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用于预防或治疗炎症相关病症的醛固酮阻滞剂治疗.pdf

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用于 预防 治疗 炎症 相关 病症 醛固酮 阻滞剂
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN03804981.3

申请日:

20030124

公开号:

CN1638777A

公开日:

20050713

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K31/58,A61P29/00,A61P9/00 主分类号: A61K31/58,A61P29/00,A61P9/00
申请人: 法玛西雅公司
发明人: R·罗查,M·D·扎克
地址: 美国密苏里州
优先权: 60/351,851
专利代理机构: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 代理人: 唐伟杰
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN03804981.3

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法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

一种预防或治疗受试者的炎症相关病症、例如心肌炎、心肌病、脉管炎和贝切特氏病的方法,所述方法包括用足以改变一种或多种在受试者的炎症或心脏重塑的调节中直接或间接涉及的表达产物的表达的治疗有效量的醛固酮阻滞剂治疗受试者。

权利要求书

1.一种预防或治疗受试者的选自以下的炎症相关病症的方法:心肌炎、心肌病、脉管炎和贝切特氏病,该方法包括用足以改变一种或多种在受试者的炎症或心脏重塑的调节中直接或间接涉及的表达产物的表达的治疗有效量的醛固酮阻滞剂治疗该受试者。2.权利要求1的方法,其中该炎症相关病症为心肌炎。3.权利要求1的方法,其中该炎症相关病症为心肌病。4.权利要求1的方法,其中该炎症相关病症为脉管炎。5.权利要求1的方法,其中该炎症相关病症为贝切特氏病。6.权利要求1的方法,其中该一种或多种在受试者的炎症或心脏重塑的调节中直接或间接涉及的表达产物的表达选自:环加氧酶-2、骨桥蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、ANF、αβ、Inf-γ、IL-1、TNF-α、NADH/NADPH氧化酶、过氧化物自由基、TXA2、b-FGF、CD44、内皮素、血管紧张素II受体、活性t-PA、非活性t-PA、PAI-1、CRP、IL-6、IL-10、IL-12、肌钙蛋白T、HSP65、淀粉样蛋白、磷脂酶A2、纤维蛋白原、CD40/CD40L、白介素-8、NF kappaB、转化生长因子-β、胶原结合整合素α1β1和胶原结合整合素α2β1。7.权利要求6的方法,其中两种或更多种该表达产物同时共表达。8.权利要求6的方法,其中该表达产物包含环加氧酶-2。9.权利要求8的方法,其中该环加氧酶-2与一种或多种选自以下的表达产物共表达:骨桥蛋白、MCP-1、白介素-8、NF kappaB、转化生长因子-βICAM-1和VCAM-1。10.权利要求6的方法,其中该表达产物包含骨桥蛋白。11.权利要求10的方法,其中该骨桥蛋白与一种或多种选自以下的表达产物共表达:环加氧酶-2、MCP-1、白介素-8、NF kappaB、转化生长因子-β、ICAM-1和VCAM-1。12.权利要求6的方法,其中该表达产物包含MCP-1。13.权利要求12的方法,其中该MCP-1与一种或多种选自以下的表达产物共表达:环加氧酶-2、骨桥蛋白、白介素-8、NF kappaB、转化生长因子-β、ICAM-1和VCAM-1。14.权利要求6的方法,其中该表达产物包含ICAM-1。15.权利要求14的方法,其中该ICAM-1与一种或多种选自以下的表达产物共表达:环加氧酶-2、骨桥蛋白、MCP-1、白介素-8、NF kappaB、转化生长因子-β和VCAM-1。16.权利要求6的方法、其中该表达产物包含VCAM-1。17.权利要求16的方法,其中该VCAM-1与一种或多种选自以下的表达产物共表达:环加氧酶-2、骨桥蛋白、白介素-8、NF kappaB、转化生长因子-β、ICAM-1和MCP-1。18.权利要求6的方法,其中该表达产物包含白介素-8。19.权利要求18的方法,其中该白介素-8与一种或多种选自以下的表达产物共表达:环加氧酶-2、骨桥蛋白、VCAM-1、NF kappaB、转化生长因子-β、ICAM-1和MCP-1。20.权利要求6的方法,其中该表达产物包含NF kappaB。21.权利要求20的方法,其中该NF kappaB与一种或多种选自以下的表达产物共表达:环加氧酶-2、骨桥蛋白、VCAM-1、白介素-8、转化生长因子-β、ICAM-1和MCP-1。22.权利要求6的方法,其中该表达产物包含转化生长因子-β。23.权利要求22的方法,其中该转化生长因子-β与一种或多种选自以下的表达产物共表达:环加氧酶-2、骨桥蛋白、VCAM-1、白介素-8、NF kappaB、ICAM-1和MCP-1。24.权利要求6的方法,其中三种或更多种表达产物同时共表达。25.权利要求1的方法,其中该醛固酮阻滞剂为醛固酮受体拮抗剂。26.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为螺甾内酯型化合物。27.权利要求25的方法,其中该螺甾内酯型化合物选自7α-乙酰硫基-3-氧代-4,15-雄甾二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮;3-氧代-7α-丙酰硫基-4,15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮;6β,7β-亚甲基-3-氧代4,15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮;15α,16α-亚甲基-3-氧代-4,7α-丙酰硫基-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮;6β,7β,15α,16α-二亚甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]-全氢化呋喃-2′-酮;7α-乙酰硫基-15β,16β-亚甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮;15β,16β-亚甲基-3-氧代-7β-丙酰硫基-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮;和6β,7β,15β,16β-二亚甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮。28.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为螺内酯。29.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为环氧甾族醛固酮拮抗剂。30.权利要求29的方法,其中该环氧甾族化合物具有与20-螺烷化合物甾核的″C″环稠合的环氧部分。31.权利要求29的方法,其中该20-螺烷化合物的特征在于存在9-α,11-β-取代的环氧部分。32.权利要求29的方法,其中该环氧甾族化合物选自:孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-,(γ-内酯,甲酯,(7α,11α,17β)-;孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-二甲酯,(7α,11α,17β)-;3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,(6β,7β,11α,17β)-;孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代,7-(1-甲基乙基)酯,一钾盐,(7α,11α,17β)-;孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-,7-甲酯,一钾盐,(7α,11α,17β)-;3′H-环丙[6,7]孕-1,4,6-三烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,(6β,7β,11α)-;3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,甲酯,(6β,7β,11α,17β)-;3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,一钾盐,(6α,7β,11α,17β)-;3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,(6β,7β,11α,17β)-;孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,乙基酯,(7α,11α,17β)-;和孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,1-甲基乙基酯,((7α,11α,17β)-。33.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为环氧美沙乐酮。34.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-二甲酯,(7α,11α,17β)-。35.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,(6β,7β,11α,17β)-。36.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代,7-(1-甲基乙基)酯,一钾盐,(7α,11α,17β)-。37.权利要求2 5的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-,7-甲酯,一钾盐,(7α,11α,17β)-。38.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为3′H-环丙[6,7]孕-1,4,6-三烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,(6β,7β,11α,)-。39.权利要求2 5的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,甲酯,(6β,7β,11α,17β)-。40.权利要求2 5的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,一钾盐,(6β,7β,11α,17β)-。41.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为3′H-环丙[6,7]孕-4,6-二烯-21-羧酸,9,11-环氧-6,7-二氢-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,(6β,7β,11α,17β)-。42.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,乙酯,(7α,11α,17β)-。43.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为孕-4-烯-7,21-二羧酸,9,11-环氧-17-羟基-3-氧代-,γ-内酯,乙酯,(7α,11α,17β)-。44.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为屈螺酮。45.权利要求25的方法,其中该醛固酮受体拮抗剂为环氧美沙乐酮。46.权利要求45的方法,其中环氧美沙乐酮的给药量为大约0.5mg至大约500mg/天。47.权利要求45的方法,其中给药的环氧美沙乐酮的治疗有效量为大约0.5mg至大约100mg/天。48.权利要求45的方法,其中给药的环氧美沙乐酮的治疗有效量为大约10mg至大约100mg/天。49.权利要求45的方法,其中给药的环氧美沙乐酮的治疗有效量为大约0.5mg至大约25mg/天。50.权利要求45的方法,其中给药的环氧美沙乐酮的治疗有效量为大约0.5至大约10mg/天。51.权利要求1的方法,其中该醛固酮阻滞剂为11β-羟基雄甾-4-烯-3-酮17-螺甾内酯或其可药用盐。52.权利要求1的方法,其中该醛固酮阻滞剂为醛固酮抑制剂。53.权利要求52的方法,其中该醛固酮抑制剂选自:芳香化酶抑制剂、12-脂氧合酶抑制剂、P450抑制剂、心房促尿钠排泄因子、20裂合酶抑制剂、PKC抑制剂、苯并二吖庚因、钙阻滞剂、二酰甘油脂酶抑制剂、钾离子载体、电子转移阻滞剂和乙醇或其可药用盐。54.权利要求52的方法,其中该醛固酮抑制剂为二酰甘油脂酶抑制剂。55.权利要求54的方法,其中该二酰甘油脂酶抑制剂为1,6-双-环己基肟基羰基氨基)-己烷或其可药用盐。56.权利要求52的方法,其中该醛固酮抑制剂为苯并二氮化合物。57.权利要求56的方法,其中该二氮化合物为安定或其可药用盐。58.权利要求52的方法,其中该醛固酮抑制剂为芳香化酶抑制剂。59.权利要求58的方法,其中该芳香化酶抑制剂为法倔唑或其可药用盐。60.权利要求52的方法,其中该醛固酮抑制剂为脂氧合酶抑制剂。61.权利要求60的方法,其中该脂氧合酶抑制剂为菲尼酮或其可药用盐。62.权利要求52的方法,其中该醛固酮抑制剂为P450抑制剂。63.权利要求62的方法,其中该P450抑制剂为18-乙烯基孕酮或其可药用盐。64.权利要求1的方法,其中该醛固酮阻滞剂为醛固酮合酶抑制剂。65.一种预防或治疗受试者炎症相关病症的方法,该方法包括用足以改变一种或多种选自白介素-8、NF kappaB和转化生长因子-β的表达产物的表达的治疗有效量的醛固酮阻滞剂治疗受试者。

说明书



太阳城集团                         发明领域

本发明属预防或治疗炎症相关病症,且更具体为与炎症相关的心血 管病症的领域。更为具体地,本发明涉及醛固酮阻滞剂疗法在预防或治 疗包括动脉粥样硬化的心血管疾病中的应用。

太阳城集团                         发明背景

前列腺素在炎症过程起主要作用,前列腺素生产,特别是PGG2、PGH2 和PGE2的生产的抑制作用是发现抗炎药的一个普遍目标。但是,具有 降低前列腺素诱导的疼痛和与炎症过程有关的肿胀的活性的普通非甾 族抗炎药(NSAID)还具有影响与炎症过程无关的其它前列腺素调节的过 程的活性。因此,使用高剂量的最普通NSAID可能产生严重的副作用, 包括危及生命的溃疡,限制了它们的治疗潜能。NSAID的一个可替代的 选择是使用皮质类固醇,它也产生严重的副作用,特别在涉及长期治疗 的时候。

已发现NSAID通过抑制人花生四烯酸/前列腺素途径,包括酶环加 氧酶(COX)防止前列腺素的产生。最近发现的与炎症(称为“环加氧酶 -2(COX-2)”或“前列腺素G/H合酶II”)有关的可诱导酶提供了一种 活的抑制靶体,更有效地减小炎症并产生较少和较弱的副作用。

太阳城集团最近,对炎症在心血管疾病中的作用有了更多的认识。Ridker等 人,(New Eng.J.Med.,336,973-9(1997))描述血小板破裂和动脉粥 样硬化性炎症的关系。

选择性抑制环加氧酶-2的化合物已公开在:美国专利5,380,738、 5,344,991、5,393,790、5,434,178、5,474,995、5,510,368和WO文 献WO96/06840、WO96/03388、WO96/03387、WO96/19469、WO96/25405、 WO95/15316、WO94/15932、WO94/27980、WO95/00501、WO94/13635、 WO94/20480和WO94/26731。

[吡唑-1-基]苯磺胺已被描述为环加氧酶-2抑制剂,并于治疗炎 症、关节炎和疼痛有前景,在预临床和临床试验中具有最小的副作用。 美国专利5,466,823描述它们用于治疗血管疾病中的炎症的应用。

                      附图的简要说明

图1-A表示依匹乐酮晶形H的X射线粉末衍射图。

太阳城集团图1-B表示依匹乐酮晶形L的X射线粉末衍射图。

图1-C表示依匹乐酮甲基乙基酮溶剂化物的X射线粉末衍射图。

太阳城集团图2-A表示从甲基乙基酮中直接结晶的非研磨晶形L的差示扫描量 热法(DSC)差示热分析图。

太阳城集团图2-B表示通过将从甲基乙基酮结晶高纯度依匹乐酮而获得的溶剂 化物去溶剂化而制得的非研磨晶形L的差示扫描量热法(DSC)差示热分 析图。

图2-C表示通过以下方法制得的晶形L的差示扫描量热法(DSC)差 示热分析图:从在甲基乙基酮中的高纯度依匹乐酮溶液结晶溶剂化物, 去溶剂化溶剂化物得到晶形L,并研磨所得的晶形L。

太阳城集团图2-D表示通过从适当的溶剂中蒸煮低纯度依匹乐酮而获得的溶剂 化物去溶剂化而制得的非研磨晶形H的差示扫描量热法(DSC)差示热分 析图。

图2-E表示甲基乙基酮溶剂化物的DSC差示热分析图。

太阳城集团图3-A表示依匹乐酮晶形H的红外光谱(漫反射,DRIFTS)。

图3-B表示依匹乐酮晶形L的红外光谱(漫反射,DRIFTS)。

太阳城集团图3-C表示依匹乐酮的甲基乙基酮溶剂化物的红外光谱(漫反射, DRIFTS)。

图3-D表示在于氯仿溶液中的依匹乐酮的红外光谱(漫反射, DRIFTS)。

太阳城集团图4表示依匹乐酮晶形H的13C NMR光谱。

太阳城集团图5表示依匹乐酮晶形L的13C NMR光谱。

图6-A表示甲基乙基酮溶剂化物的热重量分析法分析图。

太阳城集团图7表示从甲基乙基酮中分离的7-甲基氢4″,5″:9″,11″-二 环氧-17-羟基-3-氧代-17″-孕烷-7″,21-二羧酸酯,(-内酯晶形的X 射线粉末衍射图。

图8表示从异丙醇中分离的7-甲基氢11″,12″-环氧-17-羟基 -3-氧代-17″-孕-4-烯-7″,21-二羧酸酯,(-内酯晶形的X射线粉末衍 射图。

图9表示从正丁醇中分离的7-甲基氢17-羟基-3-氧代-17″-孕 -4,9(11)-二烯-7″,21-二羧酸酯,(-内酯晶形的X射线粉末衍射图。

图10表示得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)3%和(d)5%二环氧化 物的甲基乙基酮结晶的湿饼(甲基乙基酮溶剂化物)的X射线粉末衍射 图。

图11表示得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)3%和(d)5%二环氧化 物的甲基乙基酮结晶的干燥固体的X射线粉末衍射图。

图12表示从掺入了3%二环氧化物的甲基乙基酮结晶获得的干燥固 体的X射线粉末衍射图,其中(a)是干燥前没有研磨该溶剂化物,而(b) 是干燥前研磨了该溶剂化物。

图13表示得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)5%和(d)10%的11,12- 环氧化物的甲基乙基酮结晶的湿饼(甲基乙基酮溶剂化物)的X射线粉末 衍射图。

太阳城集团图14表示得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)5%和(d)10%的11,12- 环氧化物的甲基乙基酮结晶的干燥固体的X射线粉末衍射图。

太阳城集团图15表示基于表X-7A所报告的数据,产物纯度、原料纯度、冷却 速度和终点温度的立方图。

图16表示的是,为确定对终产物的纯度具有统计显著影响的变量, 用图18的立方图绘制的半标准图。

图17是基于表X-7A所报告的数据的相互作用图,其表示的是原料 纯度与冷却速度之间的相互作用对终产物纯度的影响。

图18表示的是基于表X-7A所报告的数据,晶形H重量分数、原料 纯度、冷却速度和终点温度的立方图。

太阳城集团图19表示的是,为确定对终产物的纯度具有统计显著影响的变量, 用图21的立方图绘制的半标准图。

图20是基于表X-7A所报告的数据的相互作用图,其表示的是原料 纯度与终点温度之间的相互作用对终产物纯度的影响。

图21表示无定形依匹乐酮的X射线衍射图。

太阳城集团图22表示无定形依匹乐酮的DSC差示热分析图。

图23表示血管紧张素II灌输大鼠研究中的收缩血压的变化。

太阳城集团图24表示依匹乐酮(环氧美沙乐酮(epoxymexrenone))防止血管紧 张素II灌输大鼠心脏的血管炎症。

太阳城集团图25表示在赋形剂(vehicle)灌输大鼠心脏中缺少环加氧酶 -2(COX-2)表达。

太阳城集团图26表示Ang II灌输大鼠心脏中COX-2表达的诱导。

太阳城集团图27表示依匹乐酮防止Ang II灌输大鼠心脏中COX-2表达的诱导。

图28表示赋形剂灌输大鼠心脏中缺少骨桥蛋白表达。

图29表示依匹乐酮防止醛固酮灌输大鼠心脏中骨桥蛋白表达的诱 导。

太阳城集团图30表示依匹乐酮防止醛固酮灌输大鼠心肌中骨桥蛋白上调。

图31表示依匹乐酮防止醛固酮灌输大鼠心肌中COX-2上调。

图32表示依匹乐酮防止醛固酮灌输大鼠心肌损伤。

图33表示COX-2和骨桥蛋白在醛固酮灌输大鼠冠状动脉中膜中的 上调的共表达。

图34表示醛固酮诱导的血管炎症和损伤的某些机理。

图35表示依匹乐酮治疗抑制血管紧张素II灌输、卡托普利治疗的 有中风倾向的自发性高血压大鼠尿蛋白排泄增加。

太阳城集团图36表示依匹乐酮治疗降低血管紧张素II灌输、卡托普利治疗的 有中风倾向的自发性高血压大鼠的肾损伤的组织病理分值。

太阳城集团图37表示依匹乐酮治疗增加有中风倾向的自发性高血压大鼠的存 活率并降低肾损伤。

太阳城集团图38表示依匹乐酮治疗减小有中风倾向的自发性高血压大鼠的脑 损伤。

图39表示用依匹乐酮治疗醛固酮灌输的高血压大鼠对心肌COX-2 的早期时程表达的抑制作用。

图40表示用依匹乐酮治疗醛固酮灌输的高血压大鼠对心肌骨桥蛋 白的早期时程表达的抑制作用。

图41表示用依匹乐酮治疗醛固酮灌输的高血压大鼠对心肌MCP-1 的早期时程表达的抑制作用。

图42表示用依匹乐酮治疗醛固酮灌输的高血压大鼠对心肌ICAM-1 和VCAM-1的早期时程表达的抑制作用。

图43表示醛固酮灌输升高收缩血压,而醛固酮灌输和依匹乐酮治 疗抑制这种升高。

图44表示在第28天对照大鼠、用醛固酮灌输大鼠和用醛固酮灌输 并用依匹乐酮治疗的大鼠的心肌组织病理分值,以及用醛固酮灌输大鼠 和用醛固酮灌输并用依匹乐酮治疗的大鼠的心脏重量与体重的比率。

太阳城集团图45表示对照大鼠、用醛固酮灌输大鼠和用醛固酮灌输并用依匹 乐酮治疗的大鼠的28天循环骨桥蛋白水平。

太阳城集团图46表示在第28天对照大鼠、用醛固酮灌输大鼠和用醛固酮灌输 并用依匹乐酮治疗的大鼠的炎性细胞因子的相对mRNA表达。

太阳城集团                          发明详述

本发明涉及醛固酮阻滞剂用于预防或治疗炎症相关病症的应用。更 具体而言,本发明涉及醛固酮阻滞剂在预防与炎症相关的心血管疾病中 的应用。

太阳城集团本发明提供一种用于预防或治疗有此需要的受试者的心血管病症 的方法。所述方法包括用治疗有效量的醛固酮阻滞剂或者其衍生物或可 药用盐治疗受试者。

以上的方法可以用于但不限于预防或治疗受试者的与炎症相关的 病,包括但不限于与炎症相关的心脏、肾和脑病,特别是与血管炎症相 关的病症。所述方法可以用于预防或治疗冠状动脉疾病、动脉瘤、动脉 硬化症、动脉粥样硬化包括心脏移植动脉粥样硬化、心肌梗塞、栓塞、 中风、心肌炎、心肌症、血栓形成,包括静脉血栓形成、绞痛包括不稳 定心绞痛、钙化(例如血管钙化和瓣膜钙化)、川崎氏病和炎症(例如冠 脉斑块炎症、细菌诱导的炎症包括衣原体诱导的炎症、寄生虫诱导的炎 症和病毒诱导的炎症)。所述方法通过改变一种或多种直接或间接调节 炎症的表达产物的表达而治疗或预防病症。与炎症相关的心血管病症可 以全部或部分地由一种或多种可能经历表达增加或减小的表达产物来 调节。该表达产物可以包括但不限于有机分子、蛋白质、基于DNA或基 于RNA的分子、这些产物的网状物或聚集体,它们共同或单独地作用以 直接或间接地产生效果。该表达产物表达型式的改变可能顺续或同时发 生,涉及二种或更多种表达产物。这些产物对受试者的组织或器官可以 具有直接或间接的效果,包括诱导或增强其它分子或表达产物的病理学 效应。这些表达产物可以依赖于它们分别作为前炎症或抗炎表达产物的 功能,通过增加表达或减小表达而产生前炎症效果。

所述方法通过调节在受影响的组织中的前炎症组分,包括环加氧酶 -2和骨桥蛋白而特别用于治疗或预防病症。

太阳城集团在以上方法中,心血管病症包括但不限于已知具有炎症组分并可以 由醛固酮介导的病症。以上方法还包括用要求缓和环加氧酶-2或骨桥蛋 白表达上调的醛固酮阻滞剂对患者进行的治疗。在包括但不限于肾、心 脏、胰和脑的组织中,同工型环加氧酶-2可以被诱导,而导致前炎症酶 表达上调,从而导致轻微至严重的组织和器官损害。在以上方法中,醛 固酮阻滞剂的给药用于缓和环加氧酶-2的表达上调。在另一个实施方案 中,所述方法通过抑制或阻滞在前炎症细胞因子转录中涉及的核因子, 例如抑制或阻滞NF-kappaB而缓和细胞因子表达。以上方法还用于预防 或治疗可能在包括但不限于肾、心脏和脑等组织中发生的病症,这些病 症中前炎症蛋白骨桥蛋白的表达上调可能被诱导,导致轻微至严重的组 织和器官损害。在以上方法中,醛固酮阻滞剂的给药用于缓和骨桥蛋白 的表达上调。

太阳城集团在另一个实施方案中,本发明用于预防或治疗组织和器官,包括但 不限于肾、心脏和脑的病症,这些病症中可能发生前炎症表达产物 MCP-1、IL-1、IL-6、IL-8、VCAM-1和ICAM-1中任一种的表达上调, 导致轻微至严重的组织和器官损害。在以上方法中,醛固酮阻滞剂的给 药用于缓和MCP-1、IL-1、IL-6、VCAM-1和ICAM-1中任一种的表达上 调。

太阳城集团可以通过醛固酮阻滞剂治疗来缓和其表达以减少与炎症相关的心 血管疾病的表达产物的非限制性实例如图34所示,并包括上调一种或 多种以下物质:

太阳城集团(a)血管紧张素II和内皮素受体;

(b)单核细胞活化分子、例如αvβ3(粘附、增殖、迁移)和CD44(迁 移);

(c)血管炎症介质、例如干扰素-γ(Inf-γ)、白介素-1(IL-1)、肿瘤 坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和 fractalkine;

太阳城集团(d)产生组织损害过氧化物基团的NADH/NADPH氧化酶;和

太阳城集团(e)导致活性组织纤溶酶原激活剂(t-PA)减少的血栓前纤溶酶原激 活剂抑制剂-1(PAI-1)。

太阳城集团在本发明的另一个实施方案中,可以通过用醛固酮阻滞剂治疗而缓 和其表达以减少与炎症相关的心血管疾病的表达产物的非限制性实例 包括以下一种或多种:

急性阶段反应物,例如C-活性蛋白(CRP),

太阳城集团多效性细胞因子,例如白介素-6(IL-6),

IL-12,可溶的细胞内粘附分子-1(sICAM-1),

太阳城集团肌钙蛋白T或I,热休克蛋白65(HSP65),

太阳城集团淀粉样蛋白,磷脂酶A2,纤维蛋白原,CD40/CD40L

信号传导途径

和粘附介质,例如胶原结合整合素α1β1(间质细胞)和α2β1(上皮细 胞)。

剂量和治疗方案

醛固酮阻滞剂的施用量和用于本发明方法的剂量方案取决于多个 因素,包括受试者的年龄、体重、性别和健康状况,致病作用的严重程 度,给药途径和频率,和所用的特定醛固酮阻滞剂,因此可宽泛地变化。 大约0.001-30mg/kg体重,优选大约0.005至大约20mg/kg体重,更 优选大约0.01至大约15mg/kg体重,甚至更优选大约0.05至大约10 mg/kg体重,并最优选大约0.01至5mg/kg体重的受试者的日剂量可 以是合适的。对人受试者给药的醛固酮拮抗剂的数量范围一般为大约 0.1至大约2000mg。在本发明的一个实施方案中,剂量范围为大约0.5 至大约500mg。在本发明的另一个实施方案中,剂量范围为大约0.75 至大约250mg。在本发明的进一步的另一个实施方案中,剂量范围为大 约1至大约100mg。在本发明的另一个实施方案中,剂量范围为大约 10-100mg。在本发明的另一个实施方案中,剂量范围为大约25至大约 100mg。在本发明的另一个实施方案中,剂量范围为大约25至大约75 mg。对受试者不产生实质性利尿和/或抗高血压效果的醛固酮阻滞剂的 日剂量特别包括在本发明方法中。日剂理可以是施用1-4次剂量/天。

醛固酮阻滞剂的服药剂量可以基于血压或适宜的替代标记物(例如 促尿钠排泄肽、内皮素和下述的其它替代标记物)的测定来确定和调整。 可以将醛固酮阻滞剂给药后的血压和/或替代标记物水平与对应的醛固 酮阻滞剂给药前的基线水平比较以确定本发明方法的效力并按需要调 节。用于所述方法的替代标记物的非限制性实例是用于肾和心血管疾病 的替代标记物。

预防服药

在诊断该与炎症相关的心血管病症之前进行预防性醛固酮阻滞剂 给药和在患者易患与炎症相关的心血管病症期间持续进行醛固酮阻滞 剂给药是有利的。因此可以使无显著的临床表现但易患受致病作用影响 的个体接触预防剂量的醛固酮阻滞化合物。醛固酮阻滞剂的这种预防剂 量可以但不必低于用于治疗特定目的致病作用的剂量。

心血管病理学服药

太阳城集团治疗心血管功能病理的服药可以基于促尿钠排泄肽的血液浓度的 测定来确定和调整。促尿钠排泄肽是一组结构类似但在遗传学上不同的 肽,它们在心血管、肾和内分泌内环境平衡中起不同的作用。心房促尿 钠排泄肽(″ANP″)和脑促尿钠排泄肽(″BNP″)来源于心肌细胞,而C型促 尿钠排泄肽(″CNP″)来源于内皮。ANP和BNP通过3′,5′-环鸟苷酸(cGMP) 与促尿钠排泄肽-A受体(″NPR-A″)结合,调节尿钠排泄、血管舒张、肾 素抑制、抗致有丝分裂和松驰性能。在有血液体积膨胀症状和血管损伤, 例如急性心肌梗塞之后的受试者中观察到血液促尿钠排泄肽水平,特别 是血液BNP水平升高,且在梗塞后长期保持升高(Uusimaa等人,:Int. J.Cardiol 1999;69:5-14)。

促尿钠排泄肽水平相对于醛固酮阻滞剂给药前测定的基线水平降 低表明醛固酮病理效应减小,因此提供与病理效应抑制的相关性。

因此可以将理想促尿钠排泄肽的血液水平与对应的醛固酮阻滞剂 给药前的基线水平比较以确定本发明方法治疗病理效应的效力。根据这 种促尿钠排泄肽水平测定,可以调整醛固酮阻滞剂的服药以减小心血管 病理效应。

太阳城集团类似地,还可以根据循环和尿cGMP水平来鉴定心脏病理,并确定 适宜的服药。cGMP血浆水平升高与平均动脉压降低并行。cGMP的尿排 泄减少与尿钠排泄相关。

心脏病理还可由射血分数减小或心肌梗塞或心衰或左心室肥大存 在来鉴定。左心室肥大可以由超声心动图或磁共振成像鉴定,并用于监 测治疗进展和服药的适当性。

太阳城集团因此,在本发明的另一个实施方案中,本发明的方法可能用于降 低促尿钠排泄肽水平,特别是BNP水平,从而还治疗相关的心血管病理。

肾病理学服药

治疗肾功能病理的服药可以根据蛋白尿、微白蛋白尿、肾小球滤过 率(GFR)减小或肌酸酐清除率减小的测定来确定和调整。蛋白尿通过在 24小时尿收集中大于0.3g的尿蛋白的存在来鉴定。微白蛋白尿通过可 免疫分析的尿白蛋白升高来鉴定。根据这些测定,可以调整醛固酮阻滞 剂的服药以减小肾病理效应。

神经病理学服药

太阳城集团可以感觉缺损或感觉运动能力的神经检查来鉴定神经病,特别是外 周神经病,并根据它调整服药。

视网膜病理学服药

太阳城集团可以通过眼科学检查来鉴定视网膜病,并根据它调整服药。

炎症标记物

太阳城集团某些标记物可以代表或造成炎症或者炎症前症状。这些标记物的测 定可以用于确定待给药的醛固酮阻滞剂的适宜的剂量,或者确定给药后 醛固酮阻滞剂的有效剂量。这些标记物的非限制性实例为:骨桥蛋白; 急性期反应物,例如C活性蛋白(CRP)、纤维蛋白原、因子VIII、血清 铜(载体蛋白血浆铜蓝蛋白)、血清铁(载体蛋白铁蛋白)、纤溶酶原激活 剂抑制剂-1(PAI-I)和脂蛋白(a);促尿钠排泄肽;内皮素;VCAM-1; ICAM-1;IL-1β;TNF-α;IL-6;IL-8、COX-2;fractalkine;MCP-1; 和甘油三酸酯。

