太阳城集团

  • / 13
  • 下载费用:30 金币  

具有抗多药耐药作用的阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统.pdf

关 键 词:
具有 抗多药 耐药 作用 阿霉素 藜芦 递送 纳米 系统
  专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
摘要
申请专利号:

CN201510414975.3

申请日:

20150715

公开号:

CN105055375B

公开日:

20171114

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A61K9/51,A61K31/704,A61K31/05,A61K47/28,A61P35/00 主分类号: A61K9/51,A61K31/704,A61K31/05,A61K47/28,A61P35/00
申请人: 中国人民解放军第四军医大学
发明人: 周四元,赵原,宋彦峰,成颖,刘苗,崔晗,刘道州,宦梦蕾,张邦乐
地址: 710032 陕西省西安市新城区长乐西路17号
优先权: CN201510414975A
专利代理机构: 西安文盛专利代理有限公司 代理人: 佘文英
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN201510414975.3

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种具有抗多药耐药作用的阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统。该纳米递药系统为脂质混合PLGA纳米粒,其内核为聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(PLGA),以对甲氧基苯甲酰胺‑聚乙二醇‑胆固醇连接物(AA‑PEG‑hyd‑CHOL)插入其表面,并将阿霉素(DOX)和白藜芦醇(RES)共同包封于脂质混合PLGA纳米粒中从而得到阿霉素和白藜芦醇共递送纳米粒。该纳米递药系统具有主动识别肿瘤细胞和pH敏感特性,可将阿霉素和白藜芦醇同时定位释放于肿瘤细胞,并利用两种药物间的协同作用,逆转肿瘤耐药,增强抗肿瘤活性,为治疗具有多药耐药的肿瘤提供了新策略。

权利要求书

太阳城集团1.一种具有抗多药耐药作用的阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统,其特征是递药系统是脂质混合PLGA纳米粒,其内核为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA),以对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物(AA-PEG-hyd-CHOL)插入其表面,具体制备方法如下:(1)对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物(AA-PEG-hyd-CHOL)的制备方法是:称取适量氨基己酸,以无水二氯甲烷溶解,再将对甲氧基苯甲酰氯缓慢加入到上述溶液中,常温下磁力搅拌至反应完全,真空旋转蒸发反应液;将反应物以少量的乙酸乙酯完全溶解,并以0.5M的稀盐酸进行洗涤萃取,弃去水相,加入无水硫酸钠干燥过夜,过滤弃去固体相,真空旋转蒸发有机相,以硅胶色谱柱分离纯化所得到的对甲氧基苯甲酰胺基己酸(AA);将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-N-羟基琥珀酰亚胺(EDCI/NHS)于二氯甲烷中溶解,加入上述合成的对甲氧基苯甲酰胺基己酸,常温下磁力搅拌4小时,活化后加入两末端均为氨基修饰的聚乙二醇(NH-PEG-NH)和少量三乙胺(TEA),继续磁力搅拌反应完全,真空旋转蒸发反应液;以适量甲醇溶解反应物,蒸馏水透析24小时,冷冻干燥,得AA-PEG-NH;另称适量对乙酰基苯甲酸溶于二氯甲烷,加入EDCI/NHS,反应液活化4小时后加入AA-PEG-NH,并以少量TFA催化至反应完全,真空旋转蒸发反应液,用少量甲醇重新溶解产物,蒸馏水透析24小时,冷冻干燥,得到AA-PEG-对乙酰基苯甲酸;称取适量胆固醇溶解于二氯甲烷中,并依次加入丁二酸酐、DMAP、TEA,室温下磁力搅拌,而后以硅胶色谱柱分离纯化所得到的胆固醇-琥珀酸单酯(CHOL-suc);然后,将CHOL-suc、EDCI/NHS于二氯甲烷中溶解并反应活化6小时,将适量肼基甲酸叔丁酯(Boc-NH-NH)和少量TEA投入反应液中,并以硅胶色谱柱分离纯化所得到胆固醇-琥珀酸-NHNHBoc;最后将得到胆固醇-琥珀酸-NHNHBoc溶于二氯甲烷,加入少量三氟乙酸(TFA),常温下磁力搅拌至反应完全,以二氯甲烷/水萃取反应液,弃去水相,冷冻干燥得胆固醇-琥珀酰肼(CHOL-NHNH);称取适量AA-PEG-对乙酰基苯甲酸和CHOL-NH-NH溶于适量二氯甲烷中,并加入少量TFA,常温下磁力搅拌至反应完全,真空旋转蒸发反应液,以适量甲醇溶解反应物,蒸馏水透析24小时,冷冻干燥,得到具有pH敏感特性的目标物对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物(AA-PEG-hyd-CHOL);(2)共同包封阿霉素(DOX)和白藜芦醇(RES)的脂质混合PLGA纳米粒的制备:称量一定量的PLGA和AA-PEG-hyd-CHOL溶于二氯甲烷中,以少量乙醇溶解白藜芦醇,并将一定量的盐酸阿霉素溶于蒸馏水中,将上述三种溶液混合并进行超声乳化,将0.3%的聚乙烯醇(PVA)加入超声后的液体中,并再次进行超声以固定初步形成的纳米载体;转移液体至敞口烧杯中,室温下磁力搅拌4小时,而后进行低温超速离心,弃上清液,以蒸馏水冲洗得到的沉淀并重新分散所得固体,即为目标脂质混合PLGA纳米粒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗多药耐药的肿瘤主动靶向阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统的处方组成及应用方案,递药系统为共同包封阿霉素(DOX)和白藜芦醇(RES)的新型脂质混合聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒。

