太阳城集团

  • / 10
  • 下载费用:30 金币  

一种可促进血管快速生成的骨组织工程支架.pdf

关 键 词:
一种 促进 血管 快速 生成 组织 工程 支架
  专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
摘要
申请专利号:

CN201810041798.2

申请日:

20180116

公开号:

太阳城集团CN108159490A

公开日:

20180615

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A61L27/12,A61L27/54,A61L27/38 主分类号: A61L27/12,A61L27/54,A61L27/38
申请人: 重庆医科大学
发明人: 白燕,丁庆
地址: 400016 重庆市渝中区医学院路1号
优先权: CN201810041798A
专利代理机构: 代理人:
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

CN201810041798.2

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明为一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架及其制备。本发明中,采用超临界流体强制分散溶液技术制备载有PDGF(血小板衍生生长因子)的PLLA(左旋聚乳酸)微球,再利用超临界二氧化碳发泡技术将微球、VEGF(血管内皮细胞生长因子)和FGF‑2(碱性成纤维细胞生长因子)三者共同载入PLGA(聚乳酸‑羟基乙醇酸)多孔支架中,最后在支架上种植血管内皮细胞,构建可协同调控血管生成的复合支架。本发明中,种植的血管内皮细胞可分化为新血管,其分泌的细胞外基质可提高相关细胞的粘附,三种血管诱导因子的次第释放可诱导血管的生长,三者协同作用可促进骨修复过程中血管的快速生成。本发明制备操作简单,所制得的复合支架具有良好的生物相容性及功能性,在组织工程修复体中具有应用前景。 1

权利要求书

1.一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法,其特征在于,所述方法包括下述步骤:(1)PDGF-PLLA微球的制备:将PDGF溶于二甲亚砜,PLLA溶于二氯甲烷中。当两种溶液都完全溶解后,将两者混合均匀。混合后的溶液经过高效液相色谱(HPLC)泵泵入高压沉积反应釜中,经历超临界流体强制分散溶液技术(SEDS)过程。沉淀析出的微球收集后储存于-20℃待用。(2)复合支架的制备:将羟基磷灰石(HA)与PLGA按1:4-1:2例研磨,加入一定量的PDGF-PLLA载药微球,以及FGF-2和VEGF冻干粉(FGF-2和VEGF冻干粉先用10000r/min或12000r/min,离心30s,重悬于pH7.6,5mmol/LTris至0.1g/L,加入事先混合好的PLGA、HA和PDGF-PLLA微球粉末中轻轻混匀后冻干),将混合粉末放入直径为1-8mm的圆柱形模具中室温下进行压制得到小圆片,取出。然后置于聚四氟乙烯圆柱体模具内并将模具放入超临界CO不锈钢反应釜中,采用超临界CO发泡技术制备多孔复合支架。(3)血管内皮细胞的种植:将复合支架放置于24孔板内,紫外线照射0.5h。再用75%酒精消毒,PBS浸泡清洗3次。将无菌的复合支架放置在DMEM培养液中孵育过夜。第4代血管内皮细胞经过培养消化后,制备成密度为1×10/ml的细胞悬液,分别种植于已准备好的支架材料上,37℃,5%CO细胞培养箱中继续培养24h。2.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法,其特征在于,步骤1中,采用SEDS制备PDGF-PLLA微球时,通过双通道喷嘴分别将试验溶液和超临界CO(SCCO)喷入高压反应釜中。当溶液接触到SCCO后,溶剂被SCCO萃取,使得试验溶液变成溶质的过饱和溶液,溶质从溶液中已微球的形式结晶析出。结束泵样后,维持压力和温度不变,继续通入CO淋洗30-60分钟以去除残留有机溶剂。3.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法,其特征在于,步骤1中,采用SEDS制备PDGF-PLLA微球的反应条件为:温度31-35℃,压强8-15Mpa,SCCO流速200-400ml/min,试验溶液流速为0.1-0.5ml/min。4.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法,其特征在于,步骤1中,采用SEDS制备PDGF-PLLA微球时:PDGF的用量为0.1-0.2mg,二甲基亚砜的用量为1-2.5mL。PLLA的分子量为1-10ku,用量为100-200mg,二氯甲烷的用量为10-40mL。5.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法,其特征在于,步骤2中,采用超临界CO发泡技术制备多孔复合支架的反应条件为:密封后用液泵将冷凝至0℃以下的CO压入反应釜内,反应压力为8-10MPa时开始升温,反应温度为30-37℃,通过仪器内置的热电偶和放空阀调节釜内的压力和温度,保持温度变化不超过±0.5℃,压力变化为±0.1Mpa。反应8h后,以一定的速率放气,减压速率为0.1-0.5MPa/s。6.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法,其特征在于,步骤2中,采用超临界CO发泡技术制备多孔复合支架时:PLGA的分子量为1-100ku,嵌段比为50:50-75:50,HA的用量为2-10%,PDGF-PLLA微球的用量为5-40%,FGF-2和VEGF冻干粉的用量为10-50μg。7.根据权利要求1所述的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备方法,其特征在于,释放第1至7天,VEGF、FGF-2和PDGF的累计释放率分别为71.10、69.76和43.17%。释放第7至21天,VEGF、FGF-2和PDGF的累计释放率分别为11.14、10.91和28.49%。生长因子释放初期以血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)为主,中后期以血小板衍生生长因子(PDGF)为主,能够满足血管生长不同时期对生长因子的需要,实现生长因子对血管再生的协同诱导作用。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明为一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架及其制备,属于药物剂型改变及其制备方法技术领域。具体地说,是利用超临界流体技术将微球和支架结合起来制备血管组织工程支架的新方法,特别涉及超临界流体强制分散溶液技术和超临界发泡技术对载药微球和复合支架的绿色可控制备过程,及复合支架中PDGF、FGF-2 和VEGF三种血管诱导因子的次第可控释放。

