太阳城集团

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用于包封益生菌的微粒,获得所述微粒的方法及其用途.pdf

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用于 包封益生菌 微粒 获得 方法 及其 用途
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201380046390.X

申请日:

20130705

公开号:

太阳城集团CN104602545A

公开日:

20150506

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A23L1/30,A61K9/16,A61K35/745,A61K35/747,A61K47/36,A61K47/42,A61K8/99,A61K8/73,A61K8/64,A61P37/02 主分类号: A23L1/30,A61K9/16,A61K35/745,A61K35/747,A61K47/36,A61K47/42,A61K8/99,A61K8/73,A61K8/64,A61P37/02
申请人: 国家食品安全与技术中心埃布罗实验室,纳瓦拉大学
发明人: 迈特·阿古罗斯巴佐,艾琳·埃斯帕扎卡塔兰,卡洛斯·加马索德拉拉西利亚,卡洛琳娜·冈萨雷斯费雷罗,卡洛斯哈维尔·冈萨雷斯纳瓦罗,胡安曼努埃尔·伊拉切加雷塔,丽贝卡·佩尼亚尔瓦索夫龙,安娜·罗莫瓦尔德,拉克尔·比尔托雷萨诺
地址: 西班牙纳瓦拉
优先权: P201231058
专利代理机构: 北京德崇智捷知识产权代理有限公司 代理人: 王金双
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法律状态
申请(专利)号:

CN201380046390.X

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明涉及包含由酪蛋白和壳聚糖形成的基质和益生菌的微粒;所述基质在(i)加工,(ii)存储和(iii)通过胃肠道转运期间保护所述益生菌,延长它们的寿命。本发明还涉及获得所述微粒的方法,包含所述微粒的产品及组合物。

权利要求书

太阳城集团1. 一种包含基质和益生菌的微粒,其中所述基质由酪蛋白和壳聚糖组成。2. 根据权利要求1所述的微粒,还包括交联剂。3. 根据权利要求2所述的微粒,其中所述交联剂是二价金属阳离子,三聚磷酸盐,香草醛,京尼平及其组合,所述二价金属阳离子选自由Ca、Mg、Zn、Fe及其组合组成的组。4. 根据权利要求2或3中任一项所述的微粒,其中所述交联剂是选自由Ca、三聚磷酸钠和香草醛组成的组。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的微粒,其中所述壳聚糖:酪蛋白的重量比为1:1 - 150,优选地1:5 - 100,更优选地大约1:14 - 40。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的微粒,其中所述益生菌是双歧杆菌或乳杆菌属细菌。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的微粒,其中所述益生菌是选自植物乳杆菌和干酪乳杆菌。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的微粒,其中所述微粒的大小是包括在1- 40μm之间,优选地大约2- 12μm。9. 一种用于获得在权利要求1-8中任一项定义的微粒的方法,所述方法包括混合酪蛋白或酪蛋白源,益生菌和壳聚糖。10. 根据权利要求9所述的方法,其中混合(i)酪蛋白或酪蛋白源的水溶液,(ii)益生菌的混悬液,和(iii)水性壳聚糖溶液。11. 根据权利要求9或10中任一项所述的方法,其中所述酪蛋白源是酪蛋白钠。12. 根据权利要求9-11中任一项所述的方法,还包括添加交联剂。13. 根据权利要求12所述的方法,其中以水性溶液形式添加所述交联剂。14. 根据权利要求9-13中任一项所述的方法,包括使酪蛋白或酪蛋白源、益生菌和壳聚糖的混合物,和可选择地交联剂,经历至少一个流体静压循环,以包括在100和800 MPa之间的压力。15. 根据权利要求9-14中任一项所述的方法,还包括干燥包含所形成的微粒的混悬液。16. 根据权利要求15所述的方法,其中包含所述微粒的混悬液是通过喷雾干燥的方式干燥。17. 根据权利要求15或16中任一项所述的方法,其中包含所述微粒的混悬液是在保护剂存在的情况下干燥。18. 根据权利要求17所述的方法,其中所述保护剂是糖类。19. 根据权利要求18所述的方法,其中所述保护剂是甘露醇。20. 根据权利要求17所述的方法,其中所述保护剂是益生元物质。21. 根据权利要求20所述的方法,其中所述益生元物质是选自由下列组成的组:寡聚果糖、胶质、菊粉、半乳寡糖、乳果糖、人乳寡聚糖、膳食纤维及其组合。22. 一种通过根据权利要求9-21中任一项所述的方法获得的微粒。23. 一种包括多种根据权利要求1- 8或22中任一项所述的微粒的组合物。24. 根据权利要求23所述的组合物,其中微粒的平均尺寸包括在1和40μm之间,优选地在2和12μm之间。25. 根据权利要求23或24中任一项所述的组合物,选自:组合物 A,包含:酪蛋白,重量占40%- 60%,壳聚糖,重量占0.1%- 3.5%,益生菌,10 CFU/g - 5×10CFU / g,三聚磷酸钠,重量占0%- 0.15%,和保护剂,重量占0% -60%;其中重量比涉及组合物的总重量;组合物 B,包含:酪蛋白,重量占40%-60%,壳聚糖,重量占0.1% - 3.5%,益生菌, 10 CFU/g - 5×10 CFU/g,香草醛,重量占0% - 0.6%,和保护剂,重量占 0% - 60%;其中重量比涉及组合物的总重量;和组合物 C,包含:酪蛋白,重量占40% - 60%,壳聚糖,重量占0.1% - 3.5%,益生菌, 10 CFU/g - 5×10 CFU/g,Ca,重量占 0% - 10%,和保护剂,重量占 0% - 60%,其中重量比涉及组合物的总重量。26. 一种组合物,包括至少一种根据权利要求1-8或22中任一项所述的微粒,食品,药物,化妆品或营养食品可接受的载体。27. 根据权利要求23-26中任一项所述的组合物,其中所述微粒是以干粉形式。28. 一种食品,药物,化妆品或营养食品产品,包括至少一种根据权利要求1-8或22中任一项所述的微粒,或根据权利要求23-27中任一项所述的组合物。29. 根据权利要求28所述的食品,药物,化妆品或营养食品产品,以液体、半固体或固态形式。30. 根据权利要求1-8或22中任一项所述的微粒,或根据权利要求23-27中任一项所述的组合物,或根据权利要求28-29中任一项所述的产品的用途,用于制备免疫系统调节组合物。31. 根据权利要求30所述的用途,其中所述免疫系统调节组合物是优选地诱导Th1应答和/或改变对Th1的免疫应答的组合物。32. 根据权利要求30所述的用途,其中所述免疫系统调节组合物是口服组合物,用于预防和/或治疗免疫系统损伤。33. 根据权利要求32所述的用途,其中所述免疫系统损伤是先天的损伤或诱导的损伤。34. 根据权利要求30所述的用途,其中所述免疫系统调节组合物是口服组合物,用于预防和/或治疗:-  Th2-介导移植排异反应,-  过敏症和过敏症相关疾病,-  免疫缺陷和衍生自所述免疫缺陷的病状,-  由细胞内的病原体所引起感染,或-  粘膜的感染。35. 根据权利要求34所述的用途,其中所述过敏症是选自,对于植物花粉的过敏症,对于动物的过敏症,食物过敏症,对于金属的过敏症及其组合。36. 根据权利要求34所述的用途,其中所述过敏症相关疾病是选自哮喘和过敏性皮炎。37. 根据权利要求34所述的用途,其中所述免疫缺陷是生理性的免疫缺陷,先天性免疫缺陷,或获得性免疫缺陷。38. 根据权利要求34所述的用途,其中所述细胞内的病原体是真核生物的病原体,原核生物的病原体或病毒。39. 根据权利要求38所述的用途,其中所述真核生物的细胞内的病原体是原生动物或真菌。40. 根据权利要求38所述的用途,其中所述原核生物的细胞内病原体是细菌。41. 根据权利要求30所述的用途,其中所述免疫系统调节组合物是口服组合物,用于预防和/或治疗粘膜的感染。42. 根据权利要求41所述的用途,其中所述粘膜选自口腔粘膜,胃肠道粘膜,泌尿生殖道粘膜和呼吸道粘膜。43. 根据权利要求41或42所述的用途,其中引起粘膜的感染的试剂是肠道细菌,肠道病毒或原生动物。44. 根据权利要求30-43中任一项所述的用途,其中所述免疫系统调节组合物包括食品,药物或营养食品可接受的载体。45. 根据权利要求44所述的用途,其中所述免疫系统调节组合物是药物组合物,营养食品组合物或包含在食品产品中。46. 根据权利要求30-45中任一项所述的用途,其中所述微粒在所述免疫系统调节组合物中是以干粉的形式。

说明书

技术领域

本发明包含在食品、营养食品、化妆品和制药技术领域。特别地,本发明涉及一种微粒,该微粒包含由酪蛋白、壳聚糖和益生菌形成的基质,还涉及一种用于获得所述微粒的方法,及其用途。

背景技术

概论

一个健康成年人的肠道菌群是相对稳定的,并且包含多种有益菌群,主要由乳酸杆菌和双歧杆菌菌属组成,这些有益菌群在人体健康中发挥着重要作用。有益的结肠微生物群不平衡可能引起各种紊乱,例如胃肠道感染、便秘、肠道易激综合症、炎症性肠病、过敏症、心脏病和结肠癌。世界卫生组织(WHO)已经指出有益微生物或益生菌在预防上述风险上的治疗和预防性潜力。

益生菌被定义为一种活的微生物,当以足够数量施用时可以为宿主提供有益的生理学作用(Pérez-Luyo,2008)。从这种意义上讲,它可以帮助宿主促进乳糖消化,预防肠道感染,促进免疫调节,预防癌症和心血管疾病。此外益生菌在预防龋齿方面的有益作用也正在进行研究。

益生菌的使用有四种基本方式:作为一种浓缩培养物被加到饮料中,比如果汁等;以冻干细胞的剂型(例如粉剂、胶囊、片剂等)添加在益生元纤维和乳制品中,作为一种膳食补充剂。

太阳城集团益生菌已经广泛应用于食品中,主要用于乳制品(酸奶、乳酪、冰淇淋、以牛奶为基础的甜点等)。此外还用于其他食品中,例如谷类食品、果汁、巧克力等等。

然而,在这些产品加工和/或保存的过程中,益生菌的存活率是非常低的(De Vos等,2010),为了让这些微生物产生上述有益的效果,它们必须是存活的并且在使用的时候保持合适的浓度。减少这些微生物存活力的因素有几个方面,例如,在食品加工/制备末期的酸度,有效期产生的酸化或后酸化作用,被发酵代谢物抑制,缺少营养素,包装渗透性,渗透压、贮存温度,以及与其它微生物种属的相互作用等。通常,在有效期产品越酸,双歧杆菌(Bifidobacteria)和乳酸杆菌(L.acidophilus)等益生菌的生存力就越低。

太阳城集团提高益生菌生存力的策略包括选择耐酸性菌株,增加益生微生物的起始浓度,或者加入合适的益生元,该益生元在其有效期始终维持活性代谢作用,后-酸化水平低,和阻止形成不必要的发酵代谢物。考虑到益生浓缩物通常在使用之前和在结合进食物和/或营养食品之后,储存较长的太阳城集团,发现一种在整段太阳城集团容许维持细菌生存能力的系统是极其重要的,并因此延长所述产品的保存期限,如有可能,不需要使用特定温度和湿度条件来避免额外的经济成本。

