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牛膝多糖硫酸酯的抗艾滋病和免疫调节新用途.pdf

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牛膝 多糖 硫酸 艾滋病 免疫调节 用途
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摘要
申请专利号:

CN200510055374.4

申请日:

20050321

公开号:

CN1686159A

公开日:

20051026

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K31/737,A61P31/18,A01N31/00 主分类号: A61K31/737,A61P31/18,A01N31/00
申请人: 中国医学科学院医药生物技术研究所,中国科学院上海有机化学研究所,浙江京新药业股份有限公司
发明人: 陈鸿珊,田庚元,吕刚,彭宗根,徐愿坚,王学强,郭志敏,张丽丽,滕立
地址: 100050北京市天坛西里1号
优先权: CN200510055374A
专利代理机构: 北京华科联合专利事务所 代理人: 杨厚;王为
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN200510055374.4

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明涉及一种牛膝多糖硫酸酯的新用途,其药效学试验证明,该化合物具有较好的抗艾滋病病毒和调节免疫的作用,可制备成治疗或预防艾滋病病毒感染的药物或消毒剂。

权利要求书

1.牛膝多糖硫酸酯在制备治疗或预防艾滋病病毒感染药物中的应用。2.牛膝多糖硫酸酯在制备调节免疫功能药物中的应用。3.牛膝多糖硫酸酯在制备治疗或预防艾滋病病毒感染消毒剂中的应用。4.牛膝多糖硫酸酯在制备治疗或预防艾滋病病毒所致机会性感染药物中的应用。

说明书



技术领域:

本发明涉及牛膝多糖硫酸酯在抗艾滋病病毒性疾病和免疫调节中的应用。

背景技术:

太阳城集团艾滋病自1981年发现以来,在全球范围迅速蔓延成为人类严重的灾难。目前世 界上虽有抗HIV的药物20种,其中包括11种逆转录酶抑制剂、8种蛋白酶抑制剂和 1种融合抑制剂,应用高效抗逆转录联合疗法,对艾滋病病人可成功地降低血浆病毒 载量,升高CD4细胞,重建免疫功能,延长生命,但尚不能治愈病人,控制流行。由 于病毒产生耐药性和毒副作用,一些药物对艾滋病人逐渐失效。联合治疗中增加免疫 药物如白介素2和干扰素等,可以增强疗效,但毒性也增加,影响了效果。有些传统 中药有免疫调节作用,在临床试用可提高艾滋病人免疫功能,改善症状。但中药多为 复方或单味中药制剂,成份复杂,至今尚未批准上市。

早在20世纪80年代艾滋病病毒发现以来,不少学者注意到硫酸多糖对多种有膜 病毒包括单纯疱疹病毒(HSV)和艾滋病病毒(HIV)等有广谱抗病毒作用。有关不少 动、植物和微生物以及化学合成的硫酸多糖类物质具有抗艾滋病、抗肿瘤和免疫调节 作用,已有专利和文献报导。如动物来源的肝素(heparin),化学合成的硫酸化右旋 糖苷(Sulfated dextran),海藻来源的硫酸多糖角叉菜胶(Carrageenans),真菌 来源的香菇多糖和植物来源的硫酸酯化松塔多糖等数十种均有抑制艾滋病病毒的作 用。1987年德国Bayer和Hoechst研制了木聚糖硫酸酯(Hoe/Bay946),日本研制了 Curdlan suldate CRDS,美国研制了DS2等免疫调节药物,在临床试验治疗艾滋病患 者,取得了一定的疗效。2004年中国青岛海洋研究院研制的抗艾滋病病毒海藻多糖 911,在细胞培养内抑制艾滋病病毒,对猴艾滋病病毒感染猴也有效,2002年批准进 入临床I期实验。但是,迄今为止未见牛膝多糖硫酸酯抗艾滋病病毒、免疫调节的有 关报道和专利。

牛膝多糖是从中药材牛膝(Achyranthes bidentata Blum)中分离的小分子多糖 (分子量1476KDa),毒性小,有抗肿瘤、增强免疫和升白血球作用,但无抗病毒作 用。中国科学院上海有机化学所先后于1988年、1993年申请专利,并分别于1992 年、1999年授权,专利号:88105524.7和93112588.X。本发明涉及的牛膝多糖硫酸 酯(S-AbPS),是中国科学院上海有机化学研究所田庚元教授等对牛膝多糖(Abps)磺化 后制成的,其结构式如(I)所示:

其中:R=SO3Na,R’=R或                 其中:R=SO3Na,MW=3414KDa,含硫量约

为21.26%。

n=1→9,含硫量为4-21%。其主要成

太阳城集团份是由9糖组成的果聚糖硫酸酯,结

构式如(II)所示。

太阳城集团因其水溶性好,稳定,具有抗单纯疱疹病毒1型、柯萨奇病毒和乙型肝炎病毒等 作用,于1999申请专利,2002授权,专利号:99113444.3。中国医学科学院医药生 物技术研究所1999年研究发现,牛膝多糖硫酸酯(S-AbPS)具有抗艾滋病病毒作用, 对HIV-1复制酶有广谱抑制作用:不但抑制HIV-1逆转录酶,也抑制整合酶和蛋白酶; 在人淋巴细胞MT-4培养内抑制细胞病变(MTT法);在人外周血单核细胞培养内(PBMC) 抑制HIV的P24抗原;对小鼠毒性小,口服后血清有升高抑制HIV逆转录酶的作用, 腹腔注射可升高淋巴细胞;对艾滋病病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒或乙型肝炎病毒等 机会性感染以及肿瘤等疾病可提高治疗效果,有望发展成为具广泛用途的新型药物。

太阳城集团本发明的目的在于提供牛膝多糖硫酸酯在抗艾滋病等病毒、提高免疫功能或消毒 剂中的新用途。

发明内容:

本发明对牛膝多糖硫酸酯(S-AbPS)药理活性和作用机制进行了系列的实验研究。 研究结果表明:S-AbPS能多途径抑制艾滋病病毒感染和复制,抗HIV活性稳定,口 服和腹腔注射后鼠血清有抑制HIV逆转录酶的作用,腹腔注射后能调节小鼠的免疫功 能。

本发明的优点与积极效果在于,所说的牛膝多糖硫酸酯(S-AbPS)具有多靶点多途 径抑制艾滋病病毒感染和复制的活性,若制备成药物,与现有治疗艾滋病的联合疗法 有异曲同功之妙,且毒性低,抗病毒活性稳定,同时还具有免疫调节活性,既可用于 治疗艾滋病病毒感染,也可用于预防艾滋病病毒感染,还可用以制备防治艾滋病病毒 感染的消毒剂。

具体实施方案:

太阳城集团以下所举的实施例,对本发明而言只是说明性的,而非限制性的。

太阳城集团实施例1:S-AbPS对HIV-1整合酶(HIV-1IN)、逆转录酶(HIV-IRT)和蛋白酶(HIV-1 PR)的抑制活性

太阳城集团1.ELISA检测方法测定药物抑制HIV-1 IN的活性

将供体底物包被试验板,洗板后加入:反应缓冲液、不同浓度药液和标定浓度的 基因工程HIV整合酶,37℃反应1小时。加入靶底物,混合,37℃反应1小时,洗 板。加入BSA(牛血清蛋白),室温30分钟,洗板。加入碱性磷酸酶标记的亲和素, 室温反应1小时,洗板。加显色底物显色30分钟,加0.1N NaOH终止显色反应。酶 标仪405nm测定OD值。同时设酶对照和空白对照,计算IC50,测定结果见表1。

2.3H标记检测方法测定药物抑制HIV-1RT活性

将标定浓度的基因工程HIV-1逆转录酶(p66/51)、不同浓度的药液、反应缓冲 液和3H-dTTP加入后,混合,37℃反应30分钟,0℃终止反应。反应液滴加于滤纸 片上,冷三氯乙酸洗3次,乙醇脱水后烤干。液闪仪测定cpm值,同时设酶对照、空 白对照和药物对照,计算IC50活性,测定结果见表1。

3.ELISA检测方法测定药物抑制HIV-1PR活性

太阳城集团微孔板加入反应缓冲液和底物,加入适量基因工程HIV蛋白酶及不同浓度药液, 混匀,37℃反应60分钟。加DMSO终止反应。加入碘乙酸钠,混匀,37℃反应45分 钟。加入Dig-NHS,混匀,37℃反应50分钟。加入甘氨酸中断反应。加入链亲和素 标记的96孔板中,同时加入反应缓冲液,混匀,室温反应60分钟,将底物结合到酶 标板上,洗板。加阻断剂室温阻断50分钟。加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体Fab 片段,室温1小时,洗板。加入底物pNPP显色,酶标仪405nm测OD值。同时设酶对 照、空白对照和阳性药对照,计算IC50。活性测定结果见表1。

