太阳城集团

  • / 28
  • 下载费用:30 金币  

ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用.pdf

关 键 词:
ORF7 缺陷 水痘 病毒 含有 疫苗 应用
  专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
摘要
申请专利号:

CN201610136662.0

申请日:

20100727

公开号:

CN105770886B

公开日:

20171128

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A61K39/25,A61P31/22,C12N7/00,C12R1/93 主分类号: A61K39/25,A61P31/22,C12N7/00,C12R1/93
申请人: 北京万泰生物药业股份有限公司,罗杰斯新泽西州立大学,厦门大学
发明人: 朱桦,李益民,夏宁邵,程通,叶祥忠
地址: 102206 北京市昌平区科学园路31号
优先权: 2009101573870
专利代理机构: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 代理人: 李程达
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN201610136662.0

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明属于病毒学和生物药学领域。具体而言,本发明提供了ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及其应用,提供了用于预防水痘和/或带状疱疹的疫苗,其包含水痘病毒以及疫苗用赋形剂或载体,其中所述水痘病毒的如SEQ ID NO:1所示的ORF7全部或部分缺失,由此得到的病毒不能够感染人的皮肤或感觉神经节。

权利要求书

1.用于预防水痘和/或带状疱疹的疫苗,其包含水痘病毒以及疫苗用赋形剂或载体,其中所述水痘病毒的如SEQIDNO:1所示的ORF7全部或部分缺失或被插入终止密码子,并且所述水痘病毒不能够感染人的皮肤或感觉神经节。2.根据权利要求1所述的疫苗,其中所述ORF7全部或部分被抗生素抗性基因所取代。3.根据权利要求2所述的疫苗,其中所述抗生素抗性基因选自:青霉素、链霉素、以及卡那霉素抗性基因。4.根据权利要求1所述的疫苗,其中所述水痘病毒的基因组ORF7被SEQIDNO:13所示的翻转反向移码突变的ORF7片段所取代。5.根据权利要求1所述的疫苗,其中水痘病毒是于2009年7月28日以保藏编号为CGMCCNo.3207保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的水痘病毒。6.水痘病毒在制备用于预防水痘和/或带状疱疹的疫苗中的用途,其中所述水痘病毒的如SEQIDNO:1所示的ORF7全部或部分缺失或被插入终止密码子,并且所述水痘病毒不能够感染人的皮肤或感觉神经节。7.根据权利要求6所述的用途,其中水痘病毒是于2009年7月28日以保藏编号为CGMCCNo.3207保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的水痘病毒。

说明书

本申请是申请号为201080033216.8的专利申请的分案申请。

技术领域

太阳城集团本发明属于病毒学和生物药学领域。具体而言,本发明提供了ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及其应用,为水痘-带状疱疹病毒等的预防提供良好的候选疫苗药物。

技术背景

太阳城集团水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus:VZV,简称“水痘病毒”或“VZV”)是严格种属特异性的病毒,是导致人患水痘或带状疱疹的致病因子。其中,P-Oka株是由Takahashi等于1971年在日本Oka姓氏的3岁男孩的水痘囊泡液中分离出来的,并经人胚肺细胞培养获得的,被认为具有引发水痘和带状疱疹功能(Takahashi M,Otsuka T,Okuno Y,et al.Live vaccine used to prevent the spread of varicella in children in hospital.Lancet 1974;2:1288–90.)。

太阳城集团美国专利3985615中公开了P-Oka株通过豚鼠胚胎组织(GPEC)和人胚肺细胞多次传代,产生减毒的V-Oka病毒,制备预防水痘的V-Oka活疫苗。美国专利4000256中叙述了用人胚成纤维细胞WI-38株传代培养VZV病毒10-80次生产VZV减毒疫苗。但迄今为止,只有P-Oka株经细胞传代获得的“水痘病毒减毒冈株”(特公昭53-41202号公报;Lancet 2:1288-1290,1974)为WHO批准的唯一用于预防水痘或带状疱疹疫苗制备的毒株,该毒株制备的疫苗在全球得到了广泛使用[Requirement for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984:WHO Technical Report Series,No.725,pp.102-104,1985]。但是,尽管水痘疫苗接种的人群比水痘自然感染人群的带状疱疹发生率低,且大多为免疫功能低下儿童,但是,带状疱疹发生是不争的事实,且从患者的疱疹中分离到V-Oka株(Schmid D.S,et al.Impact of Varicella Vaccine on Varicella-Zoster Virus Dynamics,CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS,Jan.2010,p.202–217)。

专利CN1163604C涉及水痘病毒减毒冈株的鉴定,并且从分子水平上揭示该毒株是由多个不同序列组成的混合株。野毒株可能存在于其中,源于V-Oka疫苗接种者产生V-Oka株的带状疱疹已有报道。故该减毒株的潜在危害性还是存在的,但是,现在还没有其它预防VZV的疫苗株上市。该病毒具有严格种属特异性,人是其唯一的自然宿主,没有合适的动物模型研究VZV基因功能;再者该病毒对宿主细胞具有强结合性,游离的病毒极易失活,获得可供转化的VZV病毒DNA非常困难,故很长太阳城集团以来该病毒基因功能研究的进展极为缓慢。

