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天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途.pdf

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天花粉 皂苷 保护 蛛网膜 出血 神经细胞 中的 用途
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摘要
申请专利号:

CN201210176044.0

申请日:

20120531

公开号:

CN102670695A

公开日:

20120919

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K36/428,A61P25/00 主分类号: A61K36/428,A61P25/00
申请人: 河南科技学院
发明人: 陈颖,黄立勇,苗永红,赵元增,杨靖,曹银萍,孙海燕
地址: 453003 河南省新乡市华兰大道东段河南科技学院
优先权: CN201210176044A
专利代理机构: 郑州大通专利商标代理有限公司 代理人: 陈大通
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法律状态
申请(专利)号:

CN201210176044.0

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途。通过实验及其结果可知,天花粉皂苷在1~10mg/L浓度时具有保护神经细胞免受损伤的能力;而在15~25mg/L浓度时除具有保护神经细胞免受损伤作用的同时还能抑制神经细胞凋亡,进而避免神经细胞死亡。随着口服天花粉皂苷浓度的升高,其对神经细胞的保护作用越强,在25mg/L时神经功能评分与对照组无差异。因此,天花粉皂苷为蛛网膜下腔出血后拮抗神经细胞凋亡,及提高对神经细胞保护的重要影响药物,将在保护神经细胞功能方面有很大的用途,在通过避免神经细胞凋亡和提高对神经细胞的保护能力治疗蛛网膜下腔出血方面具有很大的开发应用前景。

权利要求书

1.一种天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途。2.根据权利要求1所述的天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途,其特征在于:天花粉皂苷在诱导蛛网膜下腔出血后神经细胞抗凋亡中的用途。3.根据权利要求2所述的天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途,其特征在于:所述天花粉皂苷在诱导蛛网膜下腔出血后神经细胞抗凋亡中的用途时,其天花粉皂苷的浓度为15~25 mg/L。4.根据权利要求1所述的天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途,其特征在于:天花粉皂苷在保护神经细胞中的用途。5.根据权利要求4所述的天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途,其特征在于:所述天花粉皂苷在保护神经细胞中的用途时,其天花粉皂苷的浓度为1~10 mg/L。

说明书

技术领域

本发明涉及一种天花粉皂苷的用途,特别是涉及一种天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途。

背景技术

蛛网膜下腔出血多由长期高血压病、脑血管畸形、颅内动脉瘤破裂等因素引起。虽然其发病率约占脑血管病的20~30%左右,但其发病呈年轻化趋势,并且致死率和致残率位居脑血管疾病的首位。由于颅内出血后常压迫脑组织,使血液循环受阻,病人常表现出颅内压增高、意识障碍等症状。脑血管疾病的发生发展机制复杂,涉及到多系统多环节的异常。而神经细胞凋亡后导致脑组织结构的改变,加重脑损伤,最终诱发疾病的加重及患者预后较差。因而保护神经细胞,抑制脑组织神经细胞的凋亡是蛛网膜下腔出血治疗的靶点之一。迄今为止,在治疗蛛网膜下腔出血疾病时还没有一种特效药,且临床效果不尽如人意。而中药含多种有效成分,因此在治疗时可同时在多层次、多靶点、多环节发挥作用,且毒副作用小。

太阳城集团天花粉为葫芦科植物栝楼的干燥根,主要来自栝楼(Trichosanthes kirilowiiMax)和双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harm),且栝楼和双边栝楼皆被2010版《中国药典》收载。但不局限于南方栝楼(T.da miaoshanensis C. Y. Cheng et Yueh)、大子栝楼(T.truncata C. B . Clarke)、王瓜(T. cucumeroides (Ser.) Maxim)、蛇瓜(TrichosanthesanguinaL)、日本栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim Var japonica(Miq.)kitam)、大苞栝楼(Trichosanthes tricuspidata Lour. )、异株栝楼(Trichosanthes dioica Roxb.)、凤瓜(Trichosanthes integrifolia ( Roxb.) kur)等。天花粉中含有天花粉蛋白、天花粉多糖、天花粉皂苷等多种物质。对天花粉研究较为深入的是天花粉蛋白,而对天花粉皂苷方面的研究,仅见对其提取工艺、体外抗氧化(陈颖等. 天花粉总皂苷的提取及其清除DPPH自由基作用的研究.药物生物技术, 2010, 17(5):397-399;陈颖等. 天花粉中总三萜皂苷的含量分析.中国野生植物资源,2010,29(4): 61-63.陈颖等. 正交试验优选天花粉总皂苷的提取工艺. 时珍国医国药, 2011,189(7): 1668-1669)及在脑缺血中的研究(陈颖等. 天花粉皂苷及其在制备治疗缺血性脑血管疾病药物中的用途.申请号201010537400.8)。而天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞的过程中所进行的药理学研究,经权威机构检索查新,目前国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种天花粉皂苷的新用途,即天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途。