4.结果

S-AbPS抑制HIV-1IN、HIV-1RT和HIV-1PR活性结果见表1。由表1可见, S-AbPS对HIV复制的三个关键酶即整合酶、逆转录酶和蛋白酶均有一定的抑制作用。

表1:S-AbPS抑制HIV-1IN、RT和PR活性   作用机制   IC50(μM)   抑制HIV-1IN活性   抑制HIV-1RT活性   抑制HIV-1PR活性   0.067±0.015   5.156±2.230   0.188±0.088

太阳城集团实施例2:S-AbPS抑制HIV-1整合酶(HIV-1IN)活性的作用机制

1.ELISA检测方法测定药物抑制HIV-1IN的总活性

将供体底物包被试验板,洗板后加入:反应缓冲液、不同浓度药液和标定浓度的 基因工程HIV整合酶,37℃反应1小时。加入靶底物,混合,37℃反应1小时,洗 板。加入BSA(牛血清蛋白),室温30分钟,洗板。加入碱性磷酸酶标记的亲和素, 室温反应1小时,洗板。加显色底物显色30分钟,加0.1N NaOH终止显色反应。酶 标仪405nm测定OD值。同时设酶对照和空白对照,计算IC50,测定结果见表2。

太阳城集团2.抑制HIV-1IN 3′切割活性测定

将包被了供体底物1的微孔板用PBS洗板2次,再用1×反应缓冲液洗一次。分 别加入2×反应缓冲液、不同稀释浓度药液和基因工程HIV整合酶,混匀,37℃反 应1小时。PBS洗板,洗去未结合的酶及药物。加入1×反应缓冲液和靶底物,混匀, 37℃水浴继续反应1小时。后续步骤同上,测定结果见表2。

3.抑制HIV-1IN链转移活性测定

将包被了供体底物2的微孔板用PBS洗板2次,再用1×反应缓冲液洗一次。分 别加入2×反应缓冲液、水和基因工程HIV整合酶,混匀,37℃水浴反应1小时。 洗板,洗去未结合的酶。加入2×反应缓冲液、水和不同浓度药液,加入靶底物, 混匀,37℃水浴继续反应1小时。后续步骤同上,测定结果见表2。

4.抑制HIV-1IN装配活性测定

太阳城集团将包被了供体底物2的微孔板用PBS洗板2次,再用1×反应缓冲液洗一次,分别 加入2×反应缓冲液、不同浓度的药液和基因工程HIV整合酶,混匀,37℃水浴反 应1小时。洗板,洗去未结合的酶及药物,加入1×反应缓冲液和靶底物,混匀, 37℃水浴继续反应1小时。后续步骤同上,测定结果见表2。

5.结果

太阳城集团S-AbPS抑制HIV-1IN的作用机制见表2。由表2可知,S-AbPS对HIV-1IN的三 个功能都有抑制作用,对HIV-1IN活性的主要抑制活性为抑制HIV-1IN链转移活性, 即抑制HIV基因整合于宿主细胞染色体内的过程。

太阳城集团           表2:S-AbPS抑制HIV-1IN的作用机制   作用机制   药物浓度(μM)   抑制率(%)   抑制HIV-1IN(总)活性   抑制HIV-1IN3’-切割活性   抑制HIV-1IN链转移活性   抑制HIV-1IN装配活性   0.12   0.20   0.12   0.12   45.3±0.7   82.8±1.3   81.1±2.1   61.5±1.6

太阳城集团实施例3:不同太阳城集团测定的S-AbPS的抗HIV-1IN的活性

太阳城集团实验方法同实施例1,结果见表3。从表3可见在不同太阳城集团内测定的同批S-AbPS 的抗HIV-1IN的活性没有明显变化,活性稳定。

表3:不同太阳城集团测定的S-AbPS的抗HIV-1IN的活性   测定太阳城集团   (年-月-日)   抗HIV-1IN的活性   (IC50μM)   2002-04-03   0.204   2002-07-14   0.038   2002-12-31   0.118   2003-05-23   0.219   2003-08-25   0.211   2003-12-25   0.090   2004-03-27   0.139   2004-09-07   0.132   2005-01-20   0.098   2005-03-03   0.158