联合治疗

本发明的方法还可以包括其它活性成分或治疗剂的给药与醛固酮 阻滞剂给药联合。

例如,用于本发明方法的醛固酮阻滞剂可以与其它用于治疗高血压 和心血管和肾症状和病症的活性药物一起对受试者联合给药。例如,与 醛固酮阻滞剂一起给药的活性药物可以包括选自以下的药物:肾素抑制 剂、血管紧张素II拮抗剂、ACE抑制剂、无实质性醛固酮阻滞作用的 利尿剂和视黄酸。太阳城集团药物组合所述的短语“联合治疗”(或“共同治 疗”)意在包括在提供药物组合的有益效果的方案中以连续的方式对每 种试剂给药,并意在包括以基本上同时的方式,例如在这些活性试剂比 率固定的单一胶囊或注射剂中或者在多个单独的每种试剂的胶囊或注 射剂中对这些试剂进行共同给药。

太阳城集团例如,短语“血管紧张素II拮抗剂”包括WO96/40257所述的血管 紧张素II拮抗剂。

短语“血管紧张素转化酶抑制剂(″ACE抑制剂″)包括一种试剂或化 合物,或者二种或多种试剂或化合物的组合,其具有部分或完全阻滞十 肽形式的血管紧张素(″血管紧张素I″)酶转化成血管收缩性八肽形式的 血管紧张素(血管紧张素II″)的能力。血管紧张素II形成的阻滞可以通 过除去血管紧张素II的主要作用而影响体液和电解质平衡、血压和血 液体积的调节。血管紧张素II的这些主要作用包括刺激肾上腺皮质合 成和分泌醛固酮受体以及通过直接收缩小动脉平滑肌而升高血压。

太阳城集团可以用于联合治疗的ACE抑制剂的实例包括但不限于以下化合物: AB-103、血管紧张肽转化酶抑制肽、贝那普利拉、BRL-36378、BW-A575C、 CGS-13928C、CL-242817、CV-5975、Equaten、EU-4865、EU-4867、EU-5476、 foroxymithine、FPL 66564、FR-900456、Hoe-065、15B2、吲哚普利、 ketomethylureas、KRI-1177、KRI-1230、L-681176、赖苯普利、MCD、 MDL-27088、MDL-27467A、莫维普利、MS-41、nicotianamine、喷托普 利、phenacein、匹伏普利、伦唑普利、RG-5975、RG-6134、RG-6027、 RGH-0399、ROO-911、RS-10085-197、RS-2039、RS 5139、RS 86127、 RU-44403、S-8308、SA-291、螺普利拉、SQ-26900、SQ-28084、SQ-28370、 SQ-28940、SQ-31440、乌替普利、utibapril、WF-10129、Wy-44221、 Wy-44655、Y-23785、Yissum P-0154、扎普利、Asahi Brewery AB-47、 alatriopril、BMS 182657、Asahi Chemical C-111、Asahi Chemcal C-112、Dainippon DU-1777、mixanpril、Prentyl、佐芬普利拉、1-(-(1- 羧基-6-(4-哌啶基)己基)氨基)-1-氧代丙基八氢-1H-吲哚-2-羧酸、 Bioproject BP1.137、Chiesi CHF 1514、Fisons FPL-66564、伊屈普 利、Marion Merrell Dow MDL-100240、培哚普利拉和Servier S-5590、 阿拉普利、贝那普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依 那普利拉、福辛普利、福辛普利拉、咪达普利、赖诺普利、培哚普利、 喹那普利、雷米普利、乙酸沙拉新、tempocapril、群多普利、ceranapril、 meoxipril、喹那普利拉和螺普利。

一组特别有价值的ACE抑制剂为:阿拉普利、贝那普利、卡托普 利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、福辛普 利拉、咪达普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、乙酸沙 拉新、替莫普利、群多普利、ceranapril、莫昔普利、喹那普利拉和螺 普利。

这些ACE抑制剂中的许多可商购得到。例如,特别优选的ACE抑制 剂、卡托普利由E.R Squibb & Sons,Inc.,Princeton,N.J.,现 Bristol-Meyers-Squibb的部分出售,其商标″CAPOTEN″,该剂型每片 剂量为12.5mg、50mg和200mg。依那普利或马来酸依那普利马和赖 诺普利是两种更加非常优选的ACE抑制剂,Merck和Co.,West Point, Pa.有售。依那普利销售商标为″VASOTEC″,该剂型每片剂量为2.5mg、 5mg、10mg和20mg。赖诺普利销售商标为″PRINIVIL″,该剂型每片 剂量为5mg、10mg、20mg和40mg。

利尿剂可以选自多种已知种类,例如噻嗪和相关的磺胺、保钾利尿 剂、袢利尿剂和有机化学利尿剂。噻嗪类的非限制性实例为苄氟噻嗪、 苄噻嗪、氯噻嗪、环噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲基环噻嗪、多噻嗪 和三氯甲噻嗪。与噻嗪相关的磺胺的非限制性实例为氯噻酮、喹乙宗和 美托拉宗。保钾利尿剂的非限制实例为triameterene和阿米洛利。袢 利尿剂,即作用于肾亨勒袢升支的利尿剂的非限制性实例为速尿和乙炔 丙烯酸。有机汞利尿剂的非限制性实例为硫汞林钠、乙氧汞林、普鲁卡 因和含茶碱的汞撒利。

在一个实施方案中,联合治疗包括施用ACE抑制剂、作为醛固酮 受体拮抗剂的环氧-甾族化合物和对人受试者基本上不具有醛固酮拮抗 活性的襻利尿剂。

这种联合治疗将用于,例如预防或治疗哺乳动物受试者的与炎症相 关的心血管病症。基本上不具有醛固酮拮抗活性的利尿剂也可以与ACE 抑制剂和环氧甾族化合物结合使用。

可选择地,联合治疗可以包括对人受试者施用治疗有效量的ACE抑 制剂、治疗有效量的环氧甾族化合物、治疗有效量的基本上不具有醛固 酮拮抗活性的袢利尿剂和治疗有效量的地高辛,以治疗或预防与炎症相 关的心血管病症。

用于预防心血管病症的花生四烯酸代谢中的环加氧酶途径抑制剂 可以通过不同的机理抑制酶活性。例如,用于本文所述方法的抑制剂可 以抑制酶活性的表达。使用醛固酮阻滞剂在炎症损害部位阻滞环加氧酶 -2的表达非常有利,因为它将使用非选择性NSAID时发生的胃副作用最 小化,特别是在期望进行长期治疗的时候。

用于本发明方法的醛固酮受体拮抗剂一般为螺甾内酯型甾族化合 物。术语“螺甾内酯型”意在表征包含通常在甾族“D”环处通过螺键 构型与甾核相连的内酯部分的结构。螺甾内酯型醛固酮拮抗剂化合物的 一个小组由环氧甾族醛固酮拮抗剂化合物,例如依匹乐酮组成。螺甾内 酯型拮抗剂化合物的另一小组由非环氧甾族醛固酮拮抗剂化合物,例如 螺内酯组成。

用于本发明方法的环氧甾族醛固酮拮抗剂化合物通常具有被环氧 类型部分取代的甾核。术语“环氧类型”部分意在包含任何特征为在二 个碳原子之间具有一个作为桥的氧原子的部分,其实例包括以下部分:

         环氧乙基                 1,3-环氧丙基             1,2-环氧丙基

用于短语“环氧甾族”中的术语“甾族”指由具有常规“A”、“B”、 “C”和“D”环的环戊烯-菲部分。环氧类型部分可以在任何可连接或 取代位置与环戊烯菲核连接,即与甾核的一个环稠合,或者该部分可以 在环系统的环成员处被取代。短语“环氧甾族”意在包括其上连接一个 或多个环氧类型部分的甾核。

太阳城集团适用于本发明方法的环氧甾族醛固酮拮抗剂包括具有与甾核的“C” 环稠合的环氧部分的化合物家族。特别优选20-螺烷化合物,其特征在 于存在9″,11″-取代的环氧部分。下表1中的化合物1-1 1表示可以 用于本发明方法的9″,11″-环氧甾族化合物。这些环氧甾族化合物可 以通过Grob等人,美国专利4,559,332所述的方法制备。用于制备 9,11-环氧卤族化合物及其盐的其它方法公开在Ng等人,WO97/21720 和Ng等人,WO98/25948。

太阳城集团特别感兴趣的是化合物依匹乐酮(还已知为环氧美沙乐酮),它是如 上所示的化合物1。依匹乐酮为醛固酮受体拮抗剂,并且例如与螺内酯 相比对醛固酮具有较高的特异性。在本发明方法中选择依匹乐酮作为醛 固酮拮抗剂将有利地减少某些副作用,例如使用特异性较小的醛固酮拮 抗剂时发生的男子女性型乳房。

适用于本发明方法的非环氧甾族醛固酮拮抗剂包括式III定义的螺 甾内酯型化合物家族:

其中 是

其中R是多达5个碳原子的低级烷基,且

其中 是

低级烷基残基包括支链和非支链基团,优选甲基、乙基和正丙基。

式III范围内有用的特定化合物为以下化合物:

太阳城集团7α-乙酰硫基-3-氧代-4,15-雄甾二烯-[17(β-1′)-螺-5′]全氢化呋 喃-2′-酮;

太阳城集团3-氧代-7α-丙酰硫基-4,15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氢化 呋喃-2′-酮;

太阳城集团6β,7β-亚甲基-3-氧代-4,15-雄甾二烯-[17((β-1′)-螺-5′]全氢 化呋喃-2′-酮;

15α,16α-亚甲基-3-氧代-4,7α-丙酰硫基-4-雄甾烯[17(β-1′)- 螺-5′]全氢化呋喃-2′-酮;

太阳城集团6β,7β,15α,16α-二亚甲基-3-氧代-4-雄甾烯[17(β-1′)-螺-5′]- 全氢化呋喃-2′-酮;

7α-乙酰硫基-15β,16β-亚甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺 -5′]全氢化呋喃-2′-酮;

太阳城集团15β,16β-亚甲基-3-氧代-7β-丙酰硫基-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺 -5′]全氢化呋喃-2′-酮;和

太阳城集团6β,7β,15β,16β-二亚甲基-3-氧代-4-雄甾烯-[17(β-1′)-螺-5′] 全氢化呋喃-2′-酮。

制备式I的化合物的方法如1978年12月12日授权的Wiechart 等人的美国专利4,129,564所述。

太阳城集团感兴趣的非环氧甾族化合物的另一家族由式III定义:

太阳城集团其中R1为C1-3-烷基或C1-3酰基,而R2为H或C1-3-烷基。

太阳城集团式II范围内的特定的感兴趣的化合物如下:

太阳城集团1α-乙酰硫基-15β,16β-亚甲基-7α-甲硫基-3-氧代-17α-孕-4-烯 -21,17-碳内酯(carbolactone);和

太阳城集团15β,16β-亚甲基-1α,7α-二甲硫基-3-氧代-17α-孕-4-烯-21,17- 碳内酯。

1988年12月6日授权的Nickisch等人的美国专利4,789,668描 述了式III的化合物的制备方法。

感兴趣的非环氧甾族化合物的另一家族由式IV的结构定义:

其中R为低级烷基,优选的低级烷基为甲基、乙基、丙基和丁基。 特定的感兴趣的化合物包括:

太阳城集团3β,21-二羟基-17″-孕-5,15-二烯-17-羧酸(-内酯;

3β,21-二羟基-17″-孕-5,15-二烯-17-羧酸(-内酯3-乙酸酯;

3β,21-二羟基-17″-孕-5-烯-17-羧酸(-内酯;

3β,21-二羟基-17″-孕-5-烯-17-羧酸(-内酯3-乙酸酯;

21-羟基-3-氧代-17″-孕-4-烯-17-羧酸(-内酯;

21-羟基-3-氧代-17″-孕-4,6-二烯-17-羧酸(-内酯;

太阳城集团21-羟基-3-氧代-17″-孕-1,4-二烯-17-羧酸(-内酯;

7″-酰硫基-21-羟基-3-氧代-17″-孕-4-烯-17-羧酸(内酯;和

7″-乙酰硫基-21-羟基-3-氧代-17″-孕-4-烯-17-羧酸(-内酯。

1966年6月21日授权的Patchett的美国专利3,257,390描述了 式IV的化合物的制备方法。

感兴趣的非环氧甾族化合物的另一家族由式V表示:

其中E′选自亚乙基、亚乙烯基和(低级烷酰基)硫代亚乙基,E″选 自亚乙基、亚乙烯基、(低级烷酰基)硫代亚乙基和(低级烷酰基)硫代亚 丙基;R为甲基,除了当E′和E″分别为亚乙基和(低级烷酰基)硫代亚 乙基时,这种情况下的R选自氢和甲基;并如此选择E′和E″以存在至 少一个(低级烷酰基)硫代基团。

式IV范围内的优选的非环氧甾族化合物由式VI表示:

更优选的式VI的化合物为1-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β- 羟基-雄甾-4-烯-3-酮内酯。

式IV范围内的非环氧甾族化合物的另一优选的家族由式VII表示:

式VII范围内的最优选的化合物包括以下:

7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮内 酯;

7β-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮内 酯;

1″,7″-二乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄甾-4,6-二 烯-3-酮内酯;

7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羟基-雄甾-1,4-二烯-3- 酮内酯;

太阳城集团7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羟基-19-去甲雄甾-4-烯 -3-酮内酯;和

7″-乙酰硫基-17″-(2-羧基乙基)-17β-羟基-6″-甲基雄甾-4-烯 -3-酮内酯;

在式IV-VI中,术语“烷基”意在包括含有一至大约八个碳的直链 和支链烷基。术语“(低级烷酰基)硫”包括下式

低级烷基

特别感兴趣的是具有以下结构和正式名称的化合物螺内酯:

“螺内酯”:17-羟基-7″-巯基-3-氧代-17″-孕-4-烯-21-羧酸γ- 内酯乙酸酯。

太阳城集团1961年12月12日授权的Cella等人的美国专利3,013,012描述 了式V-VII的化合物的制备方法。螺内酯由G.D.Searle & Co.,Skokie, Illinois销售,其商标为″ALDACTONE″,是每片剂量为25mg、50mg 和100mg的片剂剂型。

本发明所考虑的甾族醛固酮拮抗剂的另一家族的实例为屈螺酮、 [6R-(6α,7α,8β,9α,10β,13β,14α,15α,16α,17β)]-1,3′,4′,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,20,21-十六氢-10,13-二甲基螺[17H-二环丙 [6,7:15,16]环戊[a]菲-17,2′(5′H)-呋喃]-3,5′(2H)-二酮,CAS注册 号67392-87-4。在优先权DE 2652761 1976的专利GB 1550568 1979 中描述了制备和使用屈螺酮的方法。

定义

术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括对需要的人 施用一定数量的抑制或逆转病理性心血管病发展的醛固酮阻滞剂。

术语“预防(prevention)”或“预防(preventing)”包括防止临床 上显著的心血管病发生,或者防止个体中心血管病的临床前期的发生。 此术语包括对有发生心血管病的危险性的受试者进行预防性治疗。

短语“治疗有效量”意在限定将达到改善疾病严重程度或发生率的 目的,同时避免不良副作用的二种联合给药的药剂的量。

太阳城集团用于治疗目的的术语“受试者”包括易患或患有炎症的任何人或动 物受试者,优选人类受试者。例如,受试者可能由于食物、暴露于细菌 或病毒感染而处于危险,具有常见症状,遗传学上有心血管病等倾向等。

太阳城集团术语“醛固酮”意指包括醛固酮和醛固酮酯,例如醛固酮-18-乙酸 酯、醛固酮-20-乙酸酯和醛固酮-21-乙酸酯。

术语“醛固酮阻滞剂”意指能够减小或抑制醛固酮生理作用的化合 物。醛固酮阻滞剂可以是醛固酮抑制剂或醛固酮受体拮抗剂。

本发明的醛固酮阻滞剂广义上分成两类;醛固酮抑制剂和醛固酮受 体拮抗剂。

太阳城集团术语“醛固酮抑制剂”意指直接或间接地减少或终止醛固酮的合成 或活性的化合物。

术语“醛固酮拮抗剂”和“醛固酮受体拮抗剂”意指能够与醛固酮 受体结合,在受体部位作为醛固酮自身作用的竞争性抑制剂,从而调节 受体介导的醛固酮活性的化合物。

本发明的醛固酮抑制剂的实例包括但不限于:芳香化酶抑制剂、例 如R-76713、R-83842、CGS-16949A(法倔唑)、CGS-20267(来曲唑)、 CGS-20267、氨基苯乙哌啶酮、CGS-47645、ICI-D-1033、色酮和山酮衍 生物以及YM-511;12-脂加氧酶抑制剂、例如PDGF、TNF、IL-1、IL-1β、 BW755c、菲尼酮、黄芩黄素、氨基胍、去甲二氢愈创木酸(NDGA)、桂皮 酰基-3,4-二羟基-α-氰基肉桂酸酯(CDC)、人参醇、吡格列酮和mRNA 裂解核酶;P45011β抑制剂、例如18-乙烯基孕酮和18-乙炔基孕酮、脂 肪酸、例如油酸;18-乙烯基去氧肾上腺酮、酮康唑、克霉唑、咪康唑、 依托咪酯、螺内酯和23-0586;心房促尿钠排泄因子、例如ANP、ANF 和ANF片断;17,20裂合酶(Lysase)抑制剂、例如YM-55208和YM-53789; 前列腺素合成抑制剂、例如吲哚美辛、甲氯芬那酸、氨基苯乙哌啶酮和 阿司匹林;PKC抑制剂、例如鞘氨醇、视黄醛、H-7、staurosporine 和三氟拉嗪;苯并二氮杂、例如安定和咪达唑仑;钙阻滞剂、例如氨 氯地平和米贝拉地尔;二酰甘油脂酶抑制剂、例如RHC-80267[1,6-双 -(环己基肟基羰基氨基)-己烷];钾离子载体、例如缬氨霉素和色满卡 林;电子转移阻滞剂(代谢抑制剂)、例如抗霉素A、氰化物、鱼藤酮和 异戊巴比妥;多巴胺(催乳素抑制激素)、三氯叔丁醇、18-乙炔基-11- 去氧肾上腺酮(18-EtDOC);和乙醇。

某些化合物,例如11β-羟基雄甾-4-烯-3-酮17-螺甾内酯,同时用 作为醛固酮合酶抑制剂和醛固酮受体拮抗剂。这些化合物也在本发明考 虑范围之内,并落入“醛固酮阻滞剂”的定义。

此外,已知血管紧张素II抑制剂和血管紧张素转化酶(ACE)抑制 剂减少醛固酮的合成。血管紧张素II抑制剂包括血管紧张素II类似 物,例如Des-asp1-thr8血管紧张素 II(L-Ary-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Thr)、Des-asp1-Ile8血 管紧张素II(L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Ile)和 Des-asp1-ala8血管紧张素 II(L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-Ile-L-His-L-Pro-L-Ala);和血管紧张素II 受体拮抗剂,例如坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙 坦和缬沙坦。

太阳城集团术语“前炎症”表征为在体内产生的诱导、活化或增强组织或器官 炎症反应的分子。

术语“氢基”意指单一氢原子(H)。此氢基可以例如连接到氧原子 上形成羟基或者二个氢基可以连接到一个碳原子上形成亚甲基(-CH2-) 基团。单独或在其它术语,例如“卤烷基”,“烷基磺酰基”,“烷氧 基烷基”和“羟基烷基”中使用的术语“烷基”包括具有1至大约20 个碳原子,优选1至大约12个碳原子的直链或支链基团。更优选的烷 基为具有1至大约10个碳原子的“低级烷基”。最优选具有1至大约6 个碳原子的低级烷基。这些基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙 基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。术语 “链烯基”包括2至大约20个碳原子,优选2至大约12个碳原子的具 有至少1个碳-碳双键的直链或支链基团。更优选的烷基为具有2至大 约6个碳原子的“低级链烯基”基团。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯 基、烯丙基、丙烯基、丁烯基和4-甲基丁烯基。术语“炔基”意指具有 2至大约20个碳原子,优选2至大约12个碳原子的直链或支链基团。 更优选炔基为具有2至大约10个碳原子的“低级炔基”。最优选具有2 至大约6个碳原子的低级炔基。这些基团的实例包括炔丙基、丁炔基等。 术语“链烯基”、“低级链烯基”包括具有“顺”和“反”取向,或者 可选择为“E”和“Z”取向的基团。术语“环烷基”包括具有3-12个 碳原子的饱和环烷基。更优选的环烷基为具有3至大约8个碳原子的“低 级环烷基”基团。这些基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己 基。术语“环烯基”包括具有3-12个碳原子的部分饱和碳环基团。更 优选的环烯基为具有4至大约8个碳原子的“低级环链烯基”基团。这 些基团的实例包括环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基和环己烯基。术语 “卤”意指卤素,例如氟、氯、溴或碘。术语“卤代烷基”包括这样的 基团:其中任何一个或多个烷基碳原子被以上定义的卤素取代。具体包 括一卤代烷基、二卤代烷基和多卤代烷基。例如,一卤代烷基在其基团 内可以有一个碘、溴、氯或氟原子。二卤代和多卤代烷基可以具有2个 或多个相同的卤原子或不同卤代基团的组合。“低级卤代烷基”包括具 有1-6个碳原子的基团。卤代烷基的实例包括氟甲基、二氯甲基、三氟 甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、六氟丙基、 二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。 术语“羟基烷基”包括具有1至大约10个碳原子的直链或支链烷基, 其中任何一个碳原子可以被一个或多个羟基取代。更优选的羟基烷基为 具有1-6个碳原子和1或多个羟基的“低级羟基烷基”。这种基团的实 例包括羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基和羟基己基。术语“烷 氧基(alkoxy)”和“烷氧基(alkyloxy)”包括各自具有1至大约10个 碳原子的烷基部分的直链或支链含氧基团。更优选的烷氧基为具有1-6 个碳原子的“低级烷氧基”基团。这种基团的实例包括甲氧基、乙氧基、 丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。术语“烷氧基烷基”包括具有一个或多个 与烷基连接的烷氧基的烷基,即形成一烷氧基烷基和二烷氧基烷基的。 “烷氧基”基团可以进一步被一个或多个卤原子,例如氟、氯或溴取代, 以提供卤代烷氧基。更优选的卤代烷氧基为具有1-6个碳原子和一或多 个卤代基团的“低级卤代烷氧基”。这种基团的实例包括氟甲氧基、氯 甲氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基和氟丙氧基。术语“芳基” 单独或组合地意指包含一、二或三个环的碳环芳香系统,其中这种环可 以下垂物的方式连接在一起或者可以稠合。术语“芳基”包括芳香基团, 例如苯基、萘基、四氢萘基、二氢化茚和联苯。芳基部分还可以在可取 代的位置被一个或多个独立地选自以下的取代基取代:烷基、烷氧基烷 基、烷基氨基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、烷氧 基、芳烷氧基、羟基、氨基、卤素、硝基、烷基氨基、酰基、氰基、羧 基、氨基羰基、烷氧基羰基和芳烷氧基羰基。术语“杂环基”包括饱和、 部分不饱和和不饱和的含杂原子环形状的基团,其中杂原子可以选自 氮、硫和氧。饱和杂环基的实例包括含有1-4个氮原子的饱和3至6元 杂单环基团(例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶子基、哌嗪基等);含有1-2 个氧原子和1-3个氮原子的饱和3至6元杂单环基(例如吗啉基等);含 有1-2个硫原子和1-3个氮原子的饱和3至6元杂单环基(例如噻唑烷 基等)。部分不饱和杂环基的实例包括二氢噻吩基、二氢吡喃、二氢呋 喃和二氢噻唑。术语“杂芳基”包括不饱和杂环基。还称为“杂芳基” 基团的不饱和杂环基的实例包括含有1-4个氮原子的不饱和3至6元杂 单环基,例如吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、 吡嗪基、哒嗪基、三唑基(例如4H-1,2,4-三唑基、1H-1,2,3-三唑基、 2H-1,2,3-三唑基等)、四唑基(例如1H-四唑基、2H-四唑基等)等;含 有1-5个氮原子的不饱和稠合杂环基,例如吲哚基、异吲哚基、吲嗪基、 苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并哒嗪基 (例如四唑并[1,5-b]哒嗪基等)等;含有氧原子的不饱和3至6元杂单 环基,例如吡喃基、呋喃基等;含有硫原子的不饱和3至6元杂单环基, 例如噻吩基等;含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和3至6元杂 单环基,例如噁唑基、异噁唑基、噁二唑基(例如1,2,4-噁二唑基、1,3,4- 噁二唑基、1,2,5-噁二唑基等)等;含有1-2个氧原子和1-3个氮原子 的不饱和稠合杂环基(例如苯并噁唑基、苯并噁二唑基等);含有1-2个 硫原子和1-3个氮原子的不饱和3至6元杂单环基,例如噻唑基、噻二 唑基(例如1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基等)等; 含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环基(例如苯并噻唑 基、苯并噻二唑基等)等。术语还包括杂环基与芳基稠合的基团。这种 稠合的二环基团的实例包括苯并呋喃、苯并噻吩基等。该“杂环基”可 以具有1-3个取代基,例如烷基、羟基、卤素、烷氧基、氧代、氨基和 烷基氨基。术语“烷硫基”包括含有1至大约10个与二价硫原子连接 的碳原子的直链或支链烷基。更优选的烷硫基是具有1-6个碳原子的烷 基的“低级烷硫基”基团。这种低级烷硫基基团的实例是甲硫基、乙硫 基、丙硫基、丁硫基和己硫基。术语“烷硫基烷基”包括含有通过二价 硫原子与1至大约10个碳原子的烷基连接的烷硫基的基团。更优选的 烷硫基烷基是具有1-6个碳原子的烷基的“低级烷硫基烷基”基团。这 种低级烷硫基烷基的实例包括甲硫基甲基。术语“烷基亚硫酰基”包括 含有与二价-S(=O)-基团连接的1-10个碳原子的直链或支链烷基的基 团。更优选的烷基亚硫酰基基团是具有1-6个碳原子的烷基的“低级烷 基亚硫酰基”基团。这种低级烷基亚硫酰基的实例包括甲基亚硫酰基、 乙基亚硫酰基、丁基亚硫酰基和己基亚硫酰基。单独或与其它术语,例 如烷基磺酰基联合使用的术语“磺酰基”分别意指二价基团-SO2-。“烷 基磺酰基”包括与磺酰基连接的烷基,其中烷基如以上定义。更优选的 烷基磺酰基是具有1-6个碳原子的“低级烷基磺酰基”基团。这种低级 烷基磺酰基的实例包括甲基磺酰基、乙基磺酰基和丙基磺酰基。“烷基 磺酰基”基团还可以被一或多个卤素原子,例如氟、氯或溴取代,以得 到卤代烷基磺酰基。术语“氨磺酰基”、“氨基磺酰基”和“磺胺基” 意指NH2O2S-。术语“酰基”意指在从有机酸中除羟基后的残基提供的 基团。这种酰基的实例包括烷酰基和芳酰基。这种低级烷酰基的实例包 括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、 新戊酰基、己酰基、三氟乙酰基。术语“羰基”,不管是单独还是与其 它术语,例如与“烷氧基羰基”一起使用,意指-(C=O)-。术语“芳酰 基”包括具有以上定义的羰基的芳基。芳酰基的实例包括苯甲酰基、萘 甲酰基等,且该芳酰基中的芳基可以附加地被取代。术语“羧基 (carboxy)”或“羧基(carboxyl)”,不管单独或与其它术语如“羧基 烷基”一起使用,意指-CO2H。术语“羧基烷基”包括被羧基取代的烷基。 更优选包括以上定义的低级烷基的“低级羧基烷基”,并可以附加地在 烷基上被卤素取代。这种低级羧基烷基的实例包括羧基甲基、羧基乙基 和羧基丙基。术语“烷氧基羰基”意指包含以上定义的烷氧基,通过氧 原子与羰基连接的基团。更优选具有1-6个碳的烷基部分的“低级烷氧 基羰基”基团。这种低级烷氧基羰基(酯)基团的实例包括取代或未取代 的甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基和己氧基羰基。 术语“烷基羰基”、“芳基羰基”和“芳烷基羰基”包括具有与羰基连 接的以上定义的烷基、芳基和芳烷基的基团。这种基团的实例包括取代 或未取代的甲基羰基、乙基羰基、苯基羰基和苄基羰基。术语“芳烷基” 包括芳基取代的烷基,例如苄基、联苯甲基、三苯基甲基、苯基乙基和 联苯乙基。该芳烷基中的芳基可以附加地被卤素、烷基、烷氧基、卤代 烷基和卤代烷氧基取代。术语苄基和苯基甲基是可以互换的。术语“杂 环基烷基”包括饱和和部分不饱和的杂环基-取代的烷基,例如吡咯烷 基甲基和杂芳基取代的烷基,例如吡啶基甲基、喹啉基甲基、噻吩基甲 基、呋喃基乙基和喹啉基乙基。该杂芳烷基上的杂芳基可以附加地被卤 素、烷基、烷氧基、卤代烷基和卤代烷氧基取代。术语“芳烷氧基”包 括通过氧原子与其它基团连接的芳烷基。术语“芳烷氧基烷基”包括通 过氧原子与烷基连接的芳烷氧基。术语“芳烷硫基”包括与硫原子连接 的芳烷基。术语“芳烷硫基烷基”包括通过硫原子与烷基连接的芳烷硫 基。术语“氨基烷基”包括被一个或多个氨基取代的烷基。更优选“低 级氨基烷基”基团。这种基团的实例包括氨基甲基、氨基乙基等。术语 “烷基氨基”意指已被一个或多个烷基取代的氨基。优选具有含1-6个 碳原子的烷基部分的“低级N-烷基氨基”。适宜的低级烷基氨基可以是 一或二烷基氨基,例如N-甲基氨基、N-乙基氨基、N,N-二甲基氨基、N,N- 二乙基氨基等。“芳基氨基”意指已被一个或二个芳基取代的氨基,例 如N-苯基氨基。“芳基氨基”基团还可以在此基团的芳环位置被取代。 术语“芳烷基氨基”包括通过氨基氮原子与其它基团连接的芳烷基。术 语“N-芳基氨基烷基”和“N-芳基-N-烷基-氨基烷基”意指已分别被一 个芳基或一个芳基和一个烷基取代的氨基,并具有与烷基连接的氨基。 这种基团的实例包括N-苯基氨基甲基和N-苯基-N-甲基氨基甲基。术语 “氨基羰基”意指式-C(=O)NH2的酰胺基团。术语“烷基氨基羰基”意 指在氨基氮原子上被一个或二个烷基取代的氨基羰基。优选“N-烷基氨 基羰基”、“N,N-二烷基氨基羰基”基团。更优选“低级N-烷基氨基羰 基”、“低级N,N-二烷基氨基羰基”基团,其低级烷基部分如以上定义。 术语“烷基氨基烷基”意指具有一个或多个与氨基烷基连接的烷基的基 团。术语“芳氧基烷基”意指具有通过二价氧原子与烷基连接的芳基的 基团。术语“芳基硫代烷基”包括具有通过二价硫原子与烷基连接的芳 基的基团。

