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一种菌根真菌子实体及其在抗肿瘤中的应用.pdf

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一种 菌根 菌子 实体 及其 肿瘤 中的 应用
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摘要
申请专利号:

CN201710771284.8

申请日:

20170831

公开号:

太阳城集团CN107519212A

公开日:

20171229

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A61K36/07,A61P35/00,A01G1/04 主分类号: A61K36/07,A61P35/00,A01G1/04
申请人: 广东省微生物研究所,广东粤微食用菌技术有限公司
发明人: 胡惠萍,刘远超,黄志勇,黄龙花,谢意珍,吴清平
地址: 510075 广东省广州市越秀区先烈中路100号大院
优先权: CN201710771284A
专利代理机构: 广州弘邦专利商标事务所有限公司 代理人: 张钇斌
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法律状态
申请(专利)号:

CN201710771284.8

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法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明公开一种菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,所述菌根真菌子实体为紫褶口蘑,所述紫褶口蘑为真菌界担子菌门伞菌纲伞菌目口蘑科紫褶口蘑属。本发明所述菌根真菌子实体,可通过组织分离法得到纯培养菌种,然后将菌种的菌丝体进行发酵得到发酵液,最后对发酵液进行提取得到提取物,经过试验,所得提取物具有显著的抑制肿瘤细胞作用,因此,本发明为肿瘤的治疗提供了新的选择。

权利要求书

太阳城集团1.一种菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述菌根真菌子实体为紫褶口蘑,所述紫褶口蘑为真菌界担子菌门伞菌纲伞菌目口蘑科紫褶口蘑属。2.如权利要求1所述的菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述子实体的rDNA-ITS序列为:GGAAGGATCATTATTGAATGAACTTGGTCCAAGTTGTTGCTGGCTCCTTGGAGCATATATGTGTGCACGCTTGGTACTCATTCTATTTACCCACCTGTGCACTCTTTTGTAGAGCCCTGAGATATTTAGTTATTCAGGTGTTTCCTGAGTTGAAGGTTTGCTGTGCGAAAGTCAGCTTTCCTTTATTTTTTATCTCTAGGGATTCTATGTATTCTTATATACTCCTAATGAATGTAACAGAATGTTATGTTGGTTTTAAAAAAACACAATATACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTTCTCAATCCTTCCTTTCGTTCTCAATGAATGAAAGAGGTTGGCATTGGAATGTGGAAGCTGCAGGCTTTTTATTATTATAATAAAGTCAGCTCTTCTAAAAAGCATTAGCTAAATGTTTTGAGAATTAAACTAGCATTGGTGTGATAATTATCTACGCCATTTGTTAAATCTCTTCATAGTTTAGCTTCTAATATAACATTGGTCTTTGGGACCTTGTTTTGATAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA。3.如权利要求1所述的菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述菌根真菌子实体先通过组织分离法得到纯培养菌种,然后将菌种的菌丝体进行发酵得到发酵液,最后对发酵液进行提取得到提取物用于制备抗肿瘤药物。4.如权利要求3所述的菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述采用组织分离法进行培养时,采用的培养基包含:玉米粉水提物、麦芽提取物、酵母提取物、琼脂粉和去离子水。5.如权利要求4所述的菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述培养基中,各组分的质量浓度为:玉米粉水提物50g/L、麦芽提取物20g/L、酵母提取物3g/L、琼脂粉20g/L。6.如权利要求4或5所述的菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述培养基采用如下方法配置而成:称取玉米粉,溶解至一部分去离子水,煮沸,15min后使用3层纱布过滤,保存滤液,然后称取麦芽提取物、酵母提取物,溶解至玉米粉提取液,继续添加一部分去离子水,加热并完全溶解后,称取琼脂粉并不断搅拌至完全溶解,然后添加剩余去离子水定容,分装至三角瓶或试管中,加胶塞密封,121℃高压灭菌20分钟,灭菌完成后待温度降至60℃后取出,洁净条件下倒平板或摆斜面,制成平板或斜面试管培养基。7.如权利要求3所述的菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述菌丝体发酵液采用如下方法制备而成:首先制备发酵培养基,称取玉米粉,溶解至一部分去离子水,煮沸,15min后使用3层纱布过滤,保存滤液,然后称取麦芽提取物、酵母提取物,溶解至玉米粉提取液,继续添加一部分去离子水,加热并完全溶解后,称取琼脂粉并不断搅拌至完全溶解,然后添加剩余去离子水定容,分装至三角瓶或试管中,加胶塞密封,121℃高压灭菌20分钟,灭菌完成后待温度降至60℃后取出,洁净条件下倒平板或摆斜面,制成平板或斜面试管培养基;所述发酵培养基中含以下质量浓度的组分:玉米粉水提物50g/L、麦芽提取物20g/L、酵母提取物3g/L、琼脂粉20g/L;发酵培养基的温度降至室温后,接种5-8块3-5mm菌丝块,然后180rpm避光培养30d,取出后用超声提取30min,然后使用3层无菌纱布过滤,得到发酵液。8.如权利要求3或7所述的菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于,所述采用无水乙醇对菌丝体发酵液进行提取,提取方法为:按照体积比为1:10的比例将无水乙醇加入到发酵液中,4℃冰箱存放处理12h,然后50℃、40rpm条件下旋转蒸发减压浓缩,产物在-80℃、0.008mBAR条件下使用低温冷冻干燥机干燥,冻干完成后即得菌丝体醇提物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌及其应用,尤其是一种自真菌界(Fungi)担子菌门 (Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科 (Tricholomataceae)紫褶口蘑属的紫褶口蘑及其在抗肿瘤中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是一类严重危害人类健康和生命的疾病,在所有死亡原因中已经超过心脑血管疾病、成为排名第一的死亡原因。随着自然生态的失衡和环境污染的加剧,恶性肿瘤的发病率和死亡率在世界范围内呈现着上升趋势。