背景技术

血管不仅是氧气、各种营养成分及代谢废物的运输通道,而且是参与组织修复的细胞信号分子通过的重要途径,从整体上维持骨组织修复的代谢微环境。因此,迅速有效的血管重建是骨组织再生的前提和保障,也是长期制约组织工程骨发展和临床应用的关键问题。在血管生成的过程中,各种生长因子对局部组织、细胞的调控作用至关重要,其应用被认为是解决组织工程血管化最直接有效的途径之一。各种血管诱导因子的靶向细胞和诱导机理均不同,它们分别作用于血管生成的不同时期,且各种因子之间还存在着相互协同调控的作用。其中,VEGF、FGF和PDGF三种生长因子的作用至关重要。VEGF是已知的诱导血管生成作用最显著的生长因子,通过与内皮细胞膜受体的特异性结合促进内皮细胞的增殖、分化、迁移,还能够增强血管通透性,抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移,促进血浆物质向平滑肌细胞构成的亚内皮层聚集。FGF-2能够促进多种细胞的增殖和分化,同时调节细胞代谢,包括纤溶酶原激活物和胶原酶的分泌,调节其他生长因子的表达与合成。PDGF是一种由血小板产生的糖蛋白,作为一种有丝分裂原和趋化因子,能同时促进成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的分裂和生长。虽然这些生长因子对血管生成的诱导作用都已经得到证实,但是单一的生长因子不能实现真正意义上的组织再生,因为组织修复再生是一个多因子协同调控的结果,如何实现多种生长因子对血管生成的协同调控是关键。

生长因子对血管生成的协同调控与其种类、组合、剂量、作用太阳城集团和方式等多种因素有关。本课题组的前期工作研究了VEGF、FGF-2 和PDGF对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)血管分化和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)中血管生成的剂量依赖性、太阳城集团依赖性及各个因子间的协同效应。结果证明,VEGF和FGF-2对血管生成的最佳诱导太阳城集团是血管生成的前期,即前7天;而PDGF对血管生成的最佳诱导太阳城集团是血管生成的中后期,即7-21天。三种因子联合应用对血管生成和成骨均有显著的协同诱导效应。然而,直接使用生长因子存在半衰期短、容易失活、缺乏稳定性和组织选择性等问题,而且无法按照组织生长不同阶段的需要分段释放、协同调控。因此,需要根据不同因子的诱导特性和机理构建一种具有多种生长因子次第释放特性的载体系统,使其模拟血管形成与再生的生理过程,适时适量地释放不同的生长因子到需要的组织和细胞。但是,目前尚未见报道此类载体系统。本研究基于不同生长因子协同调控血管再生机理,结合微球和支架缓释系统各自的特点,制备一种释放初期以VEGF和FGF-2为主,中后期以PDGF为主的组织工程,使其有效促进骨组织工程中血管快速生成。

太阳城集团在生长因子载体系统的构建方法上,传统的方法如乳化法、喷雾干燥法、熔融法、盐析法等,常伴有高温高压、反应条件苛刻等问题,对蛋白类药物的稳定性和生物活性产生较大的影响。因此,为了最大化保持蛋白活性,采用一种温和工艺条件方法来制备载生长因子的聚合物载体是必要的。超临界流体技术智能性地满足这一要求。超临界二氧化碳流体技术因其无毒无污染、成本较低、反应条件温和、产品无有机溶剂残留、绿色环保等特点提供了相对传统方法更加洁净有效的技术优势,该方法能够最大化地保持生长因子活性,在蛋白类药物载体的制备方面更显独特优势。但是目前,将超临界流体技术用于复合微球和支架的多种生长因子载体系统的制备还尚未见报道。