太阳城集团用于本发明方法的化合物可以游离碱或其可药用酸加成盐的形式 存在。术语“可药用盐”包括常用于形成碱金属盐和形成游离酸或游离 碱的加成盐的盐。它只要可药用,盐的性质不关键。式I的化合物的适 宜的可药用酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。这些无机酸的实例是 盐酸、氢溴酸、氢碘酸、碳酸、硝酸、硫酸和磷酸。适宜的有机酸可以 选自脂肪酸、环脂肪酸、芳香酸、芳香脂肪酸、杂环酸、羧酸和磺酸类 有机酸,其实例是甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、葡糖酸、乳 酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、 丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、甲磺酸、4-羟基 苯甲酸、苯基乙酸、扁桃酸、双羟萘酸(pamoic)、甲磺酸、乙磺酸、苯 磺酸、泛酸、2-羟基乙磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、硬 脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、半乳糖二酸和半乳糖醛酸。适宜 的可药用碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制备的金属盐和 由N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲 胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制备的有机盐。所有这些盐可以采用常规 方法,由对应的化合物,通过例如使适宜的酸或碱与化合物反应而制备。

本发明包括用于预防心血管病的药物组合物,所述组合物包含治疗 有效量的醛固酮阻滞剂与至少一种可药用载体、助剂或稀释剂(本文总 称为“载体”材料)和可能需要的其它活性成分的组合。本发明的活性 化合物可以通过任何本领域技术人员已知的适宜的途径给药,优选以适 于这种途径的药物组合物的形式和有效进行目标治疗的剂量给药。例 如,活性化合物和组合物可以口服、血管内、腹膜内、鼻内、支气管内、 皮下、肌内或局部(包括气雾剂)给药。

太阳城集团醛固酮阻滞剂的给药可以通过口服途径或通过静脉内、肌内或皮下 注射完成。制剂可以是大丸药的形式,或者水或非水等渗无菌注射液或 悬浮液的形式。这些溶液和悬浮液可以由具有一种或多种可药用载体或 稀释剂或例如明胶或羟基丙基-甲基纤维素的粘合剂,和一种或多种润 滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂的无菌粉末或颗粒制备。

对于口服给药,例如药物组合物可以是片剂、胶囊、悬浮液或液体 的形式。药物组合物优选为包含特定量活性成分的剂量单元的形式。这 种剂量单元的实例为片剂或胶囊。这些剂型可以有利地包含数量为大约 0.5至250mg,优选大约25至150mg的每种活性成分。哺乳动物的适宜 的剂量可以依赖于患者的症状和其它因素而有宽泛的变化。但是,大约 0.01-30mg/kg体重,特别是大约1-15mg/kg体重的剂量可能是适宜的。

太阳城集团活性成分还可以通过注射组合物来给药,其中例如可以将盐水、右 旋糖或水用作适宜的载体。每种活性组分的适宜的日剂量为大约 0.01-15mg/kg体重,根据治疗的疾病而每天注射多次剂量。优选的日 剂量为大约1-10mg/k体重。指定用于预防治疗的化合物优选的日给药 剂量范围一般为大约0.1mg至大约15mg/千克体重/天。更优选的剂量 范围为大约1mg至大约15mg/千克体重。最优选剂量范围为大约1至大 约10mg/千克体重/天。适宜的剂量可以是每天进行多个亚剂量给药。 这些亚剂量可以单元剂型给药。通常,剂量或亚剂量可以包含大约1mg 至大约100mg活性化合物/单元剂型。更优选的剂量包含大约2mg至大 约50mg活性化合物/单元剂型。最优选包含大约3mg至大约25mg活 性化合物/单元剂量的剂型。

在一个优选的联合治疗中,醛固酮受体拮抗剂存在的数量范围可以 为大约10mg至大约200mg。

用本发明的方法治疗病症的剂量方案根据多个因素选择,所述因素 包括患者的类型、年龄、体重、性别和健康状况,疾病的严重程度,给 药途径和所用的特定化合物,并因此可以宽泛地变化。

对于治疗目的,本方法的活性组分一般与一种或多种适于指定给药 途径的助剂组合。如果经口给药,则可以将组分与乳糖、蔗糖、淀粉、 链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、 磷酸和硫酸的钠和钙盐、明胶、阿拉伯胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和 /聚乙烯醇混合,然后制片或制胶囊用于常规给药。这些胶囊或片剂可 以包含控释制剂,如以羟基丙基甲基纤维素中活性化合物的分散体提 供。用于肠胃外给药的制剂可以是水或非水等渗无菌注射溶液或悬浮液 的形式。这些溶液和悬浮液可以由具有一种或多种所述的用于口服给药 制剂的载体或稀释剂的无菌粉末或颗粒制备。组分可以溶于水、聚乙二 醇、丙二醇、乙醇、玉米油、棉花籽油、花生油、芝麻油、苄醇、氯化 钠和/或多种缓冲剂。其它助剂和给药方式在药学技术中非常广泛熟知。

环氧甾族醛固酮拮抗剂固态形式

本发明的方法包括施用治疗有效量的依匹乐酮,其为任何固态形 式,其自身作为一种或多种固态形式或包含一种或多种固态形式依匹乐 酮的药物组合物的形式。这些新的固态形式包括但不限于溶剂化结晶依 匹乐酮、非溶剂化结晶依匹乐酮和无定形依匹乐酮。

在一个实施方案中,根据本发明的方法给药的依匹乐酮为具有下表 1A所述X射线粉末衍射图的依匹乐酮的非溶剂化晶形(本文称为“高熔 点多晶型物”或“晶形H”)。依匹乐酮晶形H公开在国际公开文本WO 01/42272中,本文引用其内容作为参考。

在另一个实施方案中,依匹乐酮以药物组合物的形式给药,其中组 合物中所含的全部数量的依匹乐酮以相纯的晶形H存在。

太阳城集团在另一个实施方案中,依匹乐酮以药物组合物的形式给药,其中组 合物中所含的全部数量的依匹乐酮以相纯的晶形L存在。晶形L依匹乐 酮公开在国际公开文本WO 01/41535,本文引用其内容作为参考。

太阳城集团在另一个实施方案中,依匹乐酮以药物组合物的形式给药,其中组 合物中所含的全部数量的依匹乐酮以相纯的溶剂化结晶依匹乐酮存在。

在另一个实施方案中,依匹乐酮以药物组合物的形式给药,其中组 合物中所含的全部数量的依匹乐酮以无定形依匹乐酮存在。

在另一个实施方案中,依匹乐酮以药物组合物的形式给药,其中该 组合物包含依匹乐酮的第一固态形式和依匹乐酮的第二固态形式,且依 匹乐酮的第一和第二固态形式选自晶形H、晶形L、溶剂化依匹乐酮和 无定形依匹乐酮。一般地,该第一固态形式与该第二固态形式的重量比 优选为至少大约1∶9,优选大约1∶1,更优选至少大约2∶1,更优选至少 大约5∶1,甚至更优选至少大约9∶1。依匹乐酮制剂也公开在国际公开 文本WO 00/33847和WO 01/41770中,本文引用其内容作为参考。

在另一个实施方案中,依匹乐酮以药物组合物的形式给药,其中组 合物包含晶形H和晶形L。组合物中晶形L与晶形H的数量比通常为大 约1∶20至大约20∶1。在另一个实施方案中,例如该比率为大约10∶1 至大约1∶10;大约5∶1至大约1∶5;大约2∶1至大约1∶2;或大约1∶1。

太阳城集团虽然以上每个实施方案可以包括宽泛的依匹乐酮粒径范围的依匹 乐酮固态形式的给药,已发现依匹乐酮的固态形式的选择和依匹乐酮粒 径的减小的结合可以改善未配制的依匹乐酮和包含该依匹乐酮固态形 式的药物组合物的生物利用度。

在一个实施方案中,未配制的依匹乐酮或用作药物组合物中的原料 的依匹乐酮的D90粒径通常小于约400微米,优选小于约200微米,更 优选小于约150微米,甚至更优选小于约100微米,甚至更优选小于约 90微米。在另一个实施方案中,D90粒径为约40微米至约100微米。在 另一个实施方案中,D90粒径为约30微米至约50微米。在另一个实施方 案中,D90粒径为大约50微米至大约150微米。在另一个实施方案中, D90粒径为大约75微米至大约125微米。

太阳城集团在另一个这样的实施方案中,未配制的依匹乐酮或用作药物组合物 中的原料的依匹乐酮的D90粒径通常小于大约15微米,优选小于大约1 微米,更优选小于大约800nm,甚至更优选小于大约600nm,甚至更 优选小于大约400nm。在另一个实施方案中,D90粒径为大约10nm至 大约1微米。在另一个实施方案中,D90粒径为大约100nm至大约800nm。 在另一个实施方案中,D90粒径为大约200nm至大约600nm。在另一个 实施方案中,D90粒径为大约400nm至大约800nm。

粒径小于大约15微米的依匹乐酮的固态形式可以根据本领域中已 知的可应用的粒径减小技术制备。这些技术包括但不限于美国专利 5,145,684、5,318,767、5,384,124和5,747,001所述的技术。美国专 利5,145,684、5,318,767、5,384,124和5,747,001如同其被详细地被 完整描述一样被引用作为参考。根据美国专利5,145,684的方法,例如 适宜大小的颗粒通过将依匹乐酮分散在液体分散介质并在研磨介质存 在下湿研磨混合物产生目标大小的颗粒而制备。如果需要或有利的话, 可以在表面改性剂存在下减小颗粒的大小。

太阳城集团适用于依匹乐酮的术语“无定形”指依匹乐酮分子无序排列存在且 不形成显著的晶格或晶胞的固态。当接受X射线粉末衍射时,无定形依 匹乐酮不产生任何特征性结晶峰。

如果在本申请中提及物质或溶液的“沸点”,则术语“沸点”意指 在可应用的工艺条件下的物质或溶液的沸点。

应用于依匹乐酮的术语“结晶形”指依匹乐酮分子排列形成明显的 晶格(i)包含明显的晶胞,和(ii)在接受X射线照射时产生衍射峰的固 态形式。

本申请全文中所用的术语“结晶”可以指根据与依匹乐酮原料的制 备有关的应用环境而进行的结晶和/或重结晶。

术语“蒸煮”意指这样一个过程:其中将在溶剂或溶剂混合物中的 固体依匹乐酮的浆于溶剂或溶剂混合物的沸点和可应用的工艺条件下 加热。

太阳城集团本文所用的术语“直接结晶”指不经中间产物依匹乐酮的溶剂化结 晶固态形式形成或去溶剂化而直接用适宜的溶剂结晶依匹乐酮。

本文所用的术语“粒径”指通过本技术中已知的常规粒径测定技术, 例如激光散射法、沉降区流动分级、光子相联分光术或圆盘离心法测定 的粒径。术语“D90粒径”意指通过这种常规粒径测定技术测定的至少 90%颗粒的粒径。

术语“纯度”意指根据常规HPLC分析得到的依匹乐酮的化学纯度。 本文所用的“低纯度依匹乐酮”通常意指包含有效量的晶形H生长促进 剂和/或晶形L生长抑制剂的依匹乐酮。本文所用的“高纯度依匹乐酮” 通常意指不含或含有小于有效量的晶形H生长促进剂和/或晶形L生长 抑制剂的依匹乐酮。

术语“相纯度”意指如本文所述的红外光谱分析法测得的太阳城集团依匹 乐酮的特定的结晶或无定形形式的依匹乐酮固态纯度。

术语“XPRD”意指X射线粉末衍射。

术语“Tm”意指熔化温度。

固态形式的特征

1.分子构象

单晶X射线分析表明在晶形H和晶形L之间依匹乐酮的分子构象 不同,特别是甾环7-位的酯基的取向不同。该酯基的取向可以通过 C8-C7-C23-02扭转角定义。

在晶形H的晶格中,依匹乐酮分子采用的构象中在7-位上酯的甲氧 基与C-H键大约成直线,而羰基大约位于B-甾环的中心。在该构象中 C8-C7-C23-02扭转角大约是-73.0°。在该取向中,酯基的羰基氧原子(01) 与9,11一环氧环的氧原于(04)紧密接触。01-04的距离约为2.97埃, 其恰低于范德华接触距离3.0埃(假设氧原子的范德华半径是1.5埃)。

太阳城集团在晶形L的晶格中,依匹乐酮分子采用的构象中相对于晶形H来说 该酯基大约旋转了150°,且C8-C7-C23-02扭转角为约±76.9°。在该取 向中,该酯的甲氧基直接与A-甾环的4,5-烃部分相对。在此取向中, 与晶形H确定的距离相比,该酯基的任一氧原子(01,02)和9,11-环氧 环的氧原子(04)之间的距离都加大了。02-04距离约为3.04埃,恰高 于范德华接触距离。01-04距离约为3.45埃。

太阳城集团在通过单晶X射线衍射分析的溶剂化晶形中,依匹乐酮分子似乎采 用晶形L特征的构象。

2.X-射线粉末衍射

用Siemens D5000粉末衍射计或Inel Multipurpose衍射计分析 依匹乐酮的各种晶形。对于Siemens D5000粉末衍射计,对于2q值, 从2-50测定原始数据,其间距为0.020而间距期为2秒。对于Inel Multipurpose衍射计,将样品置于铝制样品夹持器,并在所有2θ值同 时收集30分钟的原始数据。

表IA、IB和IC根据2q值和强度分别给出了依匹乐酮晶形的晶形 H(通过将蒸煮低纯度依匹乐酮获得的乙醇合物去溶剂化而制得的)、晶 形L(通过将重结晶高纯度依匹乐酮获得的甲基乙基酮溶剂化物去溶剂 化而制得的)和甲基乙基酮溶剂化物(通过在甲基乙基酮中室温浆液转 化高纯度依匹乐酮而制得的)的主要峰的重要参数(X-射线辐射,波长为 1.54056埃)。

太阳城集团在晶形H和晶形L的衍射图中可能出现峰位置的较小的位移,这是 晶形H和晶形L的制备途径(即溶剂化物的去溶剂化)结晶衍射面间距不 完美所至造成的。此外,品形H是从通过蒸煮粗品依匹乐酮制备的溶剂 化物中分离的。该方法导致晶形H的整体化学纯度较低(约90%)。最后, 预计由于在晶格的溶剂通道内溶剂分子的流动性增加,依匹乐酮溶剂化 形式的衍射峰位置出现了一些位移。

表1A

晶形H数据     角2θ     d间距     强度     强度%     6.994     12.628     1188     7.2     8.291     10.655     2137     13     10.012     8.827     577     3.5     11.264     7.849     1854     11.3     12.04     7.344     7707     46.8     14.115     6.269     3121     19     14.438     6.13     15935     96.8     15.524     5.703     637     3.9     16.169     5.477     1349     8.2     16.699     5.305     1663     10.1     16.94     5.23     1692     10.3     17.147     5.167     2139     13     17.66     5.018     6883     41.8     17.91     4.949     16455     100     18.379     4.823     3106     18.9     18.658     4.752     1216     7.4     19.799     4.48     1499     9.1     20.235     4.385     383     2.3     21.707     4.091     1267     7.7     21.8     4.073     1260     7.7     21.959     4.044     1279     7.8     22.461     3.955     4264     25.9     23.191     3.832     1026     6.2     23.879     3.723     1000     6.1     24.599     3.616     1688     10.3     25.837     3.445     931     5.7     26.034     3.42     686     4.2     26.868     3.316     912     5.5     27.093     3.288     1322     8     27.782     3.209     1236     7.5     28.34     3.147     1845     11.2     28.861     3.091     957     5.8     29.866     2.9892     745     4.5     30.627     2.9166     992     6     31.108     2.8726     1205     7.3     33.215     2.6951     1287     7.8     33.718     2.656     802     4.9     34.434     2.6024     914     5.6

表1B

晶形L数据     角2θ     d间距     强度     强度%     7.992     11.054     11596     26.6     10.044     8.799     12048     27.6     11.206     7.889     4929     11.3     12.441     7.109     1747     4     12.752     6.936     4340     9.9     13.257     6.673     2444     5.6     14.705     6.019     43646     100     15.46     5.727     2670     6.1     15.727     5.63     7982     18.3     16.016     5.529     3519     8.1     17.671     5.015     8897     20.4     17.9     4.951     2873     6.6     18.352     4.83     612     1.4     18.703     4.74     689     1.6     19.524     4.543     1126     2.6     20.103     4.413     3753     8.6     20.63     4.302     1451     3.3     21.067     4.214     876     2     21.675     4.097     2760     6.3     22.232     3.995     1951     4.5     22.652     3.922     1657     3.8     23.624     3.763     827     1.9     24.279     3.663     1242     2.8     25.021     3.556     5144     11.8     25.485     3.492     1702     3.9     25.707     3.463     2493     5.7     26.251     3.392     1371     3.1     26.85     3.318     1970     4.5     27.319     3.262     1029     2.4     27.931     3.192     440     1     27.969     3.187     440     1     28.937     3.083     1128     2.6     29.703     3.005     1211     2.8     30.173     2.9594     1506     3.5     30.584     2.9206     1602     3.7     30.885     2.8928     1550     3.6     31.217     2.8628     1068     2.4     31.605     2.8285     1038     2.4     32.059     2.7895     1211     2.8     32.64     2.7412     684     1.6     32.747     2.7324     758     1.7     33.46     2.6759     506     1.2     34.194     2.6201     1085     2.5     34.545     2.5943     915     2.1

表1C

太阳城集团甲基乙基酮数据     角2θ     d间距     强度     强度%     7.584     11.648     5629     32.6     7.753     11.393     15929     92.3     10.151     8.707     2877     16.7     11.31     7.817     701     4.1     12.646     6.994     1027     5.9     13.193     6.705     15188     88     13.556     6.526     14225     82.4     14.074     6.287     1966     11.4     14.746     6.002     2759     16     15.165     5.837     801     4.6     15.548     5.694     1896     11     17.031     5.202     7980     46.2     17.28     5.127     17267     100     17.706     5.005     6873     39.8     18.555     4.778     545     3.2     18.871     4.699     1112     6.4     19.766     4.488     1704     9.9     20.158     4.401     1396     8.1     20.725     4.282     2644     15.3     21.787     4.076     1127     6.5     22.06     4.026     451     2.6     22.864     3.886     1542     8.9     23.412     3.796     14185     82.2     23.75     3.743     1154     6.7     24.288     3.662     3063     17.7     25.253     3.524     1318     7.6     25.503     3.49     1736     10.1     25.761     3.455     1225     7.1     26.176     3.402     1346     7.8     26.548     3.355     1098     6.4     27.357     3.257     1944     11.3     27.605     3.229     2116     12.3     27.9     3.195     858     5     28.378     3.142     583     3.4     28.749     3.103     763     4.4     29.3     3.046     1182     6.8     29.679     3.008     2606     15.1     30.402     2.9377     2184     12.6     30.739     2.9063     648     3.8

依匹乐酮的晶形H、晶形L和甲基乙基酮溶剂化物晶形的X-射线衍 射图的实例图分别见图1-A、1-B和1-C。晶形H在7.0±0.2、8.3±0.2 和12.0±0.2°2θ显示出了区别峰。晶形L在8.0±0.2、12.4±0.2、12.8±0.2 和13.3±0.2°2θ显示出了区别峰。甲基乙基酮溶剂化物的晶形在 7.6±0.2、7.8±0.2和13.6±0.2°2θ显示出了区别峰。

3.熔化/分解温度

用TA Instruments 2920差示扫描量热计测定非溶剂化的依匹乐酮 晶形的熔化和/或分解温度。将各样品(1-2mg)置于密封或非密封的铝盘 中并以约10℃/分钟的升温速度加热。熔化/分解范因是从熔化/分解吸 热线外推的开始至最大值而定义的。

依匹乐酮晶形H和晶形L的熔化与化学分解和晶格中所捕获溶剂的 损失有关。熔化/分解温度也受分析前固体处理的影响。例如,通过从 适当溶剂中直接结晶或者将在适当溶剂或溶剂的混合物中结晶高纯度 依匹乐酮获得的溶剂化物去溶剂化制得的非研磨晶形L(D90粒径为约 180-450μm)的一般熔化/分解范围为约237℃-242℃。研磨的晶形L(D90粒径约为80-100μm)(通过从高纯度依匹乐酮在适当的溶剂或溶剂混合 物中的溶液中结晶溶剂化物,将此溶剂化物去溶剂化,并研磨所得晶形 L而制得的)一般具有较低和较宽的熔化/分解温度范围,为约223C-234 ℃。通过将蒸煮低纯度依匹乐酮获得的溶剂化物去溶剂化制得的非研磨 的晶形H(D90粒径为约180-450μm)一般具有较高的熔化/分解范围,为约 247℃-251℃。(a)直接从甲基乙基酮中结晶制备的非研磨的晶形L,(b) 通过将从甲基乙基酮中结晶高纯度依匹乐酮获得的溶剂化物去溶剂化 而制备的非研磨的晶形L,(c)通过研磨从甲基乙基酮中结晶高纯度依匹 乐酮所得溶剂化物去溶剂化状态而制备的晶形L,和(d)通过将从甲基乙 基酮中蒸煮低纯度依匹乐酮获得的溶剂化物去溶剂化制备的非研磨的 晶形H的DSC差示热分析图的实例,分别如图2-A、2-B、2-C和2-D所 示。

太阳城集团用Perkin Elmer Pyrisl差示扫描量热计测定依匹乐酮的溶剂化形 式的DSC差示热分析囹。将各样品(1-10mg)置于非密封的铝盘中并以 10℃/分钟的升温速度加热。当从溶剂化物晶格中有溶剂损失时,在较 低温度下的一个或多个吸热过程伴有焓的变化。最高温度吸热线(一个 或多个)与依匹乐酮晶形L或晶形H的熔化/分解有关。图2-E显示了依 匹乐酮的甲基乙烯酮溶剂化晶形的DSC差示热分析图的实例

4.红外吸收光谱

太阳城集团用Nicolet DRIFT(漫反射红外博里叶变换)Magna系550光谱仪获 得非溶剂化依匹乐酮晶形H和晶形L的红外吸收光谱。使用 Spectra-Tech收集器系统和微样品杯。在溴化钾中分析样品(5%)并从 400到4000cm-1扫描。用Bio-rad FTS-45光谱仪获得依匹乐酮在稀氯仿 溶液(3%)或在溶剂化晶形中的红外吸收光谱。用0.2mm路径长度带氯化 钠盐板的溶液池分析氯仿溶液样品。用IBM微-MIR(多功能内部反射度) 辅助设备收集溶剂化物FTIR光谱。从400到4000cm-1扫描样品。(a)晶 形H、(b)晶形L、(c)甲基乙基酮溶剂化物和(d)在氯仿溶液中的依匹乐 酮的红外吸收光谱的实例分别如图3-A、3-B、3-C和3-D所示。

表2公开了晶形H、晶形L和甲基乙基酮溶剂化物晶形的依匹乐酮 的示例性吸收带。还公开了氯仿溶液中的依匹乐酮的示例性吸收带以作 为对比。观察到了晶形H与晶形L或甲基乙基酮溶剂化物之间的差别, 例如,在光谱的羰基区观察到了差别。晶形H的酯羰基伸展区在约 1739cm-1,而晶形L和甲基乙基酮溶剂化物分别在约1724和1722cm-1有 相应的伸展。在氯仿溶液中的依匹乐酮在约1727cm-1产生酯羰基的伸展。 晶形H和晶形L之间酯羰基的伸展频率的变化反映了这两种晶形之间的 酯基取向的变化。此外,在A甾环中共轭酮的酯的伸展从晶形H或甲基 乙基酮溶剂化物的约1664-1667cm-1位移至晶形L的约1655cm-1。在稀溶 液中相应的羰基伸展发生在约1665cm-1。

晶形H和晶形L之间的另一个差别见于C-H弯曲区。晶形H在约 1399cm-1有吸收,这在晶形L、甲基乙基酮溶剂化物或在氯仿溶液中的 依匹乐酮中没有观察到。此1399cm-1伸展发生在邻近羰基的C2和C21 亚甲基的CH2剪切区。

太阳城集团                                   表2     吸收区域     晶形H     (cm-1)     晶形    L(cm-1) 甲基乙基酮溶剂   化物(cm-1)  氯仿中的依匹乐     酮(cm-1)     <C=O(内酯)     1773     1775     1767     1768     <C=O(酯)     1739     1724     1722     1727     <C=O(3酮)     1664     1655     1667     1665     <C=C     (3,4-烯烃)     1619     1619     1622     1623     *asCH3,*CH2,     *CH2(″to羰基)     1460,     1444,     1426     1467,     1438,     1422,     1399     1467,     1438,     1422     1464,     1438,     1422     *sCH3     1380     1381     ~1380     1378

5.核磁共振

在31.94区获得13CNMR光谱。依匹乐酮晶形H和晶形L的13CNMR光 谱的实例分别如图4和5所示。通过分析依匹乐酮晶形H以获得在图4 中反映的数据,结果发现依匹乐酮晶形H不是相纯的并含有小量的依匹 乐酮晶形L。晶形H通过在64.8ppm、24.7ppm和19.2ppm周围的碳共 振使其最清楚地区别于其它形式。晶形L通过在67.1ppm和16.0ppm周 围的碳共振使其最清楚地区别于其它形式。

6.热重量分析法

用TA Instruments TGA 2950热重量分析仪进行热重量分析。在氮 冲洗下,将样品置于未封闭的铝盘中起始温度为25℃,温度以约10℃/ 分钟的速度升温。图6-A显示了甲基乙基酮溶剂化物的热重量分析法分 析图的实例

7.晶胞参数

太阳城集团下表3A、3B和3C总结了测定的晶形H,晶形L和几种溶剂化晶形 的晶胞参数。

太阳城集团                                 表3A     参数     晶形H     晶形L   甲基乙基酮溶剂化物     晶系     正交     斜晶     正交     空间群     P212121     P21     P212121     a     21.22     8.78     23.53     b     15.40     11.14     8.16     c     6.34     11.06     13.08     α     90°     90°     90°     β     90°     93.52°     90°     γ     90°     90°     90     Z     4     2     4     体积()     2071.3     1081.8     2511.4     ρ(计算值)     1.329g/cm3     1.275g/cm3     1.287g/cm3     R     0.0667     0.062     0.088

表3B     参数     丙酮溶剂化物 甲苯溶剂化物     乙酸丁酯溶剂化物     晶系     正交     正交     正交     空间群     P212121     P212121     P212121     a     23.31     23.64     23.07     b     13.13     13.46     13.10     c     8.28     8.16     8.24     α     90°     90°     90°     β     90°     90°     90°     γ     90°     90°     90°     Z     4     4     4     体积()     2533.7     2596.6     2490.0     ρ(计算值)     1.239g/cm3     1.296g/cm3     1.334g/cm3     R     0.058     0.089     0.093

1由于通道中溶剂分子的紊乱,溶剂化物分子没有彻底精制。

                                 表3C     参数   乙酸异丁酯溶剂化物   异丙醇溶剂化物     乙醇溶剂化物     晶系     正交     正交     正交     空间群     P212121     P212121     P212121     a     23.19     23.15     23.51     b     12.95     12.73     13.11     c     8.25     8.25     8.27     α     90°     90°     90°     β     90°     90°     90°     γ     90°     90°     90°     Z     4     4     4     体积()     2476.4     24 33.2     2548.6     ρ(计算值)     1.337g/cm3     1.296g/cm3     1.234g/cm3     R     0.098     0.152     0.067

太阳城集团1由于通道中溶剂分子的紊乱,溶剂化物分子没有彻底精制。

对所选依匹乐酮溶剂化晶形的其它太阳城集团在下表4中报告。上表3A 中报告的甲基乙基酮的晶胞数据也代表了很多其它依匹乐酮结晶溶剂 化物的晶胞参数。被测的大多数依匹乐酮结晶溶剂化物基本上彼此同 构。虽然由于掺入溶剂分子的大小不同,一种溶剂化晶形与另一种在X- 射线粉末衍射峰中存在一些很小的位移,但是整个衍射图基本上相同, 而晶胞参数和分子位置对于大多数所测试的溶剂化物来说基本上一致。

                                   表4:溶剂     溶剂 化学计量(溶剂∶依匹乐     酮) 与甲基乙基酮溶剂化物     同构否? 去溶剂化温度    1(℃)     甲基乙基酮     1∶1     N/A     89     2-戊酮     ---     ---     ---     乙酸     1∶2     是     203     丙酮     1∶1     是     117     乙酸丁酯     1∶2     是     108     氯仿     ---     是     125     乙醇     1∶1     是     166     异丁醇     ---     ---     ---     乙酸异丁酯     1∶2     是     112     异丙醇     1∶1     是     121     乙酸甲酯     1∶1     是     103     丙酸乙酯     1∶1     是     122     正丁醇     1∶1     是     103     正辛醇     -     是     116     正丙醇     1∶1     是     129     乙酸丙酯     1∶1     是     130     丙二醇     ---     是     188     叔丁醇     ---     ---     ---     四氢呋喃     1∶1     是     136     甲苯     1∶1     是     83     乙酸叔丁酯     ---     是     109