但是,随着细菌人工染色体(BAC)在研究中的应用,组织培养技术的进步,异种生物间器官移植屏障的突破(联合免疫缺陷型小鼠的开发),拓宽了种属特异的VZV基因功能研究的空间,可以在体外或移植到动物体内进行VZV基因功能研究。2004年Kazuhiro N.等在“Cloning of the varicella-zoster virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli”一文中揭示被克隆到BAC载体上的VZV Oka株全基因组,可以在大肠杆菌和人胚肺细胞中增殖,BAC可被一同转化到人胚肺细胞中的Cre酶精确切除,产生的重组VZV病毒具有p-Oka同样结构,完全具有亲本病毒的特性。BAC的应用为VZV的功能研究带来了极大便利,可以对VZV每个基因进行功能研究,加速了VZV基因功能研究的进程。

水痘-带状疱疹病毒(VZV)的ORF7位于病毒基因组的8607-9386bp之间,编码一个29kDa的蛋白,可能位于皮层结构中,它的功能目前仍不清楚。

太阳城集团本发明人经过不懈的研究,惊奇地发现,ORF7决定着VZV感染人皮肤和感觉神经节的功能。当ORF7缺陷即发生如下情况之一:全部或部分缺失、被插入终止密码子,以及被一个或多个碱基取代,特别是删除了ORF7或者ORF7产生翻转反向移码突变时,ORF7的功能丧失,即VZV不感染皮肤和感觉神经节,故不存在产生水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害(我们在本发明中称之为ORF7缺陷引起的功能丧失,所述功能是指能够感染人的皮肤和感觉神经节)。ORF7删除的水痘病毒株(VZV-7D BAC或VZV-7DRM BAC)可以在大肠杆菌中进一步经抗生素筛选或半乳糖筛选(麦糠基氏培养机上产生亮红色斑)得到单一克隆株,不存于混合型V-Oka株的潜在危害,这为开发更加安全有效的疫苗带来了希望。

发明内容

太阳城集团本发明的一个方面涉及一种水痘病毒(例如P-Oka株),其基因组ORF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入,并且所述的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节。

太阳城集团ORF7(8607-9386bp)的序列如下:

ATGCAGACGGTGTGTGCCAGCTTATGTGGATATGCTCGAATACCAACTGAAGAGCCATCTTATGAAGAGGTGCGTGTAAACACGCACCCCCAAGGAGCCGCCCTGCTCCGCCTCCAAGAGGCTTTAACCGCTGTGAATGGATTATTGCCTGCACCTCTAACGTTAGAAGACGTAGTCGCTTCTGCAGATAATACCCGTCGTTTGGTCCGCGCCCAGGCTTTGGCGCGAACTTACGCTGCATGTTCTCGTAACATTGAATGTTTAAAACAGCACCATTTTACTGAAGATAACCCCGGTCTTAACGCCGTGGTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATGTTATGCTTGTATAA(SEQ ID NO:1)

在本发明的一个实施方案中,ORF7全部或部分被抗生素抗性基因和/或者无功能的核酸序列所取代。所述无功能的核酸序列是指该核酸序列不使ORF7功能恢复,即水痘病毒仍不能感染皮肤和感觉神经节,该无功能的核酸序列可以是不编码融合蛋白的,也可以是编码蛋白的核酸序列,只要所编码的蛋白不会使ORF7功能的恢复。在本发明的一个实施方案中,所述无功能的核酸序列是翻转反向移码突变的ORF7片段。

术语“ORF7片段”是指ORF7的全部或部分核酸序列。

太阳城集团在本发明的一个实施方案中,所述翻转反向移码突变的ORF7片段的序列如SEQ ID NO:13所示。

太阳城集团在本发明的一个实施方案中,所述抗生素抗性基因选自:青霉素、链霉素、以及卡那霉素的抗性基因。

在一个具体的实施方式中,发明人以来自斯坦福大学医学院Dr.Ann Arvin实验室的P-Oka临床分离株为材料,以VZV-BAC(P-Oka)为框架,应用细菌同源重组原理产生重组克隆。全长ORF7被Kanr基因取代而产生VZV-7D BAC株或被翻转反向移码突变的ORF7部分片段取代而产生VZV-7DRM BAC株。其中,Kanr基因的序列如下:

ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCGTGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTTGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCATAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAA(SEQ ID NO:2)

太阳城集团具体地,本发明提供一种水痘病毒,其保藏编号为CGMCC No.3207,保藏日期2009年7月28日,保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

体内外实验证实该病毒株不感染人皮肤和感觉神经节,故极可能不存在引发水痘或再活化产生带状疱疹的潜在危害;该毒株可在MRC-5、Mewo、或ARPE细胞上生长,且同P-Oka株生长特性一致,并且也没有改变病毒在胸腺组织的生长增殖特性;该毒株保留了P-Oka株的所有糖蛋白,其免疫原性理应同P-Oka株的免疫力相同;该毒株是通过Kanr筛选或半乳糖筛选单一克隆株,不存于混合型V-Oka株的潜在危害;由于整个ORF7删除,或以翻转反向移码突变,VZV-7D BAC或VZV-7DRM BAC株不可能产生回复突变,因而,以VZV-7D BAC或VZV-7DRM BAC株制备减毒活疫苗更为安全和有效。

太阳城集团本发明的另一方面涉及上述的水痘病毒的制备方法,包括如下步骤:

太阳城集团1)将野生型水痘病毒的基因组克隆到BAC载体上,然后通过细菌内重组,使得水痘病毒的基因组ORF7全部或部分缺失、或者被一个或多个碱基取代或插入,导致得到的水痘病毒不能够感染人的皮肤和感觉神经节;

太阳城集团2)分离1)中得到的水痘病毒的DNA,并与含Cre酶的重组质粒共转染Mewo细胞或MRC-5细胞或ARPE细胞;

3)通过Cre酶的作用在Mewo细胞或MRC-5细胞或ARPE细胞中删除BAC。

在本发明的一个实施方案中,所述野生型水痘病毒是P-Oka株,并且步骤1)中所述的ORF7被Kanr取代,或者翻转反向移码突变的ORF7片段所取代。在一个具体的实施方式中,所述翻转反向移码突变的ORF7片段是SEQ ID NO:13。

本发明的还一方面涉及一种组合物,其含有上述的任一种水痘病毒。

本发明的还一方面涉及一种预防水痘和/或带状疱疹的疫苗,其含有上所述的任一种水痘病毒,以及疫苗用赋形剂或载体。

在本发明中,术语“预防水痘和/或带状疱疹的疫苗”是指水痘疫苗、带状疱疹疫苗、以及预防水痘和带状疱疹的疫苗。

太阳城集团本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒在制备预防水痘和/或带状疱疹的疫苗中的用途。

太阳城集团本发明的还一方面涉及上述的任一种水痘病毒的DNA在制备表达载体中的用途。

太阳城集团发明的还一方面涉及一种表达载体,其由BAC和插入到BAC中的上述的任一种水痘病毒的DNA组成。一种表达载体,其为上述的任一种水痘病毒的DNA。上述的表达载体至少可以插入10kb的外源基因而不影响其本身生长和增殖,可用于表达外源基因,并且所述表达载体由于ORF7功能缺失而变得安全。也可以将该表达载体用荧光素酶基因标记(Zhang et al.Journal of Virology,Sept,2007,p9024-9033),用于体内外VZV-7DRM功能研究的监测。

太阳城集团发明的还一方面涉及一种重组载体,其含有上述的表达载体以及插入的外源基因。

太阳城集团发明的还一方面涉及一种重组细胞,其含有上述的表达载体或重组载体。

本发明的一个实施方案中,所述重组细胞所用的宿主细胞选自如下细胞:

MRC-5、Mewo、ARPE、2BS、WI-38、以及KMB17。

太阳城集团本发明的还一方面涉及一种预防水痘和/或带状疱疹的方法,包括给予患者接种有效量的上述疫苗的步骤。

太阳城集团在本发明中,术语“DPI”是“days post infection”的缩写,是指病毒感染后的天数。

附图说明

图1:p-Oka BAC(VZV BAC)载体构建。

图2:ORF7缺失BAC株(VZV-7D BAC)的制备。

图3:ORF7缺失的VZV病毒的电泳鉴定。

图4:VZV-7D病毒的背根神经节培养。A.野生型(WT)、回复突变型(7R)、缺陷型(7D)在MeMo细胞中的生长曲线。B.野生型(WT)、回复突变型(7R)、缺陷型(7D)在背根神经节(DRG)中的生长曲线。

图5:ORF-7回复突变(VZV-7R)水痘病毒的制备。

图6:带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人体MeWo细胞中生长曲线。

太阳城集团图7:带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人胸腺组织培养(TOC)物中的生长曲线。

图8:带有荧光标记的(luc)VZV-7DRM病毒在人皮肤组织培养(SOC)物中的生长曲线。

太阳城集团图9:A.用WT、VZV-7DRM和VZV-7R的DNA转染MeWo细胞和神经细胞瘤(SH-SY5Y)细胞。VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞中生长。B.背根神经节(DRG)从人胚胎的脊髓中分离所得。C.DRG被移植到重症联合免疫缺陷(SCID-hu)小鼠的肾囊里,WT或VZV-7DRM病毒感染DRG,用IVIS仪器测试病毒生长,VZV-7DRM不能在SCID-hu鼠(植入人组织的重症联合免疫缺陷鼠)中生长。D.感染后GFP强度增加显示,野生型(WT)VZV能够在DRG培养物中生长。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1:p-Oka BAC(VZV BAC)载体构建

1)BAC载体(pUSF-6),含有原核复制起始序列(Ori)、复制和分区基因(repE,parA and parB),氯霉素抗性基因(camR)、绿色荧光蛋白(gfp),两个500bpVZV片段a和b(灰色)、两个loxP位点(白色)。pUSF-6用BamH1消化成线性结构,通过同源重组将pUSF-6插入含VZV的科斯质粒pvSpe23中;

太阳城集团2)p-Oka基因结构模式图显示VZV由125kb核苷酸组成,包括一个长片段(UL)和一个短片段(US)。完整基因组被消化成4个含重叠区的VZV基因片段,克隆到科斯质粒中,产生4个重组克隆pvFsp73、pvSpe14、pvPme19和pvSpe23,pUSF-6通过同源重组插在VZV科斯质粒pvSpe23的ORF60和ORF61之间;

3)含BAC载体(pUSF-6)的pvSpe23与其它三个VZV科斯质粒共转染MeWo细胞,重组病毒(VZVBAC)能在MeWo细胞中复制并产生绿色荧光斑。

太阳城集团另外,操作过程也可以参见图1。

比较VZV BAC病毒和野生型pOka病毒的生长曲线。病毒感染后每天记录蚀斑形成单位数(PFU)。结果显示VZV BAC病毒(绿色)没有出现生长缺陷,与亲本病毒体外生长一致。