太阳城集团当使用益生菌时考虑的一个相应的方面是益生菌要产生上述对于人体健康的有益的效果,它们必须到达结肠时仍保持活性,因此它们需要克服上部胃肠道区域的障碍,即胃中的酸度和消化酶,和小肠中的胆汁盐。

此外,在工业水平制备期间,益生菌暴露于各种的压力因素,例如冷冻,干燥,暴露于氧气下,温度,在培养基中的高浓度乳酸等。

太阳城集团鉴于上述情况,现在包封活的益生菌作为用于维持它们在给定的所描述的不利的环境条件下的活性的替代方案的可能性(Borgogna等,2010;Ding和Shah,2008),得到了极大的关注。这些技术已经使用了几年,虽然通过它们获得的益处仍然可以改进。

太阳城集团到现在为止,大部分的益生菌微囊法设计都是包含在三个大组中:挤压成型,乳化和喷雾干燥,可扩大规模到工业水平(Heidebach等,2011)。挤压成型法是一种简单且经济的方法,其不损害所述细菌,虽然它不是一种能够容易地扩大规模的技术,这使得获取大量的产品变得困难。虽然在文献中乳化是用于包封益生菌最常描述的技术,但它是一种较复杂的技术,其需要使用表面活性剂和油相,因此它是无商业价值的,它可以影响它们结合在其中的所述产品的感官特性和构造,且它不适于产生低脂食品。通过喷雾干燥(喷雾)的方式的微囊法是一种简单且经济的方法,虽然由于微生物同时脱水和热灭活处理导致细菌死亡率高。

通常,用于包封益生菌的大多数合适的微胶囊应该遵循下列要求(Heidebach等,2011):

·通过一种不牺牲细菌活性的简单且经济的方式来获得

太阳城集团·具有一种尺寸和特性,其适于防止改变它们结合在其中的食品的感官特性(具有大于100μm的尺寸的颗粒可以被消费者注意)。

·保护益生菌免受不利的环境条件(基质,加工,存储等)的侵害

·使益生菌稳定并且保护它们免于遭受源于上部胃肠道区域的压力

·释放所述活菌进入肠道

太阳城集团直到现在,也没有开发出一种能满足所有需求,至少满足大多数相关的要求的制剂。

一种用于包封益生菌的材料是酪蛋白,其是一种占全部乳蛋白大约80%的结合蛋白质。已经发展了单独使用这种蛋白或与其它的聚合物结合,包括聚糖,来用于包封益生菌(Heidebach等,2009,Heidebach等,2010.Oliveira等,2007)的相关研究,没有牺牲细菌活性条件下获得了良好的包封效率结果。上述三篇文章中,前面两篇是基于极其不能规模化的乳化系统,其产生尺寸非常大的微胶囊(大于100μm)。另一方面,在三篇文章中,进行的对酸性pH的耐受性的的研究明确显示出,微胶囊保护所述细菌免受酸性破坏。然而,没有文件进行使用胃蛋白酶来复制实际胃的情况的研究,其比仅酸性的pH(所述酶可以降解所述蛋白质及增加细菌对介质的暴露)更强烈。同样地,在那些文章中进行的活性研究,在存储60–120天后观察到(在不同情况下),随着太阳城集团推移,在包封细菌的制剂和游离细菌的制剂中细菌数目都有非常显著的下降,在包封细菌的制剂中更低。

太阳城集团植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种最常使用的乳酸菌;这种细菌被认为是一种GRAS(公认安全的)有机体,能够健康的定居在人类胃肠道。现在许多植物乳杆菌菌株作为益生菌进行销售。然而,植物乳杆菌是一种对胃肠的介质情况很敏感的细菌,可以保存非常短的太阳城集团,甚至在冷藏下,因为在仅几天内它的数量就明显的下降(Ayub and Brinques,2011)。

太阳城集团近期已经公开两篇文章涉及这些细菌的包封,用于在存储和在通过胃肠屏障期间保护细菌。在第一篇文章(Ayub和Brinques,2011)中,作者使用不同的制剂形式,所有都基于海藻酸盐和/或胶质和/或壳聚糖,用于包封这样的细菌。然而,它们没能改进胃肠耐受性,虽然它们提高了在4℃存储期间的活细胞数目,在研究的38天之后,活细胞数目仍然明显减少。在另一篇文章(Gbassi等,2009)中,在固定细菌在包衣有乳清蛋白的海藻酸盐基质之后,细菌的抵抗力显著增加。然而,它不涉及微粒,而是肉眼可见的颗粒,其中的感官特性可能相当不符合要求的,并且其需要冷冻干燥用于保存。

太阳城集团另一个最常使用的乳酸菌是干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),已经广泛报导了它的促进健康的潜力。发现在全世界分布的各种产品中,包括传统的发酵牛奶例如益力多(yakult)、酸乳酒(kephir)、乳酸菌(actimel)、鼠李糖乳杆菌(gefilus)和vifit,和奶酪其中例如帕尔玛干酪(parmesan)和曼彻格奶酪(manchego)。尽管如此,这种细菌具有如之前的细菌(植物乳杆菌)同样的限制,即它对于上部胃肠道的情况敏感,和在存储周期中它的稳定度是十分有限的。

另外,已经描述基于使用海藻酸盐作为包封聚合物的用于包封益生菌的系统,在许多那些情况中获得尺寸非常大的胶囊(在700μm和2mm之间),或使用不可规模化的乳化方法。虽然细菌对于酸性pH的抵抗力在当它们包封时的情况下增加,但大多数文章没有在酶存在下进行研究,因此所述胃肠的情况没有如实地复制,仅仅关注对于酸性的抵抗力。另一方面,这些包封系统也降低在存储期间在不同情况下的细菌数目的减少,然而尽管如此,在短太阳城集团后仍有显著的减少。

太阳城集团因此,仍有需要来产生容许在加工、存储和/或通过胃肠道转运期间保护益生菌的系统;有利地所述系统是包含所述益生菌的微粒,其具有均匀的尺寸且不妨碍它们最终结合进入的产品的感官特性,并在加工和存储期间在受控或环境条件下,和在通过胃肠道转运期间能够保护益生菌。

发明概述

太阳城集团本发明的发明人已经发现解决上述问题的微粒,即具有包封益生菌的能力用于结合入食品、营养食品、化妆品和药剂的微粒。这些微粒保护所述益生菌避免通过外部试剂降低活性,当加工益生菌结合入其中的所述食品、营养食品、化妆品或药剂,和在长太阳城集团在环境或受控条件下存储时,增加这些食品或营养产品的保存期限。此外,在摄取之后,它们便于益生菌在需要的部位释放,保护它们免受上部胃肠道尤其是胃部的“酸性-胃消化酶”条件。

这些微粒在它们结合进入其中的食品、营养食品、化妆品和药物制剂中是稳定的和惰性的,防止食品、营养食品、化妆品和药物基质破坏细菌活性。

此外,发明人已经开发出一种以简单的适于工业规模的方式来获得这些微粒的方法。该方法不包括使用表面活性剂或乳化剂、合成聚合物,或任何没有批准作为食品添加剂的试剂。此外,该方法容许控制获得的微粒的尺寸小于100μm来避免它们被消费者注意到,或避免负面地影响它们结合进入其中的产品的感官特性。

太阳城集团所述微粒可以容易地再悬浮在水性介质中,而不是溶解,保护它们包含的益生菌免受介质破坏。本发明的微粒在它们结合进入的产品中保持稳定,因此防止在环境的和/或受控的条件下长太阳城集团的存储周期后活性细菌数目的显著减少。此外,这些微粒适用于不同的食品类型,从饮料和乳制品到固体食品,和营养产品。同样地,所述微粒可以配制到化妆品和药物制剂中。

太阳城集团另外,已经观察到所述微粒具有强烈的免疫调节效果,有利于T-辅助细胞1(Th1)应答的诱导,和/或转变对Th1的免疫反应,因此它们可以用于免疫系统调节(免疫调节)组合物的制备,所述组合物用于免疫系统损伤的预防和/或治疗,例如,预防和/或治疗Th2-介导的移植排异反应,过敏症和过敏症相关疾病,免疫缺陷和衍生自所述免疫缺陷的病状,由细胞内的病原体引起的感染和/或粘膜的感染。

太阳城集团本发明的微粒提供一种用于包封和稳定益生菌微生物的新系统。根据本发明,酪蛋白用于与壳聚糖组合作为一种载体,在长期存储周期和胃的条件下,用于保护益生菌免受环境条件影响,因而增加了它们的寿命并便于释放进入肠道,因而提高它们的益生菌效果。此外,所述酪蛋白本身具有显著的营养性能,其补充所述包封的益生菌本身的有益的效果。

总之,本发明的所述微粒具有在(i)加工、(ii)存储和iii)通过胃肠道转运期间,保护所述益生菌的能力。

因此在一个方面,本发明涉及包括基质和益生菌的微粒,其中所述基质由酪蛋白和壳聚糖组成。

在另一个方面,本发明涉及一种用于获得本发明提供的微粒的方法,其包括混合酪蛋白或酪蛋白源、益生菌和壳聚糖。

太阳城集团在另一个方面,本发明涉及一种组合物,其包括多种本发明提供的微粒,或包括至少一种本发明提供的微粒和食品、营养食品、化妆品或药学上可接受的载体。

在另一个方面,本发明涉及一种食品、营养食品、化妆品或药剂,其包括本发明提供的微粒。

太阳城集团在另一个方面,本发明涉及本发明提供的微粒、组合物或产品在用于制备免疫系统调节组合物中的用途,或换言之,本发明涉及本发明提供的微粒、组合物或产品用于免疫系统调节组合物的用途。所述免疫系统调节组合物有利于Th1应答的诱导和/或转变对Th1的免疫反应,优选地从Th2转变为Th1,并可以用于预防和/或治疗免疫系统损伤,例如,预防和/或治疗(i)Th2-介导移植排异反应,(ii)过敏症和过敏症相关疾病,(iii)免疫缺陷和衍生自所述免疫缺陷的病状,(iv)由细胞内的病原体引起的感染和/或粘膜的感染。

太阳城集团本发明也涉及本发明提供的微粒、组合物或产品用于口服来预防和/或治疗免疫系统损伤,以及涉及本发明提供的微粒、组合物或产品用于口服来预防和/或治疗Th2-介导移植排异反应;过敏症和过敏症相关疾病;免疫缺陷和衍生自所述免疫缺陷的病状;由细胞内的病原体引起的感染或粘膜的感染。

本发明的其它的更详细的方面将在接下来的章节阐明,其中特定实施例示出最相关的结果,包括通过更彻底的图解和注解。

附图说明

图1示出通过喷雾干燥获得的用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的光学显微图像:A)空微粒(×20);B)具有包封的植物乳杆菌(×20)。在右下侧的水平线表示100μm。

太阳城集团图2示出荧光性光学显微图像:A)以荧光标记染色植物乳杆菌(×20);B)包封(×20)的植物乳杆菌(以荧光标记染色)通过喷雾干燥的方式获得的用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒。在右下侧的水平线表示100μm。