太阳城集团大型真菌代谢产物含有丰富的活性物质,如具有抗肿瘤功效的真菌多糖、甾醇类、核苷类、萜类化合物、真菌蛋白等,现有报道具有抗肿瘤活性的大型真菌有香菇(Lentinus edodes)、灵芝(Ganoderma spp)、茯苓(Poria cocos)、金针菇 (Flammulina velutipes)、黑木耳(Auricularia auricular)、鸡油菌(Cantharellus spp)、珊瑚菌(Clavaria spp)、齿菌(Hydnum spp)、香蘑(Lepista nuda)、松茸(Tricholoma matsutake)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、墨汁鬼伞(Coprinus atramentarius)、滑菇(Pholiota nameko)、栓菌(Tremella spp)、灰树花(Grifola frondosa)、桦褐孔菌(Inonotus obliquus)等多孔菌,这些大型真菌子实体或发酵液的提取物所具有的活性成分,已经开始被开发,特别是香菇多糖、灵芝多糖、灵芝三萜等功效显著的化合物已经被明晰,因而从大型真菌中继续寻找有新的作用机制和特殊化学结构的细胞药物具有重大潜力,成为癌症防治研究的一个新的热点。

发明内容

本发明的目的在于结合上述背景技术寻找一种新的具有抗肿瘤效果的菌根真菌子实体。

为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用,所述菌根真菌子实体为紫褶口蘑,所述紫褶口蘑为真菌界担子菌门伞菌纲伞菌目口蘑科紫褶口蘑属。

太阳城集团本发明中的菌根真菌子实体为紫褶口蘑,来自真菌界(Fungi)担子菌门 (Basidiomycota)伞菌纲(Agaricomycetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科 (Tricholomataceae)紫褶口蘑属。紫褶口蘑(Tricholosporum sp.)为口蘑科 (Tricholomataceae)、紫褶口蘑属(Tricholosporum)的一个新物种,采自辽宁阜新三塔沟风景区内玉米地旁的腐殖层。子实体群生于阔叶林腐殖层上,常形成蘑菇圈,菌盖平展,淡黄色至橙色,带部分紫色,中部略凸起,菌盖边缘撕裂状,有绒毛状附属物,并呈波浪状,干燥时部分内卷,菌褶淡紫色,直生至弯生,不等长,褶缘近似锯齿状,菌柄圆柱形,下部稍粗,有绒毛状附属物,中下部颜色稍深,颜色近菌盖,上部白色,菌柄实心,纤维质,菌肉白色。担孢子十字型,6.1~6.5×5.5~5.9μm。

