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一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法.pdf

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一种 主动 引导 组织 再生 修复 仿生 胶原 基材 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201710466999.2

申请日:

20170616

公开号:

太阳城集团CN107441561A

公开日:

20171208

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A61L31/04,A61L31/16,A61L31/14,A61L27/26,A61L27/54,A61L27/56,A61L27/58,A61L27/60 主分类号: A61L31/04,A61L31/16,A61L31/14,A61L27/26,A61L27/54,A61L27/56,A61L27/58,A61L27/60
申请人: 无锡贝迪生物工程股份有限公司
发明人: 陆金婷,程咏梅,任伟业
地址: 214000 江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号
优先权: CN201710466999A
专利代理机构: 北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙) 代理人: 黄冠华
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法律状态
申请(专利)号:

CN201710466999.2

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,包括以下步骤:1)、制备低免疫原性、高纯度生物活性胶原;2)、加入酸酐使胶原酰基化;3)、加入糖胺聚糖反应得到具有多孔网络结构的胶原‑糖胺聚糖复合海绵;4)、置于EDC/NHS交联体系中交联,得到交联的胶原‑糖胺聚糖复合海绵;5)、将交联的胶原‑糖胺聚糖复合海绵浸泡在生长因子溶液中,反应得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。本发明解决了胶原‑糖胺聚糖复配时容易沉淀的难题;实现材料微观网络结构(孔径大小、孔隙率)、机械强度可调控,最终达成血管生成速度和创面愈合周期和材料性能的匹配,生长因子通过缓控释,主动引导创伤修复和组织再生。

权利要求书

太阳城集团1.一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:1)、制备低免疫原性、高纯度生物活性胶原;2)、向胶原中加入酸酐,在4~15℃下,搅拌,使胶原酰基化;3)、向2)中加入糖胺聚糖,拌均匀后,离心,去除气泡,然后灌注到模具中,冷冻干燥,得到具有多孔网络结构的胶原-糖胺聚糖复合海绵;4)、将胶原-糖胺聚糖复合海绵置于EDC/NHS交联体系中交联,用L-聚赖氨酸调节交联度,室温下摇晃反应一定太阳城集团,然后蒸馏水清洗去除残留的交联剂,得到交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵;5)、将交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵浸泡在生长因子溶液中,吸附一段太阳城集团后,置于模具中,冷冻干燥,得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。2.如权利要求1所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤1)制得的胶原的质量浓度为0.5%~1.5%。3.如权利要求1所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中的酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐和邻苯二甲酸酐中任意一种,加入酸酐的量为5~20g/100g胶原。4.如权利要求3所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中酰基化反应的太阳城集团为1~6h,反应pH为7~10。5.如权利要求1所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中的糖胺聚糖为透明质酸、硫酸软骨素、低分子量肝素、硫酸乙酰肝素和壳聚糖中的一种或多种,糖胺聚糖与胶原的质量比为1:8~20。6.如权利要求5所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中透明质酸的分子量为400~180kDa,硫酸软骨素的分子量为10~40kDa,低分子量肝素的分子量为3000~8000Da,硫酸乙酰肝素的分子量为20~50kDa。7.如权利要求1所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤4)中EDC/NHS交联体系中溶剂为蒸馏水、50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇中的一种,EDC的浓度为0.5~10mmol/L,NHS的浓度为0.125~2.5mmol/L,L-聚赖氨酸的浓度为0.1~5mmol/L。8.如权利要求6所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤4)中交联反应的太阳城集团为6~12h。9.如权利要求6所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤5)中的生长因子为bFGF、EGF、PDGF、CDGF和IGF-1中的一种或多种,生长因子的浓度为50~150μg/mL。10.如权利要求6所述的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,其特征在于,所述步骤5)中得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的厚度为1~5mm。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明涉及一种创伤修复材料,具体为一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法。

背景技术

创伤修复材料是用于手术后伤口护理、烧伤、外部创伤和长期不愈性溃疡伤口修复的一类临床医用材料,主要包括传统创伤护理产品(如棉纱绷带、浸渍棉纱、棉垫等)和高端创伤修复材料。相比传统创伤护理产品,高端创伤修复材料基于湿性伤口愈合理论开发,能够提高伤口愈合速度和愈合质量,解决慢性和复杂伤口难愈合等问题,减轻患者痛苦,且更换频率更低,更符合现代医学的发展需求和主流技术方向。