图3示出在钙盐存在的情况下,包封的(×20)植物乳杆菌(用荧光标记染色)通过喷雾干燥获得的,用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的荧光光学显微图像。在右下侧的水平线表示100μm。

图4是示出在环境条件下(25℃),随着太阳城集团的推移,植物乳杆菌的存活的图表:新鲜的植物乳杆菌混悬液;非包封的冻干植物乳杆菌;包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Ap);在香草醛存在的情况下,包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Bp);在TPP存在的情况下,包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Cp);和在钙盐存在的情况下,包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Dp)。

图5是示出植物乳杆菌在模拟胃肠的介质(0到2小时:模拟胃的介质;2.1到8小时:模拟肠的介质)中存活的图表:新鲜的植物乳杆菌的混悬液;非包封的冻干植物乳杆菌;包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Ap);在香草醛存在的情况下包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Bp);在TPP存在的情况下包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Cp);和在钙盐存在的情况下包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒的植物乳杆菌(制剂Dp)。*显示微粒数目相对于冷冻干燥产品的显著差异(p<0.05)。

太阳城集团图6显示扫描电子显微镜图像,其示出在模拟胃肠的介质中处理之后,在香草醛存在的情况下,包封的植物乳杆菌的降解过程中,用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒(制剂Bp)。

太阳城集团图7是显示在环境条件下(25℃),随着太阳城集团的推移,干酪乳杆菌存活率的图表:新鲜的干酪乳杆菌混悬液;非包封的冻干干酪乳杆菌;包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒中的干酪乳杆菌(制剂Ac);在香草醛存在的情况下,包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒中的干酪乳杆菌(制剂Cc);和在三聚磷酸盐(TPP)存在的情况下,包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒中的干酪乳杆菌(制剂Dc)。

图8是示出干酪乳杆菌在模拟胃肠的介质中的存活图表(0到2小时:模拟胃的介质;2.1到8小时:模拟肠的介质):非包封的冻干干酪乳杆菌;包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒中的干酪乳杆菌(制剂Ac);在香草醛存在的情况下,包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒中的干酪乳杆菌(制剂Cc);和在三聚磷酸盐(TPP)存在的情况下,包封在用壳聚糖修饰的酪蛋白微粒中的干酪乳杆菌(制剂Dc)。*显示微粒数目相对于冷冻干燥产品的显著差异(p<0.05)。

图9是一幅柱状图,其显示从小鼠中获得的外周淋巴细胞的免疫表型分析的结果,所述小鼠以植物乳杆菌的非包封形式(游离LP),包封植物乳杆菌(Bp)或以细菌(植物乳杆菌)和颗粒(物理状态混合物)的物理状态混合物处理。虚线示出在未处理的对照组中获得的比值。

太阳城集团图10是一幅柱状图,其示出从小鼠中获得的外周淋巴细胞体外刺激之后的Th1/Th2比值指标的结果,所述小鼠以植物乳杆菌的非包封形式(游离LP),包封植物乳杆菌(Bp)或以与细菌和颗粒(物理状态混合物)的物理状态混合物处理。

发明详述

本发明涉及用于包封益生菌的微粒的制备,以防止在结合入食品、营养食品、药物或化妆品基质之后失活,或保护它们在加工期间和长期存储后在受控条件或环境条件下被破坏,并进一步保护它们在一旦摄取后通过胃肠道转运期间免受“酸性-胃蛋白酶”条件破坏。

本发明的微粒

因此,在一个方面,本发明涉及微粒,以下“本发明的微粒”包括基质和益生菌,其中所述基质由酪蛋白和壳聚糖组成。

太阳城集团如本文使用的,术语“微粒”用来表示球体类型或类似的形状具有小于1毫米(mm)的尺寸的胶体体系,通常约为0.5到999微米(μm),代表性地约为1到900μm。在具体的实施例中,本发明的微粒具有小于1mm的尺寸,通常包括在0.1和999μm之间,代表性地在0.2和900μm之间,有利地在0.3和500μm之间,优选地在0.4和250μm之间,更优选地在0.5和125μm之间,甚至更优选地在0.7和50μm之间,仍然更加优选地在1和40μm之间,甚至仍更优选地在大约2和12μm之间。

在本发明的范围内,术语“基质”涉及包衣试剂或组合物。根据本发明,所述基质由酪蛋白和壳聚糖组成并完全地或部分地包衣益生菌。

术语“益生菌”定义为一种活的微生物,当施用合适的量时,其对宿主健康发挥有益的生理作用,(FAO/WHO 2002.Guidelines for the evaluation of probiotics in food,London)。用于本发明的所述益生菌是“益生细菌”,即施用合适的量时,对宿主健康发挥有益的生理作用的活的细菌。在具体的实施例中,所述益生菌是双歧杆菌(Bifidobacterium)或乳杆菌(Lactobacillus)属的细菌。在更具体的实施例中,所述益生菌选自植物乳杆菌和干酪乳杆菌。在特定的实施例中,所述益生菌是植物乳杆菌CECT 220和干酪乳杆菌CECT 475T,分别分离自玉米青贮和乳酪。在另一个具体的实施例中,所述益生菌是动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)亚种乳酸菌(lactis)的菌株,例如以商标BB-12销售的。

如本文使用的,术语“酪蛋白”涉及一种大约占总的乳蛋白质的80%的结合蛋白质。它是一种磷朊类型的蛋白质,其归于球蛋白定义,它是可溶解的;具有高保水能力并在大约4.6的pH在20℃下沉淀。它由四个必要的片段形成(αs1-酪蛋白,αs2-酪蛋白,β-酪蛋白和κ-酪蛋白),由于它们的氨基酸组成不同,它们的电荷分布不同和它们在存在钙的情况下倾向于形成聚合物的不同而相互不同。在牛乳中,酪蛋白形成稳定的胶体微粒,直径在50和600nm之间(平均大约150nm)。“壳聚糖”是一种衍生自壳多糖的N-脱乙酰的天然聚合物(聚-N-乙酰-D-葡糖胺)。所述脱乙酰加工包括从壳多糖的分子链移除乙酰基,留下一个完全的氨基团(-NH2)。因此,在壳聚糖样品中的脱乙酰度涉及在聚糖亚单位中游离氨基的数量,并且可以测定,例如,尤其根据Hidalgo等或ASTM F2260-03(2008)标准(Standard Test Method for Determining Degree of Deacetylation in Chitosan Salts by Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)中所描述的方法。通常,商用的壳聚糖的脱乙酰度是等于或大于40%,优选地等于或大于60%。在具体的实施例中,壳聚糖的脱乙酰度是包括在60%和100%之间,代表性地在75%和95%之间,或更多。壳聚糖具有氨基多糖结构,其基于式(I)的单体单位重复:

太阳城集团其中“n”是整数,并且“m”是单位的数量,其中氨基是乙酰化的。“n+m”的总和表示聚合度,即在壳聚糖链中的单体单位的数量。

壳聚糖主要是在酸性的pH下质子化,因此在酸性pH下,它是带正荷的聚糖。

太阳城集团壳聚糖的分子量可以在很宽的范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,用于获得本发明的微粒的壳聚糖的分子量是包括在5和850kDa之间,代表性地在25和300之间,优选地在40和200kda之间,更优选地在50和150kda之间。

太阳城集团在本发明的范围内,可以理解可以使用壳聚糖的衍生物来替代壳聚糖,这样的衍生物理解为在壳聚糖中,对一个或多个羟基和/或一个或多个氨基进行修饰。这些衍生物包括,尤其是乙酰化的、烷基化的或磺化的壳聚糖,以及硫醇化的衍生物,如Roberts,Chitin Chemistry,Macmillan,1992,166所描述的。当使用衍生物时,它优选地选自O-烷基醚壳聚糖,O–酰基酯壳聚糖,三甲基壳聚糖,用聚乙二醇修饰的壳聚糖等等。其它的可能的衍生物包括盐,例如壳聚糖柠檬酸盐,壳聚糖硝酸盐,壳聚糖乳酸盐,壳聚糖磷酸盐,壳聚糖谷氨酸盐等等。在任何情况下,本领域技术人员都可以确定,可以在壳聚糖上进行修饰而不影响最终制剂的商业稳定性和寿命。在具体的实施例中,所述壳聚糖衍生物是亲水性修饰的壳聚糖;如本文使用的,“亲水性修饰的壳聚糖”是一种用亲水基修饰的壳聚糖,例如增加壳聚糖在水性介质中溶解度的基团,例如,烷基化的壳聚糖(例如三甲基壳聚糖等),磺化的壳聚糖,硫醇化的壳聚糖,壳聚糖盐(例如谷氨酸盐,氯化物,乳酸盐,醋酸盐等),基多(quito)-低聚糖等。在另一个具体的实施例中,所述壳聚糖衍生物不是疏水性修饰的壳聚糖;如本文使用的,“疏水性修饰的壳聚糖”是一种用疏水基修饰的壳聚糖,即具有减少壳聚糖在水性介质中溶解度的基团,例如,具有足够的尺寸的烷基或芳基以便增加壳聚糖的疏水性的基团,例如脂肪酸或醛残基,优选地3到18个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸,例如棕榈酸,月桂酸,油酸,亚油酸,亚麻酸,己酸,辛酸,硬脂酸,丙酸或丁酸。在另一个具体的实施例中,当本发明的微粒的基质由酪蛋白和壳聚糖衍生物组成时,例如疏水性修饰的壳聚糖,本发明的微粒缺乏由海藻酸盐或疏水性修饰的海藻酸盐(用疏水基修饰的海藻酸盐,如之前定义的疏水性修饰的壳聚糖)组成的外包衣。

如上所述的,壳聚糖和酪蛋白构成所述基质,其是本发明的微粒的一部分。壳聚糖:酪蛋白的重量比可以在很宽范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,壳聚糖:酪蛋白重量比是1:1-150,优选地1:5-100,更优选地大约1:14-40。

太阳城集团可以存在于本发明的微粒中的每重量单位基质的益生菌的量可以在很宽范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,本发明的微粒每毫克基质包括至少106菌落数(CFU/mg),通常在106CFU/mg和5×1013CFU/mg之间,优选地在108CFU/mg和1012CFU/mg之间。

太阳城集团在具体的实施例中,本发明的微粒还包括交联剂。所述交联剂的非限制性的说明性例子包括药学上或化妆品上可接受的或适于用在人类或动物食物中的二价金属阳离子;三聚磷酸盐;和通常任何能够和酪蛋白和/或壳聚糖建立化学相互作用的物质。

太阳城集团如本文使用的,“药学上或化妆品上可接受的或适于用在人类或动物食物中的二价金属阳离子”是一种源自化合价是2的任何金属元素的阳离子,例如碱土金属,例如钙,镁,锌等,或如果它具有几个化合价,他们中之一是2,例如铁等,附加条件是药学上或化妆品上可接受的,或适于用在食物中;在具体的实施例中,所述二价金属阳离子选自由下列组成的组:Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+及其组合。如本领域技术人员所理解的,用作交联剂的二价金属阳离子可以由合适的金属阳离子来源来提供,例如在水溶液中产生所述二价金属阳离子的化合物,例如氯化钙,乙酸钙,葡萄糖酸钙,乳酸钙,山梨酸钙,抗坏血酸钙,柠檬酸钙,丙酸钙,硫酸钙等,或所述化合物的混合物。