太阳城集团1定义为从最终溶剂重量损失步骤外推的去溶剂化温度,这是通过 热重量分析以10℃/分钟的加热速度在氮气冲洗下测定的。但是去溶剂 化温度可能受溶剂化物制备方法的影响。不同的方法可能产生不同数量 的成核作用位点,该位点能在较低温度引起溶剂化物的去溶剂化。

太阳城集团溶剂化物的晶胞由4个依匹乐酮分子组成。对于多种溶剂化物,依 匹乐酮分子和溶剂分子在此晶胞中的化学计量也报告于上表4。晶形H 晶胞由4个依匹乐酮分子组成。晶形L晶胞由两个依匹乐酮分子组成。 当依匹乐酮分子晶形迁移并旋转以填补溶剂分子留下的空间时,溶剂化 物晶胞在去溶剂化过程中转变为晶形H和/或晶形L晶胞。表4也报告 了很多不同溶剂化物的去溶剂化温度。

8.杂质分子的结晶性质

在溶剂化物的去溶剂化过程中,在依匹乐酮中所选择的杂质可诱导 晶形H的形成。特别是评价如下两种杂质分子的作用:4α,5α:9”,11α- 二环氧-17-羟基-3-氧代-17α-孕烷-7α,21-二甲酸氢7-甲酯,(γ-内酯 3(“二环氧化物”);和11α,12α-环氧-17-羟基-3-氧代-17-孕-4-烯 -7”,21-二甲酸氢7-甲酯,(γ-内酯4(“11,12-环氧化物”)。

这些杂质分子对去溶剂化所得依匹乐酮晶形的作用在本文实施例 中更详细地描述。

太阳城集团由于17-羟基-3-氧代-17”-孕-4,9(11)-二烯-7α,21-二甲酸氢7- 甲酯,(γ-内酯5(“9,11一烯烃”)的单晶结构与晶形H依匹乐酮类似, 因此我们假定在溶剂化物的去溶剂化期间9,11-烯烃也可诱导晶形H的 形成。

二环氧化物,11,12-烯烃和9,11-烯烃可以分别如Ng等人, WO98/25948的实施例47C、47B和37H所述制备。分离每种杂质化合物 的单晶。分离的二环氧化物、11,12-环氧化物和9,11-烯烃晶形的代表 性X-射线粉末衍射图分别如图9、10和11所示。每种杂质分子的X-射 线粉末衍射图类似于晶形H的X-射线粉末衍射图,这表明晶形H和这三 种杂质化合物具有相似的单晶结构。

太阳城集团也分离了每种杂质化合物的单晶,并进行X-射线结构测定以证实这 三种化合物采用的单晶结构类似于晶形H。从甲基乙基酮中分离此二环 氧化物的单晶。从异丙醇中分离11,12-环氧化物的单晶。从正丁醇中分 离9,11-烯烃的单晶。测定每种杂质化合物晶形的晶体结构所得数据如 表5所示。对晶形H、二环氧化物、11,12-环氧化物和9,11-烯烃晶形 的所得晶系和晶胞参数基本上是相同的。

太阳城集团表5     参数     晶形H   二环氧化物   11,12-环氧化物   9,11-烯烃     晶系     正交     正交     正交     正交     空间群     P212121     P212121     P212121     P212121     a     21.22     21.328     20.90     20.90     b     15.40     16.16     15.55     15.74     c     6.34     6.15     6.38     6.29     α     90°     90°     90°     90°     β     90°     90°     90°     90°     γ     90°     90°     90°     90°     Z     4     4     4     4     体积()     2071.3     2119.0     2073.2     2069.3     ρ(计算值)     1.329g/cm3     1.349g/cm3     1.328g/cm3     1.279g/cm3     R     0.0667     0.0762     0.0865     0.0764

太阳城集团表5中报告的4种化合物结晶成相同的空间群,并具有相似的晶胞 参数(即它们是同构的)。假定该二环氧化物、11,1 2-环氧化物和9,11- 烯烃采用晶形H构象。对于每种杂质化合物来说,相对容易分离晶形H 填料(直接从溶液中),这表明在此系列结构相似的化合物中晶形H晶格 是稳定的填充方式。

制备依匹乐酮

用于制备本发明新晶形的依匹乐酮原料可以通过本身已知方法,包 括在上述Ng等人的国际专利出版物WO97/21720和WO98/25948中给出 的方法,特别是在二者中给出的方案1制得。

制备晶形

1.制备溶剂化晶形

依匹乐酮的溶剂化晶形可以通过从适宜的溶剂或适宜溶剂的混合 物中结晶依匹乐酮来制备。适宜的溶剂或适宜溶剂的混合物一般包括这 样的有机溶剂或有机溶剂的混合物,其在升高的温度下溶解依匹乐酮和 任何杂质,但是冷却时优先结晶溶剂化物。室温下在这些溶剂或溶剂的 混合物中依匹乐酮的溶解度一般为约5至大约200mg/mL。这些溶剂或溶 剂混合物优选选自制备依匹乐酮原料的过程中已使用过的溶剂,特别是 如果包含在含依匹乐酮晶形的最终药物组合物中时是可药用的溶剂。例 如,得到含二氯甲烷的溶剂化物的含二氯甲烷的溶剂系统一般是不可取 的。

太阳城集团所用各溶剂优选是可药用溶剂,特别是在“杂质:残余溶剂指南” 人用药物注册技术要求协调国际会议(International Conference on Harmonlsatlon of Technical Requirements For Reslstratlon of Pharmaceuticals ForHuman Use)(ICH指导委员会1997年7月17日在 ICH程序步骤4中推荐采用)中定义的2类或3类溶剂。更优选地,这些 溶剂或溶剂混合物选自甲基乙基酮、1-丙醇、2-戊酮、乙酸、丙酮、乙 酸丁酯、氯仿、乙醇、异丁醇、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正 丁醇、正辛醇、异丙醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氢呋喃、甲苯、 甲醇和乙酸叔丁酯。更优选的是,所述溶剂选自甲基乙基酮和乙醇.

太阳城集团为了制备依匹乐酮的溶剂化晶形,将一定量的依匹乐酮原料溶解在 一定体积的溶剂中,并冷却直至形成晶体。向溶剂中加入依匹乐酮时的 溶剂温度一般是根据该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线来选择。对于本 文所描述的大多数溶剂,例如该溶剂温度一般为至少约25℃,优选约 30℃至该溶剂的沸点温度,更优选为低于该溶剂沸点约25℃的温度至该 溶剂的沸点温度。

或者,可将热溶剂加到依匹乐酮中并可以将该混合物冷却直至形成 晶体。向依匹乐酮中加入溶剂时的溶剂温度一般是根据该溶剂或溶剂混 合物的溶解度曲线来选择。对于本文所描述的大多数溶剂,例如该溶剂 温度一般为至少约25℃,优选约50℃至该溶剂的沸点温度,更优选为 低于该溶剂沸点约15℃的温度至该溶剂的沸点温度。

太阳城集团与给定体积的溶剂混合的依匹乐酮原料的量同样取决于该溶剂或 溶剂混合物的溶解度曲线。一般情况下,加到溶剂中的依匹乐酮的量在 室温下在该体积的溶剂中不能完全溶解。对于本文所描述的大多数溶 剂,例如与给定体积的溶剂混合的依匹乐酮原料的量通常为在室温时所 能在该体积的溶剂中溶解的依匹乐酮的量的至少约1.5至约4.0倍、优 选为约2.0至约3.5倍、更优选为约2.5倍。

当依匹乐酮原料已经完全溶解在溶剂中时,通常将该溶液缓慢地冷 却以结晶出依匹乐酮的溶剂化晶形。对于本文所描述的大多数溶剂,例 如以低于约20℃/分钟的速度、优选以约10℃/分钟或更低的速度、更 优选以约5℃/分钟或更低的速度、还更优选以约1℃/分钟或更低的速 度冷却该溶液。

收获溶剂化晶形的终点温度取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲 线。对于本文所描述的大多数溶剂,例如该终点温度一般为低于约25 ℃、优选低于约5℃、更优选低于约-5℃。降低该终点温度通常有利于 溶剂化晶形的形成。

或者,可使用其它技术来制备溶剂化物。这样的技术的实例包括但 不限于(i)将依匹乐酮原料溶解在一种溶剂中并加入助溶剂来促进溶剂 化晶形的结晶,(ii)溶剂化物的蒸气扩散生长,(iii)通过蒸发例如旋 转蒸发分离溶剂化物,和(iv)浆液转化。

可通过任意合适的常规手段例如过滤或离心来将如上所述制得的 溶剂化晶形的晶体从溶剂中分离出来。在结晶期间提高溶剂系统的搅拌 通常导致生成粒径更小的晶体。

2.从溶剂化物制备晶形L

太阳城集团依匹乐酮晶形L可通过去溶剂化由溶剂化晶形直接制得。可通过任 意合适的去溶剂化手段,例如但不限于将溶剂化物加热、降低溶剂化物 周围的环境压力、或二者的组合来实现去溶剂化。如果将溶剂化物加热, 例如在烘箱中加热来除去溶剂,在该操作期间的温度一般不超过晶形H 和晶形L的互变转化温度。该温度优选不超过约150℃。

去溶剂化压力和去溶剂化太阳城集团并不很重要。去溶剂化压力优选为约 1个大气压或更低。然而,当降低去溶剂化压力时,同样要降低可进行 去溶剂化的温度和/或去溶剂化太阳城集团。特别是对于具有较高去溶剂化温 度的溶剂化物,真空干燥使得可以采用较低的干燥温度。仅需要能足以 进行完去溶剂化以形成晶形L的去溶剂化太阳城集团。

为了保证制得基本上都由晶形L组成的产物,依匹乐酮原料一般是 高纯度依匹乐酮,优选基本上是纯的依匹乐酮.用于制备依匹乐酮晶形L 的依匹乐酮原料一般具有至少90%的纯度,优选至少95的纯度,更优选 至少99%的纯度。如在本申请别处所讨论的那样,依匹乐酮原料中的一 些杂质可能对通过该方法所得产物的产率和晶形L含量造成不利影响。

太阳城集团通过该方法由高纯度依匹乐酮原料制得的依匹乐酮结晶产物一般 包含至少10%晶形L,优选至少50%晶形L,更优选至少75%晶形L,还 更优选至少90%晶形L,再更优选至少约95%晶形L,进一步更优选基本 上是相纯的晶形L。

太阳城集团3.由溶剂化物制备晶形H

可按照基本上与上述晶形L制备法相同的方法制备包含晶形H的产 物,通过(i)使用低纯度依匹乐酮原料来代替高纯度依匹乐酮原料,(ii) 向溶剂系统中加入相纯晶形H晶体的晶种,或者(iii)联合使用(i)和 (ii)。

A.使用杂质作为晶体生长促进剂和抑制剂

在依匹乐酮原料中存在所选杂质和其含量,而不是依匹乐酮中所有 杂质的总量在溶剂化物的去溶剂化期间实现晶形H晶体的形成潜力。所 选杂质一般是晶形H生长促进剂或晶形L生长抑制剂。所选杂质可包含 在依匹乐酮原料中,在加入依匹乐酮原料前包含在溶剂或溶剂混合物 中,和/或在加入依匹乐酮原料后加到溶剂或溶剂混合物中。Bonafede 等人,“通过在分子晶体底物上突出导向的外延的有机多晶型物的选择 性成核作用和生长”,J.Amer.Chem.SOC,117(30)(1995年8月2 日)(引入本发明以作参考)讨论了在多晶型物系统中使用生长促进剂和 生长抑制剂。对于本发明,合适的杂质一般包含具有与依匹乐酮品形H 的单晶结构基本上相同的单晶结构的化合物,杂质优选为其X-射线粉末 衍射图与依匹乐酮晶形H的X-射线粉末衍射图基本上相同的化合物,更 优选选自二环氧化物、11,12-环氧化物、9,11-烯烃和它们的组合。

制备晶形H晶体所需的杂质的量一般部分取决于溶剂或溶剂混合物 和杂质相对于依匹乐酮的溶解度。当从甲基乙基酮溶剂中结晶晶形H时, 例如二环氧化物与低纯度依匹乐酮原料的重量比一般为至少约1∶100, 优选为至少约3∶100,更优选为约3∶100至约1∶5,还更优选为约3∶100 至约1∶10。11,12-环氧化物在甲基乙基酮中的溶解度比二环氧化物高, 并且为了制备依匹乐酮晶形H晶体,通常需要更大量的11,12-环氧化 物。当杂质包含11,12-环氧化物时,该二环氧化物与低纯度依匹乐酮原 料的重量比一般为至少约1∶5,更优选为约3∶25,还更优选为约3∶25 至约1∶5。当在制备晶形H晶体的过程中既使用二环氧化物又使用 11,12-环氧化物杂质时,每种杂质与依匹乐酮原料的重量比可低于在制 备晶形H晶体的过程中仅使用一种杂质时的相应比。

太阳城集团当把包含所选杂质的溶剂化物去溶剂化时,通常会获得依匹乐酮晶 形H和晶形L的混合物。在通过将溶剂化物开始去溶剂化所获得的产物 中,晶形H的重量分数一般为低于约50%。如下所述通过结晶或蒸煮将 该产物进一步处理后,产物中晶形L的重量分数一般会增加。

B.加入晶种

晶形H晶体可通过在结晶依匹乐酮之前向溶剂系统中加入相纯晶形 H的晶种(或如上所述的晶形H生长促进剂和/或晶形L生长抑制剂)而制 得。依匹乐酮原料可以是低纯度依匹乐酮或高纯度依匹乐酮、当把由任 一种原料制得的溶剂化物去溶剂化时,晶形H在产物中的重量分数一般 为至少约70%、并且可以大至约100%。

加到溶剂系统中的晶形H晶种与加到溶剂系统中的依匹乐酮原料的 重量比一般为至少约0.75∶100,优选为约0.75∶100至约1∶20,更优选 为约1∶100至约1∶50。晶形H晶种可通过本申请中描述的太阳城集团制备晶形 H晶体的任意方法,特别是如下所述通过蒸煮制备晶形H晶体的方法制 得。

晶形H晶种可一次性加入、分多次加入、或经一段太阳城集团基本连续地 加入。然而,通常在依匹乐酮开始从溶液中结晶之前完成晶形H晶种的 加入,即在达到浊点(亚稳带低终点)前完全加入晶种。一般当溶液温度 为浊点以上约0.5℃至浊点以上约10℃,优选为浊点以上约2℃至约3 ℃时加入晶种。当加入晶种时的浊点以上的温度增加时,结晶晶形H晶 体所需的晶种加入量一般为增加。

加入晶种优选不仅可在浊点以上进行,而且也可以在亚稳带内进 行。浊点和亚稳带都取决于依匹乐酮在溶剂或溶剂混合物中的溶解度和 浓度。例如,对于甲基乙基酮的12体积稀释,亚稳带高终点一般为约 70℃至约73℃,亚稳带低终点(即浊点)为约57℃至约63℃。对于8体 积甲基乙基酮的浓度,亚稳带窄得多,这是由于溶液过饱和所致。在该 浓度下,该溶液的浊点为约75℃约76℃。因为在环境条件下甲基乙基 酮的沸点约为80℃,所以一般在约76.5℃至该沸点温度向该溶液中加 入晶种。

本文实施例7给出了加入晶形H晶种的非限制性实例。

用晶形H生长促进剂或晶形L生长抑制剂,和/或加入晶形H晶种 所获得的依匹乐酮结晶产物一般包含至少2%晶形H,优选至少5%晶形H, 更优选至少7%晶形H,还更优选至少约10%晶形H。余下的依匹乐酮结 晶产物是一般是晶形L。

太阳城集团C.通过研磨依匹乐酮制备晶形H

在另一实施方案中,已经发现少量的晶形H可通过适当地研磨依匹 乐酮而制得。已经观察到,在研磨的依匹乐酮中,晶形H的浓度高达约 3%。

D.从由低纯度依匹乐酮制得的溶剂化物制备晶形L

太阳城集团如上所述,结晶低纯度依匹乐酮以形成溶剂化物,然后将该溶剂化 物去溶剂化一般可制得包含晶形H和晶形L的产物。按照与上述制备晶 形H的方式基本上相同的方法,通过向溶剂系统中加入相纯的晶形L晶 种,或通过使用晶形L生长促进剂和/或晶形H生长抑制剂,可由低纯 度依匹乐酮制得具有较大晶形L含量的产物。加入晶种的方案以及加到 溶剂系统中的晶形L晶种的量与加到溶剂系统中的依匹乐酮原料的量的 重量比与上文太阳城集团通过加入相纯晶形H晶种来制备依匹乐酮晶形H所述 的重量比类似。

太阳城集团以该方法制得的依匹乐酮结晶产物一般包含至少10%晶形L,优选 至少50%晶形L,更优选至少75%晶形L,更优选至少90%晶形L,还更 优选至少约95%晶形L,进一步更优选基本上是相纯的晶形L。

太阳城集团本文所述太阳城集团制备依匹乐酮晶形H的加入晶种方案也可用于改善结 晶的依匹乐酮粒径的控制。

5.从溶液直接制备晶形L

依匹乐酮晶形L还可通过从合适的溶剂或溶剂混合物中直接结晶依 匹乐酮来制得,而不用形成溶剂化物中间体和所伴随需要的去溶剂化。 一般情况下,(i)溶剂具有与溶剂化物晶格中的可用通道空间不相容的 分子大小,(ii)依匹乐酮的所存在的任何杂质在升高的温度下能溶于该 溶剂中,(iii)冷却导致结晶出非溶剂化的依匹乐酮晶形L。在室温下, 依匹乐酮在溶剂或溶剂混合物中的溶解度一般为约5至约200mg/ml。所 述溶剂或溶剂混合物优选包含一种或多种选自甲醇、乙酸乙酯、乙酸异 丙酯、乙腈、硝基苯、水和乙基苯的溶剂。

为了直接从溶液中结晶出依匹乐酮晶形L,将一定量的依匹乐酮原 料溶解在一定体积的溶剂中,并冷却直至形成晶体。向溶剂中加入依匹 乐酮时的溶剂温度一般是根据该溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线来选 择。对于本文所描述的大多数溶剂,该溶剂温度一般为至少约25℃,优 选约30℃至该溶剂的沸点温度,更优选为低于该溶剂沸点约25℃的温 度至该溶剂的沸点温度。

太阳城集团或者,可将热溶剂加到依匹乐酮并可以将该混合物冷却直至形成晶 体。向依匹乐酮中加入溶剂时的溶剂温度一般是根据该溶剂或溶剂混合 物的溶解度曲线来选择。对于本文所描述的大多数溶剂,该溶剂温度一 般为至少约25℃,优选约50℃至该溶剂的沸点温度,更优选为低于该 溶剂沸点约15℃的温度至该溶剂的沸点温度。

与给定体积的溶剂混合的依匹乐酮原料的量同样取决于该溶剂或 溶剂混合物的溶解度曲线。一般情况下,加到溶剂中的依匹乐酮的量在 室温下在该体积的溶剂中不能完全溶解。对于本文所描述的大多数溶 剂,与给定体积的溶剂混合的依匹乐酮原料的量通常为在室温时所能在 该体积的溶剂中溶解的依匹乐酮的量的至少约1.5至约4.0倍,优选为 约2.0至约3.5倍,例如更优选为约2.5倍。

太阳城集团为了保证制得包含基本上相纯的晶形L的产物,依匹乐酮原料一般 是高纯度原料。依匹乐酮原料优选具有至少约65%纯度,更优选具有至 少约90%纯度,还更优选具有至少约98%纯度,最优选具有至少约99% 纯度。

在依匹乐酮原料已经完全溶解在溶剂中之后,通常将该溶液缓慢地 冷却以结晶出依匹乐酮晶形L。对于本文所描述的大多数溶剂,例如以 低于约1.0℃/分钟的速度,优选以约0.2℃/分钟或更低的速度,更优 选以约5℃/分钟至约0.1℃/分钟的速度冷却该溶液。

太阳城集团收获晶形L的终点温度取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲线。对 于本文所描述的大多数溶剂,该终点温度一般为低于约25℃,优选低于 约5℃,更优选低于约-5℃。

或者,可使用其它技术来制备溶剂化物。这样的技术的实例包括但 不限于(i)将依匹乐酮原料溶解在一种溶剂中,并加入助溶剂来促进依 匹乐酮晶形L的结晶,(ii)依匹乐酮晶形L的蒸气扩散生长,(iii)通 过蒸发例如旋转蒸发分离出依匹乐酮晶形L,和(iV)浆液转化。

太阳城集团可通过任意合适的常规手段例如过滤或离心来将如上所述制得的 依匹乐铜晶形L的晶体从溶剂中分离出来。

太阳城集团此外,依匹乐酮晶形L可通过将高纯度依匹乐酮在甲基乙基酮中的 桨液蒸煮(如下所述),并在该浆液的沸点温度下过滤蒸煮的依匹乐酮来 制得。

6.从溶液中直接制备晶形H

太阳城集团据假定,如果在晶形H和晶形L的互变转变温度(Tt)以上进行结晶, 特别是如果存在晶形H生长促进剂或晶形L生长抑制剂或者加入相纯的 晶形H晶种,晶形H将直接从溶液中结晶出来,这是因为晶形H在这些 较高温度条件下更稳定的缘故。优选使用的溶剂系统包含高沸点溶剂例 如硝基苯。合适的晶形H生长促进剂包括但不限于如上所述的二环氧化 物和11,12-烯烃。

太阳城集团7.用A溶剂蒸煮依匹乐酮

依匹乐酮的溶剂化晶形、晶形H和晶形L也可通过将依匹乐酮原料 在合适的溶剂或溶剂混合物中蒸煮而制得。在该蒸煮方法中,依匹乐酮 浆液在溶剂或溶剂混合物沸点下加热,例如,将一定量的依匹乐酮原料 与一定体积的溶剂或溶剂混合物合并,加热至回流,除去馏出液,同时 再加入一定量的溶剂和除去馏出液。或者,可将馏出液冷凝并循环使用, 这样在蒸煮操作期间就不用再另外加入溶剂。一般情况下,一旦初始体 积的溶剂已经被除去或者冷凝和循环,即将浆液冷却,并形成了溶剂化 晶形。可通过任意常规手段例如过滤或离心来将溶剂化的晶体从溶剂中 分离出来。根据该溶剂化的晶体中存在还是不存在所选杂质,如上所述 将溶剂化物去溶剂化可生成依匹乐酮晶形H或晶形L。

合适的溶剂或溶剂混合物一般包含一种或多种上述溶剂。溶剂可选 自例如甲基乙基酮和乙醇。

在蒸煮操作中,加到所用溶剂中的依匹乐酮原料的量一般是足以在 该溶剂或溶剂混合物的沸点温度下保持浆液(即依匹乐酮在溶剂或溶剂 混合物中不能完全溶解)的量。示例性的值包括但不限于之约1克依匹 乐酮每4升甲基乙基酮和大约1克依匹乐酮每8升乙醇。

通常一旦溶剂周转(turnover)完全后,即把浆液缓慢地冷却以结晶 出依匹乐酮的溶剂化晶形。对于测试溶剂,以低于约20℃/分钟,优选 约10℃/分钟或更低,更优选约5℃/分钟或更低,还更优选约1℃/分钟 或更低的速度冷却该浆液。

收获溶剂化晶形的终点温度取决于溶剂或溶剂混合物的溶解度曲 线。对于本文所描述的大多数溶剂,该终点温度一般为低于约25℃,优 选低于约5℃,更优选低于约-5℃。

如果需要主要包含或仅包含晶形L的产物,通常将高纯度依匹乐酮 原料蒸煮。所述高纯度依匹乐酮原料优选具有至少约98%纯度,更优选 至少约99%纯度,还更优选至少约99.5%纯度。以该方式制得的依匹乐 酮蒸煮产物一般包含至少约10%晶形L,优选至少约50%晶形L,更优选 至少约75%晶形L,还更优选至少约90%晶形L,再更优选至少约95%晶 形L,最优选基本上是相纯的晶形L。

如果需要主要包含或仅包含晶形H的产物,通常将低纯度依匹乐酮 原料蒸煮。低纯度依匹乐酮原料通常包含为了生成晶形H最小必需量的 晶形H生长促进剂和/或品形L生长抑制剂。该低纯度依匹乐酮原料优 选具有至少约65%纯度,更优选至少约75%纯度,还更优选至少约80% 纯度。以该方式制得的依匹乐酮蒸煮产物一般包含至少约10%晶形H, 优选至少约50%晶形H,更优选至少约75%晶形H,还更优选至少约90% 晶形H,再更优选至少约95%晶形H,最优选基本上是相纯的晶形H。

太阳城集团8.制备无定形依匹乐酮

无定形依匹乐酮可通过将依匹乐酮固体合适粉碎,例如通过压碎、 研磨和/或微粉化将依匹乐酮固体粉碎来少量制得。相纯的无定形依匹 乐酮,即基本上不含依匹乐酮晶体的无定形依匹乐酮可通过例如将依匹 乐酮溶液、特别是依匹乐酮水溶液冷冻干燥而制得。以下实施例13和 14举例说明了这些方法。

工作实施例

下述实施例详细描述了制备本文所述的各种固态形式依匹乐酮的 方法。这些详细描述在本发明范围内,并用于对本发明进行举例。这些 详述的提供仅用于例示目的,而不意在限制本发明的范围。除非另外指 出,否则所有百分比都是按重量计,温度以摄氏度计。在每一下述实施 例中使用的依匹乐酮原料都是依据上文引用的Ng等人的国际专利出版 物WO98/25948的方案1制备的。

太阳城集团实施例1:由高纯度依匹乐酮原料制备(a)甲基乙基酮溶剂化物和由 所得的溶剂化物制备(b)依匹乐酮晶形L

太阳城集团A.制备甲基乙基酮溶剂化物

太阳城集团在900rpm的磁搅拌下,通过在电热板上加热至沸将高纯度依匹乐 酮(437mg;纯度>99%,二环氧化物和11,12-环氧化物的的存在<0.2%) 溶于10ml甲基乙基酮。在持续的磁搅拌下,将所得溶液冷却至室温。 一旦达到室温,就把该溶液转移到1℃浴中,并继续搅拌1小时。1小 时后,通过真空过滤从该冷溶液中收集甲基乙基酮溶剂化物固体。

B.制备依匹乐酮晶形L

将如上所述制得的甲基乙基酮溶剂化物固体在烘箱中于100℃、常 压下干燥4小时。通过DSC和XPRD分析证实了该干燥的固体是纯晶形L。

实施例2:由高纯度的原料制备另外的溶剂化物

太阳城集团按照基本上与实施例1相同的方法,分别用下述溶剂代替甲基乙基 酮制备另外的溶剂化物:正丙醇、2-戊酮、乙酸、丙酮、乙酸丁酯、氯 仿、乙醇、异丁醇、乙酸异丁酯、异丙醇、乙酸甲酯、丙酸乙酯、正丁 醇、正辛醇、乙酸丙酯、丙二醇、叔丁醇、四氢呋喃和甲苯,并基本上 如以上实施例1步骤A所述完成结晶。由每一种基本上如实施例1步骤 B所述的溶剂化物形成晶形L依匹乐酮。

太阳城集团实施例3:通过蒸气扩散生长制备甲基乙基酮溶剂化物

通过在电热板上温热将依匹乐酮(400mg,纯度>99.9%)溶于20ml 甲基乙基酮中,以形成贮备液。将8ml量的贮备液转移到第一个20mL 闪烁瓶中,并用甲基乙基酮(80%)稀释成10ml。将10ml量的贮备液转 移到第二个20ml闪烁瓶中,并用用甲基乙基酮(40%)稀释成10ml。用 甲基乙基酮(20%)将最终2ml量的贮备液稀释至10ml。将4个包含稀释 液的瓶转移到含有少量作为抗溶剂的己烷的干燥器缸中。将该干燥缸密 封,并使得己烷蒸气扩散到甲基乙基酮溶液中。依匹乐酮甲基乙基酮溶 剂化物的晶体在80%稀释样品中生长直至第二天。

实施例4:通过旋转蒸发仪制备依匹乐酮溶剂化物晶体

称重约400mg依匹乐酮(纯度>99.9%)置于250ml圆底烧瓶中,将溶 剂(150ml)加到该烧瓶中,如果需要的话将溶液轻微加热直至依匹乐酮 溶解。将所得澄清溶液置于具有约85℃浴温的Buchi旋转蒸发仪中。当 烧瓶中剩余约10ml溶剂时停止除去溶剂。通过适当方法(例如XPRD、 DSC、TGA显微镜法等)分析所得固体以确定晶形。

实施例5:浆液转化

将大约150mg依匹乐酮晶形L和150mg依匹乐酮晶形H加到5ml乙 酸乙酯中。将所得浆液在300rpm下(磁搅拌)过夜。第一天通过过滤收 集所得固体样品。通过XPRD分析样品,结果表明该样品完全由依匹乐 酮晶形L组成。

实施例6:由低纯度依匹乐酮原料制备(a)溶剂化物和由所得的溶剂 化物制备(b)依匹乐酮晶形H

通过将所需量的杂质与足以提供100mg总样品质量的一定量依匹乐 酮一起加到7ml闪烁瓶中来制备含有不同量杂质4α,5α,9α,11α-二环 氧-17-羟基-3-氧代-17α-孕-7α,21-二甲酸氢7-甲酯,(γ-内酯(“二环 氧化物”)或杂质11α,12α-环氧-17-羟基-3-氧代-17α-孕-4-烯-7α,21- 二甲酸氢7-甲酯,(γ-内酯(“11,12-环氧化物”)的样品。各样品中二 环氧化物或11,12-环氧化物的重量百分比分别如表X-6A和X-6B所示。 向每一闪烁瓶中加入微型磁搅拌器和1ml甲基乙基酮。将闪烁瓶松松地 封盖,通过在磁搅拌下在电热板上加热至回流将固体溶解。当溶解完成 时,在热板上将溶液冷却至室温。在冷却期间保持磁搅拌。在溶液达到 室温后,通过真空过滤收集固体,并立即通过X-射线粉末衍射(XPRD) 分析。然后将固体置于100℃烘箱中,并在常压下干燥1小时。通过XPRD 分析干燥的固体,通过监测在约12.1°2θ的晶形H衍射峰的面积确定晶 形H含量。所有XPRD衍射图都是在Inel Multlpufpose衍射仪上记录 的。