实施例4:S-AbPS在细胞培养内抗HIV-1的效果

太阳城集团1.MTT染色法测定S-AbPS对MT-4细胞培养的毒性

太阳城集团将MT-4细胞接种于96孔细胞培养板内,同时分别加2倍稀释的S-AbPS共8个 浓度的药液,每个稀释度重复3孔,设细胞对照组。置37℃、5%CO2和饱和湿度培养 箱内培养,每天观察细胞病变。加药后第7天吸弃上清100μl,每孔加10μl 5mg/mlMTT染色,37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内继续培养4小时,每孔加入100μl 50%DMF-17%Triton X-100脱色液,37℃过夜,在酶联仪上测定波长为570nm的OD570nm值,计算药物半数有毒浓度(TC50),结果见表4。

太阳城集团2.MTT染色法测定S-AbPS在MT-4细胞培养内对HIV-1IIIB的抑制作用

太阳城集团将MT-4细胞接种于96孔细胞培养板内,加入HIV-1实验室病毒株IIIB培养液, 同时加最大无毒浓度以下稀释的不同浓度S-AbPS或阳性对照药AZT和NVP药液,在 37℃、5%CO2和饱和湿度下培养,观察细胞病变,于第7天吸弃上清100μl,每孔加 10μl 5mg/mlMTT染色,37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内继续培养4小时,每孔加入 100μl 50%DMF-17%Triton X-100脱色液,37℃过夜,在酶联仪上测定波长为570nm 的OD570nm值,计算药物半数有效浓度(EC50),并计算治疗指数(SI),结果见表4。

3.外周血单核细胞(PBMC)的分离和培养

取健康人新鲜静脉血,用FiColl分离液分离人外周血单核细胞(PBMC),以含 PHA的培养液制备1.5×105细胞/ml悬液接种于培养瓶内,37℃ 5%CO2培养箱内培养 72小时。用细胞刮收集细胞,配成106/ml。

太阳城集团4.3H-胸腺嘧啶掺入法测定S-AbPS对PBMC细胞培养的毒性

太阳城集团将0.1ml的PBMC细胞及不同浓度的S-AbPS在96孔板中培养。4天后,用3H-胸 腺嘧啶加进每一孔,继续培养4-6小时后收获并检测CPM值,计算TC50。结果见表4。

太阳城集团5.P24抗原测定法测定S-AbPS在PBMC细胞培养内抑制HIV-1AZT耐药株(HIV-1 018c)的活性

用AZT耐药病毒株(HIV-1018c)100TCID50的病毒液感染细胞,吸附2小时。 用无血清1640培养基洗去未吸附病毒,用培养液将感染病毒的细胞配成1×106/ml。 种入96孔培养板,100μl/孔。同时分别加不同浓度的S-AbPS药液100μl。设细胞对 照和病毒感染细胞对照组组。37℃ 5%CO2培养第4天(96小时),吸出上清,按试 剂盒所给方法测定HIV-1P24抗原。计算药物半数有效浓度(EC50),并计算治疗指数 (SI),结果见表4。

6.结果

S-AbPS在MT-4细胞培养内的毒性和抗HIV-1IIIB的作用效果及在PBMC细胞培 养内的毒性和抑制HIV-1018c的活性见表4。

表4:S-AbPS在MT-4细胞培养内的毒性和抗HIV-1IIIB的作用   细胞   TC50(μM)   EC50(μM)   SI   MT-4   PBMC   201.7   43.8   0.37   3.85   545   11

太阳城集团细胞培养内药物试验表明,S-AbPS在MT-4细胞培养有明显的抑制HIV-1IIIB的 作用,在PBMC细胞培养内有明显的抑制HIV-1018c的作用。

太阳城集团实施例5:S-AbPS给药后的鼠血清活性测定

1.小鼠灌胃和腹腔注射后血清对HIV-1RT的抑制作用

雄性昆明种小鼠18~20克(每组5只),经口服S-AbPS 1.25mmol/kg 1次,1小 时后,或S-AbPS 25μmol/kg经腹腔注射30分钟后,眼眶取血,血清经56℃ 30分 钟灭活并稀释60倍后测定其抑制HIV-1RT的活性,结果见表5。

           表5:小鼠灌胃和腹腔注射药物后血清抑制HIV活性   给药方式   取血太阳城集团   药物  对HIV-1RT抑制率(%)   腹腔注射   30分钟   生理盐水对照   S-AbPS25μmol/kg   22.3±2.3   26.9±5.9   灌胃   1小时   双蒸水对照   S-AbPS1.25mmol/kg   19.2±5.1   24.9±4.6

