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TRAIL与穿心莲内酯联用在对抗肾癌细胞耐药性中的应用.pdf

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TRAIL 穿心莲 内酯 联用 对抗 肾癌 细胞 耐药性 中的 应用
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201710853277.2

申请日:

20170920

公开号:

CN107519480A

公开日:

20171229

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A61K38/17,A61P35/00,A61K31/365 主分类号: A61K38/17,A61P35/00,A61K31/365
申请人: 吉林大学第一医院
发明人: 毕然,王春喜,魏伟
地址: 130021 吉林省长春市新民大街71号
优先权: CN201710853277A
专利代理机构: 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 代理人: 王怡敏
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201710853277.2

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明涉及一种TRAIL与穿心莲内酯联用在对抗肾癌细胞耐药性中的应用。本发明设计了TRAIL与穿心莲内酯联合应用的药物组合方案,通过实验发现二者联合应用有效对抗肾癌细胞耐药性,显著抑制肾癌细胞的活度,增殖,迁移和成克隆能力,进一步实验发现TRAIL与穿心莲内酯联合用药诱导肾癌细胞的细胞周期阻滞和衰老,并且诱导肾癌细胞进入程序性细胞凋亡和诱发DNA损伤。且所述药物组合功能产品对多株肾癌细胞TRAIL耐药株均具有显著抑制效果。是一种潜在的治疗肾细胞癌的新方案,具有很强的临床应用价值。

权利要求书

1.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与穿心莲内酯联用在制备抗肾细胞癌药物中的应用。2.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)衍生物与穿心莲内酯衍生物联用在制备抗肾细胞癌药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用,用于诱导肾癌细胞的细胞周期阻滞和衰老,或者诱导肾癌细胞进入程序性细胞凋亡、诱发DNA损伤,对多株肾癌细胞TRAIL耐药株均具有显著抑制效果。4.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与穿心莲内酯联用在制备抑制肾细胞癌增殖试剂中的应用。5.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)衍生物与穿心莲内酯衍生物联用在制备抑制肾细胞癌增殖试剂中的应用。6.根据权利要求4或5所述的应用,用于诱导肾癌细胞的细胞周期阻滞和衰老,或者诱导肾癌细胞进入程序性细胞凋亡、诱发DNA损伤,对多株肾癌细胞TRAIL耐药株均具有显著抑制效果。

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域,特别涉及TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)与穿心莲内酯联用在对抗肾癌细胞耐药性中的应用。

背景技术

太阳城集团肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,占肾脏恶性肿瘤的80%-90%,占成人恶性肿瘤的2%至3%,年新增患者数量超30万。目前,外科手术(根治性肾切除手术和保留肾单位手术)仍是局限性肾癌的首选治疗方法。对于局部进展性肾癌以手术治疗为主,术后辅助细胞因子或分子靶向治疗的综合治疗。而转移性肾癌尚无统一的标准治疗方案。研究表明分子靶向药物可以明显延长患者的生存期。2006年起,NCCN和EAU将分子靶向药物(索拉菲尼、舒尼替尼等)作为转移性肾癌治疗的一、二线临床治疗用药。它们中的大多数属于激酶抑制剂,通过抑制肿瘤血管的生长,达到控制肿瘤生长的目的,进而延长患者的生存期,但分子靶向药物的各种副作用限制了其广泛的临床应用,部分患者因此需要调整药物剂量,甚至终止治疗。目前,很多研究试图寻找和发现在有效的控制肿瘤基础上减少毒副作用的新的安全的靶向治疗药物和治疗方案。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员之一。TRAIL通过与细胞死亡受体DR4和DR5特异性结合诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞几乎无毒害性,成为最有希望的抗癌剂之一。TRAIL与DR4/5结合形成三聚体,通过死亡域(DD)相互作用,募集死亡结构域连接蛋白(FADD)到受体上,再通过FADD中的死亡效应结构域(DED)募集启始caspases(pro-caspase-8/10)到受体复合物上,形成死亡诱导信号复合体(DISC)。活化的caspase-8通过外源性途径或线粒体介导的内在凋亡途径诱导细胞凋亡。但是,研究发现,肾癌对TRAIL具有抗性,单独应用TRAIL不能取得很好的抗肾癌效果。

穿心莲内酯(Andrographolide,Andro)是从植物穿心莲中提取出的一种二萜类二酯类化合物,分子式为C20H30O。在中国传统医学中,因穿心莲内酯具有清热,消炎,抗病毒的作用,被用于治疗感冒咳嗽,发烧,喉炎和一些感染性疾病。并且因为其在人体内的半衰期较短,可以迅速地被排出体外,对人体正常细胞的毒害性很小,属于食品药监局承认且推广的前十种中草药之一。近些年又有研究发现穿心莲内酯具有抗肿瘤的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种TRAIL与穿心莲内酯联用在对抗肾癌细胞耐药性中的应用。单独应用TRAIL或穿心莲内酯对抗肾癌作用效果不明显,但二者联合应用可以在低浓度取得明显抗肾癌效果,并增强TRAIL诱导的肾癌细胞凋亡。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现:

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与穿心莲内酯联用在制备抗肾细胞癌药物中的应用。

太阳城集团肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)衍生物与穿心莲内酯衍生物联用在制备抗肾细胞癌药物中的应用。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与穿心莲内酯联用在制备抑制肾细胞癌增殖试剂中的应用。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)衍生物与穿心莲内酯衍生物联用在制备抑制肾细胞癌增殖试剂中的应用。

用于诱导肾癌细胞的细胞周期阻滞和衰老,或者诱导肾癌细胞进入程序性细胞凋亡、诱发DNA损伤,对多株肾癌细胞TRAIL耐药株均具有显著抑制效果。

太阳城集团本发明的有益效果在于:TRAIL作为安全有效的抗肿瘤因子在临床中广泛应用,穿心莲内酯作为食品药监局承认且推广的前十种中草药之一,其安全性同样得到认可。而TRAIL与穿心莲内酯联合应用,可以使本身对TRAIL抵抗的肾癌细胞对TRAIL的敏感性增强,明显增强抗肿瘤活性和TRAIL诱导的肾癌细胞凋亡,具有较高的临床应用可行性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本申请的一部分,本发明的示意性实例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。

图1,MTS方法检测TRAIL单独使用24h后对肾癌786-0细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图2,MTS方法检测Andro单独使用24h后对肾癌786-0细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

太阳城集团图3,MTS方法检测TRAIL和Andro联合使用24h后对肾癌786-0细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

太阳城集团图4,TRAIL和Andro单独使用或联合应用处理肾癌786-0细胞24h后细胞照片(×200)。

太阳城集团图5,TRAIL和Andro单独使用或联合应用处理肾癌786-0细胞10天后细胞群落形成情况。

太阳城集团图6,TRAIL和Andro单独使用或联合应用对肾癌786-0细胞增殖和成克隆能力的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图7,TRAIL和Andro单独使用或联合应用处理肾癌786-0细胞18h后细胞迁移情况照片(×100)。

太阳城集团图8,TRAIL和Andro单独使用或联合应用对肾癌786-0细胞迁移能力的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图9,TRAIL和Andro单独使用或联合应用处理肾癌786-0细胞24h后流式细胞周期图。

图10,TRAIL和Andro单独使用或联合应用对肾癌786-0细胞G2期细胞周期阻滞的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图11,TRAIL和Andro单独使用或联合应用处理肾癌786-0细胞24h后细胞衰老染色照片(×400)。衰老细胞蓝染。

图12,TRAIL和Andro单独使用或联合应用对肾癌786-0细胞细胞衰老的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

太阳城集团图13,TRAIL和Andro单独使用或联合应用处理肾癌786-0细胞24h后流式细胞凋亡图。

太阳城集团图14,TRAIL和Andro单独使用或联合应用对肾癌786-0细胞细胞凋亡的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图15,TRAIL和Andro单独使用或联合应用处理肾癌786-0细胞24h后Western blot法检测DNA损伤蛋白γ-H2AX的表达水平。

太阳城集团图16,MTS方法检测TRAIL单独使用24h后对肾癌ACHN细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图17,MTS方法检测Andro单独使用24h后对肾癌ACHN细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图18,MTS方法检测TRAIL和Andro联合使用24h后对肾癌ACHN细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图19,MTS方法检测TRAIL单独使用24h后对肾癌OS-RC-2细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图20,MTS方法检测Andro单独使用24h后对肾癌OS-RC-2细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

图21,MTS方法检测TRAIL和Andro联合使用24h后对肾癌OS-RC-2细胞细胞活度的影响。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的详细内容及其具体实施方式。

本发明的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与穿心莲内酯(Andro)联合用药治疗肾癌的新用途,更好地提高治疗肿瘤的效果。

太阳城集团第一方面,本发明提供了TRAIL和穿心莲内酯联合应用在制备治疗肾细胞癌药物中的应用。

太阳城集团第二方面,本发明揭示了所述药物的组合使用显著提高对单独用药具有耐药性的肾癌细胞的杀伤力。

TRAIL或穿心莲内酯单独使用对肾癌细胞活力均无显著影响,TRAIL与穿心莲内酯联合使用后显著提高(P<0.001)对肾癌细胞活度,增殖,迁移和成克隆能力的抑制。

