声雾化Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合纳米粒组(Sal-胍基化壳聚糖先进行超声雾化处理,再与DNA复合);5.Sal-胍基化壳聚糖与DNA的复合雾化纳米粒组(Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合后再超声雾化处理收集的雾滴)。收集各组转染的细胞,流式细胞仪计算绿色荧光蛋白表达阳性细胞比例。转染16HBE的实验分两组,分别为Sal-胍基化壳聚糖与DNA(pEGFP-N2质粒)复合纳米粒组和Sal-胍基化壳聚糖与DNA(pEGFP-N2质粒)复合雾化纳米粒组。荧光显微镜下计算平均每个视野中表达绿色荧光蛋白的16HBE细胞的数量。

结果

太阳城集团1.透射电镜示:超声雾化处理后,载体Sal-胍基化壳聚糖纳米粒径和Sal-胍基化壳聚糖与DNA复合纳米粒的粒径较前增大,约在65~85nm范围之间,粒径分布范围变窄,而且Sal-胍基化壳聚糖纳米粒的粒径分布离散度明显减小,最适粒径纳米粒的比例增多,均匀性显著增加(参见图9和图10),证明超声雾化效应能够进一步优化Sal-胍基化壳聚糖纳米载体。

2.凝胶阻滞实验显示:超声雾化对裸DNA产生明显的机械剪切作用,裸DNA被降解(图11泳道4、5、6),裸DNA雾化产物经电泳以后在泳道成带状分布。载体Sal-胍基化壳聚糖包裹DNA后再进行雾化,电泳显示复合物完整地滞留在加样孔中(图11泳道7),提示Sal-胍基化壳聚糖纳米载体能有效保护DNA免受超声雾化对核酸物质的破坏作用。

3.细胞转染实验表明:无论在HEK293细胞还是16HBE细胞,经超声雾化处理后的Sal-胍基化壳聚糖与DNA(pEGFP-N2质粒)复合雾化纳米粒的细胞转染效率均较前显著提高。另外,先对载体Sal-胍基化壳聚糖进行超声雾化修饰,再与核酸物质复合,同样可使细胞转染效率得到相似水平的提高(见图12和图13)。

太阳城集团结论:Sal-胍基化壳聚糖纳米载体或Sal-胍基化壳聚糖与核酸复合纳米粒经一定频率的超声雾化进行物理修饰,显著改善了其作为载体转运核酸物质的性能,与此同时能够形成临床雾化吸入治疗适宜的气雾滴,提供了经呼吸道给予治疗用核酸药的新系统。

实施例一

(1)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解,配制得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液,然后置于超声雾化装置中在128KHz频率下进行超声雾化成4um~6um雾滴,收集超声雾化所得的雾滴;

(2)在步骤(1)中收集的雾滴中加入干扰目标致病基因的siRNA进行复合,沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA之间的质量比为1∶1,沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒,即呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统。收集雾滴制成电镜标本,经透射电镜观察到所得呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的粒径在65~85nm之间。

实施例二

(I)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解,得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液,然后加入干扰目标致病基因的siRNA进行混合复合,沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液,其中沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA为质量比3∶1。

太阳城集团(II)沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液置于超声雾化装置中在128KHz频率下进行超声雾化成4um~6um雾滴,得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒,即呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统。收集雾滴制成电镜标本,经透射电镜观察到所得呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的粒径在65~85nm之间。

实施例三

(I)取沙丁胺醇胍基化壳聚糖加水溶解,得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖水溶液,然后加入干扰目标致病基因的siRNA进行混合复合,沙丁胺醇胍基化壳聚糖包裹干扰目标致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液,其中沙丁胺醇胍基化壳聚糖和干扰目标致病基因的siRNA为质量比5∶1。

(II)沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA的复合物溶液置于超声雾化装置中在128KHz频率下进行超声雾化成4um~6um雾滴,得到沙丁胺醇胍基化壳聚糖与干扰目标致病基因的siRNA复合雾化纳米粒,即呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统。收集雾滴制成电镜标本,经透射电镜观察到所得呼吸道归巢siRNA雾化纳米给药系统的粒径在65~85nm之间。

以上实施例中的干扰目标致病基因的siRNA是指导致炎症或肿瘤病的病毒基因的siRNA、肿瘤基因的siRNA、肿瘤相关基因的siRNA或突变基因的siRNA等,如SARS冠状病毒某些结构蛋白基因的siRNA、流感病毒A型保守基因的siRNA、肝炎病毒的siRNA等。以上干扰目标致病基因的siRNA根据具体目标致病基因的结构按常规方法制备即可。

太阳城集团本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不是限制,因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。

太阳城集团本文
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