实施例2:ORF7缺失的BAC株(VZV-7D BAC)的制备以及检验

ORF7删除的VZV突变体的构建可以参照luc VZV BAC(Zhang et al.Journal of Virology,Sept,2007,p9024-9033)。操作过程也可以参见图2以及下面的步骤:

太阳城集团1.设计的两条引物各包含20bp的卡那霉素抗性基因同源核苷酸序列和ORF7删除区起始或终止密码子相连的40bp同源序列。所用引物F1、R1如下:

F1:GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CGC TCT TGT TGG CTA GTG CGT A(SEQ ID NO:3),

太阳城集团R1:AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TTC TGC CAG TGT TAC AAC CAA(SEQ ID NO:4)。

太阳城集团卡那霉素抗性基因从质粒pGEM-oriV/kan1上扩增(Netterwald,Yang et al.2005),PCR产物用DpnI酶进行消化,用Qiagen凝胶提取试剂盒进行回收。

2.以1.6kv,250μF的BioRad Gene Pulser II电转仪将大约200ng的PCR产物转进载有VZVLuc BAC的DY380菌体中。

3.采用大肠杆菌DY380株作为高效同源重组系统,所需同源序列短至40bp。利用重组酶42℃激活/32℃抑制的特性,完成Kanr基因与ORF7的同源重组,ORF7被Kanr基因取代,在32℃下从含有30μg/ml卡那霉素的琼脂板上选择单克隆的重组子,从大肠杆菌中分离水痘病毒突变株(ORF7缺失)VZV-BAC的DNA。

4.所得病毒基因组完整性由HindIII酶切检验,重组DNA经PCR检验。证明得到了ORF7缺失的BAC株(VZV-7D BAC),其ORF7被Kanr基因取代。

实施例3:ORF7翻转反向移码突变BAC株(VZV-7DRM BAC)的制备以及检验

太阳城集团思路如下:用galk基因取代野生型病毒中的ORF7序列,含galk基因的VZV在以半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏琼脂培养物上产生亮红色斑,用这种方法筛选出单克隆;再用翻转反向移码突变序列取代galk,在完全培养基和基础培养基上筛选单克隆,获得VZV-7DRM BAC

步骤如下:

1.设计正反向引物5′端各含有60bp ORF7基因两端侧翼同源序列的galk基因表达框的扩增引物F2和R2。从pgalk上扩增galk基因序列(1-82bp为启动子,83-1231bp为galk的ORF),序列如下(SEQ ID NO:5):

CCTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCCAGGAGGCAGATCATGAGTCTGAAAGAAAAAACACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGGCTACCCTGCCACTCACACCATTCAGGCGCCTGGCCGCGTGAATTTGATTGGTGAACACACCGACTACAACGACGGTTTCGTTCTGCCCTGCGCGATTGATTATCAAACCGTGATCAGTTGTGCACCACGCGATGACCGTAAAGTTCGCGTGATGGCAGCCGATTATGAAAATCAGCTCGACGAGTTTTCCCTCGATGCGCCCATTGTCGCACATGAAAACTATCAATGGGCTAACTACGTTCGTGGCGTGGTGAAACATCTGCAACTGCGTAACAACAGCTTCGGCGGCGTGGACATGGTGATCAGCGGCAATGTGCCGCAGGGTGCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTGGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAAGCAGAAAACCAGTTTGTAGGCTGTAACTGCGGGATCATGGATCAGCTAATTTCCGCGCTCGGCAAGAAAGATCATGCCTTGCTGATCGATTGCCGCTCACTGGGGACCAAAGCAGTTTCCATGCCCAAAGGTGTGGCTGTCGTCATCATCAACAGTAACTTCAAACGTACCCTGGTTGGCAGCGAATACAACACCCGTCGTGAACAGTGCGAAACCGGTGCGCGTTTCTTCCAGCAGCCAGCCCTGCGTGATGTCACCATTGAAGAGTTCAACGCTGTTGCGCATGAACTGGACCCGATCGTGGCAAAACGCGTGCGTCATATACTGACTGAAAACGCCCGCACCGTTGAAGCTGCCAGCGCGCTGGAGCAAGGCGACCTGAAACGTATGGGCGAGTTGATGGCGGAGTCTCATGCCTCTATGCGCGATGATTTCGAAATCACCGTGCCGCAAATTGACACTCTGGTAGAAATCGTCAAAGCTGTGATTGGCGACAAAGGTGGCGTACGCATGACCGGCGGCGGATTTGGCGGCTGTATCGTCGCGCTGATCCCGGAAGAGCTGGTGCCTGCCGTACAGCAAGCTGTCGCTGAACAATATGAAGCAAAAACAGGTATTAAAGAGACTTTTTACGTTTGTAAACCATCACAAGGAGCAGGACAGTGCTGA(SEQ ID NO:5)

F2和R2序列如下:

太阳城集团F2:ACCGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:6);

太阳城集团R2:TAATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:7);

太阳城集团2.用此引物扩增galk基因表达框,用DpnI消化过夜后纯化;

3.用VZV BAC转化大肠杆菌SW102;

4.挑取单克隆接种到5ml LB-CM(含氯霉素LB)的培养基,在32℃培养过夜;