太阳城集团本发明提供一种天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途。

根据上述的天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途,天花粉皂苷在诱导蛛网膜下腔出血后神经细胞抗凋亡中的用途;所述天花粉皂苷在诱导蛛网膜下腔出血后神经细胞抗凋亡中的用途时,其天花粉皂苷的浓度为15~25 mg/L。

根据上述的天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途,天花粉皂苷在保护神经细胞中的用途;所述天花粉皂苷在保护神经细胞中的用途时,其天花粉皂苷的浓度为1~10 mg/L。

本发明涉及的天花粉皂苷对蛛网膜下腔出血后神经细胞保护中的用途。其中,保护神经细胞质膜在蛛网膜下腔出血后免受损伤的作用,激活神经细胞内起保护作用的信号分子表达的天花粉皂苷的浓度为1~10 mg/L。

另外,天花粉皂苷诱导蛛网膜下腔出血后神经细胞抗凋亡中的用途;其中,避免神经细胞凋亡,抑制神经细胞DNA片段化的天花粉皂苷的浓度为15~ 25mg/L。

为了更好地理解本发明的实质,下面用天花粉皂苷的药理学实验及结果来说明天花粉皂苷在拮抗蛛网膜下腔出血后神经细胞凋亡、保护神经细胞质膜免受损伤中的用途,即天花粉皂苷在保护蛛网膜下腔出血后神经细胞中的用途。

太阳城集团天花粉皂苷的制备:以常规方法提取天花粉皂苷,其具体操作方法为:

(1)、称取一定量的天花粉,将天花粉进行粉碎,粉碎后过20~60目筛,得到天花粉粉末,在天花粉粉末中加入水或一定浓度的乙醇(乙醇的重量百分浓度通常为50~95%),水或乙醇的加入量为天花粉粉末重量的5~20倍,加入水或乙醇后采用超声波提取器(所述超声波提取器的频率为30 kHz,功率为400~450W)进行超声提取,每次提取太阳城集团为10~20min,提取3次,将3次提取液进行合并;

太阳城集团(2)、将步骤(1)合并得到的提取液采用萃取仪(采用Ninson超声波萃取仪)进行萃取(萃取时采用的萃取剂为正丁醇、氯仿和乙酸乙酯中的任一种;采用的萃取剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为1~50:1),萃取后留取有机溶剂相,将所得溶液先通过大孔吸附树脂(大孔吸附树脂的型号为D101,D101B, D201,D301, D3520, AB-8,DM130,X-5, XDA-1, XDA-1B, XDA-7,H-20, H-30, H-40,H-60,HPD-100,HPD-300, HPD-600, NK-2, NKA-2, NK-9 和WLD中的任一种;所述大孔吸附树脂与溶液二者之间的体积比例为4~10:1)进行分离纯化,接着采用硅胶柱层析法进一步纯化(所述采用硅胶柱层析法进一步纯化时,其硅胶目数为60~300目;所述采用硅胶柱层析法进一步纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱,洗脱流速为8~12 ml/min;所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为50~85︰14~40︰1~10),纯化后将其样品先采用8倍柱体积的水洗脱至澄清(采用8倍柱体积的水洗脱时,其洗脱流速为1~2 ml/min),再用6倍柱体积的乙醇洗脱(用6倍柱体积的乙醇洗脱时,其洗脱流速为2~3ml/min,乙醇的体积浓度为50~60%),收集乙醇洗脱液;

(3)、将步骤(2)收集的乙醇洗脱液,采用旋转蒸发仪进行干燥(压力为0.6Mpa,干燥温度为50℃,旋转蒸发仪的旋转速度为60rmp,旋转蒸发干燥太阳城集团为3小时),干燥后得到膏状天花粉皂苷,最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥(真空度为0.085Mpa,干燥温度为55℃,干燥太阳城集团为3小时)、粉碎,得到粉状淡黄色天花粉皂苷备用(所得天花粉皂苷的纯度大于90%)。采用时调整到合适浓度即可。