                            表X-6A  11,12-环氧化物重量百分比     依匹乐酮重量(mg)     11,12-环氧化物重量(mg)     0%     100.44     --     1%     99.08     1.24     2%     98.09     2.24     3%     97.08     3.04     5%     95.09     5.04

太阳城集团                                   表X-6B  11,12-环氧化物重量百分比     依匹乐酮重量(mg) 11,12-环氧化物重量(mg)     0%     101.38     0     1%     99.23     1.10     5%     94.97     5.36     10%     90.13     10.86

A.二环氧化物结果

图13显示了得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)3%和(d)5%二环氧化物 的甲基乙基酮结晶的甲基乙基酮溶剂化物湿饼(甲基乙基酮溶剂化物) 的X-射线粉末衍射图。为了便于比较,已经将峰强度进行了标准化 (normalized)。在衍射圈中没有任何晶形H或二环氧化物的特征峰。该 图是依匹乐酮甲基乙基酮溶剂化物的特征。

图14显示了得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)3%和(d)5%二环氧化物 的甲基乙基酮结晶干燥固体的X-射线粉末衍射图。为了便于比较,已经 将峰强度进行了标准化。在与其中二环氧化物的掺杂水平为0%或1%的 甲基乙基酮结晶相对应的干燥样品中没有检测到任何晶形H。在与其中 掺杂水平为3%或5%的甲基乙基酮结晶相对应的干燥样品中检测到了晶 形H。对于每一样品,在约12.1°2θ的晶形H衍射峰的面积和所估算的 晶形H含量如下表X-6C所示。

太阳城集团                                  表X-6C 原料依匹乐酮混合物 中二环氧化物的重量     百分比 所得结晶中二环氧化   物的重量百分比     (HPLC) 在12°2θ的晶形H峰     面积 估算的晶形H的重量     百分比     0%     ---     未检测到     未检测到     1%     0.29%     未检测到     未检测到     3%     0.58%     1168     10%     5%     1.05%     4175     30%

表X-6C中报告的结果证实了在去溶剂化期间存在二环氧化物影响 依匹乐酮晶形H的形成。当把二环氧化物掺入到和/或吸附到甲基乙基 酮溶剂化物晶体上时,诱导了晶形H的形成。

进行第二个3%二环氧化物掺杂实验以分析制备途径对去溶剂化期 间所形成的晶形H量的影响。在此实验中,将由掺杂结晶获得的甲基乙 基酮溶剂化物分成两部分。第一部分不处理,第二部分在研钵中用研棒 轻轻地研磨,以诱导出较高水平的晶体缺损。将这两部分都在常压下于 100℃干燥1小时。通过XPRD分析干燥的固体。图15显示了从掺入3% 二环氧化物的甲基乙基酮结晶获得的干燥固体的XPRD图,其中(a)是干 燥前没有研磨该溶剂化物,(b)是干燥前研磨了该溶剂化物。XPRD图表 明,与未研磨的样品相比,研磨的样品中含有更多的晶形H。这些结果 表明,分离和处理甲基乙基酮溶剂化物的条件可影响去溶剂化所形成的 晶形。

太阳城集团B.11,12-环氧化物结果

图16显示了得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)5%和(d)10%的11,12- 环氧化物的甲基乙基酮结晶的湿饼(甲基乙基酮溶剂化物)的X-射线粉 末衍射图。为了便于比较,已经将峰强度进行了标准化。在衍射图中没 有任何晶形H或11,12-环氧化物的特征峰。该图是依匹乐酮甲基乙基酮 溶剂化物的特征。

图17显示了得自掺入了(a)0%、(b)1%、(c)5%和(d)10%11,12-环 氧化物甲基乙基酮结晶干燥固体的X-射线粉末衍射图。为了便于比较, 已经将峰强度进行了标准化。在与掺杂水平为0%、1%或5%的甲基乙基 酮结晶相对应的干燥样品中没有检测到任何晶形H。在与掺杂水平为10% 的甲基乙基酮结晶相对应的干燥样品中检测到了晶形H。对于每一样品, 在约12.1°2θ的晶形H衍射峰的面积和所估算的晶形H含量如表X-6D 所示。

                                      表X-6D 原料依匹乐酮混合物 中11,12-环氧化物的     重量百分比 所得结晶中11,12-环 氧化物的重量百分比     (HPLC) 在12°2θ的晶形H峰     面积 估算的晶形H的重量     百分比     0%     不可得到     未检测到     未检测到     1%     不可得到     未检测到     未检测到     5%     不可得到     未检测到     未检测到     10%     不可得到     1541     10-15%

表X-6D中报告的结果证实了在去溶剂化期间存在11,12-环氧化物 影响依匹乐酮晶形H的形成。对于诱导形成依匹乐酮晶形H所需的甲基 乙基酮结晶中的杂质水平,11,12-环氧化物似乎要大于二环氧化物。

太阳城集团实施例7:结晶和干燥对最终晶形的影响

太阳城集团进行下述4个实验以分析结晶和干燥对最终晶形的影响:(i)依匹 乐酮的甲基乙基酮结晶(23+3统计设计实验),(ii)低质量母液残余物的 结晶,(iii)加入晶形H晶种的高纯度依匹乐酮的结晶,和(iV)加入晶 形L晶种的低纯度依匹乐酮的结晶。这些实验中的变量包括冷却速度、 原料纯度水平和结晶的终点温度。为此实施例目的,高纯度依匹乐酮定 义为超纯研磨过的依匹乐酮(HPLC分析表明这种材料为100.8%纯),低 纯度依匹乐酮定义为纯度为89%的依匹乐酮。为了制备低纯度依匹乐酮, 将在制备依匹乐酮的过程中汽提所获得的母液分析,并混合以获得含有 61.1%依匹乐酮、12.8%二环氧化物和7.6%11,12-环氧化物的材料。然 后将该材料与足量高纯度依匹乐酮混合以获得纯度为89%的依匹乐酮。

A.甲基乙基酮结晶

在该甲基乙基酮结晶实验中,所有批次都是用60g高纯度依匹乐酮 进行的。高终点定义为45℃,低终点定义为5℃。高冷却速度定义为3 ℃/分钟,低冷却速度定义为0.1℃/分钟。中点是1.5℃/分钟冷却速度, 纯度为94.5%的依匹乐酮和25℃终点。

用FTIR进行背景读数后,将250ml甲基乙基酮置于1升Mettler RC, MP10反应器中,并以100rpm搅拌。扫描几次后,向该反应器中加入依 匹乐酮,然后再加入470ml甲基乙基酮。将搅拌速度提高至500rpm以 悬浮固体,并将该批温度增加至80℃。将该批的温度保持在80℃以保 证依匹乐酮溶解。在所得透明溶液中一般可看见黑色或白色斑点。然后 通过斜坡冷却以所需速度将该批温度降至所需的终点,在该终点温度保 持1小时,然后将其倒入移液瓶中并过滤,获得了湿饼。然后用120ml 甲基乙基酮洗涤该反应器、移液瓶和湿饼。一但洗液穿过湿饼,就停止。 对于每份样品,将约10g湿饼在真空烘箱中于75℃、轻氮气混合的标准 条件下真空干燥。对于下述的“高、高、高”和“低、低、低”实验, 在高和低条件下进行流化床干燥。高条件定义为100℃、安装4个风机, 而低条件定义为40℃、安装1个风机。

太阳城集团B.结晶低质量母液残余物

在结晶低质量母液残余物的实验中,将60g 61.1%纯度的依匹乐酮 和720ml甲基乙基酮直接加到1升Mettler RC-1,MP10反应器中。在 加到反应器中之前,纯度61.1%的依匹乐酮与高纯度依匹乐酮并不混合。 将所得混合物加热至80℃,其在室温呈不透明的浆液。继续结晶,在迅 速冷却条件下于45℃过滤该混合物。

C.加入晶形H晶种

在加入晶形H晶种的实验中,将60g高纯度依匹乐酮(100.8%)和 720ml甲基乙基酮加到1升Mettler RC-1,MP10反应器。将该混合物 加热至80℃,然后以1.5℃/分钟的速度冷却至25℃。当溶液冷却至62 ℃时,向其中加入3g相纯的晶形H晶体以引发结晶。所述晶形H晶种 是通过在下述实施例9中的蒸煮法制得的。

D.加入晶形L晶种

太阳城集团在加入晶形L晶种的实验中,将66.6g 89.3%的依匹乐酮(通过将 48.3g纯度100%依匹乐酮与18.3g纯度61.1%的依匹乐酮混合而制得的) 和720ml甲基乙基酮加到1升Mettler RC-1,MP10反应器中。将该混 合物加热至80℃,然后以1.5℃/分钟的速度冷却至25℃。当溶液冷却 至63℃时,向其中加入3g相纯的晶形L晶体以引发结晶。所述晶形L 晶种是通过在实施例1中所述的结晶和去溶剂化方法制得的。

太阳城集团这些实验所得结果报告在表X-7A中。在n+1结晶实验中,只有当 使用含有二环氧化物的低纯度依匹乐酮时才检测到晶形H。在更高的冷 却速度下还观察到终产物中二环氧化物的水平增加。

太阳城集团结晶低质量母液残余物的实验生成了低质量原材料,通过X-射线粉 末衍射分析发现其似乎是二环氧化物与晶形H的混合物。

太阳城集团在加入晶形H晶种的实验(使用高纯度依匹乐酮,加入晶形H晶种) 生成的产物中,根据X-射线粉末衍射分析其含有77%晶形H,但是根据 DSC其全部是晶形H。然而,对于超过约15%晶形H的线性,XPRD模型 从没有测试过。在这4个实验当中,该实验是唯一一个不存在二环氧化 物即生成晶形H的实验。

加入晶形L晶种的实验(使用低纯度依匹乐酮,加入晶形L晶种)生 成了全部是晶形L的产物。

太阳城集团对于依匹乐酮的高条件流化床干燥,所得数据似乎与真空烘箱干燥 所得数据相一致。从低条件流化床干燥所获得的结果与真空烘箱干燥所 得结果不同。

                                                表X-7A 冷却速   度 冷却终   点2   杂质水平3 成核温度     (℃) 11,12-环 氧化物4重 量百分比 二环氧化 物4重量百   分比   去溶剂化   晶体的分      析 百分产率   晶形H重   量百分比    (XPRD)     +     +     -     57.0     ND     ND     100.3     66.1     ND     +     -     -     54.9     ND     ND     100.3     98.1     ND     -     +     -     60.9     ND     ND     100.3     ND     -     -     -     63.4     ND     ND     100.5     79.3     ND     +     +     ++     N/A     4.8     36.6     43.3     27     1005     +     +     +     52.2     0.49     0.88     98.3     62     29     +     -     +     53.3     0.56     1.0     98.1     87     9     0     0     0     59.0     0.18     0.36     99.4     75     5     -     +     +     63.3     0.20     0.44     99.4     36     31     -     -     +     61.4     0.18     0.40     99.5     87     ND     0     0     0     60.6     0.18     0.36     99.5     79.2     ND     0     0     0     55.9     0.38     0.80     98.6     80.5     <3%     0     0 100.8%加入晶 形H晶种的依   匹乐酮     0.03     ND     100.4     82.2     77/1006     0     0 89.3%加入晶 形L晶种的依   匹乐酮     0.33     0.50     97.5     80.2     ND

1冷却速度:(+)=3℃/分;(0)=1.5℃/分;和(-)=0.1℃/分。

2冷却终点:(+)=45℃;(0)=25℃;和(-)=5℃。

太阳城集团3杂质水平:(+)=89.3%纯依匹乐酮原料;(++)=61.1%纯依匹乐 酮原料;(0)=100.8%纯依匹乐酮原料;和(-)=94.5%纯依匹乐酮原料。

太阳城集团4将溶剂化物在真空烘箱中于75℃干燥后的重量百分比

太阳城集团5通过XPRD分析发现似乎是晶形H与二环氧化物的混合物

太阳城集团6通过XPRD分析似乎是77%晶形H和通过DSC分析似乎是100%晶形 H。

A.材料纯度

图18显示了基于在表X-7A所报告的数据的产物纯度、原料纯度、 冷却速度和终点温度的立方图。该立方图表明,在开始结晶时使用较高 纯度依匹乐酮能生成较高纯度产物。结晶的终点温度对产物纯度的影响 似乎不大。然而,冷却速度显得有影响,较快冷却速度导致生成了纯度 稍低的产物。实际上,在较快的冷却速度下,二环氧化物的水平一般较 高。

图19表示的是,为了确定对终产物的纯度具有统计显著影响的变 量(如果有的话),用该立方图结果绘制的半标准图。原料纯度对产物纯 度有最大的统计显著影响,而冷却速度的影响以及冷却速度与原料纯度 之间的相互作用也有统计学显著性。

图20是基于这些结果的相互作用图,其表示的是原料纯度与冷却 速度之间的相互作用对产物纯度的影响。当使用高纯度依匹乐酮 (100.8%依匹乐酮原料)时,冷却速度看上去对最终纯度的影响很小或没 有任何影响。然而,当使用低纯度依匹乐酮(89.3%依匹乐酮原料)时, 随着冷却速度的增加产物纯度下降了。该结果表明,当在较高冷却速度 进行结晶时,会结晶出更多的杂质。

B.晶形H含量

太阳城集团图21表示的是基于表X-7A所报告数据的晶形H重量分数、原料纯 度、冷却速度和终点温度的立方图。该立方图表明,在开始结晶时使用 较高纯度的依匹乐酮会得到较少量的晶形H。结晶的终点温度似乎也对 终产物的形式有影响。冷却速度看上去对晶形H的形成影响不大,虽然 在杂质存在下,在低的终点温度以较快速度冷却会生成一些晶形H。

图22表示的是,为了确定对终产物中晶形H含量具有统计显著影 响的变量(如果有的话),用该立方图结果绘制的半标准图。看上去原料 纯度、结晶的终点温度、以及这两个变量之间的相互作用有统计显著影 响。

当使用高纯度依匹乐酮(100.8%依匹乐酮原料)时,看上去终点温度 对晶形H含量影响很小。在使用纯依匹乐酮的两个实验中都没有生成任 何晶形H。然而,当使用低纯度依匹乐酮(89.3%依匹乐酮原料)时,在两 个实验中都生成了晶形H,并且在较高终点温度显著生成了更多的晶形 H。

表X-7B报告了在使用流化床(Lab-Line/P.R.L.Hi-Speed流化床 干燥器,Lab-LineInstruments,Inc)或真空烘箱(Baxter Scientific Products真空干燥烘箱,型DP-32)干燥的材料中测定的晶形H的重量分 数。对于在高流化床或真空烘箱中干燥的可比的材料,观测到了类似的 晶形H含量。然而,对于在低流化床中干燥的可比的材料,所观测到的 结果与真空烘箱不同。

太阳城集团                             表X-7B   冷却速度     终点   杂质水平   干燥类型   晶形H重量百分比     高     高     高   真空烘箱     29%     高     高     高   高流化床     25%     高     高     高   低流化床     4.7%     低     低     低   真空烘箱     ND     低     低     低   高流化床     ND     低     低     低   低流化床     5.5%

实施例8:从甲基乙基酮中结晶晶形H和晶形L的混合物以制备溶 剂化物,并(b)去溶剂化溶剂化物以制备晶形L

将依匹乐酮晶形H(10g)与80ml甲基乙基酮合并。将该混合物加热 至回流(79℃),并在该温度下搅拌约30分钟。然后通过将该浆液在65 ℃、50℃、35℃和25℃分别保持90分钟来将所得浆液以逐步、停点 (holdPoint)的方式冷却。过滤该浆液,并用约20ml甲基乙基酮洗涤。 将所分离出的固体首先在滤器上干燥,并然后在真空烘箱中于40-50℃ 干燥。在真空烘箱中于90-100℃完成干燥。以82%的收率获得了去溶剂 化的固体。XPRD、MIR和DSC证实了该固体具有晶形L晶体结构。

实施例9:用溶剂蒸煮低纯度依匹乐酮原料来制备晶形H

A.用乙醇溶剂蒸煮

将低纯度依匹乐酮(24.6g,HPLC测定的纯度为64%)与126ml乙醇 3A合并。将该浆液加热至回流,并除去馏出液。当126ml溶剂通过常压 蒸馏被除去时,同时加入126ml乙醇3A。溶剂周转完成后,将该混合物 冷却至25℃并搅拌1小时。将所得固体过滤,并用乙醇3A洗涤,然后 风干,获得了乙醇合物。将该溶剂化物在真空烘箱中于90-100℃进一步 干燥6小时,获得了14.9g依匹乐酮晶形H。

太阳城集团B.用甲基乙基酮溶剂蒸煮

太阳城集团在另一蒸煮方法中,将1克低纯度依匹乐酮(纯度大约为65%)在4ml 甲基乙基酮中蒸煮2小时,然后将该混合物冷却至室温。一旦冷却,即 通过真空过滤收集所得固体,并通过XPRD分析证实了其为甲基乙基酮 溶剂化物。将该固体在100℃干燥30-60分钟。XPRD证实该干燥的固体 是纯的晶形H。

实施例10:用溶剂蒸煮高纯度依匹乐酮原料来制备晶形L

A.用乙醇溶剂蒸煮

太阳城集团将高纯度依匹乐酮(1克)在8ml乙醇中蒸煮大约2小时。然后将该 溶液冷却至室温,并通过真空过滤收集固体。过滤后立即通过XPRD分 析该固体,结果表明该固体是溶剂化物(假定是乙醇溶剂化物)。然后将 该固体在100℃于常压下干燥30分钟。通过XPRD分析该干燥的固体, 结果证实了其主要是晶形L(没有检测到任何晶形H)。

B.用甲基乙基酮溶剂蒸煮

将高纯度依匹乐酮(1克)在4ml甲基乙基酮中蒸煮大约2小时。然 后将该溶液冷却至室温,并通过真空过滤收集固体。立即通过XPRD分 析该固体,结果表明该固体是溶剂化物(假定是甲基乙基酮溶剂化物)。 然后将该固体在100℃于常压下干燥30-60分钟。通过XPRD分析该干 燥的固体,结果证实了其主要是晶形L,不存在到任何晶形H衍射峰。

实施例11:从溶液中直接结晶晶形L

方法A:通过加热至75℃将2.5g依匹乐酮溶于乙酸乙酯中。将该 溶液在75℃保持30分钟以确保溶解完全,然后以1℃/分钟的冷却速度 冷却至13℃。用架空式搅拌器以750rPm将所得浆液搅拌2小时。通过 真空过滤收集固体,并在真空烘箱中于40℃干燥1小时。该固体的XPRD 图和DSC差示热分析图是依匹乐酮晶形L的特征。该固体的热重分析 (TGA)表明,在最高达200℃该固体没有重量损失。

方法B:在一个可选择的方法中,通过在磁搅拌下在电热板上加热 将2g依匹乐酮溶于350ml 15%乙腈和85%水的混合物中。一旦依匹乐酮 已经溶解,在磁搅拌下将该溶液于室温冷却过夜,通过真空过滤收集所 得固体。该晶体有双折射效应,并具有三角形片状晶体习性,该固体具 有依匹乐酮晶形L的XPRD和DSC分析特征。TGA表明在最高达200℃也 没有任何重量损失。

方法C:在一个可选择的方法中,将640mg依匹乐酮置于具有20ml 乙基苯的50ml烧瓶中。将所得浆液加热至116℃,该混合物变成了澄清 溶液,然后用30分钟将其冷却至25℃。在冷却期间在84℃开始成核。 将所得固体从该溶液中过滤出来,风干,获得了530mg固体(收率83%)。 热台(Hot-stage)显微镜检查和XPRD证实了该固体是依匹乐酮晶形L。

方法D:在一个可选择的方法中,将1.55g依匹乐酮加到20ml硝基 苯中并加热至200℃。将所得浆液在200℃搅拌过夜,该混合物变成了 澄清溶液,然后通过自然空气对流将其冷却至室温以分离出固体。通过 XPRD和偏振光显微镜证实了该固体是依匹乐酮晶形L。

方法E:在一个可选择的方法中,将5.0g依匹乐酮(纯度>99%)加到 82g(104ml)甲醇中。在搅拌作用(210rpm)下,将该溶液加热至60℃, 并在该温度下保持20分钟以确保完全溶解。然后在搅拌下以0.16℃/ 分钟的速度将该溶液冷却至-5℃。通过过滤收集所得固体,并在真空烘 箱中于40℃真空干燥20小时。DSC和XPRD分析证实了该干燥的固体是 纯的依匹乐酮晶形L。

太阳城集团方法F:在一个可选择的方法中,将6.0g依匹乐酮(含有9%乙醇的 乙醇合物,其校正纯度为95.2%)加到82g(104ml)甲醇中。在搅拌作用 (210rpm)下,将该溶液加热至60C,并在该温度下保持20分钟以确保 完全溶解。然后以0.14℃/分钟的速度将该溶液冷却至50℃,并在该温 度下保持2.5小时。然后在搅拌下以0.13℃/分钟的速度将该溶液冷却 至-5℃。通过过滤收集晶体,并在真空烘箱中于40℃真空干燥16小时。 DSC和XPRD分析证实了该干燥的固体是纯的依匹乐酮晶形L。

太阳城集团实施例12:从溶液中直接结晶晶形H

太阳城集团将150.5mg二环氧化物和2.85g依匹乐酮加到1.5ml硝基苯中。将 该混合物在200℃下磁搅拌几小时。然后通过自然空气对流将所得浆液 冷却至室温。将样品干燥并通过偏振光显微镜和XPRD分析样品。XPRD 分析表明该样品是晶形H与晶形L的混合物。该晶体在显微镜下是半透 明的,这表明没有发生去溶剂化(和转化成晶形H或晶形L)。

实施例13:通过粉碎制备无定形依匹乐酮

太阳城集团将大约1半钢制Wig-L-Bug容器填充上约60g依匹乐酮(纯度 >99.9%)。将钢球和盖放在该样品容器上,并通过该Wig-L-Bug装置搅 拌30秒。将依匹乐酮从该Wig-L-Bug容器的表面上刮下来,并将该容 器再搅拌30秒。通过XPRD和DSC分析所得固体,发现该固体是无定形 依匹乐酮和依匹乐酮晶形L的混合物。

实施例14:通过冻干制备无定形依匹乐酮

太阳城集团称重约100mg依匹乐酮粗品置于含有400ml水的烧杯中。将溶液轻 微加热5分钟,然后超声处理,并再搅拌5分钟。将大约350ml依匹乐 酮溶液过滤到含有50ml HPLC水的1000ml圆底烧瓶中。将该溶液于干 冰/丙酮浴中迅速冷冻1-2分钟。将烧瓶连接到Labconco Freezone 4.5 冷冻干燥器上,并将其中的内容物干燥过夜。将烧瓶中的固体转移到棕 色小瓶中。在偏振光显微镜下于10×、1.25×optivar放大倍数观察在 cargille油(1.404)中的小等分试样,并观察到至少有95%无定形依匹 乐酮。图24和25显示了无定形依匹乐酮的XPRD图和DSC差示热分析 图。在图24中,在39°2θ观察到的峰是由于铝样品容器所致。

实施例15:依匹乐酮多晶型物组合物

太阳城集团制备含有25mg、50mg、100mg和200mg剂量依匹乐酮晶形L的片剂, 且其具有以下组成: 成分 片剂的重量% 依匹乐酮晶形L 29.41 依匹乐酮晶形H 未检测到 乳糖一水合物(#310,NF) 42.00 微晶纤维素(NF,Avicel PH101) 18.09 交联羧甲基纤维素钠(NF,Ac-Di-Sol) 5.00 羟基丙基甲基纤维素(#2910,USP,Pharmacoat 603) 3.00 月桂基硫酸钠(NF) 1.00 滑石(USP) 1.00 硬脂酸镁(NF) 0.5 总量 100.00

实施例16:依匹乐酮多晶型物组合物

制备含有100mg剂量依匹乐酮并具有以下组成的胶囊(明胶胶囊, #0) 成分 量(mg) 依匹乐酮晶形L 90.0 依匹乐酮晶形H 10.0 乳糖,含水,NF 231.4 微晶纤维素,NF 45.4 滑石,USP 10.0 交联羧甲基纤维素钠,NF 8.0 月桂基硫酸钠,NF 2.0 胶体二氧化硅,NF 2.0 硬脂酸镁,NF 1.2 总胶囊填充重量 400.0

实施例17:依匹乐酮多晶型物组合物

制备含有200mg剂量依匹乐酮、并具有以下组成的胶囊(硬明胶胶 囊,大小#0)。 成分 量(mg) 依匹乐酮晶形L 190.0 依匹乐酮晶形H 10.0 乳糖,含水,NF 147.8 微晶纤维素,NF 29.0 滑石,USP 10.0 交联羧甲基纤维素钠,NF 8.0 月桂基硫酸钠,NF 2.0 胶体二氧化硅,NF 2.0 硬脂酸镁,NF 1.2 总胶囊填充重量 400.0

实施例18:依匹乐酮细粉的制备

首先,将干燥的依匹乐酮甲基乙基酮溶剂化物在FitZ碾磨机上经 由20目筛网过筛以使其解块。然后,以约250kg/小时的加料速度在液 氮冷却下使用Alpine Hosakawa柱栓圆盘针式研磨(stud disk pin mil) 粉碎操作对解块的固体进行针式研磨、针式研磨后的依匹乐酮的D90粒 径为大约65-100微米。

受试者群体:

某些小组更易患调节醛固酮作用的疾病。这些对醛固酮敏感的小组 成员一般还对盐敏感,其中个体的血压通常分别随钠消耗的增加和减少 而升高和降低。虽然不应将本发明理解为限于这些小组的实施,但考虑 这些受试者小组可能特别适于用抗炎剂量的本发明醛固酮阻滞剂来治 疗。

在本发明的一个实施方案中,受试者的部分或全部优选为日本人种 族或黑人种族中的一个成员。日本的高血压是一个严重的问题。一项最 近的研究提示,大约3千万的日本成人患有高血压(Saruta T.J Clin Ther Med 1997;13:4024-9)。尽管血压控制状况最近在日本得到了改 进,高血压控制仍被认为是不够的(Shimamoto;K.Japanese Cases. Nihon Rinsyo(Clinical Medicine in Japan),2000;58(Suppl): 593-6) Trends in blood pressure and urinary sodium and potassium excertion in Japan:reinvestigation in the 8th year after the Intersalt Study.Nakagawa H等人:Hum Hypertens 1999 Nov.;13(11): 735-41推荐日本人增加饮食钾以减少饮食钠。

然而,限钠方案在日本由于依从性差而受到了阻碍。由Kobayashi 等进行的一项日本人的研究制定了将饮食限制在5-8g/日的方案,但仍 然难以达到良好的依从性。(kobayashi,Y等人:Jpn Circ J1983;47: 268-75)。日本健康和福利部门推荐了将钠限制在低于10克/日 (Guidelines on treatment of hypertension In the elderly,1995---a tentative plan for comprehensive research projects on aging and health---Members of the Research Group for“Guidelines on Treatment of Hypertension in the Elderly”,ComPrehensive Research Projects on Aging and Health,the 20 Ministry of Health and Welfare of Iapan)。ogihara T等人,Nippon Ronen Igakkai Zasshi. 1996;33(12):945-75)。尽管主动对公众进行了10年的教育,仍然存 在很高的不依从率(估计高于约50%),这由日本的正常和高血压个体的 尿钠水平而测量(Kobayashi Y等人,Jpn Circ J;47(2):268-75)。

太阳城集团此外,日本人有两个主要的群体:盐敏感和盐不敏感(Preventive nutritional factors In epidemiology:Interaction between sodium and calcium Mizushima S,Clin Exp Pharmacol Physiol 1999;26: 573)。已经确认许多日本人的高血压是盐敏感的。因此,表现出盐敏感、 高钠摄取和不能主动限制钠消耗的日本人种族成员尤其可以从本发明 的治疗获益。

因此,在本发明的另一种实施方案中,需要治疗的受试者是盐敏感 个体,他们全部或部分为日本人种族的成员,并且具有或易患高血压和 /或心血管病,特别是选自以下一种或多种的心血管病:心衰、左心室 舒张功能障碍、肥厚性心肌病以及舒张性心衰。

黑人中的高血压同样是一个显著的问题。许多高血压和正常血压的 黑人是盐敏感的(svetkey等人,Hypertension.1996;28:854-8)。 积累的流行病学数据表明,在几乎所有年龄和性别匹配的组中,黑人中 高血压的流行高于白人。高血压黑人一般比高血压白人具有更高的左心 室功能障碍、中风和肾脏损伤的发病率(但缺血性心脏病的发病率更 低)(Eisner,GM.Am J Kidney Dis 1990;16(4 Suppll):35-40)。美 国黑人中高血压的流行原因很大程度上是环境引起的:高钠和酒精摄 取、肥胖、身体活动少、以及心理压力都被鉴定为原因(Flack,JM等 人,J Assoc Acad Minor Phys 1991;2:143-50)。

太阳城集团黑人和白人中都具有的问题的原因是不明确的,但似乎钠处理上的 差异可能会造成黑人高血压患者的特定血液动力学和体液特征。已经提 出,限制尿钠排泄能力的内在或高血压诱导的肾功能异常、Na+、 K(+)-ATP酶泵活性的减少、其它膜离子运输失调、对心理压力的不同暴 露、更大的胰岛素抵抗以及饮食因素(钙和钾摄取减少)可能起了一定作 用(Flack,JM等人:Hypertension;1991;17(Supp):1115-2)。一 项研究表明,遗传差异可能也会成为黑人中盐敏感性的基础(Syetkey LP 等人:Hypertension 1996;28:854-8)。

黑人中的高血压起初一般是通过限制饮食中的钠摄取而控制的。如 果饮食控制还不够,推荐给予一种具有24小时效力并降低血管外周阻 力、促进钠排泄、并潜在改进肾脏血液动力学的抗高血压剂(Eisner,GM Am J Kidney Dis 1990;16(4 Suppll):35-40)。然而,与白人相比, 黑人一般对抗高血压剂的反应不同。总的说来,β-肾上腺素受体拮抗剂 或ACE抑制剂的单一治疗在黑人中不如白人中有效。黑人男性对ACE抑 制剂的反应甚至容易低于黑人女性(Eisner GM.Am J Kidney Dis 1990; 16(4 Suppl 1):35-40)。因此,表现出盐敏感、高钠摄取和不能主动 限制钠消耗的黑人种族尤其可以从本发明的治疗获益。