太阳城集团2.大鼠给药后血清抑制HIV-1RT活性

太阳城集团雄性SD大鼠190~210克(每组3只),经口服S-AbPS 1.25mmol/kg 1次,1小时 后,或S-AbPS 25μmol/kg经腹腔注射30分钟后,眼眶取血,血清经56℃ 30分钟 灭活并稀释60倍后测定其抑制HIV-1RT的活性,结果见表6。

太阳城集团         表6:SD大鼠灌胃和腹腔注射药物后血清抑制HIV活性   剂量   给药方式   对HIV-1RT抑制率(%)   15分钟   30分钟   1小时   S-AbPS1.25mmol/kg   灌胃   20.15±9.93   24.99±6.00   双蒸水对照   15.91±5.55   19.77±15.36   S-AbPS25μmol/kg   腹腔注射   21.86±8.30   8.79±5.71   生理盐水对照   4.57±4.52   6.26±3.82

上述给药后鼠血清抗HI-1RTV活性试验显示,S-AbPS经口服或腹腔注射后,在 大、小鼠血清中均可检测出其抑制HIV-1的活性。

实施例6:S-AbPS对小鼠免疫细胞的影响

1.实验方法

太阳城集团选用18-20克BALB/C小鼠,实验分5组,每组5只。腹腔注射给药,给药体积 为0.2ml/20g。5组分别为生理盐水对照组、环磷酰胺对照组、环磷酰胺+胸腺素阳性 药对照组、环磷酰胺+S-AbPS药物组和S-AbPS药物对照组。环磷酰胺第1天一次性 腹腔注射80mg/kg、第7天40mg/kg加强一次;胸腺素500μg/kg为皮下注射,除环 磷酰胺外,其它为每天1次,连续给药12天,其中S-AbPS前7天剂量为4mg/kg, 后5天改为8mg/kg。于第12天小鼠眼眶取血,EDTA-K3抗凝。标记前先将抗凝血样 品用生理盐水稀释5倍。准备两组流式细胞测定管,第一组每管加入CD3、CD4、CD8 荧光抗体各3μl,第二组每管加入CD3、CD19荧光抗体各3μl,然后加入100μl 稀释后的抗凝血样品,避光标记20分钟。加入0.5ml Lysing Solution使红细胞溶 解,1500rpm离心5分钟,PBS洗两次,最后用0.4mlPBS悬浮细胞,用流式细胞仪测 定CD3(T细胞),CD4,CD8以及CD19(B细胞)的相对数量。用SPSS10.0软件进行多 因素方差分析。

2.实验结果

太阳城集团S-AbPS对小鼠免疫细胞的影响结果见表7。由表可见,与生理盐水对照组小鼠各 细胞百分比相比,给S-AbPS小鼠各细胞百分比没有变化;给环磷酰胺小鼠B细胞(CD19) 百分比显著降低。与环磷酰胺组各细胞百分比相比,环磷酰胺+胸腺素小鼠CD3和CD4 细胞百分显著升高,而B细胞百分比显著降低;环磷酰胺+S-AbPS小鼠CD3和CD4 细胞百分显著升高。由此可见:S-AbPS对正常小鼠外周血淋巴细胞亚群百分比没有 影响,但可以增加环磷酰胺导致的免疫低下(B细胞降低)小鼠的外周血T(CD3)细 胞百分比,T细胞中CD4细胞百分比显著增加,CD8细胞百分比不变,但对环磷酰胺 降低B细胞百分比没有逆转作用,其结果与阳性药胸腺素作用相同。

         表7:S-AbPS对小鼠外周血T、B细胞百分比的影响   药物   细胞百分比(%)   CD3   CD4   CD8   CD19  生理盐水  环磷酰胺  环磷酰胺+胸腺素  环磷酰胺+S-AbPS  S-AbPS   56.5±5.24   64.6±15.55   72.9±9.38   82.6±3.25   65.1±5.80   41±2.90   45.6±10.19   53.7±7.45   62.8±0.92   46.6±4.53   15.2±2.72   19±5.37   19.2±2.23   19.9±4.17   18.5±1.27   33.2±4.68   14.3±11.21   11.4±0.20   11.8±2.83   27.4±5.66

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