随着社会经济的发展、人口老龄化以及随之而来的糖尿病溃疡、静脉曲张溃疡、褥疮等慢性创伤患者的增加,全球市场对高端创伤修复材料的需求进一步扩大。据统计,2012年全球高端创伤修复材料市场规模在75亿美金左右,约占创伤修复材料市场50%份额,预计2016年将增至152亿美元。其中,美国占据高端创伤修复材料约47%的市场,欧洲占34%,其它国家和地区占19%,高端创伤修复材料市场在欧美国家整体呈快速增长趋势。目前,全球30家主要的医疗制品生产商已开发出超过300个创伤修复材料品种,其中包括多种生物基型、非粘连型、专用高吸收型、皮肤替代型等高端产品。

而国内创伤护理市场目前主要以传统棉质护理产品为主。高端创伤修复材料仅为40亿人民币左右、占20%市场份额,且从事高端创伤修复材料生产的企业不超过10家,产品性能与功能性品种方面与国外的差距非常明显。患者使用高端创伤修复产品的比例也远低于欧美国家,中高端领域几乎为国外品牌所垄断。整体而言,我国对于高端创伤修复材料尚处于市场培育阶段,但依据2011年的相关统计,按全国医疗卫生机构外科门诊量的10%、住院病人的20%计,每年约有1.1亿人次需要创伤护理,高端创伤护理市场显然潜力巨大,预计到2020年市场规模可达200亿。

国内市场高端创伤修复材料主要包括胶原类、氧化纤维素类、壳聚糖类和海藻多糖类等四类产品。其中胶原类产品因具有良好的生物相容性、生物可降解性、加速伤口愈合等优点,成为目前临床使用最主流的产品,广泛应用于各类创伤护理以引导创伤修复,适合于几乎每一个需采用高级护理模式、加速封闭情况的慢性创伤患者。目前国内市场胶原基创伤修复产品主要包括皮耐克(进口)、倍菱、科劳得、其胜、创福康和可即邦等,其中皮耐克几乎占据创伤修复市场近90%的份额,国内产品虽同时具有止血、修复和填充的功能,在临床应用时因为缺乏产品功能细分和专业指导,更多作为止血产品使用。

单纯的胶原基生物材料只是作为支架被动地引导创伤修复,但无法主动诱导组织再生。材料主动引导组织再生修复的功能可通过复合多种具有促进或抑制细胞分裂繁殖、迁移和基因表达作用的组织生长因子来实现。国内市场现有胶原基产品基本都属于被动引导修复这一类型。对于高端创伤修复材料领域而言,可主动引导并加速创伤修复和组织再生的产品才是未来的最终发展目标。目前国内科研院所对此进行的基础研究较多,产业化结合不够紧密;而我国创伤修复产品生产企业规模较小,科研实力薄弱,直接转型进入高端创伤修复市场也面临着不小的困难,主动型创伤修复材料的研发产业化在国内相当滞后。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的单一的胶原材料,只能被动地促进创伤修复的缺陷,提供一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法。

为了解决上述技术问题,本发明提供了如下的技术方案:

一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,包括以下步骤:

太阳城集团1)、制备低免疫原性、高纯度生物活性胶原;优选的,制备胶原的具体方法参照专利号为ZL201110361034X的发明专利;

太阳城集团2)、向胶原中加入酸酐,在4~15℃下,搅拌,使胶原酰基化;

3)、向2)中加入糖胺聚糖,拌均匀后,离心,去除气泡,然后灌注到模具中,冷冻干燥,得到具有多孔网络结构的胶原-糖胺聚糖复合海绵;

4)、将胶原-糖胺聚糖复合海绵置于EDC/NHS交联体系中交联,用L-聚赖氨酸调节交联度,室温下摇晃反应一定太阳城集团,然后蒸馏水清洗去除残留的交联剂,得到交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵;

太阳城集团5)、将交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵浸泡在生长因子溶液中,吸附一段太阳城集团后,置于模具中,冷冻干燥,得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。

太阳城集团进一步的,所述步骤1)制得的胶原的质量浓度为0.5%~1.5%。

进一步的,所述步骤2)中的酸酐为乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐和邻苯二甲酸酐中任意一种,加入酸酐的量为5~20g/100g胶原。优选的,酰基化反应的太阳城集团为1~6h,反应pH为7~10。

进一步的,所述步骤3)中的糖胺聚糖为透明质酸、硫酸软骨素、低分子量肝素、硫酸乙酰肝素和壳聚糖中的一种或多种,糖胺聚糖与胶原的质量比为1:8~20。优选的,透明质酸的分子量为400~180kDa,硫酸软骨素的分子量为10~40kDa,低分子量肝素的分子量为3000~8000Da,硫酸乙酰肝素的分子量为20~50kDa。