太阳城集团因此,在本发明的另一种实施方案中,需要治疗的受试者是盐敏感 个体,他们全部或部分为黑人种族的成员,并且具有或易患高血压和/ 或心血管病,特别是选自以下一种或多种的心血管病:心衰、左心室舒 张功能障碍、肥厚性心肌病以及舒张性心衰。

非调节个体

太阳城集团非调节个体表现出在肾血流速度和肾上腺醛固酮产生方面对高钠 摄取或血管紧张素II给药的钝化阳性反应。这些非调节个体还可以表 现出空腹胰岛素水平的增加和葡萄糖刺激胰岛素水平增加的增加 (Ferri等人,Diabetes 1999;48:1623-30)。胰岛素抗性也与心肌梗 塞风险的增加相关。

因此,在本发明的另一种实施方案中,需要治疗的受试者是盐敏感 和非调节个体,他们(i)具有或易患胰岛素抗性,特别是I型或II型糖 尿病,和/或葡萄糖抗性,和/或(ii)具有或易患心血管病。

老年个体

在盐敏感个体中,对给定增加饮食钠摄取的血压升高反应随年龄增 加。同样,在老年个体中更容易观察到盐敏感性。而且,胰岛素耐受类 似地随年龄增加。

太阳城集团因此,在本发明的一种实施方案中,需要治疗的受试者是至少55 岁的盐敏感个体,优选至少约60岁,更优选至少约65岁,并且具有或 易患胰岛素抗性,特别是I型或II型糖尿病,和/或葡萄糖抗性。

解毒的和恢复的酗酒者

解毒的和恢复的酗酒者一般也是盐敏感的(Genaro C等人, Hypertension 2000:869-874)。因此,在本发明的另一种实施方案中, 需要治疗的受试者是盐敏感个体,并且,是解毒或恢复的酗酒者。

肥胖

肥胖个体一般是盐敏感的。Bonner的研究(MMW Fortschr Med 1999; 14 34-6)估计,44%的高血压患者是超重的,并进一步与盐敏感性、细 胞内钙升高、钠储留、和心输出量的增加相关。此外,Dimsdale等人(Am J Hypertens 1990;3:429-35)报道了肥胖病人更容易反应于盐负荷而 增加收缩压。此外,盐敏感儿童也增加了肥胖和心血管病的可能性 (Falkner B等人,Am J Clin Nutr 1997;65:618S-621S)。甚至在血 压正常的个体中,钠敏感个体的体重容易超过钠耐受性个体(Rocchini AP等人,Am J Med Sci 1994;307 Suppll:S75-80)。因此,在本发 明的另一种实施方案中,需要治疗的受试者是盐敏感个体,并且肥胖。

                     生物学评价

人心血管病是复杂的病症,一般由血管性高血压或心肌梗塞(MI)引 起。为了确定对心血管病的可能治疗功效,在许多试验中确定组分的效 力是重要的。因此,在试验″A″中,用血管紧张素II灌输确定醛固酮拮 抗剂依匹乐酮(环氧美沙乐酮)对血管炎症高血压大鼠模型的效力。在试 验″B″中,描述了用醛固酮灌输产生高血压和血管炎症来评价醛固酮拮 抗剂依匹乐酮(环氧美沙乐酮)对大鼠模型的效力的研究。在试验″C″中, 描述了用醛固酮灌输产生高血压和血管炎症来评价醛固酮拮抗剂依匹 乐酮(环氧美沙乐酮)对大鼠模型的效力的另一项研究。

太阳城集团此外,用临床试验评价人的醛固酮拮抗剂治疗。这些治疗试验中的 许多实例已公开,包括American Journal of Cardiology 78, 902-907(1996)所述的RALES 003研究和New England Journal of Medicine 341,709-717(1999)所述的RALES 004研究。

试验A:体内血管紧张素II灌输模型

方案:

方法:

●雄性Wistar大鼠(n=50,10/组;BW=200g)

太阳城集团●待饮用的1%NaCl

●实验组

1.对照

太阳城集团2.血管紧张素II(25ng/分钟,皮下,通过alzet微型真空泵)

3.血管紧张素II(25ng/分钟,皮下)+依匹乐酮100mpk

太阳城集团4.血管紧张素II(25ng/分钟,皮下)+肾上腺切除术+地塞米松 (12μg/kg/d,皮下)

5.血管紧张素II(25ng/分钟,皮下)+肾上腺切除术+地塞米松 (12μg/kg/d,皮下)+醛固酮(40mg/kg/d,皮下,通过alzet微型真空 泵)

●通过每周尾套测定SBP

●每天测定24小时食物和液体摄入和尿液排出

●每天收集尿样以测定尿电解质

●4周后通过exanguination处死。将血液收集在干燥管中以测定 血清电解质,收集在含EDTA的管中以测定醛固酮和肾上腺酮水平。

●用苏米精和曙红将心脏染色,并分析确定形态异常(即坏死、血管 损伤)。

结果

血压  所有接受血管紧张素II灌输的动物收缩血压升高。与接受 赋形剂的动物相比,依匹乐酮和肾上腺切除术都没有降低血压。醛固酮 灌输升高血管紧张素II/盐、肾上腺切除大鼠的血压。图23显示这种收 缩血压升高。

电解质排泄  每日尿Na+排泄和尿K+排泄之间的比率(U Na+/K+比率) 用作尿钠排泄的指数。尿Na+/K+比率在开始处理前在所有的组中类似, 并在所有动物中在开始高盐饮食时类似地增大。尿Na+/K+比率在所有接 受血管紧张素II灌输的动物中没有改变,直至第17天这些动物相对于 赋形剂灌输的大鼠而言其尿Na+/K+比率显著增大。类似的地作用发生在 接受依匹乐酮的血管紧张素II灌输动物,它们在灌输第14天起显示出 尿Na+/K+比率增大。但是,依匹乐酮处理的大鼠没有在任何太阳城集团点表现 出比用赋形剂处理的血管紧张素II灌输的大鼠更高的尿Na+/K+比率。 实际上,仅在第21天观察到显著的变化,当灌输血管紧张素II时,赋 形剂处理的大鼠表现出比依匹乐酮处理的动物更高的尿Na+/K+比率,表 明在这些实验条件下依匹乐酮不产生显著的利尿或促尿钠排泄作用。进 行或不进行醛固酮灌输的肾上腺切除动物总是表现出比肾上腺完整动 物更高的尿Na+/K+比率。

太阳城集团心肌损伤.10只血管紧张素II/盐处理的动物中有7只产生冠状动 脉血管炎性改变。这些改变的特征是血管周围空间白细胞渗透,主要是 巨噬细胞渗透。在某些动脉中观察到血管中膜的纤维蛋白样坏死。在某 些情况下,当损伤广泛时,存在与周围心肌有关的心肌细胞坏死。在这 些情况下观察到实质性出血,与心肌坏死的发现一致。仅在10只接受 依匹乐酮的血管紧张素II灌输的动物中的一只上观察到这些血管炎性 损伤,尽管这些动物与赋形剂处理的血管紧张素II灌输大鼠一样具有 高血压(参见图24)。类似地,肾上腺切除术防止心脏血管炎性损伤。但 是,醛固酮补充恢复了严重的冠脉和心肌炎症以及在血管紧张素-II灌 输、肾上腺完整、赋形剂处理大鼠上观察到的损伤。

采用环加氧酶-2特异性抗体免疫染色血管紧张素II灌输大鼠心脏 鉴定在动脉周围炎症区域中,主要在单核细胞/巨噬细胞中存在这种酶。 还在冠状动脉的血管中层的血管平滑肌细胞中观察到环加氧酶-2染色, 甚至在血管周围空间没有明显的形态变化或炎性聚集(图26)。依匹乐酮 处理以及肾上腺切除术显著地降低,并在大部分情况下完全防止血管紧 张素II灌输大鼠心脏中环加氧酶-2的表达(参见图25和27)。给血管 紧张素-II、肾上腺切除大鼠补充醛固酮恢复冠状动脉中环加氧酶-2的 存在。

骨桥蛋白(还已知为早期T细活化-1,Eta-1)是一种具有前炎症特 征的分泌型糖蛋白,它调节单核细胞的化学吸引、活化和迁移。用骨桥 蛋白特异性抗体将血管紧张素II灌输的、饮用盐水的大鼠免疫染色鉴 定冠状动脉血管中膜中存在骨桥蛋白。依匹乐酮处理和肾上腺切除术防 止血管紧张素II灌输的饮用盐水的大鼠心脏中骨桥蛋白表达(图28和 29)。醛固酮补充恢复肾上腺切除动物中骨桥蛋白表达。

太阳城集团试验B:体内醛固酮灌输模型

方案2:

方法:

太阳城集团●雄性Sprague Dawley大鼠(n=39;BW=250g)

太阳城集团●待饮用的1%NaCl

●在植入微型真空泵中进行单测肾切除术

●实验组

1.对照

2.醛固酮(0.75mg/小时,皮下,通过alzet微型真空泵)

2.醛固酮(0.75mg/小时,皮下,通过alzet微型真空泵)+依匹乐 酮100mpk,口服

太阳城集团1.醛固酮(0.75mg/小时,皮下,通过alzet微型真空泵)+在饮用 液体中的0.6%KCl

太阳城集团●第1、2和3组仅接受在饮用溶液中的0.3%KCl。

●通过在腹主动脉插入放射遥测术探针来测定SBP。

●4周后处死。

太阳城集团→收集心脏并通过中部心室横切面分成两半:上半部分保存于福尔 马林。下部分在液氮中快速冷冻以用于进行生物化学分析。

太阳城集团●用苏木精和曙红和胶原特异性染料picro-sirius红将心脏染色, 并分析测定间质胶原体积分数和形态异常(即坏死、血管损伤)。

太阳城集团●测定冷冻心脏的羟基脯氨酸浓度。

太阳城集团●通过定量RT-PCR(Taqman)测定骨桥蛋白和COX-2。还通过免疫组 织化学鉴定心脏中的骨桥蛋白。

结果

血压  所有接受醛固酮灌输的动物收缩血压升高。依匹乐酮处理显 著降低血压,但没有使血压正常化。图43图示这些结果。

心肌损伤

饮用盐、单侧进行肾切除手术的大鼠没有心肌损伤。通过组织学测 定间质胶原体积分数或通过生物化学测定羟基脯氨酸浓度证明在接受 醛固酮/盐处理的动物中不存在心肌纤维化。但是,检查醛固酮/盐处理 的大鼠中苏木精和曙红染色的心脏证明严重的血管炎性损伤。这些损伤 与方案1所述的损伤相同。依匹乐酮给药完全抑制醛固酮灌输、饮用盐 水、单侧肾上腺切除大鼠的血管炎性变化(图32),尽管它没有使血压正 常化。饮食钾的升高并没有显著影响醛固酮诱导的损伤的发展,因为这 些动物表现出与接受赋形剂的醛固酮/盐处理大鼠类似的损伤水平。

在第28天测定血清骨桥蛋白水平,并对每组进行测定(饮用NaCl 1% 的大鼠,饮用NaCl 1%及醛固酮的大鼠,饮用NaCl 1%及醛固酮和依匹 乐酮的大鼠)。图48表示依匹乐酮处理大鼠中循环骨桥蛋白水平的显著 降低。

太阳城集团还对这些动物心脏进行骨桥蛋白免疫染色。在未接受醛固酮的饮用 盐水、单侧肾上腺切除动物上未检测到骨桥蛋白。但是,在接受醛固酮 灌输的动物的冠状动脉的血管中膜中鉴定骨桥蛋白。依匹乐酮处理,防 止醛固酮灌输大鼠心脏中骨桥蛋白的表达(图30和40)。增加饮食钾并 没有降低骨桥蛋白表达。通过定量RT-PCR测定骨桥蛋白mRNA,表明接 受赋形剂的醛固酮/盐处理大鼠心脏中细胞因子明显(7倍)上调(相对 mRNA表达:1.7±0.2 vs 12.25±1.7,P<0.0001)。依匹乐酮(相对mRNA 表达:2.5±0.6,P<0.0001对醛固酮/盐+赋形剂组)防止这种作用。与 环加氧酶-2在心脏醛固酮诱导的血管炎症发展中的作用一致的是,醛固 酮/盐+赋形剂处理的大鼠的COX-2mRNA表达增加3倍(相对mRNA表达: 1.2±0.12对3.7±0.46,P<.0001)。与对骨桥蛋白表达的作用类似的是, 依匹乐酮防止醛固酮/盐处理大鼠的COX-2表达增加(相对mRNA表达: 1.8±0.36,P<0.01对醛固酮/盐+赋形剂组,参见图31和39)。

以上数据表明,醛固酮调节高血压大鼠心脏的血管炎性表型。这种 表型与动脉血管中膜的血管平滑肌中细胞因子骨桥蛋白和酶环加氧酶 -2的上调有关,从而可能调节观察到的血管周围炎症和结果的冠状动脉 和心肌的局部缺血/坏死损伤。在不意受限于任何理论的情况下,认为 这是调节在疾病,例如心衰、冠状动脉疾病、自体免疫或病毒心肌炎、 结节性动脉外膜炎、中风和肾硬化中观察到的血管改变机制。图33显 示骨桥蛋白和环加氧酶以类似的冠状动脉壁的区域表达。尽管理论对本 发明不起作用,但图34表示这种模型的一种建议的机理。在这些实例 中,依匹乐酮处理防止心脏血管炎症的程度类似于肾上腺切除术,如在 方案#1所示。依匹乐酮的作用很大程度上独立于收缩血压原发性降低, 如方案#1证明。依匹乐酮在血管紧张素II/盐性高血压大鼠中利尿或促 尿钠排泄作用的缺乏表明选择性醛固酮拮抗剂的保护作用还独立于其 对上皮组织的潜在作用。此外,饮食钾升高难以模仿依匹乐酮的作用的 事实,反驳了依匹乐酮通过其钾潴留性能提供益处的可能性。因此,我 们建议醛固酮对冠状血管可能直接具有有害作用,其与这种激素在上皮 组织电解质动态平衡中的作用或其对血压的作用无关。依匹乐酮对人的 给药可以通过其在血管化的器官,包括但不限于心脏、肾和脑中的抗炎 作用提供优点,如本实验建议。

太阳城集团试验C:进一步的体内醛固酮灌输研究

将试验B的方法扩展至进一步的研究。单侧肾切除手的 Sprague-Dawley大鼠饮用1%NaCl-0.3%KCl和进行一种以下处理:赋形 剂;醛固酮灌输或醛固酮灌输与依匹乐酮(100mg/kg/day)联合。30天 后醛固酮/盐处理诱导大鼠严重高血压,其通过依匹乐酮得以显著降低。 在处理后第7、14或30天检查每一处理组动物的心肌组织。组织病理 学分析表明血管炎性损伤起始于第14天,并延伸至心肌周围,导致病 灶局部缺血/坏死变化。损伤之前是前炎症分子表达和渐进性上调。通 过依匹乐酮处理显著地减少前炎症分子上调和相关的血管与心肌损害。 这些数据证明依匹乐酮有效地降低血压,并提供对醛固酮诱导的心脏血 管炎症损害的终点器官保护作用。

动物

太阳城集团将雄性Sprague-Dawley大鼠,重230-250g,(Harlan Sprague-Dawley Industries,Indianapolis,IN)笼养于12小时亮/12 小时暗日循环和22±1℃(n=96)的外周温度的室内。动物在到达之后调 整一周并自由获取TEKLAD 22/5啮齿动物食物(Harlan TEKLAD,Madison, WI)和自来水直至实验开始。

实验方案

在手术前,将动物单独称重,并置于以下小组之一:(I)高盐对照(赋 形剂/普通固型食物/1%NaCl和0.3%KCl饮用水,n=31,涉及3个时 间点组),(II)醛固酮对照(醛固酮/普通固型食物/1%NaCl和0.3%KCl饮用水,n=28,涉及3个太阳城集团点组),(III)100mg/kg/天依匹乐酮(醛 固酮/依匹乐酮固型食物/1%NaCl和0.3%KCI饮用水,n=30,涉及3个 太阳城集团点)。将氯化钾补剂加到盐溶液以防止与醛固酮过量有关的潜在低 血钾。

太阳城集团在手术时的处理,将含有赋形剂(9%乙醇/87%丙二醇/4%dH2O)或1.0 mg/mL d-醛固酮(Sigma Chemical,St.Louis,MO)的Alzet 2002渗透 微型真空泵(Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)皮下插入颈背。以0.75μg/ 小时的剂量施用醛固酮。以固型食物(计算递送100mg/kg/天)的浓度 将依匹乐酮加到TEKLAD22/5啮齿动物食物(Harlan TEKLAD,Madison, Wis.)。先前的分析工作表明依匹乐酮在这种食物中的稳定性以及在制 备后获得的均匀性。对于每组(n=8-13)在处理后7、14或30天处死动 物。

手术方法

太阳城集团在处理后第7或14天处死的动物进行单侧肾切除,并植入Alzet 微型真空泵。对处理30天的动物进行单侧肾切除,配合Alzet微型真 空泵,并根据以下方法植入放射遥测单元(型#TA11PA-C40,Data Sciences Inc.,St.Paul,Minn.)。用5%异氟烷(SOLVAY Animal Health Inc.,Mendota Heights,Minn.)麻醉动物,用VMS麻醉装置将其在O2中递送(Matrix Medical,Inc.,Orchard Park,N.Y.)。用1-2%异氟 烷通过手术方法保持麻醉。夹住手术部位,用洗必泰擦洗,并用聚烯吡 酮碘喷雾。用11号解剖刀片作喙尾部切口通过胸腔基底的皮肤至耻区。 作第二切口通过腹壁肌肉以暴露腹腔。分离左肾尿道、肾动脉和静脉, 用4-0丝打结,并将肾切除并弃去。小心地用组织牵开器处理器官以暴 露腹主大动脉。清除腹主动脉分歧进入回肠动脉的口的1.5cm片段周 围过量的结缔组织,并用4-0丝与大动脉附近锚定。然后将微血管夹置 于清除区域的两端以终止过度的血液流动。使用弯曲、21标准规格针穿 透腹主大动脉。插入放射遥测单元的套管并用4-0丝锚定于大脉。重新 放置器官,并将遥测单元置于器官上。用带4-0丝的非中断的缝合方式 将腹壁封闭,然后用4-0丝以中断缝合方式封闭皮肤。在缝合处附近用 100μL麻醉剂麻卡因HCl(Sanofi Winthrop Pharmaceuticals,New York, N.Y.)注射动物,并注射(i.m.)抗生素头孢羟唑钠甲酸酯(Eli Lilly & Co.,Indianapolis,Ind.)。手术后护理包括在回收期间在加热板上监 测动物直至重新恢复胸骨横卧。每天监测动物的痛苦症状和手术部位的 感染。用0.1-0.5mg/kg,皮下施用Buphrenorphine(Rickett & Colman Pharmaceuticals,Inc.Richmond,VA)处理手术后的继续表现出不适 的动物。然后将动物获得自来水和TEKLAD22/5啮齿动物食物(Harlan TEKLAD,Madison,WI)。

血压分析

太阳城集团用DATAQUEST A.R.T 1.1版Gold软件(Data Sciences International,St.Paul,Minn.)计算放射遥测的动脉血压。对于每 只动物在24小时期间内用设定为每5分钟进行10秒读数的收集速率收 集数据点。所用的24小时期间为6:00a.m.至6:00a.m。

处死

在每次实验太阳城集团点结束时,用戊巴比妥(65mg/kg i.p.,Sigma Chemical,St.Louis MO)麻醉动物,并用Mettler PM6000天平 (Mettler-Toledo,Inc.,Hightstown,N.J.)称重。打开腹腔以暴露腹 主大动脉。将16-标准规格针插到腹主大动脉,并将动物抽血至12cc 注射器。立即将血样转移到玻璃血清收集管(Terumo Medical Corp., Elkton,Md.)以进行药物水平分析。将样品置于湿冰直至完成样品收集, 并在4℃下以3000转/分钟离心15分钟。

在抽血之后,分离心脏和肾,移出,用冷的磷酸盐缓冲盐水冲洗, 并吸干。立即通过用刀片沿长轴将肾分为两部分,并将其置于10%中性 缓冲的福尔马林(NBF,Richard-Allen Scientific,Kalamazoo,MI)。 对于心脏,将右心室(RV)与左心室切开,用Mettler AEl63天平 (Mettler-Toledo,Inc.,Hightstown,N.J.)对二个心室称重,并将右 心室置于10%NBF。移出2mm左心室顶端的冠状厚块,用干冰/异戊烷 冷冻以分析基因表达,并将左心室的剩余部分置于10%NBF以进行固定。 在固定后3-4天完成最后的湿修整,其中取出第二个2mm冠状厚块以 进行羟基脯氨酸分析,并从中纬区移出第三个2mm厚块以进行组织学分 析。

组织处理和染色

太阳城集团用自动组织处理器(Hypercenter XP,Shandon/Lipshaw Inc., Pittsburgh,PA)常规石蜡处理心脏中纬区,并将其包埋入新鲜石蜡中, 顶面向下(Shandon Embedding Center,Shandon/Lipshaw Inc.)。用 Leica RM2035旋转切片机(Leica Inc.,Houston,Texas)从每个组织 区块中切除5个10μm切片,并将其封固于Superfrost/Plus显微镜玻 片(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)。用胶原特异性染料, Picrosirius红F3BA(饱和苦味酸(Sigma Chemical,St.Louis,MO) 和0.1%(w/v)Sirius红F3BA(C.I.#35780,Pfaltz & Bauer,Inc. Waterbury,CN)(6)将10μm切片染色。用水将封固的组织水合。然后用 含0.2%(w/v)磷钼酸(Sigma Chemical,St.Louis MO)的蒸馏水将玻片 培养15分钟,将其转移到0.1%Picrosirius红F3BA染料,持续110 分钟,在95%乙醇w/1%乙酸(v/v)中放置1分钟,然后在100%乙醇中 进行2次1分钟培养,并在二甲苯中清洗1分钟。用#1盖玻片和 Permount组织封固剂(Fisher Scientific)盖片。为每只动物切2个封 有5μm切片的玻片。一个玻片用苏木精和曙红染色处理,一个用高碘酸 Schiff(PAS)染色处理。苏木精和曙红和PAS用于对心脏进行病理打分。

组织病理分析

如前述并进行细微修改(7)来进行心肌损伤半定量。简言之,0-4 刻度用于给心肌损伤水平打分。0分代表没有损害。1分代表存在血管 和血管周围炎症损害但没有心肌细胞损伤。在观察到一个清楚的心肌坏 死区域时打2分。心肌坏死定义为在心肌细胞中存在坏死性损害,例如 核固缩或核溶解、非收缩性边缘波状纤维和细胞质的嗜曙红细胞过度增 多,或者明显的心肌细胞膜破坏症状。当发现2个或更多个单独的坏死 区时(意味着存在2个不同的内折区),心脏接受的打分为3分。4分指 定表现出广泛的包括大于50%的左心室的坏死区域的心脏。

图像分析

Picrosirius红F3BA染色的玻片用于用Videometric 150 Image 分析系统(Oncor Inc.,Gaitherburg,Md.)对间质胶原进行定量。简言 之,用与Nikon Optiphot显微镜(Nikon Inc.)相连的Nikon E Plan 10/0.25;160/-物镜(Nikon Inc.Garden City,N.Y.)捕捉图像。 Toshiba 3 CCD彩色摄影机(Model#IK-T30T,Toshiba Corp.Japan)转 播来自显微镜的RGB格式的图像至具有V150视频板的386计算机。V150 视频板/V150软件应用程序(Oncor Inc.)将RGB图像转化成HIS(Hue, Intensity,Saturation)格式以在放大率为305×的Sony Trinitron彩 色摄影机(Model#PVM-1342Q,Sony Corp,Tokyo,Japan)上显示和分析。 一旦在图像监示器上显示图像,则通过称为限定阈值的方法定义待测定 的像素的色调、亮度和饱和度。然后将V150应用程序仅衡量落入阈值 限内的像素。用测微计刻度(EM Sciences,FT.Washington,Pa.19034) 校准系统,它以mm2或μm2为单位表示数据。在每次测定之后,将数据自 动保存成ASCII文件格式,并转化成Microsoft Excel 7.0版以进行最 后的合计。

免疫组织化学

在二甲苯将5μm切片脱蜡(二次,5-10分钟培养),并如下通过在 乙醇中培养3分钟再次水合:在100%乙醇中进行2次培养,然后在95% 醇中2次培养,并在70%醇中1次培养。一旦水合,用自来水将切片冲 洗1分钟,并用蒸馏水冲洗1分钟。通过将玻片在3.0%H2O2中放置15 分钟,然后用蒸馏水冲洗5分钟来阻断内源性过氧化物活性。用柠檬酸, pH6.0处理玻片以进行抗原恢复。将玻片加热至沸腾,在25℃下冷却20 分钟,并用蒸馏水冲洗。用DAKO自动染色器(DAKO Corporation, Carpinteria,Calif.)将玻片染色。在染色前,冲洗玻片并在封闭缓冲 剂中培养20分钟。封闭缓冲剂在Vectastain ABC试剂盒(Vector Labs, Burlingame,Calif.)中描述,且包含10mL TNB(NEN TSA生物素系统 试剂盒,Cat#NEL700A,NEN Life ScienGe Products,Boston,Mass.) 和3滴正常(对应于第二抗体)血清。

太阳城集团用于染色的主要抗体包括:1∶100稀释的骨桥蛋白(Mouse monoclonal,Cat#MPIIIb10,Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of Iowa,Iowa City,Iowa);1∶500稀释的ED-1(抗 巨噬细胞糖蛋白,小鼠单克隆,MAB1435,Chemicon International Inc., Temecula,Calif.);1∶300稀释的CD-3(抗T细胞,兔多克隆亲合力纯 化抗体,A0452,DAKO Corporation,Carpineria,Calif.);1∶100稀 释的ICAM-1(山羊多克隆亲合力纯化,M-19:sc-1511,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,Calif.);1∶100稀释的VCAM-1(山羊多 克隆亲合力纯化,C-19:sc-1504,Santa Cruz Biotechnology)。用主 要抗体将玻片培养60分钟,然后用最终浓度为5μL/mL的生物素化抗体 在25℃下培养30分钟。用Vectastain ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories)和二氨基联苯胺染色法(DAKO Corporation, Carpinteria,Calif.)使染色显色。用水冲洗玻片并用苏木精反染色大 约30秒。将同型相符的IgG(Sigma Chemical,St.Louis MO)用作主 要抗体的阴性对照。

骨桥蛋白mRNA的原位杂交

太阳城集团基于大鼠骨桥蛋白的序列(GenBank登录号#NM 008608-1)产生RNA 探针。简言之,通过RT-PCR使用以下引物产生大鼠骨桥蛋白的cDNA片 断:正向引物,5′-TGG CAC ATT TGT CTT;反向引物,3′AGC CCA TCC AGTC。 用TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif.)将cDNA 片断插入PCR II质粒。在100μL包含以下的体外转录反应物中标记探 针:rRNasin(2U)、DNase(0.5U)、TE缓冲液(1X)、rGTP(10mM)、rCTP(10 mM)、rATP(10mM)、rUTP(10mM)、(PROMEGA,Madison,Wis)、5μL(50μ Ci)33P-UTP(Elkin Pelmer,Boston,MA)和适宜的RNA聚合酶(Sp6 RNA 聚合酶;T7 RNA聚合酶、PROMEGA),在37℃下持续60分钟。用Microcon YM-50微型浓缩器(Amicon,Bedford,MA)从反应物中移出游离标记物。 在二甲苯中将切片脱蜡,在分级乙醇溶液中如以上所述进行再水合,并 在4%多聚甲醛(EMS,Ft.Washington,Pa.)中于4℃下固定10分钟。 然后用蛋白酶K(5mg/mL;10分钟,37℃,Roche,Indianapolis,IN) 将组织消化,并用0.5X SSC缓冲液(盐水-柠檬酸钠缓冲液)洗涤(10分 钟)。在分级的一系列乙醇中连续脱水之后进行预杂交,如上述作反转 处理以进行再水合,然后在杂交缓冲液(50%甲酰胺,2X SSC,10%硫酸 右旋糖酐,v/v)中于42℃下培养2小时。用含有tRNA(50μg/mL,Sigma, St.Louis,MO)的杂交缓冲液和适宜标记的探针在55℃下杂交过夜。 然后连续地用2X SSC缓冲液,0.1X SSC-EDTA缓冲液(0.1X SSC,1mM EDTA) 和2x SSC缓冲液将杂交组织洗涤1小时40分钟。最后在如上述包含 NH4OAc(各2分钟)的一系列分级的乙醇中将玻片脱水,并在真空干燥器 中于室温下干燥1.5小时。将组织过夜暴露于磷筛网。用照相乳液(Kodak, Rochester,N.Y.)涂布玻片,并在4℃下曝光3-5周,然后显影。用苏 木精和曙红将显影的玻片反染色。

太阳城集团TaqMan分析的原理

太阳城集团使用Applied Biosystems′7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)进行荧光5′-核 酸酶分析(TaqMan PCR)允许通过监测基因特异性、染料标记的寡核苷酸 探针的荧光的增大而实时检测/定量特定的基因。用于目标和对比基因 的探针在5′-端用6-羧基荧光素(6FAM)报告染料标记,在3′-端用6- 羧基-N,N,N′,N′-四甲基罗丹明(TAMRA)猝灭剂染料标记。当将探针退火 至目标基因时,通过紧密相邻的TAMRA防止6FAM的荧光。Taq聚合酶 的外切核酸酶活性通过取代来自目标序列的探针来释放来自寡核苷酸 探针的染料,导致与存在的目标太阳城集团的数量成正比的荧光激发。用来自 Applied Biosystems的Sequence Detection System软件进行数据分 析。

TaqMan引物和探针:TGFβ1、ANP、胶原I、胶原III

用Oligo Primer Analysis Software,5.0版(National Biosciences Inc.(NBI)-Wojciech Rychlik,Cascade,CO)设计引物和 探针。由Life Technologies(Grand Island,N.Y.)合成引物,并由 Applied Biosystems合成探针。由大鼠基因的已知序列设计引物/探针 组以作分析。将所有的目标基因值根据比较基因组成型表达的亲环素标 准化。引物/探针组序列可见于表8。