如本文使用的,“三聚磷酸盐”是一种包括多磷酸盐戊阴离子的化合物,其是三磷酸的共轭碱,例如三聚磷酸钠,通常称为STPP(三聚磷酸钠)或简称为“TPP”。

在本发明中用作交联剂,能够和酪蛋白和/或壳聚糖建立化学相互作用的物质的额外的例子包括香草醛[3-甲氧基-4-羟基苯甲醛],京尼平[甲基(1R,2R,6S)-2-羟基-9-(羟甲基)-3-氧杂双环[4.3.0]壬-4,8-二烯-5-羧化物]等。

在具体的实施例中,所述交联剂是二价金属阳离子,其选自下列组成的组:Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+及其组合,三聚磷酸盐;香草醛;京尼平;或其组合。在更具体的实施例中,所述交联剂是钙阳离子(Ca2+),TPP或香草醛。在另一个具体的实施例中,所述交联剂是Ca2+,所述交联还包括使包含由酪蛋白和壳聚糖组成的基质、益生菌和交联剂的混合物经历压力处理,例如在包括在100和800MPa之间的压力下,达到流体静压循环。

太阳城集团在具体的实施例中,本发明的微粒包括两个或更多交联剂,优选两种不同的交联剂;所述最终存在于本发明的微粒中的两种不同的交联剂的组合的说明性的例子包括下列两种成分的组合:

太阳城集团-三聚磷酸盐,例如TPP,和香草醛;

-三聚磷酸盐,例如TPP,和京尼平;

-三聚磷酸盐,例如TPP,和药学上或化妆品上可接受的或适于用在人类或动物食物中的二价金属阳离子,例如二价金属阳离子选自下列组成的组:Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+及其组合;

-香草醛和京尼平;

-香草醛和药学上或化妆品上可接受的或适于用在人类或动物食物中的二价金属阳离子,例如二价金属阳离子选自下列组成的组:Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+及其组合;

-京尼平和和药学上或化妆品上可接受的或适于用在人类或动物食物中的二价金属阳离子,例如二价金属阳离子选自下列组成的组:Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+及其组合。

如果本发明的微粒包括至少一种交联剂,交联剂和由酪蛋白和壳聚糖组成的基质的重量比可以在很宽范围内变化,其取决于交联剂的类型。在具体的实施例中,当所述交联剂是TPP,所述交联剂(TPP):基质(酪蛋白和壳聚糖)比值是大约1:0.1-800,有利地1:1-500,优选地大约1:100-300。在另一个具体的实施例中,当所述交联剂是香草醛时,所述交联剂(香草醛):基质(酪蛋白和壳聚糖)比值是1:0.1-500,有利地1:1-250,优选地大约1:50-100。在另一个具体的实施例中,当所述交联剂是Ca2+时,所述交联剂(Ca2+或Ca2+源):基质(酪蛋白和壳聚糖)比值是1:0.1-50,有利地1:1-25,优选地大约1:6-16。

在另一个具体的和可选择的实施例中,本发明的微粒还包括在通过常规方法干燥所述微粒,或干燥包含本发明的微粒的混悬液的过程中一种保护基质和益生菌的化合物,例如通过喷雾干燥,在下文称为“保护剂”。事实上,符合那些特性的任何化合物都可以用作保护剂。在具体的实施例中,所述保护剂是糖类或通常合适的食品添加剂,其除了有保护作用之外,还发挥益生元作用。如本文使用的,术语“益生菌”涉及不易消化的食品成分,其刺激益生菌生长和/或活性。可以用于本发明的范围的保护剂的非限制性的、说明性的例子包括乳糖,甘露醇,蔗糖,麦芽糖糊精,葡萄糖,山梨糖醇等,以及具有益生元特性的物质,例如寡聚果糖,胶质,菊粉,半乳寡糖,乳果糖,人乳寡聚糖,膳食纤维等,及其组合。在具体的实施例中,所述保护剂是甘露醇或蔗糖。如果本发明的微粒包括一种保护剂,由酪蛋白和壳聚糖组成的基质和所述保护剂的重量比可以在很宽范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,所述基质(酪蛋白和壳聚糖):保护剂的重量比是1:0.1-5,代表性地1:0.5-4,优选地大约1:1。

用于获得本发明的微粒的方法

在另一个方面,本发明涉及一种方法,在下文称为“本发明的方法”,用于获得包含基质和益生菌的微粒,其中所述基质由酪蛋白和壳聚糖组成(本发明的微粒),其包含混合酪蛋白或酪蛋白源,益生菌和壳聚糖。

太阳城集团所述酪蛋白可以照此结合或可以通过酪蛋白源提供。为了简化起见,术语“酪蛋白”和“酪蛋白源”在本说明书中可以交替使用。事实上任何酪蛋白源可用于实施本发明的方法。所述酪蛋白源可以具有非常不同的来源,例如乳,豆等。在具体的实施例中,所述酪蛋白源是以水性溶液或混悬液形式;在这种情况下,所述酪蛋白可以是以酪蛋白酸或酪蛋白酸盐形式,例如酪蛋白酸钠等,或任何其他的可溶的酪蛋白形式。即使其它的酪蛋白酸盐,例如酪蛋白钙或磷酸钙可以使用,在实践中更有利的是使用酪蛋白酸钠。包含酪蛋白源的水溶液或混悬液可以通过本领域技术人员已知的常规方法来获得,例如通过将酪蛋白源加入到水介质中。如本文使用的,“水介质”是一种包括水的介质,优选地包含大部分的水的介质,更优选地所述水介质基本上由水组成。包含在所述水溶液中的所述酪蛋白的量可以在宽范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,包含在所述水溶液中的所述酪蛋白的量包括在0.1%和10%(w/v)之间,优选地在0.5%和5%之间,更优选地在1%和2%之间。所述酪蛋白的水溶液优选地不包含任何有机溶剂。

为了实施本发明的方法,有利地制备益生菌的混悬液。虽然事实上可以使用任何益生菌,在具体的实施例中,所述益生菌是双歧杆菌或乳杆菌属细菌。在更具体的实施例中,所述益生菌是植物乳杆菌或干酪乳杆菌。在特定的实施例中,所述益生菌是植物乳杆菌CECT 220和干酪乳杆菌CECT 475T。在另一个具体的实施例中,所述益生菌是动物双歧杆菌亚种乳酸菌菌株,例如以商标BB-12销售的。细菌悬液除了益生菌之外还包括适于相应益生菌的介质。所述介质是本领域技术人员已知的。在具体的实施例中,当所述益生菌是乳杆菌属的细菌,例如植物乳杆菌或干酪乳杆菌时,所述介质包括用于乳杆菌的肉汤,根据De Man,Rogosa和Sharpe,例如定义为110661MRS肉汤(Merck)[MRS肉汤];所述介质容许乳酸杆菌及其他乳酸菌生长良好和通常用来从临床的样品和食品,特别乳制品来培养和富集乳酸杆菌。通常,所述MRS介质包括(g/L):10g多聚蛋白胨;10g肉汁,5g酵母提取物,20g葡萄糖,1.08ml吐温80(多聚乙氧基去水山梨糖醇单油酸酯或聚山梨酯80),2g磷酸钾,5g乙酸钠,2g柠檬酸铵,0.2g硫酸镁,0.05g硫酸锰。介质在25℃温度下的pH是6.4±0.2。该培养基容许所有乳酸杆菌种类充分的生长。蛋白胨和葡萄糖是氮源,碳源及其他对于细菌生长必要的要素的来源。所述多聚乙氧基去水山梨糖醇单油酸酯,镁,锰和醋酸盐提供辅助因子,可以抑制一些微生物的生长。柠檬酸铵为抑制革兰氏阴性细菌生长的抑制剂。

存在于所述细菌悬液中的益生菌的量可以在宽范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,存在于所述细菌悬液中的益生菌的量是至少106CFU/ml,通常在106和5×1012CFU/ml之间,优选地在108和1012CFU/ml之间。在具体的和可选择的实施例中,所述细菌悬液同时包含糖类,例如蔗糖或其它的合适的二糖,例如麦芽糖或海藻糖;这些化合物通常在微粒干燥的加工期间起重要作用,因为它们保护细胞膜和蛋白质。当脱水发生时,所述二糖与蛋白质形成氢键,其容许维持蛋白质结构且防止变性。另一方面,糖类可以充当在脱水期间的水分子的代用品,环绕磷脂双层和细胞膜的极性基团,维持细胞膜和蛋白质的结构完整性。如果所述细菌悬液包含二糖,用于说明目的,例如蔗糖,存在于所述细菌悬液中的二糖(例如蔗糖)将包括在0.1%和10%(w/v)之间的二糖(例如蔗糖),优选地在1%和3%(w/v)之间。太阳城集团壳聚糖,事实上任何壳聚糖,或合适的壳聚糖衍生物可以用于实施本发明的方法;尽管如此,在具体的实施例中,所述壳聚糖具有的脱乙酰度包括在60和100%之间,优选地在75%和95%之间,且分子量包括在5和850kDa之间,代表性地在25和300kDa之间,优选地在40和200kDa之间,更优选地在50和150kDa之间。在具体的实施例中,所述壳聚糖是以水溶液或混悬液的形式。包含壳聚糖的所述水溶液或混悬液可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得,例如通过添加壳聚糖到水介质,例如水或主要地包含水的介质。包含在所述水溶液或混悬液中的壳聚糖的量可以在很宽的范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,包含在所述水溶液或混悬液中的壳聚糖的量是包括在0.05%和1%(w/v)之间,优选地在0.1%和0.3%之间,更优选地在1%和2%之间。所述壳聚糖的水溶液或混悬液优选地不包含任何有机溶剂。

在本发明的方法的混合步骤中酪蛋白、益生菌和壳聚糖的混合顺序是不相关的。在具体的实施例中,首先混合所述酪蛋白和益生菌,然后添加壳聚糖;在另一个具体的实施例中,首先混合酪蛋白和壳聚糖,然后添加益生菌;在另一个具体的实施例中,首先混合益生菌和壳聚糖,然后添加酪蛋白;且在另一个具体的实施例中,添加并混合酪蛋白、益生菌和壳聚糖。在具体的实施例中,以酪蛋白的水溶液,益生菌的混悬液和壳聚糖的水溶液形式,添加如上所述的组分。

太阳城集团所述酪蛋白,益生菌和壳聚糖优选地在室温下混合,即温度包括在18℃和25℃之间,优选地在20℃和22℃之间,以便不影响益生菌的活力,有利地在搅拌下。

太阳城集团在本发明的微粒形成之前存在于混合物中的壳聚糖和酪蛋白的重量比可以在很宽的范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,所述酪蛋白:壳聚糖的重量比是1:0.01-0.5,优选地1:0.01-0.1,更优选地大约1:0.02-0.07,或换言之,在本发明的微粒形成之前存在于混合物中的壳聚糖:酪蛋白的重量比值是1:1-150,优选地1:5-100,更优选地大约1:14-40。

太阳城集团本发明的微粒形成之前存在于混合物中的益生菌和基质组分(酪蛋白和壳聚糖)的比值可以在很宽范围内变化;尽管如此,在具体的实施例中,所述益生菌/基质比值是每mg基质至少106CFU,通常包括在106CFU/mg和1013CFU/mg之间,优选地在109CFU/mg和1012CFU/mg之间。