太阳城集团5.用过夜培养菌接种到250ml LB-CM培养液中,32℃振荡培养到OD值达到0.4-0.6;

6.制备电转细胞(VZVBAC转化的大肠杆菌SW102);

7.取1-2μl(约200ng)步骤2纯化的PCR产物按实施例2中的电转参数电转到步骤6中制备的VZVBAC大肠杆菌SW102感受态细胞中;

8.向转化细胞中加1ml LB并于32℃培养1小时;

太阳城集团9.恢复后,用1×M9盐如下洗涤细菌3次:13200RPM离心沉淀培养物15秒,吸取离心上清,用1×M9盐重悬沉淀,如上离心,重复洗涤一次。经3次洗涤后,弃除上清液,沉淀用1×M9盐1ml重悬。重悬物、10倍稀释物、100倍稀释物加到含半乳糖、亮氨酸、生物素和氯霉素的M63基础培养基上。

10.32℃培养3天;

11.挑取几个克隆到含有半乳糖、氯霉素指示剂的麦糠基氏琼脂培养板上培养,获得单克隆。培养3天出现的克隆应该是Gal+,但是,为了排除Gal-污染,获得单一亮红色克隆对进行下一步试验是非常重要的;

太阳城集团12.挑取单一亮红色(半乳糖为唯一碳源的麦糠基氏培养基上培养,Gal+)克隆,接种到5ml LB-CM培养液中,32℃过夜培养;用过夜培养物制备BAC DNA,并用PCR确证含有galk基因,所用引物如下:

F3:CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO:8);

太阳城集团R3:TCA GCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO:9);

13.以F4(SEQ ID NO:10)和R4(SEQ ID NO:11)为引物的ORF7近3′端457bp的PCR扩增(457bp读码框序列(SEQ ID NO:12))。由于F4、R4引物设计引入了1位碱基移码,故扩增产物产生移码突变。

太阳城集团F4和R4引物序列如下:

太阳城集团F4:CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATTTAATGGGATTTCTTGATCGCGGGG(SEQ ID NO:10)

R4:AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATGTGGTCCGTTCACACATGGAAAAC(SEQ ID NO:11)

太阳城集团457bp读码框序列如下:

GTCCGTTCACACATGGAAAACTCAAAACGGCTTGCTGATATGTGTTTAGCTGCAATTACCCATTTGTATTTATCGGTTGGCGCGGTGGATGTTACTACGGATGATATTGTCGATCAAACCCTGAGAATGACCGCTGAAAGTGAAGTGGTCATGTCTGATGTTGTTCTTTTGGAGAAAACTCTTGGGGTCGTTGCTAAACCTCAGGCATCGTTTGATGTTTCCCACAACCATGAATTATCTATAGCTAAAGGGGAAAATGTGGGTTTAAAAACATCACCTATTAAATCGGAGGCGACACAATTATCTGAAATTAAACCCCCACTTATAGAAGTATCGGATAATAACACATCTAACCTAACAAAAAAAACGTATCCGACAGAAACTCTTCAGCCCGTGTTGACCCCAAAACAGACGCAAGATGTACAACGCACAACCCCCGCGATCAAGAAATCCCATG(SEQ ID NO:12)。

然后参照本实施例的步骤4-10制备电转感受态SW102细胞。

太阳城集团14.200ng含与步骤2galk基因侧翼同源的PCR产物经热激转化50μl步骤13的感受态细菌。转化产物加到含10mlLB培养液的50ml锥形瓶中,32℃水浴振荡培养4.5小时进行恢复。这种长太阳城集团恢复旨在获得只含目标序列的重组VZV BAC(舍弃含galk表达框的VZV BAC)。因为F4由60bp OFR7 5′端侧翼同源序列和ORF7近3′端457bp反向序列组成,R4由60bp OFR7 3′端侧翼同源序列和ORF7近3′端457bp正向序列组成,所以扩增产物与OFR7位点上的galk基因同源重组时,3′端457bp序列产生翻转反向连接,产生翻转反向移码突变突变(SEQ ID NO:13),不具表达功能。翻转反向移码突变序列如下:

CATGGGATTTCTTGATCGCGGGGGTTGTGCGTTGTACATCTTGCGTCTGTTTTGGGGTCAACACGGGCTGAAGAGTTTCTGTCGGATACGTTTTTTTTGTTAGGTTAGATGTGTTATTATCCGATACTTCTATAAGTGGGGGTTTAATTTCAGATAATTGTGTCGCCTCCGATTTAATAGGTGATGTTTTTAAACCCACATTTTCCCCTTTAGCTATAGATAATTCATGGTTGTGGGAAACATCAAACGATGCCTGAGGTTTAGCAACGACCCCAAGAGTTTTCTCCAAAAGAACAACATCAGACATGACCACTTCACTTTCAGCGGTCATTCTCAGGGTTTGATCGACAATATCATCCGTAGTAACATCCACCGCGCCAACCGATAAATACAAATGGGTAATTGCAGCTAAACACATATCAGCAAGCCGTTTTGAGTTTTCCATGTGTGAACGGAC(SEQ ID NO:13)。

15.如步骤9操作,沉淀1ml培养物,用1×M9盐洗涤细菌3次,沉淀用1×M9盐1ml重悬。重悬物和10倍稀释物各100μl加到含甘油、亮氨酸、生物素、2-脱氧-半乳糖和氯霉素的M63培养板上。