太阳城集团                   表8TaqMan RT-PCR基因标记引物/探针组     基因     正向基因     反向基因     探针 转化生长因子 β1(TGFβ1) CACCATCCATGACATGAACC ACCTTGCTGTACTGTGTGTCC TCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC 心房促尿钠排泄因子 (ANP) TGGGCTCCTTCTCCATCCAC ACCAGAGCCCTCAGTTTG CCATATTGGAGCAAATCCCGTATAC 胶原I ACCAAGGCTGCAACCTGGA GCAGGAAGGTCAGCTGGAT CCATACTCGAACTGGAATCCATCG 胶原III GGCTTTCAGCTATGG GTGATCTTCTTGCTGGTCTTGC CCACAATGCTCATGCCTTCTTTCACC 亲环素 CTTGTCCATGGCAAATGCTG GTGATCTTCTTGCTGGTCTTGC CCACAATGCTCATGCCTTCTTTCACC 环加氧酶-2(COX-2) TCAAAGACACTCAGGTAGACATTGATCT CGGCACCAGACCAAAGACTT CACGTCCCTGAGCACCTGCGG 骨桥蛋白 CCAGCACACAAGCAGACGTT TCAGTCCATAAGCCAAGCTATCACCAGTCGA TGTCCCTGACGGCCG 单核细胞化学吸引蛋白 -1(MCP-1) GCAGGTCTCTGTCACGCTTCT GGCTGAGACAGCACGTGGAT CCTGTTCTTCACAGTTGCTGCCTGTAGC 分子间粘附分子 -1(ICAM-1) ACCTGCAGCCGGAAAGC CCCGTTTGACAGACTTCACCAT CCGATAGGCAGCGGGACACCA 血管细胞粘附分子 -1(VCAM-1) GAAGCCGGTCATGGTCAAGT GGTCACCCTTGAACAGTTCTATCTC TGGCTCCTGATGTTTACCCAATTGACAGA 亲环素 AGAGAAATTTGAGGATGAGAACTTCAT TTGTGTTTGGTCCAGCATTTG AAGCATACAGGTCCTGGCATCTTGTCCAT

太阳城集团所有的寡核苷酸写成5′-3′。引物未标记或者所有的探针在5′端用 6-羧基荧光素(6FAM)受体染料标记,并在3′端用6-羧基-N,N,N′,N′- 四甲基罗丹明(TAMRA)猝灭剂染料标记。

太阳城集团RNA分离:TGFβ1、ANP、胶原I、胶原III

太阳城集团根据制造商教导(Leedo Medical Laboratories,Inc.,Houston, Texas)用1.5mL RNA-STAT 60从冷冻(-70℃)的左心室组织(大约10-20 mg)中提取RNA。简言之,用配备5mm探针(Ultra-Turrax T8 Homogenizer,IKA Works,Inc.Wilmington,N.C.)的组织均化器均化 组织。在均化之后,在室温下周期性混合10分钟来培养等体积的分子 级氯仿(Sigma Chemical Co.)。将样品在12,000g下离心10分钟,并 通过加入等体积的分子级异丙醇(Sigma Chemical Co.)而从顶层沉淀 RNA,然后在-80℃下培养过夜。通过在12,000g下离心使RNA沉淀,用 75%乙醇洗涤,并在不含核酸酶的水(Promega,Madison,WI)中溶解。 将RNA稀释并用分光光度法分析浓度和纯度(A260/A280=1.9-2.0,且平 均产率为2-5μg RNA)。

太阳城集团逆转录:TGFβ1、ANP、胶原I、胶原III

通过将400ng RNA(4μL)加到20μl包含15%不含核酸酶的水 (Promega,Madison,WI)、1X RT缓冲液(Life Technologies,Grand Island,N.Y.)、10mM DTT(Life Technologies)、0.5mM每种dATP、 dTTP、dGTP、dCTP(PE Biosystems,Foster City,Calif.)、2.5μM寡 聚d(T)15(Oligo Therapeutics,Inc.,Wilsonville,Oreg.)、40单 位RNAsin(Promega)和200个单位SuperScript II逆转录酶(Life Technologies)的最终体积而合成双链cDNA。在带盖薄壁反应管中 (Applied Biosystems)进行反应以确保准确的反应温度。用GeneAmp 9600热循环控制装置(Applied Biosystems)根据以下方案进行反应: 在37℃下1小时,在95℃下5分钟,和在4℃下10分钟。

太阳城集团TaqMan分析:TGFβl、ANP、胶原I、胶原III

各PCR反应物包含以下:2.5μL(50ng)各cDNA,其加到22.5μL 含有以下的PCR混合物:38.5%不含核酸酶的水(Promega),1X PCR缓 冲液II、2mM MgCl2、0.05U/μL AmpliTaq Gold(PCR Core Reagent Kit, N808-0228,Applied Biosystems)、300nM每一种正向和反向引物(Life Technologies)、200nM探针(Applied Biosystems)和200μM各种dATP、 dTTP、dGTP和dCTP(Applied Biosystems)。在带MicroAmp光学盖 MicroAmp光学管(Applied Biosystems)中设立单一反应物,并将其装 载至7700序列检测器。将以下方案应用于所有反应:在95℃下10分钟 (聚合酶活化)、在95℃下10秒循环(变性)和在57℃下1分钟(退火)。

太阳城集团TaqMan引物和探针:COX-2、骨桥蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1

使用补充7700 Sequence Detection System的Primer Express软 件设计所有的引物和探针,并通过Applied Biosystems合成。用5倍 稀释的总RNA(来自200ng-320pg)绘制标准曲线以确定设置在TaqMan 反应中的每种引物/探针在实验样品分析前的效率。由已知的待分析的 大鼠基因序列设计引物/探针组。将所有的目标基因值根据对比基因组 成表达的亲环素标准化。引物/探针序列见于表8。

RNA分离:COX-2、骨桥蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1

用完全RNA分离试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,TX)从冷冻的(-80 ℃)的大鼠心脏组织中提取RNA。用不锈钢臼和研棒压碎已冷却至-80℃ 的组织,并转移至含有3-10mL冷的变性缓冲液的杜恩斯均化器(Kontes, Vineland,N.J.)。将组织均化并转移至无菌、15mL聚丙烯离心管中。 加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),将样品剧烈振荡1分钟,并 在冰上培养至少15分钟。在10,000g下将样品离心30分钟。移出水 相,加入1/10体积的乙酸钠溶液(3.0M NaOAc pH4.5),并将样品振 荡或倒置10秒,加入与原始样品体积相等体积的酸-酚(与异丙醇预混 合)∶氯仿(5∶1,Ambion,Inc.)。将样品剧烈搅拌1分钟,然后在冰上 培养15分钟,并在10,000g下离心30分钟。移出水相,并将其置于 清洁的聚丙烯管中。加入等体积的异丙醇(Sigma,St.Louis,Mo.), 并将样品混合并在-20℃下培养过夜。将样品在10,000g下离心30分 钟,移出上清液,并将RNA沉淀再悬浮在不含DNAse/RNAse的水中。在 -80℃下将样品冷冻至少2小时,在湿冰上融化,并稀释用于定量。

太阳城集团所有的RNA还通过DNase消化纯化除去基因组DNA,并进行LiCl沉淀以除去糖类。各RNA(100μg)在37℃下与在含有40mM Tris pH7.8、 6mM MgCl2、10mM CaCl2的缓冲液中的1单位的DNAse(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)和10单位的RNAse抑制剂(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)一起培养45分钟。使用用于RNA清 除(Qiagen,Valencia,Calif.)的RNeasy Mini方案除去DNAse和缓冲 液。然后用等于样品体积一半的体积的7.5M LiCl/50mM EDTA(Ambion, Inc.,Austin,TX)沉淀RNA,在-20℃下培养过夜,并在4℃下于 13-16,000g下离心30分钟。在-80℃下将所有的RNA冷冻至少2小 时,融化,稀释并进行分光光度法分析浓度和纯度。

太阳城集团TaqMan分析:COX-2、骨桥蛋白、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1

太阳城集团如下完成TaqMan反应。将10μL(200ng)总RNA(DNAsed和LiCl沉 淀)加到包含以下的15μLRT-PCR反应混合物:12.5μL不含尿嘧啶-N- 糖基化酶(包含AmpliTaq Gold DNA聚合酶、dNTP和dUTP、阴性对照和 最佳缓冲液组分)的2X一步PCR Master Mix、0.625μL 40X MultiScribe 和RNAse抑制剂Mix、0.625μL 20μM正向引物、0.625μL 20μM反向引 物、0.5μL的5μMTaqMan探针和0.125μL不含DNAse/RNAase的水。将 反应物2等份装在带MicroAmp光学盖或粘合盖的MicroAmp光学96孔 反应平板(Applied Biosystems),并将其装载至7700序列检测器。将 以下方案应用于所有反应:在48℃下30分钟(逆转录)、95℃下10分钟 (逆转录和聚合酶活化失活)、95℃下15秒(变性)和6℃下1分钟(退火) 的循环进行40个。

羟基脯氨酸分析

通过对如前述的氧化羟基脯氨酸和对二甲基氨基苯甲醛之间的反应 进行定量的比色法分析测定心肌羟基脯氨酸浓度(4)。简言之,在60℃ 下用Reacti-Therm加热储备液(Pierce,Rockford,IL)将组织干燥18 小时并称重。用2mL 6N HCl在150℃下将干燥组织和阳性胶原对照(牛 胶原类型I,Sigma,St.Louis,Mo.)水解3小时。在氮气氛下蒸发酸, 用1mL柠檬酸盐-乙酸盐缓冲液(0.7M NaOAc,0.2M柠檬酸盐,45mM 柠檬酸,pH 6.0)在4mL异丙醇存在下将样品再水合,并通过0.45μm Millex LCR过滤器(Gelman Sciences,Ann Arbor,Mich.)过滤。

通过用350μL柠檬酸盐-乙酸盐-异丙醇缓冲液(柠檬酸盐-乙酸盐 缓冲液和40%异丙醇,v/v)和100μL 300mM氯胺T(J.T.Baker, Phillipsburg,N.J.)将60μL水解样品或胶原标准品在25℃下培养5 分钟来测定羟基脯氨酸含量。加入Erlich试剂(1.25mL,3.5M对二 甲基氨基苯甲醛,在70%高氯酸和80%异丙醇中,v/v)以显现和定量羟 基脯氨酸。将样品在60℃下培养30分钟,冷却至室温,并在558nm下 监测吸光率。由新制作的反-4-羟基-L-脯氨酸(Sigma,St.Louis,Mo.) 的标准曲线对羟基脯氨酸含量进行定量。所有的样品和标准品进行双份 实验。

统计学分析

用单向差异分析法(ANOVA)分析数据。由于组内的正态和组间的差 异等同性不可能一致地相符,根据原始数据的等级转化值进行分析(非 参数分析)。α=0.05水平的差异性用于方法之间的预定比较。最小显著 性差异(LSD)方法用于组间的预定比较。用在SAS统计软件包(SAS PC, 6.12版,SAS Institute,Cary,N.C.)的PROC TTEST分析数据。所有 数据报道为平均值±平均值的标准偏差(SEM)。

动物排除

太阳城集团三只动物在实验期间死亡:大鼠#17(醛固酮+盐组,在灌输后第24 天发现死亡),大鼠#64(醛固酮+盐组,在手术后死亡),和大鼠5(赋形 剂组,在手术后死亡)。如果发现多个参数不代表它们被指定的处理组 (例如偏离该处理组平均值大于3个标准偏差),则排除附加的动物。三 只这种动物从研究中排除:大鼠#57(来自7天的方案,醛固酮+盐组), rat#97(来自14-天方案,醛固酮+盐组),和大鼠24(来自30天的方案, 100mg/kg/天依匹乐酮组)。这三只动物表现出炎症标记(COX-2、骨桥 蛋白、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1)基因的表达,即偏离处理组平均值大 于3个标准偏差。还由于遥测单元功能障碍而排除大鼠#24。这些动物 产生的值显示于表9.10-表9.19,其独立于该数据表中其它动物的数据。

太阳城集团表9.10用于表10的个体数据

对照:赋形剂+盐   大鼠#     1     2     4     6     7     8     9     10     天                                          收缩血压(mmHg)     3     118     130     121     --   --     --     --     118     4     120     122     125     --   --     --     --     123     5     126     123     125     --   --     --     --     127     6     132     129     130     --   --     --     --     131     7     133     132     134     --   --     --     --     131     8     135     133     133     --   --     --     --     129     9     131     131     133     --   --     --     --     128     10     130     132     128     124   --     116     135     127     11     130     130     129     125   --     118     138     128     12     130     128     126     124   --     124     143     128     13     131     127     128     121   --     123     143     126     14     142     122     126     125   --     128     148     128     15     144     128     127     128   --     125     134     127     16     132     133     127     128   --     125     134     123     17     133     133     127     123   --     124     140     128     18     134     133     129     121   --     126     143     128     19     125     129     120     125   --     124     140     128     20     119     131     121     125   --     122     139     126     21     123     131     125     126   --     120     136     128     22     127     128     128     126   --     125     133     129     23     129     133     131     125   --     128     138     131     24     132     134     130     125   --     132     140     130     25     133     131     125     125   --     128     136     129     26     132     131     127     126   --     132     141     130

太阳城集团--=由于技术困难没有收集到数据

表9.10(续)

醛固酮+盐  大鼠#     11     12     13     14     15     16     18     19     20     天                                          收缩血压(mmHg)     3     116     152     115     127     143     122     ---     124     159     4     120     149     122     134     129     135     ---     125     152     5     126     158     124     142     129     137     ---     128     151     6     132     170     136     157     144     149     ---     135     158     7     140     179     139     165     153     154     ---     145     165     8     145     182     143     160     158     154     ---     146     163     9     150     191     148     172     172     159     ---     151     169     10     156     196     149     175     175     165     ---     151     172     11     154     201     155     178     181     163     ---     155     175     12     159     207     161     190     186     170     ---     163     190     13     161     210     166     196     191     172     ---     166     194     14     164     208     170     204     192     181     159     172     192     15     171     200     164     205     183     173     160     175     194     16     179     218     165     200     194     176     166     187     198     17     174     222     178     209     220     185     170     192     202     18     181     226     174     212     213     186     175     198     203     19     189     219     185     208     231     188     177     201     203     20     192     225     190     220     212     198     180     207     204     21     197     227     197     218     220     201     186     213     211     22     198     227     204     213     223     204     190     221     204     23     200     221     203     223     214     204     187     220     199     24     204     218     199     222     219     207     194     212     212     25     215     209     205     231     219     210     198     196     210     26     219     211     215     224     207     202     192     212     205

--=由于技术困难没有收集到数据

表9.10(续)

依匹乐酮+醛固酮+盐   大鼠#     21     22     23     25     26     27     28     29     30    24*     天                                              收缩血压(mmHg)     3     123     126     130     128     119     125     126     125     130    -     4     130     128     131     139     122     126     128     130     134    -     5     132     134     132     143     123     127     127     133     142    -     6     133     142     136     152     126     133     137     140     150    -     7     140     142     143     156     132     140     140     141     156    -     8     142     146     141     156     131     138     138     139     152    -     9     142     146     139     154     130     133     137     141     151    -     10     143     143     138     158     134     136     139     142     149    -     11     145     139     138     160     136     137     140     145     152    -     12     147     140     139     165     137     139     140     148     154    -     13     148     144     137     170     140     140     140     149     153    -     14     146     142     138     178     143     144     143     152     161    -     15     145     143     137     173     143     144     141     149     156    -     16     148     137     137     179     145     145     143     150     164    -     17     148     141     143     182     149     148     143     160     174    -     18     151     146     144     187     152     149     148     162     177    -     19     156     147     145     192     153     154     150     166     177    -     20     159     147     146     192     155     151     151     168     176    -     21     162     148     152     200     159     154     155     175     182    -     22     162     149     153     203     160     158     155     176     185    -     23     169     157     157     209     163     160     159     180     191    -     24     168     164     159     211     163     162     161     180     195    -     25     174     165     161     215     165     161     161     182     198    -     26     178     168     163     223     167     166     162     192     202    -

--=由于技术困难没有收集到数

*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

太阳城集团表9.11用于表11的个体数据

对照:赋形剂+盐   大鼠# 最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度     (cm)  左心室重量/   胫骨长度     (mg/cm) 右心室重量/   胫骨长度     (mg/cm) ANP(AU)     47     291     771     194     3.9     198     50     0.90     48     283     699     155     3.8     184     41     0.70     49     284     696     166     3.8     183     44     3.59     50     267     562     175     3.8     148     46     3.96     51     268     636     178     3.8     167     47     1.11     52     273     709     185     3.7     192     50     0.94     53     269     699     197     3.8     184     52     0.64     54     245     612     189     3.8     161     50     1.06     55     286     667     190     3.8     176     50     0.93     56     245     616     149     3.8     162     39     1.1   平均值     271     667     178     3.8     175     47     1.49     SEM     5     19     5     0.01     5     1     0.38

表9.11(续)

太阳城集团醛固酮+盐   大鼠# 最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg)   胫骨长度     (cm)   左心室重量/   胫骨长度     (mg/cm) 右心室重量/ 胫骨长度   (mg/cm)    ANP(AU)     58     266     784     183     3.8     206     48     11.92     59     271     719     178     3.6     200     49     3.99     60     299     719     223     3.9     184     57     13.41     61     286     779     185     3.9     200     47     3.64     62     274     746     168     3.8     196     44     9.09     63     276     620     154     3.8     163     41     13.13     65     --     849     197     3.9     218     51     6.13     66     266     674     174     3.7     182     47     3.88     平均     277     736     183     3.8     194     48     8.15     SEM     5     25     7     0.03     6     2     1.51

--=由于技术困难没有收集到数据     57*     267     778     208     3.8     205     55   13.32

*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

表9.11(续)

太阳城集团依匹乐酮+醛固酮+盐   大鼠# 最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度     (cm) 左心室重量/   胫骨长度   (mg/cm) 右心室重量/   胫骨长度   (mg/cm) ANP(AU)     67     306     859     216     3.9     220     55     1.26     68     295     712     181     3.8     187     48     1.81     69     286     618     154     3.7     167     42     0.59     70     277     658     174     3.8     173     46     2.58     71     295     754     192     3.8     198     51     4.48     72     281     733     171     3.8     193     45     4.98     73     273     726     181     3.8     191     48     3.82     74     286     696     190     3.8     183     50     3.59     75     ---     700     170     3.8     184     45     0.95     76     276     688     187     3.8     181     49     3.67     平均     286     714     182     3.8     188     48     2.77     SEM     4     20     5     0.01     5     1     0.49

--=由于技术困难没有收集到数据。

表9.12用于表12的个体数据

对照:赋形剂+盐 大鼠# 最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度     (cm)   左心室重量/   胫骨长度     (mg/cm)  右心室重量/   胫骨长度     (mg/cm)   ANP(AU)     87     319     76 0     188     3.9     195     48     0.16     88     337     782     238     3.9     201     61     0.92     89     322     665     179     3.9     171     46     0.36     90     322     802     208     3.8     211     5 5     0.89     91     ---     742     174     3.8     195     46     7.04     92     327     790     200     3.8     208     53     1.89     93     324     747     303     3.8     197     80     3.33     94     301     826     184     3.80     217     48     1.80     95     303     745     178     3.8     196     47     1.08     96     295     756     206     3.9     194     53     0.17     127     313     777     174     3.9     199     45     nd     128     295     677     178     3.8     178     47     nd     129     278     657     165     3.8     173     43     nd     平均     311     748     198     3.8     195     52     1.76     SEM     5     15     10     0.01     4     3     0.66

太阳城集团--=由于技术困难没有收集到数据。

太阳城集团nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据

表9.12(续)

太阳城集团醛固酮+盐   大鼠# 最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度     (cm)   左心室重量/   胫骨长度     (mg/cm)   右心室重量/   胫骨长度     (mg/cm)    ANP(AU)     98     298     846     194     3.8     223     51     4.58     99     261     784     189     3.8     206     50     7.75     100     307     912     208     3.9     234     53     7.34     101     242     720     174     3.8     189     46     4.18     102     307     923     217     3.9     237     56     1.59     103     279     854     186     3.8     225     49     17.81     104     308     894     216     3.9     229     55     6.48     105     290     859     171     3.9     220     44     8.08     106     264     750     153     3.80     197     40     2.51     130     275     818     202     3.8     215     53     nd     131     193     746     195     3.7     202     53     nd     132     215     700     172     3.6     194     48     nd     平均     270     817     189     3.8     214     50     6.7     SEM     11     22     5     0.02     5     1     1.59

太阳城集团nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据     97*     235     809     178     3.9     207     46     5.96

*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

表9.12(续)

依匹乐酮+醛固酮+盐    大鼠# 最终体重     (g) 左心室重  量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度     (cm)   左心室重量/   胫骨长度     (mg/cm) 右心室重量/   胫骨长度     (mg/cm) ANP(AU)     133     281     804     182     3.8     212     48     nd     134     304     898     188     3.8     236     49     2.84     135     293     789     176     3.8     208     46     3.22     136     268     851     189     3.9     221     49     6.39     137     267     668     139     3.8     176     37     4.04     138     247     833     371     3.7     225     100     25.90     139     296     886     193     3.8     233     51     5.52     140     291     756     188     3.8     199     49     3.57     141     297     751     158     3.8     198     42     2.29     142     264     795     155     3.7     215     42     8.37     143     302     915     225     3.9     235     58     4.24     平均     283     813     197     3.8     214     52     6.64     SEM     6     22     19     0.02     6     5     2.22

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据

太阳城集团表9.13用于表13的个体数据

对照:赋形剂+盐 大鼠# 最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度     (cm) 左心室重量/   胫骨长度   (mg/cm) 右心室重量/   胫骨长度   (mg/cm)   ANP(AU)     1     308     686     160     4.0     172     40     0.95     2     337     763     194     4.1     186     47     0.30     4     316     728     162     4.0     182     41     0.12     6     343     721     162     4.1     176     40     1.06     7     291     664     153     4.0     166     38     1.93     8     294     612     180     4.1     149     44     0.24     9     291     613     141     4.0     153     35     1.17     10     332     812     184     4.2     193     44     0.11     平均     314     700     167     4.1     172     41     0.74     SEM     8     25     6     0.03     5     1     0.23

表9.13(续)

醛固酮+盐    大鼠#  最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度   (cm) 左心室重量/   胫骨长度   (mg/cm)  右心室重量/   胫骨长度     (mg/cm)    ANP(AU)     11     289     934     196     4.0     234     49     23.59     12     219     726     148     3.8     191     39     43.11     13     289     963     215     3.9     247     55     14.83     14     282     942     176     3.9     242     45     18.9     15     290     1030     224     3.9     264     57     14.83     16     267     837     173     3.9     215     44     23.43     18     319     962     220     3.9     247     56     15.14     19     263     873     187     4.0     218     47     6.77     20     234     919     185     3.8     242     49     20.97     平均     272     910     192     3.9     233     49     20.17     SEM     10     29     8     0.02     7     2     3.36

表9.13(续)

太阳城集团依匹乐酮+醛固酮+盐 大鼠# 最终体重     (g) 左心室重 量(mg) 右心室重 量(mg) 胫骨长度   (cm) 左心室重量/   胫骨长度     (mg/cm) 右心室重量/   胫骨长度   (mg/cm) ANP(AU)     21     310     873     177     3.9     224     45     1.93     22     343     908     202     4.1     2 33     52     1.15     23     334     899     200     3.9     231     51     4.89     25     299     1063     209     3.9     273     54     21.26     26     361     958     187     3.9     246     48     10.63     27     351     1129     242     3.9     289     62     20.25     28     316     929     189     3.9     238     48     10.20     29     352     805     181     4.0     206     46     4.82     30     317     861     195     3.9     221     50     7.67     平均     331     936     198     3.9     240     51     9.20     SEM     7     34     6     0     9     2     2.44     24*     273     822     178     3.9     211     46     13.45

*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

太阳城集团表9.14用于表14的个体数据

太阳城集团对照:赋形剂+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%) 羟基脯氨酸  (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     47     0.0     2.9     5.11     1.72     1.39     48     0.0     7.1     5.72     0.63     0.80     49     0.0     3.1     3.15     1.97     2.00     50     0.0     4.1     2.37     1.08     1.19     51     0.0     3.4     2.23     1.40     1.09     52     0.0     4.5     2.48     0.73     0.92     53     0.0     2.3     2.35     1.22     1.27     54     0.0     6.6     2.42     0.78     0.91     55     0.0     4.1     4.68     0.54     0.70     56     0.0     6.3     5.21     0.93     0.61     平均     0.0     4.4     3.57     1.1     1.09     SEM     0.0     0.5     0.45     0.15     0.13

表9.14(续)

醛固酮+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%) 羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     58     0     nd     4.48     0.84     0.65     59     0     3.2     4.06     1.40     1.29     60     0     6.5     2.32     1.97     1.67     61     0     nd     2.14     1.89     1.67     62     0     6.1     2.18     1.36     1.59     63     0     6.9     2.31     1.05     1.59     65     0     6.5     2.10     1.33     1.58     66     0     4.4     2.22     1.07     1.30     平均     0     5.6     2.73     1.36     1.42     SEM     0     0.6     0.34     0.14     0.12

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据     57*     0     3.1     3.86     1.71     1.15

太阳城集团*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

表9.14(续)

依匹乐酮+醛固酮+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%) 羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     67     0     4.3     2.02     0.62     0.93     68     0     7.2     4.18     0.92     0.95     69     0     2.9     4.08     0.29     0.43     70     0     3.3     3.96     1.79     1.25     71     0     4.2     4.26     0.78     1.03     72     0     6.6     4.17     0.85     1.14     73     0     4.4     1.90     0.29     0.45     74     0     4.9     1.53     0.42     0.64     75     0     8.8     2.08     1.28     1.33     76     0     6.9     2.41     1.21     2.71     平均     0     5.4     3.06     0.85     1.09     SEM     0     0.6     0.36     0.15     0.21

表9.15用于表15的个体数据

对照:赋形剂+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%) 羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     87     0     4.6     2.03     0.90     0.96     88     0     3.9     2.20     1.60     1.60     89     0     6.5     4.51     0.92     0.80     90     0     4.4     4.07     0.58     0.65     91     0     6.3     4.93     1.28     1.42     92     0     3.1     4.00     0.94     1.05     93     0     4.9     2.89     1.14     1.00     94     0     3.9     3.24     1.07     1.02     95     0     3.2     3.21     1.56     1.00     96     0     3.7     3.16     0.80     0.56     127     0     4.9     2.66     nd     nd     128     0     6.0     2.70     nd     nd     129     0     6.1     2.84     nd     nd     平均     0     4.7     3.26     1.08     1.01     SEM     0     0.4     0.24     0.10     0.10

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据

表9.15(续)

醛固酮+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%) 羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     98     0.0     4.4     2.89     1.15     0.76     99     1.0     5.4     2.91     2.31     1.80     100     0.0     3.2     6.28     0.25     0.44     101     0.0     5.9     5.63     1.89     1.39     102     0.0     4.6     4.83     2.03     1.17     103     1.0     3.9     5.64     1.00     1.24     104     0.0     4.8     5.29     1.20     1.06     105     0.0     4.6     2.76     1.70     1.31     106     1.0     5.9     2.68     0.43     0.59     130     0.0     3.4     2.60     nd     nd     131     3.0     6.4     3.00     nd     nd     132     3.0     9     3.99     nd     nd     平均     0.8     5.1     4.04     1.33     1.08     SEM     0.3     0.5     0.40     0.24     0.14

太阳城集团nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据     97*     3.0     3.2     2.73     2.69     1.22

*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

表9.15(续)

太阳城集团依匹乐酮+醛固酮+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%) 羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     133     1.0     4.1     2.95     0.86     0.60     134     0.0     6.2     5.97     0.86     1.19     135     1.0     3.9     6.52     0.90     1.16     136     0.0     3.7     5.35     1.65     1.24     137     0.0     4.2     6.80     1.14     1.70     138     0.0     3.5     5.32     1.44     1.81     139     1.0     3.3     2.72     0.50     0.60     140     0.0     3.7     3.13     1.24     1.61     141     0.0     5.2     2.41     1.69     2.21     142     2.0     5.6     2.81     2.03     1.80     143     0.0     6.0     5.03     3.02     3.77     平均     0.5     4.5     4.46     1.39     1.61     SEM     0.2     0.3     0.50     0.21     0.26

太阳城集团表9.16用于表16的个体数据

太阳城集团对照:赋形剂+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体 积分数(%) 羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     1     0.0     4.3     2.00     1.69     1.43     2     0.0     4.1     2.71     0.90     0.98     4     0.0     6.4     2.95     1.65     1.02     6     0.0     7.9     3.02     0.90     1.28     7     0.0     5.8     2.81     0.97     0.62     8     0.0     7.7     5.84     1.03     0.54     9     0.0     6.0     5.45     0.69     0.94     10     0.0     7.1     7.03     0.92     0.48     平均     0.0     6.2     3.98     1.09     0.91     SEM     0.0     0.5     0.65     0.13     0.12

太阳城集团醛固酮+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%)  羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     11     1.5     6.6     7.24     2.20     0.75     12     2.5     8.8     8.01     2.02     0.58     13     3.0     7.2     3.62     5.88     1.99     14     2.0     7.1     3.69     1.05     0.72     15     3.0     9.3     4.00     1.32     2.04     16     0.5     6.8     3.54     2.02     1.43     18     2.0     4.0     3.07     1.98     1.82     19     0.3     7.2     3.25     1.63     1.89     20     3.5     14.5     3.09     2.54     1.28     平均     2.0     7.9     4.39     2.29     1.39     SEM     0.4     1.0     0.62     0.47     0.20

表9.16(续)

太阳城集团依匹乐酮+醛固酮+盐     大鼠#   心肌坏死     (0-4) 间质胶原体积   分数(%) 羟基脯氨酸   (μg/mg)     胶原-I     mRNA(AU)     胶原-III     mRNA(AU)     21     0.0     3.4     5.18     1.89     0.95     22     0.0     5.0     6.11     1.54     0.72     23     0.0     6.5     5.17     2.65     1.37     25     0.0     7.9     6.40     1.97     0.89     26     0.0     7.1     2.73     2.98     1.26     27     0.0     6.3     2.84     2.65     1.87     28     0.0     6.1     2.97     2.90     1.66     29     0.0     5.4     2.82     2.88     2.89     30     0.0     7.8     2.72     3.35     2.16     平均     0.0     6.2     4.10     2.53     1.53     SEM     0.0     0.5     0.53     0.20     0.23     24*     0.0     4.4     5.75     2.01     0.73