太阳城集团如上所述的,在具体的实施例中,本发明的微粒还包括交联剂,例如三聚磷酸盐(例如三聚磷酸钠(TPP));香草醛;京尼平;药学上或化妆品上可接受的,或适于用在人类或动物食品中的二价金属阳离子,例如二价金属选自由Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+及其组合所组成的组;或任何其组合,或任何其它的能够与酪蛋白和/或壳聚糖建立化学相互作用的物质。在另一个具体的实施例中,本发明的微粒包括两种或更多种交联剂,对于本发明的微粒优选两种不同的上述交联剂的组合。如果本发明的微粒包括至少一种交联剂,则本发明的方法包括将所述至少一种交联剂加入到酪蛋白、益生菌和壳聚糖的混合物中。在具体的实施例中,所述交联剂可以以水溶液的形式添加到所述混合物中。当所述交联剂是钙阳离子(ca2+)时,可以通过合适的阳离子源来提供,例如在水溶液中产生二阶阳离子的化合物,例如氯化钙,乙酸钙,葡萄糖酸钙,乳酸钙,山梨酸钙,抗坏血酸钙,柠檬酸钙,丙酸钙,硫酸钙等,或所述化合物的混合物。如果本发明的微粒包括交联剂,本发明的微粒中所述交联剂的添加量取决于如上所述的交联剂的性质。在任何情况下,所述交联剂将以足够量添加,以便当所述交联剂是TPP时,所述交联剂(TPP):基质(酪蛋白和壳聚糖)比值是1:0.1-800,有利地1:1-500,优选地大约1:100-300;当所述交联剂是香草醛时,所述交联剂(香草醛):基质(酪蛋白和壳聚糖)比值是1:0.1-500,有利地1:1-250,优选地大约1:50-100;和当所述交联剂是Ca2+时,所述交联剂(Ca2+或钙源):基质(酪蛋白和壳聚糖)比值是1:0.1-50,有利地1:1-25,优选地大约1:6-16。

在上述的情况下,即在室温下并在搅拌下,在混合所述酪蛋白、益生菌和壳聚糖之后,形成包括由酪蛋白和壳聚糖组成的基质,和益生菌的本发明的微粒。在具体的实施例中,本发明的微粒是悬浮在它们已经形成的介质中。

接下来,如果需要的话,酪蛋白、益生菌和壳聚糖混合产生的,包含本发明的微粒的所述混悬液通过常规方法进行干燥处理,有利地通过喷雾干燥或通过冷冻干燥,以干燥本发明的微粒;这种干燥处理容许以粉剂的形式获得本发明的微粒,其有助于增加它的稳定性。在具体的实施例中,这种干燥处理,特别当通过喷雾干燥或通过冷冻干燥进行时,对于本发明的微粒,包括添加如上所述的保护剂,其在它的干燥处理期间保护所述基质和益生菌,例如糖类或通常合适的食品添加剂,其除了保护作用之外,还充当益生元。在本发明的范围内可以用作保护剂的糖类的非限制性的、说明性的例子包括乳糖,甘露醇,蔗糖,麦芽糖糊精,葡萄糖,山梨糖醇等,以及具有益生元特性的聚糖,例如寡聚果糖,胶质,菊粉,半乳寡糖,乳果糖,人乳寡聚糖,膳食纤维等。在具体的实施例中,所述保护剂是甘露醇。如果本发明的微粒包括保护剂,以合适的量添加保护剂;即使由酪蛋白和壳聚糖组成的基质和保护剂的重量比可以在宽范围内变化,在具体的实施例中,所述基质(酪蛋白和壳聚糖):保护剂重量比值是1:0.1-5,代表性地1:0.5-4,优选地大约1:1。

在具体的实施例中,其中本发明的方法包括干燥本发明的微粒的混悬液,所述混悬液和本发明的微粒是通过喷雾干燥来进行干燥;为此,将包含本发明的微粒的混悬液和/或酪蛋白,益生菌和壳聚糖的混合物,和可选择地交联剂和/或保护剂引入到喷雾干燥器中并控制加工条件[进气温度,排气温度,气压,样品泵速,吸入和气流]。本领域技术人员可以设置加工条件,其最适合于每种情况。

如果需要的话,本发明的方法可以包括额外步骤,用于稳定本发明的微粒。在具体的实施例中,当通过加入交联剂和高压处理的方式进行本发明的微粒的交联时,例如二价金属阳离子,例如Ca2+,本发明的方法包括将包含本发明的微粒的混悬液,进一步包括交联剂,和/或包括酪蛋白,益生菌,壳聚糖和交联剂的混合物引入到一种合适的容器,例如密封的塑料袋并经历至少一个流体静压循环,在包括在100和800MPa之间的压力下,优选地在100和400MPa之间,太阳城集团包括在1和30分钟之间,优选地在2和10分钟之间。在具体的实施例中,所述高静水压处理包括在所述包括酪蛋白、益生菌、壳聚糖和交联剂的混合物上应用在100MPa的5分钟循环,或在300MPa的2分钟循环。在具体的实施例中,所述包括酪蛋白、益生菌、壳聚糖和交联剂(Ca2+)的混合物经历在100MPa的5分钟循环。在通过喷雾干燥的方式进行干燥处理之前,将这种高压处理应用在包括酪蛋白、益生菌、壳聚糖和交联剂的混合物上。可选择地,如本领域技术人员已知的,所述高压处理是一种容许交联微粒本身而不需要结合交联剂的处理,因此本发明的微粒可以通过高压处理来交联,而不需要交联剂。

太阳城集团本发明的方法容许以干粉的形式获得本发明的微粒,其有助于本发明的微粒在长太阳城集团的存储期间在受控或环境条件下的稳定性,并且它还可以容易地结合入不同的固体和液体产品(例如食品等)。

太阳城集团通过本发明的方法获得的微粒具有本发明的微粒的特性,并构成本发明的另外的方面。

应用

本发明的微粒具有包封益生菌的能力,及在加工(包括由酪蛋白和壳聚糖组成的基质,装载所述益生菌的获得微粒)和长期存储期间在受控条件或环境条件下保护益生菌,以及一旦摄取在通过胃肠道转运期间保护益生菌免受“酸性-胃蛋白酶”条件破坏;因而阻止或基本上减少在结合到不同的产品之后,益生菌失活。

另外,本发明的微粒具有强大的免疫调节效果,因此它们用于制备免疫系统调节组合物,其用于预防和/或治疗免疫系统损伤。

因此在另一个方面,本发明涉及一种组合物,在下文称为“本发明的组合物”,其选自:

太阳城集团(i)由多种本发明的微粒组成的组合物,或由多种通过本发明的方法获得的微粒组成的组合物,或由多种本发明的微粒和通过本发明的方法获得的微粒组成的组合物;和

太阳城集团(ii)组合物,其包括至少一种本发明的微粒,和/或通过本发明的方法获得的微粒,和食品,营养食品,化妆品或药学上可接受的载体。

太阳城集团本发明的微粒的特性已经在上面定义,通过引用纳入本文。在具体的实施例中,本发明的微粒的平均尺寸是包括在0.5和125μm之间,优选地在1和40μm之间,更优选地在2和12μm之间。“平均尺寸”理解为微粒群体在水介质一起移动的平均直径。这个体系的平均尺寸可以通过本领域技术人员已知的标准方法检测,例如在下面的实验部分描述的。在另一个具体的实施例中,存在于所述本发明的微粒中的益生菌是选自双歧杆菌和乳杆菌属的细菌;在更具体的实施例中,所述益生菌是选自植物乳杆菌和干酪乳杆菌。在特定的实施例中,所述益生菌是植物乳杆菌CECT 220和干酪乳杆菌CECT 475T。在另一个具体的实施例中,所述益生菌是动物双歧杆菌亚种乳酸菌的菌株,例如以商标BB-12销售的菌株。

在另一个具体的实施例中,本发明的微粒包括如上所述的交联剂,例如TPP,香草醛或二价金属阳离子,例如Ca2+。在另一个具体的实施例中,本发明的微粒包括两种或更多种交联剂,本发明的微粒优选包括两种不同的上述的交联剂的组合。在另一个具体的实施例中,本发明的微粒包括保护剂,例如糖类,例如甘露醇。在另一个具体的实施例中,本发明的微粒为干粉形式。

太阳城集团在第一种情况下,本发明的组合物(i)是仅由本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒构成。在具体的实施例中,所述本发明的组合物(i)选自:

太阳城集团 组合物A,其包含:

酪蛋白,重量占40%-60%,

壳聚糖,重量占0.1%-3.5%,

益生菌,109CFU/g-5×1012CFU/g,

太阳城集团三聚磷酸钠,重量占0%-0.15%,和

保护剂,重量占0%-60%;

太阳城集团其中重量比涉及组合物的总重量;

组合物B,其包含:

酪蛋白,重量占40%-60%,

太阳城集团壳聚糖,重量占0.1%-3.5%,

益生菌,109CFU/g-5×1012CFU/g,

香草醛,重量占0%-0.6%,和

保护剂,重量占0%-60%;

太阳城集团其中重量比涉及组合物的总重量;和

组合物C,其包含:

酪蛋白,重量占40%-60%,

壳聚糖,重量占0.1%-3.5%,

太阳城集团益生菌,109CFU/g-5×1012CFU/g,

Ca2+,重量占0%-10%,和

保护剂,重量占0%-60%,

其中重量比涉及组合物的总重量。

在第二种情况下,本发明的组合物(ii)包括至少一种本发明的微粒和/或一种通过本发明的方法获得的微粒,和食品,营养食品,化妆品或药学上可接受的载体。

在具体的实施例中,本发明的组合物是食品或饲料,其包括至少一种本发明的微粒和/或一种通过本发明的方法获得的微粒,或包括多种本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒的组合物。如本文使用的,术语“食品”是任何属性的物质或产品,固体或液体,天然的或取决于它的特性、应用、组分、制备和保存状况的加工,通常或理论上可以用于一些下列目的:a)作为正常的用于人类或动物的营养食品,或作为令人愉快的食品;或b)作为饮食产品,在人类或动物食品的特殊情况。术语“饲料”包括所有的任何来源的天然的材料和制成品,其独立地或方便地相互混合,适于作为动物食物。例如一种适于消费的即食食品,其不需要通过水溶液稀释。本领域技术人员认为,原则上,存在于即食食品的成分是平衡的,不必添加额外的成分至食品中来使其可以食用。压缩食品是其中一种或多种成分以比即食食品更高的浓度存在,因此例如食用时必须通过水溶液稀释以适合食用。本发明提供的食品的非限制性的说明性的例子包括乳制品和衍生物,例如发酵乳,酸乳酪(yoghurt),酸牛乳酒(kephir),凝乳,奶酪,黄油,冰淇淋,基于牛乳的餐后甜点等,和非乳制品,例如焙烤产品,西饼和糕点(pastries),谷类食品,巧克力,果酱,果汁,其它的水果衍生物,油剂和人造黄油,配制的菜肴等。