背景技术

癌症是一种普遍的公共健康问题,有数以千万计的人因这一致命疾病而丧生。化疗是癌症治疗的主要手段之一。近年来的体内外实验发现,肿瘤细胞对细胞毒类化疗药物产生的内在性和获得性多重耐药性(multidrug resistance,MDR)是临床恶性肿瘤化疗失败最常见和最难以克服的问题之一。并且,MDR一经形成一般是永久性的,一旦肿瘤细胞对某一种化疗药物产生耐药,亦可对其他化学结构、细胞作用靶点和作用机理不同的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性,从而呈现出独特的广谱耐药现象。阿霉素(DOX)作为肿瘤化疗的一线药物,具有疗效确切、价格低廉等特点,但阿霉素对正常组织的毒副作用和易耐药的特点限制了其临床应用。白藜芦醇(Resveratrol,RES)是一种非黄酮类多酚化合物,广泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物中。随着对白藜芦醇的深入研究,发现白藜芦醇可以通过干扰肿瘤细胞生长、诱导P53、抑制核苷酸还原酶、抑制细胞色素P450等机制产生对肿瘤细胞的抑制作用。并且,近几年的研究发现,白藜芦醇还可作为一种化疗药物增敏剂,增加阿霉素等化疗药物在细胞内的积累,从而增强其对肿瘤的抑制作用。同时,白藜芦醇还可通过抑制P-糖蛋白活性,下调ATP结合盒(ABC)转运蛋白基因(如抑制MDR1和MRP1的水平),抗氧化等机制增强化疗药物的抗肿瘤作用。

本研究通过把阿霉素和白藜芦醇同时载入PLGA纳米载体中,同时,在纳米粒表面嵌入功能化的混合脂质,使纳米粒兼具肿瘤主动靶向、抗多药耐药等多种功能,改变DOX及RES在体内的分布,达到增强DOX的抗肿瘤作用、降低DOX的毒副作用、逆转DOX耐药的目的。

发明内容

太阳城集团本发明的目的是提供一种具有抗多药耐药作用的阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统。通过递药系统的设计,可将阿霉素和白藜芦醇同时定位释放于肿瘤细胞内,并利用两种药物间的协同作用,逆转肿瘤耐药,增强抗肿瘤活性,从而得到高效、低毒、逆转耐药的递药系统,为治疗具有多药耐药的肿瘤提供了新思路。