第三方面,所述药物组合功能产品用于:诱导肾癌细胞的细胞周期阻滞和衰老。

第四方面,所述药物组合功能产品用于:诱导肾癌细胞i)进入程序性细胞凋亡,ii)诱发DNA损伤。

第五方面,所述药物组合功能产品对多株肾癌细胞TRAIL耐药株均具有显著抑制效果。

本发明涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与穿心莲内酯联用在对抗肾癌细胞耐药性中的应用。本发明设计了TRAIL与穿心莲内酯联合应用的药物组合方案,通过实验发现二者联合应用有效对抗肾癌细胞耐药性,显著抑制肾癌细胞的活度,增殖,迁移和成克隆能力,进一步实验发现TRAIL与穿心莲内酯联合用药诱导肾癌细胞的细胞周期阻滞和衰老,并且诱导肾癌细胞进入程序性细胞凋亡和诱发DNA损伤。且所述药物组合功能产品对多株肾癌细胞TRAIL耐药株均具有显著抑制效果。是一种潜在的治疗肾细胞癌的新方案,具有很强的临床应用价值。

实施例1:TRAIL和穿心莲内酯联合应用对肾癌细胞活度的影响。

接种5×103个786-0细胞置96孔板中,置于培养箱中培养(培养条件为:5%CO2;温度为37℃),待细胞贴壁后,应用DMSO或TRAIL(50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml)或穿心莲内酯(2.5μM,5μM,10μM)或联合应用TRAIL(50ng/ml)和穿心莲内酯(2.5μM,5μM,10μM)处理细胞24小时后,通过MTS法测细胞活度。如附图1-4所示。

实施例2:TRAIL和穿心莲内酯联合应用对肾癌细胞增殖和成克隆能力的影响。

太阳城集团接种5×102个786-0细胞置6孔板中,置于培养箱中培养(培养条件为:5%CO2;温度为37℃),待细胞贴壁后,应用DMSO或TRAIL(50ng/ml)或穿心莲内酯(0.5μM)或联合应用TRAIL(50ng/ml)和穿心莲内酯(0.5μM)处理细胞,置于培养箱中持续培养2周左右,待出现肉眼可见细胞群落时终止培养,0.1%结晶紫染色后,在光学显微镜下对细胞群落(细胞数>50)进行计数。如附图5-6所示。

实施例3:TRAIL和穿心莲内酯联合应用对肾癌细胞迁移能力的影响。

接种1×105个786-0细胞置6孔板中,置于恒温箱中培养。当细胞密度为90%时,用10μl枪头刮伤细胞,然后用PBS洗涤2次,应用DMSO或TRAIL(50ng/ml)或穿心莲内酯(5μM)或联合应用TRAIL(50ng/ml)和穿心莲内酯(5μM)处理细胞,分别于划伤后0h、6h、12h、18h和24h通过显微镜观察肾癌细胞迁移情况。如附图7-8所示。

太阳城集团实施例4:TRAIL和穿心莲内酯联合应用诱导肾癌细胞的细胞周期阻滞和衰老。

太阳城集团接种1×105个786-0细胞置6孔板中,置于培养箱中培养(培养条件为:5%CO2;温度为37℃),待细胞贴壁后,应用DMSO或TRAIL(50ng/ml)或穿心莲内酯(5μM)或联合应用TRAIL(50ng/ml)和穿心莲内酯(5μM)处理细胞24h后,通过PI(碘化丙啶)染色后流式细胞议检测细胞周期和β-半乳糖甘酶染色后高倍显微镜测细胞衰老。如附图9-12所示。

实施例5:穿心莲内酯增强TRAIL对肾癌细胞的诱导凋亡的作用和诱发DNA损伤。

太阳城集团接种1×105个786-0细胞置6孔板中,置于培养箱中培养(培养条件为:5%CO2;温度为37℃),待细胞贴壁后,应用DMSO或TRAIL(50ng/ml)或穿心莲内酯(5μM)或联合应用TRAIL(50ng/ml)和穿心莲内酯(5μM)处理细胞24h后,应用V-FITC凋亡试剂盒染色后通过流式分析仪进行检测。药物处理24h后细胞通过Western blot法检测DNA损伤蛋白γ-H2AX。如附图13-15所示。

太阳城集团实施例6:TRAIL和穿心莲内酯联合应用对肾癌细胞系ACHN和OS-RC-2的细胞活力的影响。

太阳城集团接种5×103个ACHN和OS-RC-2细胞置96孔板中,置于培养箱中培养(培养条件为:5%CO2;温度为37℃),待细胞贴壁后,应用DMSO或TRAIL(50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml)或穿心莲内酯(2.5μM,5μM,10μM)或联合应用TRAIL(50ng/ml)和穿心莲内酯(2.5μM,5μM,10μM)处理细胞24小时后,通过MTS法测细胞活度。如附图16-21所示。

实验数据:

表1细胞活度

表2增殖和成克隆能力

表3迁移能力

表4细胞凋亡率

表5细胞周期G2期阻滞

综上所述可知,联合应用TRAIL和穿心莲内酯可以有效抑制肾癌细胞活度、增殖、迁移和成克隆能力,并且穿心莲内酯可以增加TRAIL抵抗的肾癌细胞对TRAIL的敏感性,增强TRAIL诱导的肾癌细胞凋亡。TRAIL和穿心莲内酯联合应用,可以有效杀死肾肿瘤细胞并抑制肾肿瘤细胞再度生长,具有很强的临床应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

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