在另一个具体的实施例中,本发明的组合物是营养组合物,其包括至少一种本发明的微粒和/或一种通过本发明的方法获得的微粒,或包括多种本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒的组合物。如本文使用的,术语“营养组合物”涉及一种适用于人类或动物的组合物,其包括一个或多个具有治疗作用的天然产品,其提供健康益处或者与疾病预防或减轻有关,例如益生菌等,它包括膳食补充剂,其存在于通常存在于(或没有)食品中的浓缩天然的生物活性产品中的非食品基质(例如胶囊,粉剂等),并当以比存在于那些食品中更高的剂量摄取时,对健康发挥有利的效果,其大于正常食品可以具有的效果。因此,术语“营养组合物”包括分离的或提纯食物产品以及添加剂或食品补充剂,其通常存在于通常口服剂型,例如胶囊,片剂,小袋,饮料管瓶等;这样的产品提供生理学的益处或预防疾病,通常相对于慢性疾病。如果需要,本发明提供的所述营养组合物可以包含,除了益生菌之外,另外一种或多种营养成分(与疾病预防或减轻有关的产品或物质),例如类黄酮,Ω-3脂肪酸等,和/或一种或多种益生元(刺激益生菌活性和/或生长的不易消化的食品成分),例如寡聚果糖,胶质,菊粉,半乳寡糖,乳果糖,人乳寡聚糖,膳食纤维等。

在另一个具体的实施例中,本发明的组合物是药物组合物,其包括至少一种本发明的微粒和/或一种通过本发明的方法获得的微粒,或包括多种本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒的组合物,适于口服,局部,直肠或阴道给药;为此,所述组合物包括一种药学上可接受的载体,其包括一种或多种适于口服的辅料,例如以胶囊,粉剂,颗粒,片剂(包衣或非包衣),小袋,基质,混悬液等的形式,或包括一种或多种适于局部给药的辅料的药学上可接受的载体,例如以霜剂,油膏,软膏剂等的形式,或包括一种或多种适于直肠给药的辅料的药学上可接受的载体,例如以栓剂等的形式,或包括一种或多种适于阴道给药的辅料的药学上可接受的载体,例如以丸剂,栓剂等的形式。用于口服,局部、直肠或阴道给药的适于药物组合物的制剂的辅料的太阳城集团,以及所述药物组合物的制备可以在书籍“Tratado de Farmacia Galénica”,C.Faulíi Trillo,第10版,1993,Luzán 5,S.A.de Ediciones中找到。

在另一个具体的实施例中,本发明的组合物是化妆品组合物,其包括至少一种本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒,或包括多种本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒的组合物。如本文使用的,术语“化妆品组合物”涉及一种组合物,其适于人类或动物的个人卫生,或用于增强天然美或改变身体外观,而不影响人类或动物体的结构或功能,其包括一种或多种提供这样的效果的产品。如果需要,通过本发明提供的化妆品组合物可以包含,除了益生菌之外,一种或多种化妆品产品,即意在放置在与人类或动物体的外部(表皮,毛发系统,指甲,口唇和外生殖器)或齿和颊粘膜接触的物质或混合物,用于以下唯一的或主要的目的:清洁它们,芳香它们,改变它们的外观,保护它们,保持它们的完好性或修饰身体气味。化妆品产品的说明性的例子包括包含在INCI(国际化妆品成分命名法)中列出的产品。

在另一个具体的实施例中,本发明的组合物是化妆品组合物,其包括至少一种本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒,或包括多种本发明的微粒和/或通过本发明的方法获得的微粒的组合物。如本文使用的,术语“化妆品组合物”涉及一种适用于身体或动物体的组合物,其包含一个或多个化妆品产品(功能性的化妆品,药物化妆品或活性化妆品),即具有包含对皮肤,毛发和/或指甲有效果的活性成分的化妆品-药物特性的局部的混合产品,以更高的更有效浓度,因此它们处于在化妆品和药物之间的中间状态。化妆品产品的说明性的例子包括香精油,神经酰胺,酶,矿物质,肽,维生素等。本领域技术人员将理解本发明的微粒或包含它们的组合物可以属于食品或饲料,或营养食品、药物或化妆品产品,其构成本发明的额外的方面。所述产品可以是液体、半固体的或固体形式。

另外,本发明的微粒具有强大的免疫调节效果和有利Th1应答的诱导和/或改变对Th1的免疫反应,优选地从Th2到Th1(实施例7),因此它们可以用于制备用于预防和/或治疗免疫系统损伤的免疫系统调节组合物,例如用于预防和/或治疗Th2-介导的移植排异反应,过敏症和过敏症相关疾病,免疫缺陷和衍生自所述免疫缺陷的病状,由胞内的病原体引起的感染和/或粘膜的感染。

太阳城集团因此在另一个方面,本发明涉及本发明的微粒,或本发明的组合物,或包括至少一种本发明的微粒或本发明的组合物的食品,药物,化妆品或营养食品产品的用途,下文称为“本发明的产品”,用于制备免疫系统调节组合物。换言之,依据这个有创造性的方面,本发明涉及本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品用于免疫系统调节组合物。

如本文使用的,“免疫系统调节组合物”,下文称为“本发明的免疫调节组合物”,是能够刺激免疫系统某些应答的组合物,使之更具有反应性,例如通过特异的细胞因子的制备干预涉及在免疫应答中的细胞的发育。如本文使用的,术语“组合物”包括任何药物组合物,食品组合物(食品或饲料),营养食品组合物等,其包括上述的本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品。

实施例7显示的结果清楚地显示包含植物乳杆菌的本发明的微粒口服给药于CD1小鼠,一方面,诱导细胞毒素的淋巴细胞(通过CD4+/CD8+比值的减少清楚地显示)数目的轻微增加(图9),和另一方面,相较于白细胞间介素-6(IL-6)的产生,引起干扰素-γ(IFN-g)合成的增加因而改变对于Th1型的免疫应答。虽然不希望被束缚,这些结果似乎表明在本发明的微粒和免疫系统之间可能的相互作用,改进免疫应答的类型和改变它为对Th1应答。

因此在一个具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物是一种组合物,其优选地诱导Th1应答和/或改变对于Th1的免疫应答,优选地从Th2到Th1。根据这个具体的实施例,本发明的免疫调节组合物主要地或优选地刺激或诱导免疫系统的Th1应答,在涉及Th1免疫应答的细胞的生长过程中,通过特异的细胞因子的产生使之更具反应性的,例如IFN-g,干扰素-α(IFN-a),白细胞间介素-12(IL-12),白细胞间介素-18(IL-18))等。本领域技术人员可以通过常规方法容易地确定是施用本发明的微粒否优选地诱导Th1应答和/或改变免疫应答从Th2到Th1,例如通过基于Th1应答和选择性地Th2应答的定量特异的细胞因子的方法,例如实施例7中描述的实验。

太阳城集团在优选的具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物是一种适于口服的组合物(在本说明书中为了简化,有时称为“口服组合物”),并将以固体,液体或半固体的剂型存在。为此,本发明的所述免疫调节组合物与本发明的微粒,或本发明的组合物,或本发明的产品一起,将包括药学上可接受的载体;所述药学上可接受的载体包括一种或多种适于口服的辅料,例如以胶囊,粉剂,颗粒剂,混悬液等的形式。本领域技术人员已知适于口服的药物组合物的剂型的辅料,以及用于制备所述组合物的方法。通过示例的方式,适于口服的药物组合物的制剂的辅料,以及它们的制备的太阳城集团可以在书籍“Tratado de Farmacia Galénica”,C.Faulíi Trillo,第10版,1993,Luzán 5,S.A.de Ediciones中找到。

太阳城集团在另一个具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物是口服组合物,用于预防和/或治疗免疫系统损伤;所述免疫系统损伤可以是天然的(遗传的)损伤或诱导损伤,例如通过感染过程,压力等诱导的损伤。在另一个具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物是口服组合物,用于预防和/或治疗:

太阳城集团-Th2应答-介导移植排异反应,

-过敏症和过敏症相关疾病,

-免疫缺陷和衍生自所述免疫缺陷的病状,

-由胞内的病原体引起的感染,或者

-粘膜的感染。

移植排异反应是一种过程,其中所述移植受者的免疫系统攻击移植的器官或组织。由于它们的特性,特别地,本发明的免疫调节组合物可以用于预防和/或治疗Th2应答-介导的移植(例如器官,组织等)排异反应。

过敏症是免疫系统的超敏性疾病。当人的免疫系统对环境中通常无害的物质反应时,发生过敏性反应。引起在对于所述物质敏感的患者中免疫反应(过敏反应)的物质称为“过敏原”。当过敏原进入对它过敏的患者身体中,患者的免疫系统通过产生大量的抗体(IgE)来应答;连续暴露于同样的过敏原引起化学介质的释放,特别是组胺,其将产生一种变态反应的典型症状。通过非限制性的示例性的方式,存在大量的过敏原,所述过敏原可以是花粉的过敏原提取物,动物的过敏原提取物,其包括家畜,昆虫,螨类等,食品或食物产品的过敏原提取物,金属,存在于唾液中的组分,诱导在患者中的敏感反应的昆虫螯或毒刺,存在于植物中的引导患者的敏感反应的组分等。

太阳城集团存在于群体中的最常见的过敏是:

太阳城集团-对于植物花粉的过敏症,例如对于禾本科花粉的过敏症(例如多年生黑麦草(Lolium perenne),草地早熟禾(Poa pratense),猫尾草(Phleum pratense),狗牙根(Cynodon dactylon),草甸羊茅(Festuca pratensis),鸭茅(Dactylis glomerata),黑麦(Secale cereale),大麦(Hordeum vulgare),燕麦(Avena sativa),小麦(Triticum sativa)等),对于其它草的花粉的过敏症(例如艾草(Artemisia vulgaris),藜草(Chenopodium album),长叶车前(Plantago lanceolata),蒲公英(Taraxacum vulgare),欧蓍草(Parietaria judaica),猪毛菜(Salsola kali),大荨麻(Urtica dioica)等),对于树木花粉的过敏症(例如齐墩果(Olea Europea),法国梧桐亚种(Platanus sp.),柏木亚种(Cupresus sp.)等);

太阳城集团-对于动物的过敏症,包括对于动物皮,头皮屑或羽毛(例如狗,猫,马,家禽等)的过敏症,对于昆虫的过敏症,例如对于存在于昆虫唾液、螯或毒刺中的组分的过敏症,其诱导患者的敏感反应(例如蜜蜂,黄蜂,蚊子,马蝇等),对于螨类的过敏症,例如尘螨(例如户尘螨(Dermatophagoides pteronyssimus),粉尘螨(Dermatophagoides farinae),粗脚粉蜡(Acaros Siro),热带无爪螨(Blomia tropicalis),埋内欧尘螨(Euroglyphus maynei),家甜食螨(Glyciphagus domesticus),害鳞嗜螨(Lepidoglyphus destructor),腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)等);

-对于真菌的过敏症(例如互隔交链孢霉(Alternaria alternata),腊叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)等);

-对于食品或存在于食品中的食品组分的过敏症,例如鱼,水果(菠萝,猕猴桃等);