太阳城集团本发明的技术方案是:一种具有抗多药耐药作用的阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统,该纳米递药系统为脂质混合PLGA纳米粒,其内核为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA),以对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物(AA-PEG-hyd-CHOL)插入其表面,并将阿霉素(DOX)和白藜芦醇(RES)共同包裹于脂质混合PLGA纳米粒中从而得到共同载药纳米粒。其中

太阳城集团(1)对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物(AA-PEG-hyd-CHOL)的制备方法是:

称取适量氨基己酸,以无水二氯甲烷溶解,再将对甲氧基苯甲酰氯缓慢加入到上述溶液中,常温下磁力搅拌至反应完全,真空旋转蒸发反应液。将反应物以少量的乙酸乙酯完全溶解,并以0.5M的稀盐酸进行洗涤萃取,弃去水相,加入无水硫酸钠干燥过夜。过滤弃去固体相,真空旋转蒸发有机相,以硅胶色谱柱分离纯化所得到的对甲氧基苯甲酰胺基己酸(AA)。将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与N-N-羟基琥珀酰亚胺(EDCI/NHS)于二氯甲烷中溶解,加入上述合成的对甲氧基苯甲酰胺基己酸,常温下磁力搅拌4小时,活化后加入两末端均为氨基修饰的聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和少量三乙胺(TEA),继续磁力搅拌反应完全,真空旋转蒸发反应液;以适量甲醇溶解反应物,蒸馏水透析24小时,冷冻干燥,得AA-PEG-NH2;另称适量对乙酰基苯甲酸溶于二氯甲烷,加入EDCI/NHS,反应液活化4小时后加入AA-PEG-NH2,并以少量TFA催化至反应完全,真空旋转蒸发反应液,用少量甲醇重新溶解产物,蒸馏水透析24小时,冷冻干燥,得到AA-PEG-对乙酰基苯甲酸。

称取适量胆固醇溶解于二氯甲烷中,并依次加入丁二酸酐、DMAP、TEA,室温下磁力搅拌,而后以硅胶色谱柱分离纯化所得到的胆固醇-琥珀酸单酯(CHOL-suc);然后,将CHOL-suc、EDCI/NHS于二氯甲烷中溶解并反应活化6小时,将适量肼基甲酸叔丁酯(Boc-NH-NH2)和少量TEA投入反应液中,并以硅胶色谱柱分离纯化所得到胆固醇-琥珀酸-NHNHBoc;最后将得到胆固醇-琥珀酸-NHNHBoc溶于二氯甲烷,加入少量三氟乙酸(TFA),常温下磁力搅拌至反应完全,以二氯甲烷/水萃取反应液,弃去水相,冷冻干燥得胆固醇-琥珀酰肼(CHOL-NHNH2)。

称取适量AA-PEG-对乙酰基苯甲酸和CHOL-NH-NH2溶于适量二氯甲烷中,并加入少量TFA,常温下磁力搅拌至反应完全,真空旋转蒸发反应液,以适量甲醇溶解反应物,蒸馏水透析24小时,冷冻干燥,得到具有pH敏感特性的目标物对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物(AA-PEG-hyd-CHOL)。

(2)共同包裹阿霉素(DOX)和白藜芦醇(RES)的脂质混合PLGA纳米粒的制备:

称量一定量的PLGA(m1)和一定量的AA-PEG-hyd-CHOL(m2,m1=2m2)溶于二氯甲烷中(V1),以少量乙醇溶解白藜芦醇,并将一定量的盐酸阿霉素溶于蒸馏水中(V2,V2=2V1),将上述三种溶液混合并进行超声乳化,将0.3%的聚乙烯醇(PVA,V3,V3=V1+V2)加入超声后的液体中,并再次进行超声以固定初步形成的纳米载体;转移液体至敞口烧杯中,室温下磁力搅拌4小时,而后进行低温超速离心(12000rpm,15分钟,4℃),弃上清液,以蒸馏水冲洗得到的沉淀并重新分散所得固体,即为目标纳米粒。