发明的目的

根据不同血管诱导因子的诱导机理和作用特性,利用超临界流体技术将微球和支架进行复合制备一种模拟生理修复状况模式释放不同生长因子的聚合物载体系统,快速有效地促进组织工程骨中血管的生成。

发明的基本构思

太阳城集团生长因子缓释系统不能仅仅局限释放单一生长因子,而应该在一种类似生理修复状况模式下以最佳的比例释放多种生长因子到需要的靶向细胞。本发明根据生长因子协同调控血管生成的最佳诱导模式,采用超临界二氧化碳强制分散技术将PDGF载入聚乳酸(PLLA)微球中,再采用超临界二氧化碳发泡技术将PDGF-PLLA微球、VEGF 和FGF-2冻干粉载入复合支架中构建多生长因子缓释系统,使其按照设计的释放特性和剂量分阶段次第释放多种生长因子,以满足血管再生生理状况下的太阳城集团和空间上的生长因子需要,从而迅速有效地实现组织工程骨的血管化。

发明内容

本发明的目的在于根据不同因子对血管生成的诱导机理和协同作用制备一种模拟生理修复状况模释放多种生长因子的复合支架。采用超临界二氧化碳强制分散技术将PDGF载入聚乳酸(PLLA)微球中,再采用超临界二氧化碳发泡技术将PDGF-PLLA微球、VEGF和 FGF-2冻干粉载入复合支架中构建多生长因子缓释系统,使其按照设计的释放特性和剂量分阶段次第释放多种生长因子。从而迅速有效地实现组织工程骨的血管化,为组织工程骨的进一步应用提供了技术保障。

本发明制备的一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架所采用的工艺步骤如下:(1)PDGF-PLLA微球的制备:将PDGF 溶于二甲亚砜,PLLA溶于二氯甲烷中。当两种溶液都完全溶解后,将两者混合均匀。混合后的溶液经过高效液相色谱(HPLC)泵泵入高压沉积反应釜中,经历超临界流体强制分散溶液技术(SEDS)过程。沉淀析出的微球收集后储存于-20℃待用。

(2)复合支架的制备:将PLGA与羟基磷灰石(HA)按一定的比例研磨,加入一定量的PDGF-PLLA载药微球,以及FGF-2和VEGF 冻干粉(FGF-2和VEGF冻干粉先用10 000r/min或12 000r/min,离心30s,重悬于pH 7.6,5mmol/L Tris至0.1g/L,加入事先混合好的PLGA、HA和PDGF-PLLA微球粉末中轻轻混匀后冻干),将混合粉末放入直径为5mm的圆柱形模具中室温下进行压制得到小圆片,取出。然后置于聚四氟乙烯圆柱体模具内并将模具放入超临界 CO2不锈钢反应釜中,采用超临界CO2发泡技术制备多孔复合支架。 (2)血管内皮细胞的种植:将直径为5mm的复合支架放置于24 孔板内,紫外线照射0.5h。再用75%酒精消毒,PBS浸泡清洗3次。将无菌的复合支架放置在DMEM培养液中孵育过夜。第4代血管内皮细胞经过培养消化后,制备成密度为1×105/ml的细胞悬液,分别种植于已准备好的支架材料上,37℃,5%CO2细胞培养箱中继续培养24h。

太阳城集团本发明原创性和显著的技术进步在于:

基于一种可促进骨组织工程中血管快速生成的复合支架的制备,一方面,利用超临界流体强制分散溶液技术制备载PDGF的PLLA微球,并采用超临界二氧化碳发泡技术将微球和VEGF、FGF-2共同载入支架中制备复合支架。不但能够调控复合支架的性能,还有效保障了生长因子的生物活性,并可用于其他蛋白类大分子药物载体的制备。另一方面,本发明制备的复合支架结合了微球和支架的优势,模拟生理修复模式释放PDGF、FGF-2和VEGF,充分发挥三种生长因子的协同效应,满足血管生成过程中机体对不同生长因子的需要,进而快速有效地促进组织工程骨中血管的生成。最后,支架上种植的血管内皮细胞可分化为新血管,其分泌的细胞外基质可提高相关细胞的粘附,为新血管的形成提供细胞基础。

本发明的用途:本发明方法所得到的复合支架在蛋白类大分子药物的递送载体、再生医学领域具有重大的推动作用及应用前景。

附图说明

图1复合支架的制备过程示意图

太阳城集团图2超临界流体强制分散溶液技术制备PDGF-PLLA微球

图3 PDGF-PLLA载药微球形貌

图4复合支架形貌

图5复合支架中PDGF、VEGF和FGF-2释放规律

太阳城集团图6复合支架对鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)血管生成的作用

具体实施方式

下面结合附图及以下实施例对本发明做进一步详细说明,但并不能限制本发明的内容。在本发明的构思前提下,对本发明修饰方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实例一 PDGF-PLLA载药微球的制备