蛛网膜下腔出血模型的制备:小鼠随机分为对照组(n = 6)和实验组(n = 66)。对照组在造模前和造模后均未给予天花粉皂苷治疗,实验组以不同剂量的天花粉皂苷灌胃。首先将冻存的溶血产物溶解恢复至37℃备用。昆明小鼠术前禁食,自由饮水。10%水合氯醛腹腔注射(50ml/kg)麻醉后,头部皮肤常规局部消毒,切开颅顶部皮肤,暴露颅骨并去除颅膜。7#注射针头在距前卤“十”字缝右侧3.5 mm处钻一直径约1 mm大小的洞。50μl微量进样器(上海光正医疗仪器有限公司)吸取备用的溶血产物50μl,沿针孔垂直进针5mm后,缓慢注入到脑组织。注血太阳城集团控制在10 ± 2 min内,注血完毕后,原位留针10min,4号线缝合皮肤。小鼠自然苏醒,自由饮食(详见附图1)。

采用细胞生物学和分子生物学的方法,进行如下实验:研究天花粉皂苷对溶血产物诱导的蛛网膜下腔出血小鼠的神经细胞保护及抗凋亡的影响:

太阳城集团1、用TUNEL方法检测神经细胞凋亡:对照组及不同实验组脑组织切片二甲苯脱蜡后,梯度酒精复水。在21℃~37℃下用蛋白酶K消化15~30 min。PBS清洗2次后,加入50μl TUNEL反应混合物37℃避光孵育60min。PBS清洗3次后,用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜观察。结果发现:天花粉皂苷10~25 mg/L浓度处理蛛网膜下腔出血小鼠5天时,抑制神经细胞凋亡;天花粉皂苷在1~10mg/L浓度时与对照相比凋亡的神经细胞数量未有明显改变(详见附图2)。

太阳城集团2、用2,4-二硝基苯肼方法检测LDH表达,以判断天花粉皂苷对神经细胞的细胞质膜保护情况:按南京建成试剂盒说明操作。取0.2%不同实验组和对照组小鼠脑组织匀浆35 μl检测LDH活力。分别设标准管(标准液0.02ml)、标准空白管(蒸馏水0.15 ml)、测定管(样品0.035 ml)及测定空白管(样品0.035 ml和蒸馏水0.115 ml),加入基质缓冲液0.25 ml。测定管中再加入辅酶I 0.05 ml,后37℃水浴15 min。加入0.25 ml的2,4-二硝基苯肼后37℃再水浴15 min。最后加入0.4 mol/L氢氧化钠2.5 ml室温放置3 min后440nm测光吸收。活力单位为U/L。组织中LDH活性=(OD测定管-OD对照管)/(OD标准管-OD空白管) × C标准浓度/ C待测样本蛋白浓度。天花粉皂苷对神经细胞的保护详见表1:

表1  天花粉皂苷对神经细胞的保护

注:表1中天花粉皂苷治疗5天,n = 6;x ± s; * P < 0.05, **P < 0.01与对照组相比。

太阳城集团3、用免疫组化方法检测神经细胞NF-κB表达,以判断天花粉皂苷促进神经细胞生长的作用:组织切片梯度复水后,95℃抗原修复10~30min后正常山羊血清封闭15min。加入一抗37℃孵育2~3h后以生物素标记二抗孵育30min后DAB显色,中性树脂封片(详见附图3)。

4、神经功能障碍指标测定:按Zausinger六分法进行神经功能评分,将小鼠分为6个等级评分。0分:不能自由行走;1分:自由走动状态下向病变对侧旋转;2分:抓住鼠尾,小鼠向病变对侧旋转;3分:对于施向病变对侧的侧压力抵抗力下降;4分:不能伸直病变对侧前爪,甚至全身向对侧屈曲;5分:无神经功能缺损。天花粉皂苷治疗后蛛网膜下腔出血小鼠神经功能评分结果详见表2。

表2   神经功能障碍指标测定

注明:表2中天花粉皂苷治疗5天,n = 6;x ± s; *P < 0.05, **P < 0.01与对照组相比。

5、实验数据统计学处理:实验数据以平均值±标准差表示,经t检验:P<0.05表示有明显差异,P<0.01有极显著性差异。

由上述实验及其结果,可以得出如下结论:

天花粉皂苷在1~10 mg/L浓度时具有保护神经细胞免受损伤的能力;而在15~25 mg/L 浓度时除具有保护神经细胞免受损伤的作用,还能抑制神经细胞凋亡,进而避免神经细胞死亡。随着口服天花粉皂苷浓度的升高,其对神经细胞的保护作用越强,在25mg/L时神经功能评分与对照组无差异。因此,天花粉皂苷为蛛网膜下腔出血后拮抗神经细胞凋亡,及提高对神经细胞保护的重要影响药物,将在保护神经细胞功能方面有很大的用途,在通过避免神经细胞凋亡和提高对神经细胞的保护能力治疗蛛网膜下腔出血方面具有很大的开发应用前景。

四、附图说明:

图1 是制备小鼠蛛网膜下腔出血模型的大体标本;

太阳城集团图1中:A为正常小鼠脑组织,B为蛛网膜下腔出血小鼠脑组织。

图2 是荧光显微镜下所示神经细胞TUNEL 结果;

太阳城集团图2 中:A为对照组,B为5mg/L量天花粉皂苷治疗后的神经细胞凋亡,C为20mg/L量天花粉皂苷治疗后的神经细胞凋亡。

太阳城集团图3 是免疫组化所示神经细胞NF-κB的表达;

图3中:A为对照组,B为5mg/L量天花粉皂苷治疗组,C为20mg/L量天花粉皂苷治疗组。

图4 是免疫组化所示神经细胞p53的表达;

图4中:A为对照组,B为5mg/L量天花粉皂苷治疗组,C为20mg/L量天花粉皂苷治疗组。

太阳城集团图5 是免疫组化所示神经细胞caspase-3的表达;

太阳城集团图5中:A为对照组,B为5mg/L量天花粉皂苷治疗组,C为20mg/L量天花粉皂苷治疗组。

太阳城集团图6 是免疫组化所示神经细胞JNK的表达;

太阳城集团图6中:A为对照组,B为5mg/L量天花粉皂苷治疗组,C为20mg/L量天花粉皂苷治疗组。

太阳城集团 五、具体实施方式:

以下结合实施例对本发明作进一步说明,但并不限制本发明的内容。

实施例1:

天花粉皂苷的分离提取方法:按照常规提取方法进行提取,具体操作步骤为:

太阳城集团(1)、称取一定量的天花粉,将天花粉进行粉碎,粉碎后过20~60目筛,得到天花粉粉末,在天花粉粉末中加入水或一定浓度的乙醇(乙醇的重量百分浓度通常为50~95%),水或乙醇的加入量为天花粉粉末重量的5~20倍,加入水或乙醇后采用超声波提取器(所述超声波提取器的频率为30 kHz,功率为400~450W)进行超声提取,每次提取太阳城集团为10~20min,提取3次,将3次提取液进行合并;

(2)、将步骤(1)合并得到的提取液采用萃取仪(采用Ninson超声波萃取仪)进行萃取(萃取时采用的萃取剂为正丁醇、氯仿和乙酸乙酯中的任一种;采用的萃取剂与合并得到的提取液二者之间加入量的体积比例为1~50:1),萃取后留取有机溶剂相,将所得溶液先通过大孔吸附树脂(大孔吸附树脂的型号为D101,D101B, D201,D301, D3520, AB-8,DM130,X-5, XDA-1, XDA-1B, XDA-7,H-20, H-30, H-40,H-60,HPD-100,HPD-300, HPD-600, NK-2, NKA-2, NK-9 和WLD中的任一种;所述大孔吸附树脂与溶液二者之间的体积比例为4~10:1)进行分离纯化,接着采用硅胶柱层析法进一步纯化(所述采用硅胶柱层析法进一步纯化时,其硅胶目数为60~300目;所述采用硅胶柱层析法进一步纯化时采用“氯仿-甲醇-水”三者的混合液作为溶剂进行洗脱,洗脱流速为8~12 ml/min;所述“氯仿-甲醇-水”三者之间的混合体积比例为50~85︰14~40︰1~10),纯化后将其样品先采用8倍柱体积的水洗脱至澄清(采用8倍柱体积的水洗脱时,其洗脱流速为1~2 ml/min),再用6倍柱体积的乙醇洗脱(用6倍柱体积的乙醇洗脱时,其洗脱流速为2~3ml/min,乙醇的体积浓度为50~60%),收集乙醇洗脱液;