太阳城集团本发明设计了一种新型纳米递药系统,此递药系统是脂质混合PLGA纳米粒,纳米粒结构包括PLGA、对甲氧基苯甲酰胺-聚乙二醇-胆固醇连接物(AA-PEG-hyd-CHOL)。该纳米粒具有肿瘤主动靶向性,将阿霉素和白藜芦醇同时释放于茴香酰胺受体高表达的肿瘤细胞中,从而发挥逆转耐药及抗肿瘤活性。

附图说明

太阳城集团图1A是同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)的DLS粒径图。

图1B是同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)的zeta电位图。

图2是不同太阳城集团点NPs于各个pH(pH 5.0,pH 6.5和pH 7.4)缓冲液介质中释放阿霉素和白藜芦醇量的曲线。**p<0.01,*p<0.05,vspH=7.4等太阳城集团点DOX释放量;##p<0.01,#p<0.05,vs pH=7.4等太阳城集团点RES释放量。

图3A是游离DOX、游离RES,游离DOX与RES混合溶液(MIX),及同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)对HepG2细胞的细胞毒性。

太阳城集团图3B是游离DOX、游离RES,游离DOX与RES混合溶液(MIX),及同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)对A549细胞的细胞毒性。

太阳城集团图3C是游离DOX、游离RES,游离DOX与RES混合溶液(MIX),及同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。

图3D是游离DOX、游离RES,游离DOX与RES混合溶液(MIX),及同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)对耐阿霉素的MDA-MB-231/ADR细胞的细胞毒性。

图3E是游离DOX、游离RES,游离DOX与RES混合溶液(MIX),及同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)对耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞的细胞毒性。

图3F是游离DOX、游离RES,游离DOX与RES混合溶液(MIX),及同时负载DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒(NPs)对耐甲氨蝶呤的MCF-7/ADR细胞的细胞毒性。

其中n=6,**p<0.01,*p<0.05,vs等剂量MIX;##p<0.01,#p<0.05,vs等剂量DOX;&&p<0.01,&p<0.05,vs等剂量RES。

太阳城集团图4是荷耐阿霉素MCF-7/ADR肿瘤细胞裸鼠肿瘤体积增长情况。图5是荷耐阿霉素MCF-7/ADR肿瘤细胞裸鼠静脉注射给予游离DOX(5mg/kg)以及NPs(含DOX 5mg/kg)后24小时,DOX在荷瘤裸鼠体内的分布情况。

图6是荷耐阿霉素MCF-7/ADR肿瘤细胞裸鼠静脉注射给予游离RES(20mg/kg)以及NPs(含RES 20mg/kg)后24小时,RES在荷瘤裸鼠体内的分布情况。

具体实施方式

共同包裹DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒的制备及其抗肿瘤活性研究

1目的:评价共同包封DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒的抗肿瘤活性。

2研究方法:

2.1载药量测定

取一定量纳米粒溶于定量的二甲基亚砜中以破坏纳米粒结构,荧光分光光度法检测载药量。

载药量=(递药系统中包裹的药物量/载药递药系统重量)×100%2.2pH敏感性评价

太阳城集团取一定量共同包裹DOX和RES的脂质混合PLGA纳米粒,平均分为三分,分别溶于pH 5.0,pH 6.5和pH 7.4的磷酸盐缓冲液中,置于37℃水浴中避光孵育,荧光分光光度仪测定其在不同太阳城集团点于各个pH(pH 5.0,pH 6.5和pH 7.4)介质中的阿霉素和白藜芦醇荧光值,并绘制释药曲线。

2.3细胞毒性评价

以1×104个细胞/孔的密度分别将处于对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231细胞、耐阿霉素人乳腺癌MDA-MB-231/ADR细胞、耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADR细胞、耐甲氨蝶呤人乳腺癌MCF-7/MTR细胞、肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞接种于96孔板中,置于孵箱中培养24小时,而后分别加入游离DOX、游离RES,MIX及NPs,以不含药物的培养液为空白对照组,继续置于孵箱中孵育48小时,而后加入20μL MTT,继续置于孵箱中孵育4小时,弃药液及培养液,以150μL DMSO完全溶解结晶紫,于490nm下以酶标仪读取OD值,绘制细胞存活率曲线图,按公式计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=(试验组OD值/空白对照组OD值)×100%