进一步的,所述步骤4)中EDC/NHS交联体系中溶剂为蒸馏水、50%乙醇、75%乙醇和95%乙醇中的一种,EDC的浓度为0.5~10mmol/L,NHS的浓度为0.125~2.5mmol/L,L-聚赖氨酸的浓度为0.1~5mmol/L。优选的,步骤4)中交联反应的太阳城集团为6~12h。

进一步的,所述步骤5)中的生长因子为bFGF、EGF、PDGF、CDGF和IGF-1中的一种或多种,生长因子的浓度为50~150μg/mL

太阳城集团进一步的,所述步骤5)中得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的厚度为1~5mm。

太阳城集团制备低免疫原性、高纯度生物活性胶原包括原料预处理、除脂、酸酶结合处理、超声波处理、H2O2溶液处理、酸溶盐析纯化、透析纯化、干燥,具体步骤如下:(1)取新鲜动物组织(猪皮、牛皮、牛跟腱等),切割清除油脂层和毛皮层,去除杂质,清洗,将组织破碎成小颗粒状,按照固液比1:30~1:40的比例,加入0.01~0.03mol/L的氢氧化钠水溶液,于6~8℃浸泡1~2小时,过滤,备用;(2)在上述预处理后的组织中加入质量为组织质量6~8倍的无水乙醚或者丙酮,于35~40℃回流5-8小时,之后用蒸馏水冲洗至无异味,备用;(3)将上述组织浸入0.6~0.7mol/L冰醋酸和600~700mg/L胃蛋白酶的混合液中,持续搅拌25~30小时;(4)对上述混合物采用渐进式超声波处理,先使用100~200W超声处理30分钟,再使用200~300W超声处理30分钟,最后使用300~400W超声处理1小时;(5)加入2~3%的H2O2溶液,混合静置2~4小时,调节pH至5.0,离心;(6)取上清液,加入NaCl,搅拌20-30小时,离心,沉淀物加入0.6-0.7moL/L冰醋酸溶解,离心,取上清液,调节pH至7.5,加入NaCl,搅拌20-30小时,离心;(7)将步骤(6)得到的沉淀物溶解于0.6~0.7moL/L冰醋酸,先以0.6~0.7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次,每次4小时,再以蒸馏水为透析外液透析5~7次,每次4小时,至外液检测不到氯离子,得到胶原液体;(8)将上述液体冷冻干燥,得到具有三螺旋结构活性的胶原。

太阳城集团本发明通过复合生长因子开发可主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。但生长因子必须与细胞接触超过一定太阳城集团才能起效,而其半衰期较短、易被蛋白酶降解,简单将生长因子与胶原复合是无法实现主动引导创伤修复这一功能的。本发明中创造性的引入糖胺聚糖,利用糖胺聚糖与生长因子间的特异性作用,可实现生长因子的缓控释以调节生长因子的活性,进而实现胶原基创伤修复材料的主动引导组织再生修复功能。

太阳城集团本发明采用仿生构建技术,以低免疫原性、高纯度生物活性胶原为基材,通过胶原-糖胺聚糖共组装成复合纤维,解决二者复配时容易沉淀的难题,进而复合生长因子并实现生长因子的缓控释,开发可主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。该产品可应用于各种急慢性创伤的治疗,尤其针对愈合速度慢、组织再生困难、血管化程度低的慢性创面,可达到加快创伤修复和组织再生的疗效。该产品的发明,有望解决创伤修复领域中深度和大面积创伤、难愈合创伤(如糖尿病足、下肢静脉溃疡)等临床存在的血管化程度低、伤口愈合速度慢、组织再生困难等问题。

本发明通过胶原酰基化的改性,使胶原的等电点为4~4.5,解决了胶原-糖胺聚糖复配时容易沉淀的难题;通过L-聚赖氨酸对体系中自由氨基数量的调节,精确控制材料的交联密度,实现材料降解周期的可控调节,使材料的孔径大小可在50~200μm之间进行调节,孔隙率可在80%~95%之间进行调节,降解周期可在4~12周之间进行调节,实现材料微观网络结构(孔径大小、孔隙率)、机械强度可调控,最终达成血管生成速度和创面愈合周期和材料性能的匹配。通过胶原基生物材料仿生构建技术,复合生长因子和糖胺聚糖,糖胺聚糖在保护生长因子活性的同时调节生长因子的缓控释放,生长因子通过缓控释,主动引导创伤修复和组织再生。

附图说明

太阳城集团附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:

太阳城集团图1是本发明胶原基创伤修复材料微观结构SEM图。

具体实施方式

太阳城集团以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。

实施例1

一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,包括以下步骤:

1)、制备质量浓度为0.5%的低免疫原性、高纯度生物活性胶原;

太阳城集团2)、向胶原中加入乙酸酐,在4℃,pH为7下搅拌,酰基化反应6h,乙酸酐的加入量为5g/100g胶原;

3)、向2)中加入分子量为180kDa透明质酸,拌均匀后,离心,去除气泡,然后灌注到模具中,冷冻干燥,得到具有多孔网络结构的胶原-糖胺聚糖复合海绵;透明质酸与胶原的质量比为1:8;

4)、将胶原-糖胺聚糖复合海绵置于EDC/NHS交联体系中交联,用L-聚赖氨酸调节交联度,室温下摇晃交联反应6h,然后蒸馏水清洗去除残留的交联剂,得到交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵;EDC/NHS交联体系中溶剂为蒸馏水,EDC的浓度为0.5mmol/L,NHS的浓度为0.125mmol/L,L-聚赖氨酸的浓度为0.1mmol/L;

太阳城集团5)、将交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵浸泡在浓度为50μg/mL的生长因子bFGF溶液中,吸附一段太阳城集团后,置于模具中,冷冻干燥,得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。

实施例2

太阳城集团一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,包括以下步骤:

1)、制备质量浓度为1.5%的低免疫原性、高纯度生物活性胶原;

2)、向胶原中加入丁二酸酐,在15℃,pH为10下搅拌反应1h,使胶原酰基化;丁二酸酐的加入量为20g/100g胶原;

太阳城集团3)、向2)中加入分子量为40kDa的硫酸软骨素,拌均匀后,离心,去除气泡,然后灌注到模具中,冷冻干燥,得到具有多孔网络结构的胶原-糖胺聚糖复合海绵;硫酸软骨素与胶原的质量比为1:20;

太阳城集团4)、将胶原-糖胺聚糖复合海绵置于EDC/NHS交联体系中交联,用L-聚赖氨酸调节交联度,室温下摇晃反应12h,然后蒸馏水清洗去除残留的交联剂,得到交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵;EDC/NHS交联体系中溶剂为50%乙醇,EDC的浓度为10mmol/L,NHS的浓度为2.5mmol/L,L-聚赖氨酸的浓度为5mmol/L;

5)、将交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵浸泡在浓度为150μg/mL的生长因子PDGF溶液中,吸附一段太阳城集团后,置于模具中,冷冻干燥,得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。

实施例3

太阳城集团一种主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的制备方法,包括以下步骤:

太阳城集团1)、制备质量浓度为1.2%的低免疫原性、高纯度生物活性胶原;

2)、向胶原中加入邻苯二甲酸酐,在10℃下,pH为9搅拌反应3h,使胶原酰基化;加入酸酐的量为10g/100g胶原;

3)、向2)中加入壳聚糖,拌均匀后,离心,去除气泡,然后灌注到模具中,冷冻干燥,得到具有多孔网络结构的胶原-糖胺聚糖复合海绵;糖胺聚糖与胶原的质量比为1:14;

4)、将胶原-糖胺聚糖复合海绵置于EDC/NHS交联体系中交联,用L-聚赖氨酸调节交联度,室温下摇晃反应10h,然后蒸馏水清洗去除残留的交联剂,得到交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵;EDC/NHS交联体系中溶剂为95%乙醇,EDC的浓度为5mmol/L,NHS的浓度为1.8mmol/L,L-聚赖氨酸的浓度为3mmol/L;

5)、将交联的胶原-糖胺聚糖复合海绵浸泡在浓度为100μg/mL的生长因子溶液中,吸附一段太阳城集团后,置于模具中,冷冻干燥,得到主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料。生长因子为PDGF、CDGF和IGF-1中的混合物。

太阳城集团表1本发明的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料的部分性能

采用本发明的主动引导组织再生修复的仿生胶原基材料对猪全层皮肤缺损的修复,结果表明,胶原基创伤修复材料结构相对致密,孔隙率高,有利于细胞的迁移和营养物质的运输,移植材料后4周血管化最明显,胶原沉积较多,纤维结缔组织再生良好,自体皮完全存活,移植支架后6周,支架基本降解,真皮样组织替代了支架植入部位,支架的降解速度与新生组织生成速度相匹配,真皮组织的重建与塑形能够被很好的诱导生成,植皮效果好,满足了临床上对真皮替代物的需求。结果表明本发明制得的胶原基创伤修复材料与进口的皮耐克产品在促进成纤维细胞生长、结缔组织再生、组织血管化等方面的功效一致,甚至优于皮耐克。

最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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