16.32℃培养3-4天;

17.挑选并移种单克隆转到LB-CM和Galk-M63CM基础培养基的平板上。在LB-CM生长而在基础培养板上不生长的单克隆,提取病毒基因组用HindIII酶切检验完整性,重组DNA经PCR检验。证明得到了ORF7翻转反向移码突变的BAC株(VZV-7DRM BAC)。

上述步骤所用试剂的配制如下面的表1所示:

表1:本实施例所用试剂及其配制

实施例4:VZV-7D和VZV-7DRM病毒的制备

太阳城集团1.从实施例2制得的VZV-7D BAC中提取DNA,转入DY380菌中培养、增殖、提取、纯化。

太阳城集团2.将提取纯化的DNA单独电转染至(Marchini,Liu et al.2001)MRC-5细胞,(BAC上带的GFP可以用于病毒在细胞中生长增殖研究)或与Cre表达载体一同电转染至(Marchini,Liu et al.2001)MRC-5细胞,BAC被Cre酶从其两端的loxP酶切位点完全切除,产生VZV-7D病毒。

太阳城集团类似地,可以得到翻转反向移码突变取代ORF7的VZV-7DRM病毒,由于VZV-7DRM的ORF7只有部分且为翻转反向序列,所以,此片段不能表达,更无ORF7功能。因此,VZV-7DRM与VZV-7D具有相同的功能。

实施例5:VZV-7D病毒的鉴定

用实施例4中制得的VZV-7D病毒感染长成单层的MRC-5细胞,用含2%牛血清的MEM培养基培养,约80%细胞病变发生时,弃培养基,收获病变细胞,提取DNA,以P-Oka为对照进行试验。PCR扩增ORF-10和ORF-7基因,用HindIII消化VZV-7D和P-Oka株的DNA。PCR产物和HindIII消化产物用0.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,电泳产物见图3。VZV-7D在ORF-10的PCR产物同P-Oka的一致,但在ORF-7上没有条带,证实ORF-7缺失。HindIII对病毒的酶切图谱上,VZV-7D和P-Oka之间看不出差别。

实施例6:VZV-7D病毒的背根神经节培养

用无菌的外科剪刀和镊子分离妊娠20周胚胎的宫颈段和胸段脊骨的背根神经节(DRG),分离的背根神经节用含1%青霉素/链霉素的冰浴1ΧPBS瞬时洗涤,然后转到冰浴的培养基(DEM,含15%热灭活的胎牛血清和1%青霉素/链霉素),将每个背根神经节单独放到六孔板中胶原覆盖的盖玻片上,加0.5ml培养基,培养5天,其间换培养基一次。六孔细胞板中制备50%Mewo细胞培养物,用于滴度检测和生长曲线分析(图4A)。第6天收获P-Oka,VZV-7D和VZV-7R新近感染的Mewo细胞,于培养基悬浮至1ml。每个背根神经节单独饲养在六孔板中胶原包被的盖玻片上。10μl悬液用于病毒滴度检测,2μl用于Mewo细胞感染的生长曲线。其余细胞悬液用力通过27号针20次,细胞碎片通过4000rpm离心10min沉淀。上清均分,用于感染背根神经节,约120μl/样品,另外,2滴(20μl)细胞悬液用于感染另一个背根神经节,37℃5%CO2下培养3小时后,背根神经节用1×PBS洗涤,再补加新鲜培养基。每24小时检测一次荧光素酶活性。样品用含150μg/ml的D-luciferin 37℃培养10分钟后,用IVIS仪器和软件分析光子数。检测结果见图4B。

结果表明,VZV-7D在Mewo上生长正常,而在背根神经节中几乎不生长。VZV-7D不感染背根神经节细胞,这为开发安全的减毒活疫苗奠定了坚实基础。

太阳城集团实施例7:VZV-7D病毒的回复突变体(VZV-7R)制备以及验证

ORF7缺失正确与否不仅可以用HindIII酶切鉴定,而且可以通过基因的同源重组获得完整的VZV加以验证。即应用细菌同源重组机理拯救出完整的VZV,见图5。可以利用Invitrogen的高保真Taq DNA聚合酶试剂盒PCR扩增ORF7片段,并将其克隆到质粒pGEM-lox-zeo的NotI和BglII位点之间,从而形成pGEM-zeo-ORF7质粒。该克隆片段通过测序分析鉴定正确,且通过PCR扩增没有错误密码子被引入ORF7编码框中。之后以pGEM-zeo-ORF7质粒为模板用下述引物PCR扩增zeoR-ORF7编码框。

太阳城集团F5:GAT TTA TCC ATA GTT CAA TAC GTT GGA AAG CCA GTC AAT CAT GCA GAC GGT GTG TGC CAG(SEQ ID NO:14);

太阳城集团R5:AAA CAT ACA CCA GAA ACG TTT TTA GTT TTT ATT TCA ATA TGG ATG GAT CCA TAA CTT CGT(SEQ IDNO:15),

太阳城集团得到的PCR产物是两端各含一段40bp的VZV基因序列,与kanR编码框序列相连的,位于删除的ORF7位点上。将得到的这段嵌合PCR产物按上文提到的方法电转化到携带有ORF7D BAC的DY380菌体中。重组体要通过含有50μg/ml的zeocin(Invitrogen)和12.5μg/ml的氯霉素的琼脂平板32℃培养筛选。正确的VZV克隆通过它们对抗生素的敏感状况而筛选获得。正确的克隆应该是氯霉素抗性、潮霉素抗性、zeocin抗性、卡那霉素敏感性以及氨苄霉素敏感性的。这些克隆进一步被酶切消化和PCR分析确证正确。