-对于金属的过敏症(例如镍等)。

通常,很常见的是,对特定过敏原敏感的患者对其他不同的过敏原也敏感。

一般而言,本发明的免疫调节组合物可以口服使用,用于预防和/或治疗过敏症;在具体的实施例中,所述过敏症是选自如上所述过敏症的组,即选自由下列组成的过敏症组,对于植物花粉的过敏症,对于昆虫的过敏症,对于螨类的过敏症,对于真菌的过敏症;对于动物的过敏症,对于存在于食品中的食用组分的过敏症,对于金属的过敏症,对于粉尘的过敏症等,及其组合。

虽然似乎不是严格地必需的,在具体的实施例中,通过使用本发明的免疫调节组合物来预防和/或治疗过敏症,有利地,可以通过施用引起过敏症的过敏原。为此,所述过敏原可以与本发明的免疫调节组合物一起给药于患者(本发明的免疫调节组合物和过敏原同时给药),通过将过敏原包括本发明的免疫调节组合物的制剂本身中,或通过在独立的制剂中施用过敏原但与本发明的免疫调节组合物同时给药。可选择地,所述过敏原可以在本发明的免疫调节组合物给药之前或之后一段太阳城集团(本发明的免疫调节组合物和过敏原顺续给药)给药于患者;在这种情况下,所述过敏原可以配制为它自己的制剂。虽然事实上任何过敏原都可以给药,在一个特定的实施例中,所述过敏原为在前段中提及的引起过敏症的过敏原。所述过敏原可以通过本领域技术人员已知的常规方法获得或可以从市场中获得。

太阳城集团本发明的免疫调节组合物可以口服使用,用于预防和/或治疗过敏症相关疾病。本领域技术人员已知通常与过敏症相关的疾病。通过非限制性说明的方式,最常见的过敏症相关疾病是选自哮喘和过敏性皮炎。

免疫缺陷是一种病理状态,其中免疫系统对于感染疾病的抵抗能力损害或缺少;在那些情况下,免疫系统无法完成它的相应保护功能,使得机体易受感染。实际上,免疫缺陷使得受影响人群高度易受感染。通常,大部分的免疫缺陷是获得性免疫缺陷(“继发性免疫缺陷”);尽管如此,有些人生而具有免疫系统缺陷(“原发性免疫缺陷”)。已经发现在可能具有免疫缺陷的患者中,采用药剂来抑制它们的免疫系统作为抗移植排异反应措施的移植患者,以及具有过度活跃的免疫系统的患者。通常,除了可以影响每个人的正常感染之外,具有免疫缺陷的人特别易于遭受机会感染。

太阳城集团免疫缺陷可以是生理性的,先天的,或获得性免疫缺陷。通常在免疫缺陷情况下,有机体抵御病原体随着之后Th1/Th2平衡的改变而降低,例如,在生理性的免疫缺陷(例如在新生儿,怀孕期间等),原发性或先天的免疫缺陷(例如遗传性疾病,例如在迪乔治(DiGeorge)综合症中的无丙球蛋白血症等),或在获得性或继发性免疫缺陷(例如由于营养不良,年老,用某些药剂治疗,例如化学治剂,抗风湿药,免疫抑制剂(在器官移植之后给药),糖皮质激素等引发的获得性免疫缺陷;爱滋病(AIDS),自身免疫疾病等)。

太阳城集团本发明的免疫调节组合物用于支持有机体的天然的免疫防护,例如在特特应激下,例如身心应激,如果它是非常强烈的或者持续很长太阳城集团,可以导致通过对于不同强度的感染的易损性的,临床上显现的免疫缺陷情况。

因为本发明的免疫调节组合物调节免疫系统,优选地通过Th1应答诱导和/或改变免疫反应对于Th1(例如从Th2到Th1)的应答,例如,它也可用于口服来预防和/或治疗源自或由免疫缺陷引起的病状。本领域技术人员已知衍生自免疫缺陷的病状,例如感染等。

太阳城集团因此,本发明的免疫调节组合物可以用于预防和/或治疗任何来源的免疫缺陷和所产生的病状,例如口服来预防和/或治疗由胞内的病原体所引起的感染(例如细菌,原生动物,病毒等)以及粘膜的感染(例如口腔感染,呼吸道感染,胃肠道感染,泌尿生殖道感染,粘膜感染,皮肤感染等)和通常衍生自免疫缺陷情况的所有的感染。

在另一个具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物可以用于治疗和/或预防由胞内的病原体所引起的感染。在具体的实施例中,所述胞内的病原体是一种真核生物的病原体,例如原生动物(例如间日疟原虫(Plasmodium vivax)(其引起疟疾),利什曼原虫亚种(Leishmania sp.)(与利什曼病相关),内变形虫属亚种(Entamoeba sp.),隐孢子虫亚种(Cryptosporidium sp.)等,或真菌,原核生物的病原体,例如细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli),沙门氏菌亚种(Salmonella sp.),志贺氏菌属亚种(Shigella sp.),弯曲杆菌属亚种(Campylobacter sp.),耶尔森氏菌属亚种(Yersinia sp.),弧菌(Vibrio sp.),结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),M.麻风杆菌(M.leprae),李斯特菌属亚种(Listeria sp.),布鲁氏菌属亚种(Brucella sp.),衣原体属(chlamydias)等),或病毒(例如双链DNA(dsDNA)病毒,例如腺病毒,疱疹病毒,痘病毒等),单链DNA(ssDNA)病毒,例如细小病毒等,双链RNA(dsRNA)病毒,例如呼肠孤病毒等,阳性的单链RNA((+)ssRNA)病毒,例如小核糖核酸病毒,囊膜病毒等,阴性的单链RNA[(-)ssRNA]病毒,例如正粘病毒,弹状病毒等,逆转录单链RNA(ssRNA-RT)病毒,例如逆转录病毒等;或逆转录双链RNA(dsRNA-RT)病毒,例如嗜肝DNA病毒等)。

太阳城集团在另一个具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物可以用于治疗和/或预防粘膜的感染;通过非限制性说明的方式,所述粘膜可以是口腔粘膜,胃肠道粘膜,泌尿生殖道粘膜和呼吸道粘膜等。通常,这些感染可以由胞内的病原体引起。在具体的实施例中,所述粘膜的感染由肠细菌所引起(例如大肠杆菌(Escherichia coli),沙门氏菌亚种(Salmonella sp.),志贺氏菌属亚种(Shigella sp.),弯曲杆菌属亚种(Campylobacter sp.),耶尔森氏菌属亚种(Yersinia sp.),弧菌(Vibrio sp.)等),肠道病毒(例如萼状病毒,轮状病毒,腺病毒,星状病毒等)或原生动物(例如内变形虫属亚种(Entamoeba sp.),隐孢子虫亚种(Cryptosporidium sp.),利什曼原虫亚种(Leishmania sp.)等)。

太阳城集团适于口服的本发明的免疫调节组合物通过本领域技术人员已知的方法制备,可以考虑其中存在的活性成分的具体的性质,其包括活的物质,具体地说益生菌,且优选地通过本发明提供的方法,由于产生的微粒在加工,存储和给药期间保护所述益生菌,特别在通过胃肠道转运(口服)期间。另外,在摄取之后,它们利于益生菌释放在预定位置,保护它们免受上部胃肠道、特别是胃的“酸性-胃蛋白酶”条件破坏。

在具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物是以单个剂型来给药,每天一次或若干次,其根据治疗病状的类型和严重性,以及患者的年龄和体重来确定。

在具体的实施例中,存在于本发明的免疫调节组合物中的本发明的微粒是以干粉或冻干制剂的形式,可选择地存在适于给药患者的载体中。通常,活性成分(本发明的微粒,组合物或产品)包含在合适的组合物中。

太阳城集团因此,在具体的实施例中,本发明的免疫调节组合物包括食品,药物或营养食品可接受的载体。在特定的实施例中,本发明提供的药物组合物,营养食品组合物或食物产品提供一种用于益生菌的合适的载体。因此,在特定的实施例中,本发明的免疫调节组合物包括药物组合物,营养食品组合物,或包含在食品产品中。非限制性的说明的例子包括药剂,饮食产品,衍生自牛乳的产品,例如酸乳酪,乳酪,奶油,糖果,果汁等,且可以包括,如果如上所述需要的话,对有机体有益的其它的物质,例如维生素,无机盐,其它相容的活性成分,例如益生元,纤维等。

如上所述,这个有创造性的方面可以可选择地表示为本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品,用于免疫系统调节组合物(本发明的免疫调节组合物)。太阳城集团上面的免疫调节组合物的特性在此处是适当的在细节上做必要的变更。在优选的具体的实施例中,所述免疫系统调节组合物优选地诱导Th1应答和/或改变对于Th1的免疫应答;优选地从Th2到Th1。同样地,在具体的实施例中,所述免疫系统调节组合物除本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品之外还包括食品,药物或营养食品可接受的载体。在另一个具体的实施例中,所述免疫系统调节组合物包括本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品,是以药物组合物的形式,营养食品组合物的形式,或可选择地包含在食品产品中。在另一个具体的实施例中,存在于免疫系统调节组合物中的微粒是以干粉的形式。

太阳城集团本发明还涉及本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品用于口服来预防和/或治疗免疫系统损伤(例如天生的损伤或诱导的免疫系统损伤)。在具体的实施例中,本发明的微粒是在配制的用于口服的药物组合物中。在另一个具体的实施例中,本发明的组合物是配制的用于口服的药物组合物。在另一个具体的实施例中,本发明的产品是适于口服的药剂。

同样地,本发明还涉及本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品用于口服来预防和/或治疗Th2-介导的移植排异反应;过敏症和过敏症相关疾病;免疫缺陷和衍生自免疫缺陷的病状;由细胞内的病原体所引起的感染,或粘膜的感染[Th2-介导的移植排异反应;过敏症和过敏症相关疾病;免疫缺陷和衍生自免疫缺陷的病状;由细胞内的病原体所引起的感染,或粘膜的感染的特性,已经在上面提及并通过引用纳入本文]。在具体的实施例中,本发明的微粒是在配制的用于口服的药物组合物中。在另一个具体的实施例中,本发明的组合物是配制的用于口服的药物组合物。在另一个具体的实施例中,本发明的产品是适于口服的药剂。

在另一个方面,本发明涉及用于预防和治疗患者中的免疫系统损伤或病状的方法,其包括口服给药于需要治疗的患者,有效量的本发明的免疫调节组合物,或本发明的微粒,或本发明的组合物,或本发明的产品。

太阳城集团如本文使用的,在患者中,术语“免疫系统损伤或病状”包括天生的和诱导的免疫系统损伤,例如基于Th-1应答的治疗可以有益的疾病,例如Th2-介导移植排异反应;过敏症和过敏症相关疾病;免疫缺陷和衍生自免疫缺陷的病状;由细胞内的病原体所引起的感染,或粘膜的感染。Th2-介导移植排异反应,过敏症和过敏症相关疾病;免疫缺陷和衍生自免疫缺陷的病状;由细胞内的病原体所引起的感染,或粘膜的感染的特性已经在上述提及且并入此处作为参考。

如本文使用的,术语“患者”包括任何哺乳动物,包括人类。

太阳城集团本发明的免疫调节组合物,本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品的特性已经在上面定义且并入此处作为参考。