作为本发明所述菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用的优选实施方式,所述子实体的rDNA-ITS序列为:

GGAAGGATCATTATTGAATGAACTTGGTCCAAGTTGTTGCTGGCTCCTTGG AGCATATATGTGTGCACGCTTGGTACTCATTCTATTTACCCACCTGTGCACT CTTTTGTAGAGCCCTGAGATATTTAGTTATTCAGGTGTTTCCTGAGTTGAAG GTTTGCTGTGCGAAAGTCAGCTTTCCTTTATTTTTTATCTCTAGGGATTCTAT GTATTCTTATATACTCCTAATGAATGTAACAGAATGTTATGTTGGTTTTAAAA AAACACAATATACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATG AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA TCATCGAATCTTTGAACGCATCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGAGCATG CCTGTTTGAGTGTCATTAAATTTCTCAATCCTTCCTTTCGTTCTCAATGAAT GAAAGAGGTTGGCATTGGAATGTGGAAGCTGCAGGCTTTTTATTATTATAAT AAAGTCAGCTCTTCTAAAAAGCATTAGCTAAATGTTTTGAGAATTAAACTA GCATTGGTGTGATAATTATCTACGCCATTTGTTAAATCTCTTCATAGTTTAGC TTCTAATATAACATTGGTCTTTGGGACCTTGTTTTGATAATTTGACCTCAAAT CAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA。

太阳城集团子实体及菌丝体经试剂盒提取DNA,并以ITS1/ITS4引物扩增和测序,子实体和菌丝体共同的rDNA-ITS序列如上所示。

作为本发明所述菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用的优选实施方式,所述菌根真菌子实体先通过组织分离法得到纯培养菌种,然后将菌种的菌丝体进行发酵得到发酵液,最后对发酵液进行提取得到提取物用于制备抗肿瘤药物。

本发明所述菌根子实体通过组织分离法进行多次纯化培养,得到菌根真菌, 所得菌根真菌已于2017年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址: 中国,武汉,武汉大学,邮编430072),保藏编号:CCTCC NO:M 2017185,保藏菌 株号:HMGIM-D160241,拉丁文分类命名为:Tricholosporum sp.,子实体及菌 种的rDNA-ITS序列已提交至NCBI,登记号分别为:MF538720,MF538721。

太阳城集团作为本发明所述菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用的优选实施方式,所述采用组织分离法进行培养时,采用的培养基包含:玉米粉水提物、麦芽提取物、酵母提取物、琼脂粉和去离子水。采用组织分离方法在MMN、PDA 等通用培养基上接种组织块无法萌发获得纯培养,而在改良的复合培养基上生长情况较好,其配方包含:玉米粉水提物、麦芽提取物、酵母提取物、琼脂粉和去离子水。

作为本发明所述菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用的优选实施方式,所述培养基中,各组分的质量浓度为:玉米粉水提物50g/L、麦芽提取物 20g/L、酵母提取物3g/L、琼脂粉20g/L。

作为本发明所述菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用的优选实施方式,所述培养基采用如下方法配置而成:称取玉米粉,溶解至一部分去离子水,煮沸,15min后使用3层纱布过滤,保存滤液,然后称取麦芽提取物、酵母提取物,溶解至玉米粉提取液,继续添加一部分去离子水,加热并完全溶解后,称取琼脂粉并不断搅拌至完全溶解,然后添加剩余去离子水定容,分装至三角瓶或试管中,加胶塞密封,121℃高压灭菌20分钟,灭菌完成后待温度降至60℃后取出,洁净条件下倒平板或摆斜面,制成平板或斜面试管培养基。在该培养基上菌丝呈现淡紫色、有气生菌丝,基内菌丝较弱,且生长一段太阳城集团(10d)后形成拧结状,质地绒状。