太阳城集团将鉴定正确的克隆(即携带有ORF7缺失或者luc VZV BAC拯救子的大肠杆菌DY380)接种于含12.5μg/ml的氯霉素的500mlLB培养基中32℃培养20小时。VZVBAC的DNA通过BAC DNA大量提取试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA)分离得到,并且利用转染试剂FuGene6(Roche,Indianapolis,IN)按照使用说明转染到MRC-5细胞。6孔板中的一孔(35-mm)在转染时DNA与转染试剂的使用比例为1.5μg:6μl。一般情况转染后3天可见水痘病毒病斑。为从水痘病毒基因组中去除BAC载体(两侧有loxP酶切位点),可将Cre表达载体与VZV BAC DNA一起共转染(Marchini,Liu et al.2001)MRC-5细胞,利用Cre酶的特性而精确切除BAC,产生完整的VZV。

太阳城集团水痘ORF-7回复突变的病毒具有同P-Oka病毒相同的生长和增殖特性。说明ORF-7的功能可以通过回复突变手段得到恢复。

实施例8:VZV-7DRM病毒的Mewo细胞培养

六孔板中长成单层的Mewo细胞分别用含Luc的VZV-7DRM、VZV-7R和P-Oka株感染,以未感染的Mewo细胞作对照,Mewo细胞在37℃下用含2%牛血清的MEM培养基培养。感染24小时后,D-luciferin加到培养的细胞孔中,终浓度为150μg/ml,37℃培养10分钟,不同孔的生物荧光用体内成像系统IVIS(50Series;Xenogen Corporation,Alameda,CA)同时测量光子数,每天测量3孔感染细胞,测量后,细胞用病毒培养液取代D-luciferin物质继续培养。病毒荧光量每24小时测量一次,连续测量7天。用3孔测量的数据均值对太阳城集团绘制生长曲线。结果见图6。

太阳城集团人MeWo细胞不被感染或者被水痘-带状疱疹病毒野生株(lucVZV)或者VZV-7DRM突变株或者VZV-7D回复株(luc7R)感染、培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数,用3孔测量的均值对太阳城集团绘制生长曲线,图中标出3孔测量数据的误差线。本试验表明VZV-7DRM病毒和VZV-7R病毒和野生株一样都可以在MeWo细胞中正常生长。同时,试验结果表明将BAC插入VZV-7DRM中,7DRM能正常增殖,BAC上的基因也能正常表达,即VZV-7DRM可以用作外源基因表达的载体。

实施例9:VZV-7DRM病毒在人胸腺组织的培养

太阳城集团人胸腺-肝脏联合移植体异体移植到雄性的CB-17SCID/beige鼠内。人胸腺-肝脏联合移植体构建和使用按Jennifer F.M(Journal of Virology,Sept.1995,p.5236 5242)描述的方法进行。移植3月后,人胸腺-肝脏移植体经外科手术暴露后,直接注射2×103至4×103PFU的Mewo培养的含有荧光素酶的VZV-7DRM和P-Oka,10-20μl细胞悬液,每种病毒感染3只小鼠,以未感染鼠为对照,感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物,即D-luciferin10分钟后,用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例8的方法测量荧光量,每种病毒测量3只小鼠。结果见图7。

培养的人胸腺组织不受病毒感染或者受VZV野生株或者VZV-7DRM株感染,培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数。用3只鼠测量的光子数均值对太阳城集团绘制生长曲线。图中显示3只测量数据的误差线。本试验表明VZV-7DRM缺陷株像野生株一样能在胸腺组织(T-细胞)中生长。

太阳城集团类似的实验证明,VZV-7D缺陷株也像野生株一样能在胸腺组织(T-细胞)中生长。

实施例10:VZV-7DRM病毒的皮肤培养

人胚胎皮肤完整结构按Jennifer F.M(Journal of Virology,Sept.1995,p.5236 5242)描述的方法,异体移植到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。移植4周后,三种含荧光素酶的VZV-7DRM、VZV-7R和P-Oka株感染皮肤,每种病毒感染3只小鼠,以未感染鼠为对照,感染后每天测量荧光量。腹腔注射250μl荧光素酶底物,即D-luciferin10分钟后,用生物荧光体内成像系统IVIS在移植区按实施例8的方法测量荧光量,每种病毒测量3只小鼠。结果见图8。

太阳城集团培养的人皮肤组织被病毒野生株(P-Oka)或者ORF7缺失株(VZV-7DRM)或者ORF7回复突变株(VZV-7R)感染、以不被感染的鼠为对照,培养7天。感染后每天用IVIS系统测量光子数,用3只测量的光子均值对太阳城集团绘制生长曲线。图中标出3只测量数据的误差线。实验证实VZV-7DRM在皮肤中有严重生长缺陷,这种功能缺陷在VZV-7DRM株回复突变后可以被恢复。