2.4药物的体内抗肿瘤活性评价

将4周龄的雌性裸鼠随机分为2组,每组5只。以细胞密度为1×107/ml收集耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,悬浮于无血清培养液中,在每只裸鼠背部皮下注射0.2ml。第五天时,裸鼠尾静脉注射NPs溶液(DOX 5mg/kg,RES 20mg/kg),空白对照裸鼠尾静脉注射等体积生理盐水。每6天给药一次,测量每组各只裸鼠肿瘤体积,并从首次给药时的肿瘤体积开始记录。

2.5药物的在荷瘤裸鼠体内的分布

以细胞密度为1×107/ml收集耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,悬浮于无血清培养液中,在4周龄的雌性裸鼠背部皮下注射0.2ml。待肿瘤体积为200mm3时,尾静脉注射NPs溶液(DOX 5mg/kg,RES 20mg/kg),并以尾静脉注射等体积生理盐水的裸鼠为空白对照。给药24小时后,将三组裸鼠脱颈处死,取脑、心、肝、脾、肺、肾及肿瘤,活体成像观察药物的在荷瘤裸鼠体内的分布。

3实验结果:

太阳城集团3.1脂质混合PLGA纳米粒的表征

太阳城集团如图1所示,脂质混合PLGA纳米粒的粒经为204±26nm,多分散指数为0.14±0.06,Zeta电位为-15.8±0.8mV。DOX的载药量为4.6±1.4%,RES的载药量为15.5±5.3%。

太阳城集团3.2pH敏感特性评价

如图2所示,脂质混合PLGA纳米粒的释药量(DOX或RES)均随pH的降低而显著升高。当孵育太阳城集团为24小时后,纳米粒在pH=5.0的缓冲液中,其所包裹的DOX和RES的释药量分别达到了67.7%和81.4%;而在pH=7.4的缓冲液中,其所包裹的DOX和RES的释药量只有43.7%和43.6%。该结果提示,在该酸性条件下,纳米粒表面的酸敏材料AA-PEG-CHOL水解从而释放药物。

3.3体外抗肿瘤活性

太阳城集团如图3所示,NPs对A549细胞、MDA-MB-231细胞、HepG2细胞均表现出明显的细胞毒性作用。在三种耐药肿瘤细胞中,相比于游离DOX和RES组,MIX组的细胞毒性明显增加,并且游离DOX处理组未显示明显的细胞毒性作用;而相比于MIX组,NPs对耐药肿瘤细胞表现更强的细胞毒性。上述结果显示,RES可显著增强多种肿瘤细胞对DOX的敏感性,DOX与RES具有显著的协同抗肿瘤作用;脂质混合PLGA纳米粒对于多种肿瘤细胞具有良好的细胞毒性作用。

3.4体内抗肿瘤活性

太阳城集团如图4所示,NPs显著抑制了荷瘤裸鼠肿瘤的生长,可使肿瘤最终消失。

3.5药物的在荷瘤裸鼠体内的分布

如图5和图6所示,荷瘤裸鼠给予NPs后,RES和DOX显著蓄积于肿瘤组织中,特别是DOX在心脏组织中基本无蓄积,从而降低了DOX的心脏毒性。提示PLGA纳米粒具有肿瘤靶向蓄积作用。

4结论:

体内外抗肿瘤实验结果显示,与游离阿霉素和游离白藜芦醇相比,共同包封DOX和RES的PLGA纳米粒可显著提高对耐药肿瘤细胞的细胞毒性,逆转肿瘤细胞多药耐药;共同包封DOX和RES的PLGA纳米粒可显著增加阿霉素和白藜芦醇在肿瘤组织的富集,显著减少DOX在心脏组织中的蓄积,降低心脏毒副作用,并呈现出良好的体内抗肿瘤活性,具有一定的开发前景。

太阳城集团本文
本文标题:具有抗多药耐药作用的阿霉素和白藜芦醇共递送纳米递药系统.pdf
链接地址:http://zh228.com/p-6749071.html
太阳城集团我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - - 联系我们

copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
葡京赌场|welcome document.write ('');