太阳城集团作为本发明所述菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用的优选实施方式,所述菌丝体发酵液采用如下方法制备而成:首先制备发酵培养基,称取玉米粉,溶解至一部分去离子水,煮沸,15min后使用3层纱布过滤,保存滤液,然后称取麦芽提取物、酵母提取物,溶解至玉米粉提取液,继续添加一部分去离子水,加热并完全溶解后,称取琼脂粉并不断搅拌至完全溶解,然后添加剩余去离子水定容,分装至三角瓶或试管中,加胶塞密封,121℃高压灭菌20分钟,灭菌完成后待温度降至60℃后取出,洁净条件下倒平板或摆斜面,制成平板或斜面试管培养基;

太阳城集团所述发酵培养基中含以下质量浓度的组分:玉米粉水提物50g/L、麦芽提取物20g/L、酵母提取物3g/L、琼脂粉20g/L;

发酵培养基的温度降至室温后,接种5-8块3-5mm菌丝块,然后180rpm避光培养30d,取出后用超声提取30min,然后使用3层无菌纱布过滤,得到发酵液。

作为本发明所述菌根真菌子实体在制备抗肿瘤药物中的应用的优选实施方式,所述采用无水乙醇对菌丝体发酵液进行提取,提取方法为:按照体积比为 1:10的比例将无水乙醇加入到发酵液中,4℃冰箱存放处理12h,然后50℃、40rpm 条件下旋转蒸发减压浓缩,产物在-80℃、0.008mBAR条件下使用低温冷冻干燥机干燥,冻干完成后即得菌丝体醇提物。

本发明所述菌根真菌子实体,可通过组织分离法得到纯培养菌种,然后将菌种的菌丝体进行发酵得到发酵液,最后对发酵液进行提取得到提取物,经过试验,所得提取物具有显著的抑制肿瘤细胞作用,因此,本发明为肿瘤的治疗提供了新的选择。

附图说明

太阳城集团图1为本发明菌根真菌子实体的照片图。

图2为本发明菌根真菌子实体的担孢子扫描电镜图。

图3为本发明菌根真菌培养10天的生长状况图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和有益效果,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本发明菌根真菌子实体的一种实施例,本实施例所述菌根真菌子实体为紫褶口蘑,所述紫褶口蘑来自真菌界(Fungi)担子菌门(Basidiomycota)伞菌纲 (Agaricomycetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Tricholomataceae)紫褶口蘑属,是口蘑科(Tricholomataceae)、紫褶口蘑属(Tricholosporum)的一个新物种,采自辽宁阜新三塔沟风景区内玉米地旁的腐殖层。

太阳城集团子实体群生于阔叶林腐殖层上,常形成蘑菇圈,菌盖平展,淡黄色至橙色,带部分紫色,中部略凸起,菌盖边缘撕裂状,有绒毛状附属物,并呈波浪状,干燥时部分内卷,菌褶淡紫色,直生至弯生,不等长,褶缘近似锯齿状,菌柄圆柱形,下部稍粗,有绒毛状附属物,中下部颜色稍深,颜色近菌盖,上部白色,菌柄实心,纤维质,菌肉白色,如附图1所示。担孢子十字型,6.1~6.5× 5.5~5.9μm,担孢子扫描电镜图如附图2所示。此种的主要特点是担孢子呈十字型。

太阳城集团该新种是通过野外采集得到,依据形态学和分子生物学鉴定,菌种是分离自新鲜的子实体,经过多次纯化培养获得,并使用ITS序列验证与子实体一致,纯化培养基配置方法如下:称取玉米粉50g,溶解至500ml去离子水,煮沸,15min 后使用3层纱布过滤,保存滤液,然后称取麦芽提取物20.0g,酵母提取物3.0g,溶解至玉米粉提取液,继续添加400ml去离子水,加热并完全溶解后,称取琼脂粉20.0g并不断搅拌至完全溶解,然后添加去离子水定容至1000ml,分装至 250ml三角瓶或试管中,加胶塞密封,121℃高压灭菌20分钟,灭菌完成后待温度降至60℃后取出,洁净条件下倒平板或摆斜面,制成平板或斜面试管培养基。

子实体及菌丝体经试剂盒提取DNA,并以ITS1/ITS4引物扩增和测序,子实体和菌丝体共同的rDNA-ITS序列如下:

GGAAGGATCATTATTGAATGAACTTGGTCCAAGTTGTTGCTGGCTCCT TGGAGCATATATGTGTGCACGCTTGGTACTCATTCTATTTACCCACCTGTGC ACTCTTTTGTAGAGCCCTGAGATATTTAGTTATTCAGGTGTTTCCTGAGTTG AAGGTTTGCTGTGCGAAAGTCAGCTTTCCTTTATTTTTTATCTCTAGGGATT CTATGTATTCTTATATACTCCTAATGAATGTAACAGAATGTTATGTTGGTTTTA AAAAAACACAATATACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTCGCATCG ATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCATCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGAGC ATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTTCTCAATCCTTCCTTTCGTTCTCAATG AATGAAAGAGGTTGGCATTGGAATGTGGAAGCTGCAGGCTTTTTATTATTAT AATAAAGTCAGCTCTTCTAAAAAGCATTAGCTAAATGTTTTGAGAATTAAA CTAGCATTGGTGTGATAATTATCTACGCCATTTGTTAAATCTCTTCATAGTTT AGCTTCTAATATAACATTGGTCTTTGGGACCTTGTTTTGATAATTTGACCTC AAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA

采用组织分离法得到的纯培养菌种即为菌根真菌,已于2017年4月10日 保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国,武汉,武汉大学,邮编430072), 保藏编号:CCTCC NO:M 2017185,保藏菌株号:HMGIM-D160241,拉丁文分类命 名为:Tricholosporum sp.,子实体及菌种的rDNA-ITS序列已提交至NCBI,登 记号分别为:MF538720,MF538721。

太阳城集团实施例2本发明菌根真菌子实体用于抗肿瘤的效果试验

太阳城集团采用组织分离方法在MMN、PDA等通用培养基上接种组织块无法萌发获得纯培养,而在改良的复合培养基上生长情况较好,其配方为:玉米粉50g水提物,麦芽提取物20.0g,酵母提取物3.0g,琼脂粉20.0g,去离子水1000ml, 121℃高压灭菌15分钟。在该培养基上菌丝呈现淡紫色、有气生菌丝,基内菌丝较弱,且生长一段太阳城集团(10d)后形成拧结状,质地绒状,如附图3所示。

太阳城集团菌丝体发酵液的制备方法:首先准备发酵培养基:称取玉米粉50g,溶解至500ml去离子水,煮沸,15min后使用3层纱布过滤,保存滤液,然后称取麦芽提取物20.0g,酵母提取物3.0g,溶解至玉米粉提取液,继续添加400ml去离子水,加热并完全溶解后,添加去离子水定容至1000ml,分装至250ml三角瓶中,每个三角瓶定量100ml,加胶塞密封,121℃高压灭菌20分钟,灭菌完成后待温度降至50℃时取出三角瓶并转移至洁净台,待温度降至室温时接种5-8块3-5mm 菌丝块,然后180rpm避光培养30d,取出后用超声提取30min,然后使用3层无菌纱布过滤,得到发酵液。

太阳城集团醇提物制备方法:按照1:10的比例加入无水乙醇至发酵液中,4℃冰箱存放处理12h,然后50℃、40rpm条件下旋转蒸发减压浓缩,产物在-80℃、 0.008mBAR条件下使用低温冷冻干燥机干燥,冻干完成后使用无菌密封袋低温保存。

方法:

太阳城集团1.消化对数生长期Du145,NIH3T3细胞,种24孔板,8000个/孔,每孔500μL;

太阳城集团2.各样品称量30mg溶于300μL DMSO,完全溶解后加300μL DMEM (10%FBS),设置以下浓度100,250,300,350,400μg/ml,加药;

3.培养48h,观察细胞致死率,结果如表1所示。

表1细胞致死率结果

太阳城集团由表1结果可看出,发酵液的醇提物的IC50在300-350μg/mL之间,在浓度为400μg/mL时,Du145细胞死亡率为90%,NIH3T3细胞死亡率为100%,由此可说明,本发明所述菌根真菌子实体,经过分离纯化培养后得到菌根真菌,采用该菌根真菌的菌丝体发酵液醇提物能够有效抑制肿瘤细胞,可用于制备抗肿瘤药物等。

太阳城集团最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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