太阳城集团*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

表9.17用于表17的个体数据

对照:赋形剂+盐   大鼠#   COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU) MCP(AU) TGF-β(AU) ICAM(AU) VCAM(AU)     47     nd     nd     nd     1.32     nd     nd     48     nd     nd     nd     0.66     nd     nd     49     nd     nd     nd     1.46     nd     nd     50     0.57     1.28     1.13     0.72     1.15     1.19     51     1.04     0.94     1.00     1.17     0.94     nd     52     0.99     0.73     0.71     0.80     1.17     1.17     53     0.87     1.00     0.84     1.11     0.82     0.60     54     1.88     nd     nd     0.90     nd     nd     55     1.01     nd     nd     0.52     nd     nd     56     nd     1.66     1.67     1.50     1.00     0.86     平均     1.06     1.12     1.07     0.98     1.02     0.96     SEM     0.18     0.16     0.17     0.12     0.07     0.14

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据

表9.17(续)

太阳城集团醛固酮+盐   大鼠#  COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU) MCP(AU) TGF-β(AU) ICAM(AU) VCAM(AU)     58     2.10     1.84     2.05     1.23     1.39     3.49     59     0.70     0.84     1.78     0.98     0.80     0.85     60     2.01     0.95     3.06     1.31     1.09     2.06     61     2.95     1.05     2.36     1.89     1.61     2.51     62     2.05     1.08     1.95     1.22     1.11     1.65     63     1.94     4.92     2.33     1.45     1.15     0.61     65     3.54     3.29     3.14     1.47     1.56     0.94     66     2.45     1.32     2.40     1.21     1.06     0.27     平均     2.22     1.91     2.38     1.35     1.22     1.55     SEM     0.29     0.51     0.17     0.09     0.10     0.39     57*     0.82     28.64     5.17     1.35     1.68     5.23

太阳城集团*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

表9.17(续)

太阳城集团依匹乐酮+醛固酮+盐   大鼠#   COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU)  MCP(AU) TGF-β(AU) ICAM(AU) VCAM(AU)     67     1.19     0.54     2.35     0.80     0.91     0.67     68     2.85     1.24     1.60     0.81     0.89     0.58     69     0.60     0.52     0.85     0.51     0.89     0.22     70     nd     nd     nd     1.31     nd     nd     71     1.16     0.27     0.83     0.80     0.40     0.57     72     0.82     0.60     1.74     1.02     1.23     nd     73     1.86     1.13     2.38     0.61     nd     nd     74     nd     nd     nd     0.84     nd     nd     75     0.60     0.96     0.67     1.51     0.58     0.53     76     0.91     0.75     2.03     1.64     1.00     1.00     平均     1.25     0.75     1.56     0.99     0.83     0.56     SEM     0.29     0.12     0.25     0.12     0.10     0.08

太阳城集团nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据

太阳城集团表9.18用于表18的个体数据

对照:赋形剂+盐   大鼠# COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU) MCP(AU) TGF-β(AU) ICAM(AU) VCAM(AU)     87     1.69     1.28     1.28     1.21     1.45     0.92     88     0.74     1.13     0.94     1.19     1.11     0.64     89     nd     nd     nd     1.00     nd     nd     90     1.00     0.94     0.73     0.84     1.14     nd     91     1.43     1.00     1.38     1.32     1.23     0.93     92     0.61     1.28     0.91     1.26     0.98     1.00     93     0.84     1.40     1.00     0.86     0.94     1.35     94     1.18     0.87     1.05     0.82     1.00     nd     95     nd     nd     nd     1.00     nd     nd     96     nd     nd     nd     0.74     nd     nd     127     nd     nd     nd     nd     nd     nd     128     nd     nd     nd     nd     nd     nd     129     nd     nd     nd     nd     nd     nd     平均     1.07     1.13     1.04     1.02     1.12     0.97     SEM     0.15     0.08     0.08     0.07     0.07     0.11

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据

表9.18(续)

醛固酮+盐   大鼠#  COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU)   MCP(AU) TGF-β(AU)  ICAM(AU)  VCAM(AU)     98     nd     nd     nd     1.26     nd     nd     99     7.39     8.14     2.42     1.85     1.16     0.89     100     1.83     1.02     1.87     0.55     1.18     0.69     101     5.80     6.19     4.59     1.91     1.75     0.84     102     2.59     4.06     3.19     1.49     1.15     0.72     103     6.63     12.04     3.34     1.18     1.91     2.23     104     4.18     2.35     1.91     1.32     1.19     1.03     105     3.71     8.25     2.50     1.27     1.82     1.65     106     2.62     10.41     2.22     0.56     1.57     1.24     130     nd     nd     nd     nd     nd     nd     131     nd     nd     nd     nd     nd     nd     132     nd     nd     nd     nd     nd     nd     平均     4.34     6.56     2.76     1.27     1.47     1.16     SEM     0.72     1.37     0.32     0.16     0.12     0.19

太阳城集团nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据     97*     23.34     81.29     5.88     1.29     1.84     1.75

太阳城集团*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中。

表9.18(续)

太阳城集团依匹乐酮+醛固酮+盐   大鼠# COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU)    MCP(AU) TGF-β(AU)   ICAM(AU) VCAM(AU)     133     1.56     4.03     1.78     0.58     1.20     0.54     134     1.04     1.00     1.37     0.62     1.36     0.66     135     0.70     0.77     1.27     1.04     0.95     0.61     136     1.41     8.43     1.75     1.42     1.26     0.61     137     3.78     1.59     1.60     1.29     1.56     0.67     138     1.86     3.97     1.24     1.49     0.98     0.86     139     6.19     3.93     1.92     0.71     1.51     1.21     140     1.87     2.13     1.24     1.21     0.79     1.00     141     0.99     0.72     1.89     1.44     0.98     0.68     142     1.92     4.76     2.21     1.69     1.72     1.60     143     0.86     0.99     1.20     2.41     0.83     0.68     平均     2.02     2.94     1.59     1.26     1.19     0.83     SEM     0.49     0.72     0.10     0.16     0.09     0.10

表9.19用于表19的个体数据

太阳城集团对照:赋形剂+盐   大鼠#   COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU)   MCP(AU) TGF-β(AU) ICAM(AU) VCAM(AU)     1     1.15     0.81     2.39     0.53     1.01     0.96     2     1.75     1.46     1.79     0.52     2.29     1.93     4     0.96     0.57     1.00     1.00     0.99     nd     6     0.95     0.82     0.81     1.19     1.60     1.38     7     0.86     1.13     0.52     1.00     nd     nd     8     1.07     1.16     0.53     1.68     0.55     0.45     9     1.00     1.00     1.52     0.90     0.96     1.00     10     nd     nd     nd     1.24     nd     nd     平均     1.11     0.99     1.22     1.01     1.23     1.14     SEM     0.11     0.11     0.27     0.13     0.25     0.25

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据

太阳城集团醛固酮+盐   大鼠#   COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU)   MCP(AU) TGF-β(AU)   ICAM(AU)   VCAM(AU)     11     nd     nd     nd     1.41     nd     nd     12     4.26     13.13     3.94     1.27     nd     nd     13     4.81     11.43     7.19     2.11     2.67     3.48     14     nd     nd     nd     1.20     nd     nd     15     1.54     13.78     1.61     1.95     1.63     1.87     16     nd     nd     nd     1.49     nd     nd     18     3.10     7.97     9.35     0.83     1.69     2.99     19     5.28     18.44     2.30     0.54     1.50     1.64     20     8.20     14.88     2.86     1.21     1.54     0.72     平均     4.53     13.27     4.54     1.33     1.81     2.14     SEM     0.92     1.43     1.25     0.16     0.22     0.49

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据。

表9.19(续)

依匹乐酮+醛固酮+盐   大鼠#  COX-2(AU) 骨桥蛋白(AU)   MCP(AU) TGF-β(AU) ICAM(AU) VCAM(AU)     21     2.44     1.53     2.11     1.00     1.54     1.42     22     0.55     3.28     1.70     1.49     2.06     1.29     23     1.97     1.98     2.21     1.40     1.01     1.49     25     3.41     8.91     1.38     1.31     1.21     1.27     26     3.71     1.88     2.10     0.96     1.26     0.79     27     3.04     1.97     2.02     1.93     1.06     0.52     28     2.11     1.28     1.43     1.54     0.60     0.57     29     1.34     1.43     5.58     1.32     0.99     0.61     30     1.92     1.01     2.11     0.89     nd     1.42     平均     2.28     2.59     2.29     1.32     1.22     1.04     SEM     0.33     0.82     0.42     0.11     0.15     0.14

nd=由于mRNA样品不足而没有报道数据。     24*     12.21     54.57     8.14     1.35     2.92     4.01

*来自这种动物的数据不考虑进行统计分析并不包括在最终的结果 中

结果

血压

整个实验中赋形剂+盐对照组的血压保持正常(表10)。醛固酮+盐诱 导血压随太阳城集团渐进性升高。接受依匹乐酮+醛固酮+盐的动物的收缩血压 在第8-30天显著降低。但是,与赋形剂+盐对照相比血压保持升高。

表10醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理随太阳城集团对血压的影响                                    收缩血压(**Hg)     天   赋形剂+盐     n     醛固酮+盐     n     依匹乐酮+醛固酮+盐     n     3     122±3     4     132±6     8     126±1     9     4     123±1     4     133±4*     8     130±2*     9     5     125±1     4     137±4*     8     132±2*     9     6     130±1     4     148±5*     8     139±3*     9     7     132±1     4     155±5*     8     143±3*     9     8     132±1     4     156±4*     8     142±3*#     9     9     131±1     4     164±5*     8     142±3*#     9     10     127±2     7     168±6*     8     142±2*#     9     11     128±2     7     171±6*     8     143±3*#     9     12     129±2     7     178±6*     8     145±3*#     9     13     128±3     7     182±6*     8     147±3*#     9     14     131±4     7     182±6*     9     150±4*#     9     15     130±2     7     181±5*     9     148±4*#     9     16     129±2     7     187±6*     9     150±4*#     9     17     130±2     7     195±7*     9     154±5*#     9     18     131±3     7     196±6*     9     157±5*#     9     19     127±2     7     200±6*     9     160±5*#     9     20     126±3     7     203±5*     9     160±5*#     9     21     127±2     7     208±4*     9     165±6*#     9     22     128±1     7     209±4*     9     167±6*#     9     23     131±2     7     208±4*     9     172±6*#     9     24     132±2     7     210±3*     9     174±6*#     9     25     130±2     7     210±4*     9     176±6*#     9     26     131±2     7     210±3*     9     180±7*#     9

太阳城集团这些数据如图1图示。

数值为在24小时期间内每5分钟得到的数值的平均±SEM。

太阳城集团*与赋形剂+盐有显著性差异,p<0.05。

#与醛固酮+盐有显著性差异,p<0.05。

体重、心肌肥大和ANP

太阳城集团与赋形剂+盐正常血压的对照相比,接受醛固酮+盐处理的动物在第 7、14和30天体重显著降低(表11-13)。醛固酮+盐处理导致的体重降 低通过在第30天进行依匹乐酮给药而显著减少(表11;图45)。对醛固 酮+盐处理的反应是发生显著的左右心室肥大。左心室肥大在醛固酮+盐 处理7天后明显(表11),而右心室肥大仅在醛固酮+盐处理后30天明显 (表13)。依匹乐酮根本不影响由醛固酮+盐处理诱导的心室重量或心室 重量与胫骨长度比率(表11-13)。在用醛固酮+盐处理的动物上也观察 到心房促尿钠排泄肽(ANP)mRNA水平的升高(表11-13)。依匹乐酮在处 理后30天而不是14天显著降低ANP mRNA上调(表13)。

表11醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理7天后对大鼠 的影响     组   最终体重     (g)   左心室重   量(mg)   右心室重   量(mg)  胫骨长度   (cm)  左心室重量/   胫骨长度   (mg/mm)  右心室重量/   胫骨长度   (mg/mm)     ANP     mRNA     (AU) 赋形剂+盐   271±5   (n=10)   667±19   (n=10)   178±5   (n=10)   3.8±0.01   (n=10)     175±5     (n=10)     47±1     (n=10)   1.49±0.38   (n=10) 醛固酮+盐   277±5   (n=7)   736±25*  (n=8)   183±7   (n=8)   3.8±0.03   (n=8)     194±6*    (n=8)     48±2     (n=8)   8.72±1.51*  (n=8) 依匹乐酮+ 醛固酮+盐   287±4*  (n=9)   714±20   (n=10)   182±5   (n=10)   3.8±0.01   (n=10)     188±5     (n=10)     48±1     (n=10)   2.77±0.49* #(n=10)

太阳城集团数值为处理7天后测定的平均值±SEM。

太阳城集团*与赋形剂+盐对照有显著性差异,p<0.05。

#与醛固酮+盐有显著性差异,p<0.05。

依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

ANP=心房促尿钠排泄肽。

太阳城集团AU=任意单位,相对于亲环素表达测定。

表12醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理14天后对大 鼠的影响     组  最终体重     (g)  左心室   重量   (mg)  右心室   重量   (mg)   胫骨长度     (cm) 左心室重量 /胫骨长度   (mg/mm) 右心室重 量/胫骨长 度(mg/mm)     ANP     mRNA     (AU) 赋形剂+盐   311±5   (n=12) 748±25 (n=13)   198±10   (n=13)   3.8±0.01   (n=13)   195±4   (n=13)   52±3   (n=13)    1.76±0.66    (n=10) 醛固酮+盐   270±11*   (n=12) 817±22* (n=12)   189±5   (n=12)   3.8±0.02   (n=12)   214±5*   (n=12)   50±1   (n=12)    6.70±1.59*    (n=9) 依匹乐酮+ 醛固酮+盐   283±6*   (n=11) 813±22* (n=11)   197±19   (n=11)   3.8±0.02   (n=11)   214±6*   (n=11)   52±5   (n=11)    6.64±2.22*    (n=10)

数值为处理14天后测定的平均值±SEM。

*与赋形剂+盐对照有显著性差异,p<0.05。

依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

太阳城集团ANP=心房促尿钠排泄肽。

太阳城集团AU=任意单位,相对于亲环素表达测定。

太阳城集团表13醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理30天后对大鼠 的影响     组   最终体重(g) 左心室重 量(mg)  右心室重   量(mg)  胫骨长度   (cm) 左心室重量/胫 骨长度(mg/mm)  右心室重量/   胫骨长度   (mg/mm)     ANP     mRNA     (AU)  赋形剂+盐   (n=8)   314±8 700±25 167±6 4.1±0.03     172±5     41±1   0.74±0.23  醛固酮+盐   (n=9)   272±10* 910±29* 192±8* 3.9±0.02*     233±7*     49±2*   20.17±3.36* 依匹乐酮+醛   固酮+盐   (n=9)   331±7# 936±34* 198±6* 3.9±0.00*     240±9*     51±2*   9.20±2.44*#

太阳城集团数值为处理30天后测定的平均值±SEM。

太阳城集团*与赋形剂+盐有显著性差异,p<0.05。

#与醛固酮+盐有显著性差异,p<0.05。

依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

ANP=心房促尿钠排泄肽。

太阳城集团AU=任意单位,相对于亲环素表达测定。

心肌纤维化

太阳城集团实验组间在任何太阳城集团点的间质的胶原体积分数和羟基脯氨酸水平 没有在统计学上不同(表14-16)。与赋形剂+盐对照相比,在醛固酮+盐 和醛固酮+依匹乐酮+盐处理的30天内胶原类型I信使的适度增加(表 16)。胶原类型III mRNA水平在任何太阳城集团点没有显著增加(表14-16)。

表14醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理7天后对大鼠 心肌损伤和纤维化的影响     组   心肌坏死     (0-4)     ICVF(%)    羟基脯氨酸     (μg/mg)    胶原-I(AU)    胶原-III(AU) 赋形剂+盐     0.0±0.0     (n=10)     4.4±0.5     (n=10)     3.57±0.45     (n=10)     1.10±0.15     (n=10)     1.09±0.13     (n=10) 醛固酮+盐     0.0±0.0     (n=8)     5.6±0.6     (n=6)     2.73±0.34     (n=8)     1.36±0.14     (n=8)     1.42±0.12     (n=8) 依匹乐酮+ 醛固酮+盐     0.0±0.0     (n=10)     5.4±0.6     (n=10)     3.06±0.36     (n=10)     0.85±0.15     (n=10)     1.09±0.21     (n=10)

数值为处理7天后测定的平均值±SEM。

依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

ICVF=间质胶原体积分数

太阳城集团胶原-I=胶原类型I mRNA

胶原-III=胶原类型III mRNA

AU=任意单位,相对于亲环素表达测定。

太阳城集团表15醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理14天后对大鼠 心肌损伤和纤维化的影响     组    心肌坏死     (0-4)    ICVF(%)     羟基脯氨酸     (μg/mg)    胶原-I(AU)    胶原-III(AU) 赋形剂+盐     0.0±0.0     (n=13)   4.7±0.4   (n=13)     3.26±0.24     (n=13)     1.08±0.10     (n=13)     1.01±0.10     (n=13) 醛固酮+盐     0.8±0.3     (n=12)   5.1±0.5   (n=12)     4.04±0.40     (n=12)     1.33±0.24     (n=9)     1.08±0.14     (n=9) 依匹乐酮+ 醛固酮+盐     0.5±0.2     (n=11)   4.5±0.3   (n=11)     4.46±0.50     (n=11)     1.39±0.21     (n=11)     1.61±0.26     (n=11)

数值为处理14天后测定的平均值±SEM。

太阳城集团依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

太阳城集团ICVF=间质胶原体积分数

太阳城集团胶原-I=胶原类型I mRNA

太阳城集团胶原-III=胶原类型III mRNA

AU=任意单位,相对于亲环素表达测定。

表16醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理30天后对大鼠 心肌损伤和纤维化的影响     组     心肌坏死      (0-4)   ICVF(%)    羟基脯氨酸     (μg/mg)   胶原-I(AU)   胶原-III(AU)   赋形剂+盐     (n=8)     0.0±0.0   6.2±0.5   3.98±0.65   1.09±0.13   0.91±0.12   醛固酮+盐     (n=9)     2.0±0.4*   7.9±1.0   4.39±0.62   2.29±0.47*   1.39±0.20 依匹乐酮+醛固     酮+盐     (n=9)     0.0±0.0#   6.2±0.5   4.10±0.53   2.53±0.20*   1.53±0.23

太阳城集团数据为处理30天后测定的平均值±SEM。

*与赋形剂有显著性差异,p<0.05。

#与醛固酮+盐有显著性差异,p<0.05。

依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

太阳城集团ICVF=间质胶原体积分数

太阳城集团胶原-I=胶原类型I mRNA

胶原-III=胶原类型III mRNA

AU=任意单位,相对于亲环素表达测定。

心肌组织病理

在处理7、14和30天后用半定量评分系统评价的心肌组织损害。 赋形剂+盐对照的心脏在所有太阳城集团点组织学正常。在处理7天后接受醛 固酮+盐的大鼠的心脏没有鉴定到血管和心肌损害(表14)。相反,从处 理14天开始观察到病灶性动脉和心肌改变(表15和16)。醛固酮+盐处 理14天和30天后的动脉和心肌的质变类似,但频率和严重程度随太阳城集团 增大。如图44所示,依匹乐酮给药显著减少所有太阳城集团点的心肌损伤(表 14-16)。

炎症介质的基因表达

太阳城集团用定量Taqman PCR分析评价多种前炎症分子的表达水平(表 17-19)。环加氧酶-2(COX-2)和单核细胞化学吸引蛋白(MCP-1)的表达水 平类似,并通过醛固酮+盐处理而在所有的太阳城集团点显著增加。骨桥蛋白 表达在醛固酮+盐处理后14天(6倍)和30天(13倍)也显著上调(表 18-19)。转化生长因子β-1(TGF-β,mRNA水平在任何检查太阳城集团点没有上 调。细胞内粘附分子-1(ICAM-1)mRNA表达在醛固酮+盐处理后14和30 天上调,虽然增加是适度的(表9-10)。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1) 的基因表达在醛固酮+盐处理第30天增加2倍,但是这种增加没有达到 统计学显著性(表19)。与用醛固酮+盐处理的动物的基因表达相比,依 匹乐酮显著降低所有标记基因的表达(图46)。

表17.醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理7天后对大鼠 炎症标记物的相对mRNA表达的影响     组     COX-2    mRNA(AU)    骨桥蛋白    mRNA(AU)     MCP-1    mRNA(AU)    TGF-β1    mRNA(AU)     ICAM    mRNA(AU)     VCAM    mRNA(AU) 赋形剂+盐   1.06±0.18     (n=6)   1.12±0.16     (n=5)   1.07±0.17     (n=5)   0.98±0.12     (n=10)   1.02±0.12     (n=5)   0.96±0.14     (n=5) 醛固酮+盐   2.22±0.29*     (n=8)   1.91±0.51     (n=8)   2.38±0.17*     (n=8)   1.35±0.09     (n=8)   1.22±0.10     (n=8)   1.55±0.39     (n=8) 依匹乐酮+ 醛固酮+盐   1.25±0.27#    (n=8)   0.75±0.12     (n=8)   1.56±0.25#    (n=8)   0.99±0.12     (n=10)   0.83±0.10     (n=7)   0.56±0.08     (n=6)

数值为处理7天后任意单位的mRNA表达平均值±SEM(相对于亲环 素表达)。

*与赋形剂+盐有显著性差异,p<0.05。

太阳城集团#与醛固酮+盐有显著性差异,p<0.05。

太阳城集团依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

COX-2=环加氧酶-2。

MCP-1=单核细胞化学吸引蛋白-1。

太阳城集团TGF-β1=转化生长因子β-1。

ICAM=分子内粘附分子-1。

VCAM=血管细胞粘附分子-1。

表18.醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理14天后对大 鼠炎症标记物的相对mRNA表达的影响     组     COX-2    mRNA(AU)    骨桥蛋白    mRNA(AU)     MCP-1    mRNA(AU)   TGF-β1   mRNA(AU)     ICAM    mRNA(AU)     VCAM    mRNA(AU) 赋形剂+盐   1.07±0.15     (n=7)   1.13±0.08     (n=7)   1.04±0.08     (n=7)   1.02±0.07     (n=10)   1.12±0.07     (n=7)   0.97±0.11     (n=7) 醛固酮+盐   4.34±0.72*    (n=8)   6.56±1.37*    (n=8)   2.76±0.32*    (n=8)   1.27±0.16     (n=9)   1.47±0.12*    (n=8)   1.16±0.19     (n=8) 依匹乐酮+ 醛固酮+盐   2.02±0.49*#    (n=11)   2.94±0.72#*    (n=11)   1.59±0.10*#    (n=11)   1.26±0.16     (n=11)   1.19±0.09#    (n=11)   0.83±0.10     (n=11)

数值为处理14天后任意单位的mRNA表达平均值±SEM(相对于亲环 素表达)。

*与赋形剂+盐有显著性差异,p<0.05。

太阳城集团#与醛固酮+盐有显著性差异,p<0.05。

依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

COX-2=环加氧酶-2。

太阳城集团MCP-1=单核细胞化学吸引蛋白-1。

太阳城集团TGF-β1=转化生长因子β-1。

ICAM=分子内粘附分子-1。

太阳城集团VCAM=血管细胞粘附分子-1。

太阳城集团表19.醛固酮+盐单独或与依匹乐酮联合处理在处理30天后对大 鼠炎症标记物的相对mRNA表达的影响     组     COX-2    mRNA(AU)    骨桥蛋白    mRNA(AU)     MCP-1    mRNA(AU)   TGF-β1   mRNA(AU)     ICAM    mRNA(AU)     VCAM    mRNA(AU) 赋形剂+盐   1.11±0.11     (n=7)   0.99±0.11     (n=7)   1.22±0.27     (n=7)   1.01±0.13     (n=8)   1.23±0.25     (n=6)   1.14±0.25     (n=5) 醛固酮+盐   4.53±0.92*    (n=6)   13.27±1.43*    (n=6)   4.54±1.25*    (n=6)   1.33±0.16     (n=9)   1.81±0.22*    (n=5)   2.14±0.49     (n=5) 依匹乐酮+醛   固酮+盐   2.28±0.33*#    (n=9)   2.59±0.82*#    (n=9)   2.29±0.42*#    (n=9)   1.32±0.11     (n=9)   1.22±0.15#    (n=8)   1.04±0.14#    (n=9)

数值为处理30天后任意单位的mRNA表达平均值±SEM(相对于亲环 素表达)。

*与赋形剂+盐有显著性差异,p<0.05。

#与醛固酮+盐有显著性差异,p<0.05。

依匹乐酮剂量为100mg/kg/天。

COX-2=环加氧酶-2。

MCP-1=单核细胞化学吸引蛋白-1。

太阳城集团TGF-β1=转化生长因子β-1。

太阳城集团ICAM=分子内粘附分子-1。

太阳城集团VCAM=血管细胞粘附分子-1。

免疫组织化学

醛固酮+盐诱导的前炎症反应的分子分析用免疫组织化学分析进行 进一步表征。粘附于内皮并渗透血管周围空间的大部分细胞的染色对单 核细胞/巨噬细胞抗体(ED-1)阳性,而对T细胞抗体(CD-3)阴性。与赋 形剂+盐对照的心脏中不存在骨桥蛋白染色相比,醛固酮+盐处理大鼠的 心脏的骨桥蛋白表达是明显可见的。骨桥蛋白表达主要位于受影响和某 些未受影响的冠状动脉的中间细胞,但还存在于血管周围空间和心肌坏 死区域的某些巨噬细胞中。在心肌细胞中没有发现明显的骨桥蛋白表 达。在内皮细胞和血管周围空间鉴定了ICAM-1染色。但是,VCAM-1主 要在内皮细胞中表达。依匹乐酮给药显著减轻醛固酮+盐处理诱导的所 有被评价的标记蛋白的心肌组织的染色。

骨桥蛋白mRNA的原位杂交

太阳城集团进行原位杂交以将骨桥蛋白表达定位于心肌组织。在冠状动脉的中 间细胞中发现大部分的骨桥蛋白mRNA;但还在血管周围细胞和渗透局 部缺血和坏死区域的细胞中发现骨桥蛋白太阳城集团。骨桥蛋白mRNA在心肌 细胞或未影响的间质区域中未出现。

结论

太阳城集团在盐诱导的血管炎症和心组织损害的情况下用醛固酮处理大鼠。醛 固酮+盐处理诱导的这种损害之前是炎症反应,其特征是前炎症分子上 调。依匹乐酮显著减少最初的血管炎症反应和随后的心肌损伤。

可以获得许多其它适于评价心血管症状的预防,包括动脉粥样硬化 的预防的动物模型。参见Stehbens,Prog.Card.Dis.,XXIX, 1007-28(1986)和Zhang等人,Science,258,468-71(1992)。

太阳城集团在本发明的另一个实施方案中,公开了一种治疗或预防脉管炎的方 法。贝切特氏病(BD)是一种多系统疾病,其特征在于脉管炎。已提出BD 和结肠的憩室疾病有关。Sahan C等人,Behcet’s Disease and Diverticulosis Dig Surg 2001,18(5):421-2。用于本发明方法的醛固 酮阻滞剂用于治疗和预防心血管炎症。因此,本发明的方法将用于治疗 和预防贝切特氏病和憩室疾病,包括结肠憩室疾病。

在本发明的另一个实施方案中,公开了一种治疗或预防心肌炎的方 法。在本发明的另一个实施方案中,公开了一种治疗或预防心肌病的方 法。

大鼠实验性自体免疫性心肌炎(EAM)

太阳城集团在心脏肌球蛋白诱导的自体免疫心肌炎之后大鼠的膨胀心肌病可 以用作慢性心衰的动物模型。用猪心脏肌球蛋白诱导Lewis大鼠的实验 性自体免疫性心肌炎。特征为在损害处出现多核巨大细胞的急性严重性 心肌炎在免疫后第15天引起。暴发性心肌炎持续至大约第28天,然后 炎性细胞从心肌中的渗出平息。在自体免疫巨大细胞心肌炎痊愈之后, 可见类似人膨胀心肌病的慢性心衰。治疗期可能持续6周,例如大约29 天。在一个实例中,构建小组以确定治疗的效力。例如可以构建四组。 一组可以是对照组,用赋形剂,例如用盐水处理。其它组可以由用低剂 量、中等剂量和高剂量醛固酮阻滞剂给药的大鼠组成。在一个特别优选 的实例中,第一组以大约20毫克环氧美沙乐酮/千克/体重/天的低剂量 给药。第二组以大约100毫克环氧美沙乐酮/千克体重/天的中等剂量给 药。第三组以500毫克环氧美沙乐酮/千克体重/天的高剂量给药。可以 通过测定心脏重塑的不同指标来展示效力。非限制性的指标包括:血液 动力学参数,例如左心室收缩压、右心室终点舒张压张;病理发现,例 如心脏重量,心脏重量与体重比率,心肌纤维化面积和胶原纤维组分的 测定;以及已知影响重塑的翻译不同蛋白质,例如转化生长因子 -β(TGF-β)的mRNA的表达。据信,本发明的方法有效地治疗和预防心肌 炎和心肌病。

太阳城集团生长和分化因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族调节极宽范围的 成人的生物功能,并对胚胎发育期间的图式发育和细胞命运决定是非常 重要的。TGF-β具有宽泛的生物作用。具体而言,它刺激细胞外基质组 分的产生,且它通过抑制蛋白酶的表达和增加蛋白酶抑制剂的表达而抑 制细胞外基质的降解。这些对生长和细胞外基质的作用对心肌病的发展 是重要的。

太阳城集团Roselear等人,(Arterioscle.Thromb.Vasc.Biol.,16, 1013-18(1996))描述了动脉粥样硬化的APOe小鼠模型。醛固酮阻滞剂 应该具有防止动脉粥样硬化损害的活性。

太阳城集团虽然根据特定的实施方案描述本发明,但不应将这些实施方案的细 节认为是限定。

本文引用的参考专利文献作为本文的参考。

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本文标题:用于预防或治疗炎症相关病症的醛固酮阻滞剂治疗.pdf
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