太阳城集团将0.2mg PDGF溶于2.5mL二甲亚砜,200mg分子量为10ku的 PLLA溶于40mL二氯甲烷中。当两种溶液都完全溶解后,将两者混合均匀待用。将钢瓶中的CO2经制冷系统液化后,由高压柱塞泵加压,再由管路中的恒温水浴升温后,通过高压釜顶部同轴二流式喷嘴外侧通道被泵入体积为500mL的高压釜中。待釜内压力达到12Mpa后,维持CO2泵入速率,开启放气阀以300ml/min的流速放气,维持釜内压力恒定。调节高压釜外部干燥箱及管路水浴温度,以保持釜内温度恒定在33℃。然后将混合后的试验溶液经过高效液相色谱(HPLC) 泵通过喷嘴内侧通道泵入高压釜中,试验溶液流速为0.5ml/min。接触到SCCO2后,溶剂被SCCO2萃取,使得试验溶液变成溶质的过饱和溶液,溶质从溶液中已微球的形式结晶析出。结束泵样后,维持压力和温度不变,继续通入CO2淋洗30分钟以去除残留有机溶剂。结束清洗后,缓慢卸压,待釜内压力降为常压时,打开反应釜收集样品。储存于-20℃待用。扫描电镜观察微球形貌,如附图1所示。

太阳城集团实例二复合支架的制备

太阳城集团将PLGA(PLA:PLG=50:50,MW=ku)与HA粉末以1:4的比例进行研磨,研磨太阳城集团为8小时。加入20%的PDGF-PLLA载药微球,以及20μg FGF-2和VEGF冻干粉。FGF-2和VEGF冻干粉先用10 000r/min或12 000r/min,离心30s,重悬于pH 7.6,5mmol/L Tris 至0.1g/L,加入事先混合好的PLGA、HA和PDGF-PLLA微球粉末中轻轻混匀后冻干。将混合粉末放入直径为5mm的圆柱形模具中室温下进行压制得到小圆片,取出。然后置于聚四氟乙烯圆柱体模具内并将模具放入超临界CO2不锈钢反应釜中。反应釜密封后用液泵将冷凝至0℃以下的CO2压入反应釜内,反应压力为8MPa时开始升温,反应温度为35℃,通过仪器内置的热电偶和放空阀调节釜内的压力和温度,保持温度变化不超过±0.5℃,压力变化为±0.1Mpa。反应8h后,以一定的速率放气,减压速率为0.1MPa/s。打开反应釜,取出样品,储存于-20℃待用。扫描电镜观察微球形貌,如附图2所示。检测复合支架中PDGF、VEGF和FGF-2的累计释放率,如附图 3所示。

太阳城集团实例三复合支架对鸡胚尿囊绒毛膜中血管生成的诱导

选择表面清洁,蛋壳均质的白皮种蛋,每蛋50-65g,形状规范,气室、气孔均匀。用温水清洗2次,然后用新洁尔灭洗液浸泡3分钟。将鸡胚放置于孵化箱中孵育,温度37.8±0.5℃,湿度40-60%。在孵育过程中要不停地转蛋,可防止胚胎发生粘连,促进羊膜运动。鸡胚顿端向上,呈45。倾斜,每天至少转蛋2-4次。每天用检蛋灯检查胚胎发育状况,识别胚胎发育的标志性特征,随时淘汰死胎。孵育第2-6天是鸡胚发育的关键时期,此后胚胎自身已有体温,并具有一定的调节能力。为了提高鸡胚的成活率,在孵育第7天开始加药有利于对待测药物作用的血管效应进行观察。鸡胚中血管生长的特点是在孵育的第3-5天、7-10天是血管生长高峰期,血管生长最活跃,便于结果的观察;12天以后CAM血管逐渐萎缩;5-6天左右,绒毛膜与尿囊膜发生融合,故选取7-12天为药物刺激最佳太阳城集团。因此,选择第7天至第12天进行生长因子对血管生成效应的考察。第7天以75%酒精擦拭卵壳,在超净台中吹干后用无菌镊子和尖嘴锥在鸡蛋的平钝端小心钻出一个小洞,小心用无菌石蜡膜覆盖以防干燥,鸡胚平钝端朝上在37℃、55%的相对空气湿度和3%CO2的条件下继续孵育,但不再翻动。开窗后第二天,按照实验分组加入复合支架,以自然发育的鸡胚作为对照组。第13天去掉鸡胚,取下CAM并与蛋皮分离,用解剖显微镜观察计数血管生成情况,如附图4所示。

太阳城集团本文
本文标题:一种可促进血管快速生成的骨组织工程支架.pdf
链接地址:http://zh228.com/p-6708326.html
太阳城集团我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - - 联系我们

copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
葡京赌场|welcome document.write ('');