(3)、将步骤(2)收集的乙醇洗脱液,采用旋转蒸发仪进行干燥(压力为0.6Mpa,干燥温度为50℃,旋转蒸发仪的旋转速度为60rmp,旋转蒸发干燥太阳城集团为3小时),干燥后得到膏状天花粉皂苷,最后将膏状天花粉皂苷进行真空干燥(真空度为0.085Mpa,干燥温度为55℃,干燥太阳城集团为3小时)、粉碎,得到粉状淡黄色天花粉皂苷备用(所得天花粉皂苷的纯度大于90%)。采用时调整到合适浓度即可。

将上述所得淡黄色天花粉皂苷配成1mg/L,2.5mg/L,5mg/L,7.5mg/L,10mg/L,12.5mg/L,15mg/L,17.5mg/L,20mg/L,22.5mg/L,25mg/L等浓度,连续灌胃治疗蛛网膜下腔出血小鼠5天后取材。通过实验结果可以看到:1~10 mg/L的药物浓度处理蛛网膜下腔出血小鼠时,神经细胞NF-κB的表达升高,LDH的表达降低,从而保护神经细胞免受损伤;而15~25mg/L浓度时随药物浓度的增加神经细胞凋亡数目不断减少,25 mg/L浓度时仅有10%的神经细胞凋亡,而对照组此时的凋亡细胞为28%;进而对神经细胞起到保护作用。

实施例2:

天花粉皂苷的分离提取方法与实施例1相同。

天花粉皂苷对蛛网膜下腔出血小鼠p53表达的作用:

太阳城集团将上述所得淡黄色天花粉皂苷配成1mg/L,2.5mg/L,5mg/L,7.5mg/L,10mg/L,12.5mg/L,15mg/L,17.5mg/L,20mg/L,22.5mg/L,25mg/L等浓度,连续灌胃治疗蛛网膜下腔出血小鼠5天后取材。用p53特异性抗体(Santa cruz,sc-6243)通过免疫组化方法检测其表达。通过实验结果可以看到:随天花粉皂苷浓度的增加p53的表达减少(详见附图4)。定量分析显示对照组p53的表达量为0.052763;低剂量组p53的表达基本在0.039358左右,与对照组相比无显著性差异,而高剂量组时p53的表达在0.021859左右,与对照组相比有显著性差异。天花粉皂苷高剂量组通过抑制p53的表达拮抗神经细胞的凋亡。

实施例3:

天花粉皂苷的分离提取方法与实施例1相同。

天花粉皂苷对蛛网膜下腔出血小鼠caspase-3表达的作用:

将上述所得淡黄色天花粉皂苷配成1mg/L,2.5mg/L,5mg/L,7.5mg/L,10mg/L,12.5mg/L,15mg/L,17.5mg/L,20mg/L,22.5mg/L,25mg/L等浓度,连续灌胃治疗蛛网膜下腔出血小鼠5天后取材。用caspase-3特异性抗体(Santa cruz,sc-7148)通过免疫组化方法检测其表达。通过实验结果可以看到:随天花粉皂苷浓度的增加caspase-3的表达减少(图5)。定量分析显示对照组caspase-3的表达量为0.0761,低剂量组caspase-3的表达基本维持在0.0602左右,与对照组相比显著性差异,而高剂量组caspase-3的表达基本维持在0.0361 左右,与对照组相比差异显著。天花粉皂苷高剂量组通过抑制caspase-3的表达拮抗神经细胞的凋亡。

实施例4:

太阳城集团天花粉皂苷的分离提取方法与实施例1相同。

天花粉皂苷对蛛网膜下腔出血小鼠JNK表达的作用

太阳城集团将上述所得淡黄色天花粉皂苷配成1mg/L,2.5mg/L,5mg/L,7.5mg/L,10mg/L,12.5mg/L,15mg/L,17.5mg/L,20mg/L,22.5mg/L,25mg/L等浓度,连续灌胃治疗蛛网膜下腔出血小鼠5天后取材。用JNK特异性抗体(Santa cruz, sc-572)通过免疫组化方法检测其表达。通过实验结果可以看到:随天花粉皂苷浓度的增加JNK的表达减少(详见附图6)。定量分析显示对照组JNK的表达量为0.03156,低剂量组其表达基本维持在0.0284左右,相反高剂量组JNK的表达基本维持在0.4018左右,与对照组相比差异显著。蛛网膜下腔出血后天花粉皂苷通过抑制JNK活性对神经细胞起保护作用。

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