类似的实验显示,VZV-7D在皮肤中也有严重生长缺陷,并且这种功能缺陷在VZV-7D株回复突变后可以被恢复。

实施例11:ORF7对VZV感染神经细胞为必需的验证实验

1.神经细胞瘤细胞感染实验

用野生型(WT)、ORF7删除型(VZV-7DRM)和ORF7回复突变型(VZV-7R)的BAC DNA转染MeWo细胞和神经细胞瘤(SH-SY5Y)细胞。研究发现,WT、VZV-7R在MeWo细胞和神经细胞瘤细胞上生长正常,但VZV-7DRM不能在神经细胞瘤细胞上生长(图9A)。研究结果显示ORF7很可能是VZV感染神经细胞所必需的。

太阳城集团2.DRG移植体感染实验

为了进一步验证本实施例中实验1的结果,使用植入人胎儿背根神经节(DRG)移植体的重症联合免疫缺陷鼠(SCID-hu)模型进行试验。结果发现,野生型在DRG移植体中经历一个短暂的复制循环(有荧光现象)后,很可能一直潜伏着。但是,VZV-7D不能在DRG移植体中复制。这些结果表明,ORF7很可能是VZV的嗜神经因子(图9B-D)。

太阳城集团以上两个实验证明,ORF7是VZV感染神经元所必需的。

实施例12:疫苗的制备以及VZV-7DRM病毒的免疫原性检定

VZV-7DRM按MOI=0.1感染长成单层的ARPE或MRC-5细胞,病毒在细胞上吸附40分钟后,向培养瓶中加病毒培养液后于35℃下培养。细胞病变达到80%左右(通常为3天)时,用0.1%EDTA消化收获,收获物经离心、加保护剂破碎和澄清后冻干制成疫苗。

太阳城集团疫苗复溶后经皮下接种体重约250g豚鼠,5只/苗,5000PFU/0.5ml/剂,初免4周后,加强免疫1剂,以P-Oka和V-Oka为对照进行试验。

加强免疫后2周经心脏采血,用gp-ELISA检测免疫血清抗体滴度。用免疫抑制法检测免疫血清对病毒的中和能力。免疫血清或免前血清10倍稀释后与病毒1:1混合,37℃培养60分钟,培养混合液感染MRC-5细胞,于37℃5%二氧化碳培养箱中培养7天后,弃去培养液,用考马斯蓝染色,计蚀斑数再换算病毒滴度,用100×(被免前血清中和的病毒滴度-被免后血清中和的病毒滴度)/被免前血清中和的病毒滴度。检定结果见表2。

表2:水痘病毒的豚鼠免疫血清抗体滴度和中和水平

实验结果表明VZV-7DRM有良好的免疫原性,抗体水平和V-Oka的相当,且VZV-7DRM免疫血清对三株病毒都有良好的中和作用,初步显示有疫苗开发前景。

类似的实验显示,VZV-7D也具有良好的免疫原性,具有疫苗开发前景。

实施例13:VZV-7DRM为载体的生物活性原料制备

太阳城集团用含ORF7侧翼区同源序列的EV71-VP1引物从pT-VP1质粒上PCR扩增EV71-VP1阅读框。

阅读框序列如下:

TGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAATTGAAAGCTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCAACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAGAGATAGATCTCCCTCTTAAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCGCAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGAAGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCCAGGGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCCACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCTCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGCGCTTACCAATGGTTTTATGACGGATATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAATATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGTACAGCGATCACTACTCTTTAA(SEQ ID NO:16)

PCR引物序列:

太阳城集团F6(ORF7 5′端侧翼区同源序列,起始密码子和EV71-VP1同源序列):

太阳城集团 CGAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGGGAGATAGGGTAGCAGATGTAA(SEQ ID NO:17)

太阳城集团R6(ORF7 3′端侧翼区同源序列和EV71-VP1同源序列):

AATTTTATATACAAAATAAAAACATACACCAGAAACGTTTTTAGTTTTTATTTCAATATTTAAAGAGTAGTGATCGCTGTACGACTGGTA(SEQ ID NO:18)

PCR产物采用电转手段转入含VZV-7DRM BAC的SW102细菌中,按照实施例2筛选重组菌,经鉴定正确后,适量培养,提取VZV-7DRM-VP1BAC,与Cre表达载体一同电转染至ARPE细胞,BAC被Cre酶从其两端的loxP酶切位点完全切除,产生VZV-7DRM-VP1重组病毒。重组病毒感染长成单层的ARPE细胞,35℃培养3-4天,细胞出现病变。收集的病毒培养上清、细胞悬液经反复冻融或超声裂解后的离心上清原倍上样,采用EV71特异的双抗体夹心法检测VP1活性,用EV71和VZV-7DRM作对照。结果(见表3)在VZV-7DRM-VP1病毒感染的ARPE细胞中检测到VP1活性,表明VP1重组到VZV-7DRM中。此例表明VZV-7DRM能用作外源基因的表达载体表达目标蛋白。

太阳城集团表3:VZV-7DRM-VP1重组病毒的VP1活性检测(双抗体夹心法)

太阳城集团类似的实验证明,VZV-7D也可以用于制备表达外源蛋白的载体。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

太阳城集团本文
本文标题:ORF7缺陷型水痘病毒、含有该病毒的疫苗及应用.pdf
链接地址:http://zh228.com/p-6749742.html
太阳城集团我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - - 联系我们

copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
葡京赌场|welcome document.write ('');