太阳城集团本发明的免疫调节组合物,本发明的微粒,本发明的组合物,本发明的产品的外观特性和给药形式已经在上面提及且并入此处作为参考。

太阳城集团向需要治疗的患者给药,本发明的免疫调节组合物,本发明的微粒,本发明的组合物,或本发明的产品可以包括在食品,药物或营养食品可接受的载体中,或可以存在于药物组合物,营养食品组合物或包含在食品产品中。

下列实施例用于阐明本发明,而不对本发明构成限定。

具体实施方式

太阳城集团下列实施例描述酪蛋白和壳聚糖微粒的制备,其可以结合益生菌并能够保护微生物免受上述的因素(加工,存储和/或通过胃肠道转运)的破坏。除非另有说明,使用的一般方法描述如下,来执行这些实施例。

一般方法

太阳城集团I.用于制备空白酪蛋白和壳聚糖微粒的一般方法

太阳城集团用于制备酪蛋白和壳聚糖微粒的方法包括在水介质中溶解酪蛋白钠(ANVISA,Madrid,Spain),接着在磁力搅拌和恒流条件下加入特定体积的壳聚糖溶液和选择性地加入特定量的交联剂。在包含微粒的混悬液通过喷雾干燥器之后,在添加保护剂例如甘露醇之后干燥形成的微粒。

除非另有说明,用于这些实施例的壳聚糖是具有脱乙酰度90.2%和分子量105+0.01kDa的壳聚糖,购自Guinama(Valencia,Spain)。

除非另有说明,用于这些实施例的喷雾干燥器是具有Büchi accessories,B-295Inert Loop和B-296Dehumidifier,Büchi Switzerland,Flawil(瑞士)的Büchi B-290Mini Spray–Dryer。

用于这些实施例的甘露醇是99.4%纯度的D-甘露醇,E-421,购自Guinama(Valencia,Spain),虽然有时也使用购自Sigma-Aldrich的D-甘露醇。

II.微粒鉴定

通过使用具有彩色软件成像系统(Colorview Soft Imaging Systems)相机的Olympus CH40显微镜的光学显微镜的方式来测定微粒的尺寸。

太阳城集团使用扫描电子显微镜(Zeiss,DSM 940A,Germany)进一步观察微粒的形态。为此,所述微粒以9nm的分子金层包衣(Emitech K550,Sputter-Coater equipment,英国)并通过Zeiss DMS 940A microscope(美国)拍照。

太阳城集团III.用于制备益生菌混悬液的一般方法

太阳城集团用于执行这些实施例的益生菌是分别分离自玉米青贮和乳酪的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CECT 220和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CECT 475T。两种微生物的冷冻干燥产品在MRS肉汤(Merck,Barcelona)在37℃无氧环境(85%氮,10%氢,5%二氧化碳)的厌氧培养室(MACS 500AIRLOCK,AES Chemunex,Spain)中恢复活力。从这些恢复活力的培养物来制备500μL份的储备混悬液,所述混悬液在-85℃冷冻直到使用之时。

使用的混悬液配制如下。将100μL份的相应微生物转移到10mL MRS肉汤。在37℃在缺氧条件下培养12小时之后,在Thoma chamber中进行显微镜中计数来评估样品量,其必须转移到包含MRS肉汤的50mL烧瓶来到达106CFU/mL(每毫升菌落数)的量。在接种那些量后,在预先描述的条件下培育烧瓶24小时直到到达早期稳定生长期。细菌种群追踪和计数,通过在每个取样太阳城集团接种相应10倍稀释度(0.1%BPW肉汤(Merck,Barcelona))的方式进行。

IV.用于制备包含包封的益生菌的酪蛋白和壳聚糖微粒的一般方法

太阳城集团用于制备包含包封的益生菌的酪蛋白和壳聚糖微粒的一般方法,包括在水介质中溶解酪蛋白钠(ANVISA,Madrid,Spain),接着加入特定体积的根据上面第III部分描述的方法获得的细菌悬液,并在离心之后,在搅拌和恒流条件下,在特定体积的2%蔗糖(w/v)的溶液中再悬浮。然后加入特定体积的壳聚糖溶液和可选择地特定体积的交联剂。

V.用于益生菌着色和包封的一般方法

执行这个方法是通过荧光性光学显微镜定性地证实细菌是包封在微粒中,即由酪蛋白和壳聚糖组成的基质包裹了所述益生菌。

用于使所述细菌着色的方法包括准备若丹明B异硫氰酸盐的饱和溶液的磷酸盐缓冲液(pH 7.4),通过0.2μm膜过滤,并添加到根据在前述部分描述的方法所获得的特定体积的细菌悬液中。一旦所述混合物以3,000rpm离心15分钟来移除在上层清液中过量的若丹明,着色的细菌在特定体积的2%蔗糖(w/v)的溶液中再悬浮。根据在前述部分描述的方法包封着色的细菌。

VI.用于定量存在于所述制剂中的存活的细菌,和测定在加工过程中细菌死亡周期的一般方法

太阳城集团为了计算包封的细菌,将1mL的1%NaOH(pH 10)的溶液添加到已知重量的微囊(大约500μg)中,并在涡流5分钟之后,在0.1%BPW肉汤(Merck,Barcelona,Spain)中进行相应的10倍稀释,并在MRS琼脂平板上接种。以37℃在缺氧条件下(MACS 500Airlock chamber,AES Chemunex,Spain)培养24-48小时之后,计算菌落数。

考虑在细菌经历喷雾干燥器之前,最初包含在所述制剂内每克的制剂的细菌的量,和在加工最后获得的数字,通过下列方程式测定细菌死亡周期∶

细菌死亡周期:log(初始CFU/g)–log(回收的CFU/g)

VII.用于评价微胶囊化的乳酸菌在模拟胃肠的介质中的耐受性的方法

根据Vinderola等,2003描述的方法评价植物乳杆菌和干酪乳杆菌的胃肠的耐受性。

太阳城集团为了进行研究,将10μL的液体细菌培养物或500ug的粉剂形式的微粒的制剂添加到具有0.99mL胃的模拟液的pH 2.5的PVC管中。由于许多管子用于计划评价的治疗次数,具体地说具有胃的模拟物的5个管子对应于所述次数:0和2小时(对于胃的模拟物的耐受性))和0,3和6小时(对于肠的模拟物的耐受性)。

根据药典配制胃的模拟物,具有下列组合物的1升溶液:

-2g NaCl

太阳城集团-3.2g胃蛋白酶(Sigma,Barcelona,Spain)

-7mL 37%HCl(v/v)

将胃蛋白酶溶解在HCl中,然后添加所述混合物到1升类型I的水中。调节最终的pH到1.2或2.5,这取决于用37%HCl(v/v)进行的测试。

太阳城集团同样按照药典处方配制肠的模拟物,其由下列组成:

-将6.8g磷酸二氢钾(Panreac,Madrid,Spain)溶于250mL类型I水中的,并添加77mL的0.2N NaOH

-500mL水

太阳城集团-10g胰酶(Sigma,Barcelona,Spain)

太阳城集团用0.2N NaOH或0.2N HCl调节pH到6.8。

将5个管子在37℃下保持在轨道的搅拌器(150rpm)上,直到进行样品萃取和存活评估时。在胃的模拟物(2小时)处理之后,离心(13,000rpm/10分钟)PVC管并丢弃上层清液。为了评价2小时的太阳城集团点,一个管子的小粒用上面描述的1%NaOH(pH 10)处理破裂微囊。剩余管子的小粒在0.99mL的肠的模拟物中再悬浮来评价在这个介质中在太阳城集团点0,3和6小时(从研究开始2,5和8小时后)的耐受性。在这些太阳城集团过去后,离心所述管子,丢弃上层清液并用1%NaOH(用于破裂微囊的处理)处理小粒来评价剩余的存活者。

使用如上在MRS琼脂平板上计数的方法,对存活细菌数目进行计数。在37℃缺氧条件下,培养所述板24-48小时,测定菌落数。根据下列方程式估算存活细菌的分数:

太阳城集团其中Nt表示在每个太阳城集团点的处理之后,存活的乳酸菌总数,N0表示接种乳酸菌的初始数量(LAB)(Bao等,2010)。

VIII.用于评价微胶囊化的乳酸菌在环境条件下随存储太阳城集团推移的稳定性的方法

通过评价细菌在室温下(25℃)随存储太阳城集团的推移的存活率进行微胶囊化的细菌的稳定性研究。

为此,从保存在密封的玻璃容器的微囊制剂中取500μg样品,所述样品经过破裂处理和上述的存活评估方法。作为对照,以类似方式在微生物的新鲜的混悬液和在冷冻干燥产品中进行研究。

实施例1

包含包封的植物乳杆菌属益生菌的酪蛋白和壳聚糖微粒的制备和鉴定

制备包含细菌的不同类型的微粒,均用酪蛋白作为壳聚糖修饰的基础聚合物。用于制备所述微粒的方法取决于使用或不使用交联剂,和使用的交联剂的类型而不同。

(Ap)不使用交联剂情况下壳聚糖修饰的酪蛋白微粒

太阳城集团将在“一般方法”的III部分描述的1.5mL的细菌悬液(1.2×1012CFU/mL)添加到25mL的10mg/mL的酪蛋白钠的水溶液,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的10mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中,所述壳聚糖溶液是在搅拌下通过将400mg壳聚糖添加到250ml纯净水并用0.1N HCl调节pH配制而成。

在5分钟的培养之后,将100mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是∶

-进口空气温度:85℃

-出口空气温度:40-45℃

-气压:6bar(6×105Pa)

太阳城集团-样品泵速:3.5mL/min

-抽吸:100%

-气流:600L/h

太阳城集团再次收集获得的粉剂形式的微粒进行鉴定和定量。在缺少细菌的情况下进行同样的研究来核实益生菌的存在如何影响颗粒的物理化学特性。图1显示在存在和不存在益生菌的条件下,获得的颗粒的光学显微图像。在图像中证实颗粒尺寸不受包封的细菌存在与否的影响。

另一方面,为了证实细菌是包封在酪蛋白和壳聚糖微粒中的,根据在“一般方法”第V部分中描述的方法,使用具有荧光标记的着色细菌重复同样的研究。图2显示着色游离细菌(A)和包封细菌(B)的荧光光学显微图像。在微粒(A)中观察到的荧光是专门地针对细菌。因为存在在微粒外的细菌是根本观察不到的,证实了包封了细菌。

太阳城集团 (Bp)在存在香草醛的情况下的酪蛋白和壳聚糖微粒

将0.5mL的香草醛(5mg/mL)的水溶液添加到25mL的10mg/mL酪蛋白钠的水溶液中。在(至少)15分钟培养之后,将在“一般方法”的III部分描述的0.3mL的细菌悬液(4.7×1011CFU/mL)添加到所述混合物中,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的10mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中。

在5分钟的培养后,将250mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是类似于在Ap部分描述的。

太阳城集团再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。

(Cp)在存在TPP的情况下酪蛋白和壳聚糖的微粒

将在“一般方法”的III部分描述的1.5mL的细菌悬液(4.7×1011CFU/mL)添加到25mL的10mg/mL酪蛋白钠的水溶液中,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的10mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中。在5分钟培养之后,添加0.8mL的1mg/mL TPP的溶液。

太阳城集团在5分钟后,将250mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是类似于在Ap部分描述的。

再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。

太阳城集团 (Dp)在存在钙盐的情况下的酪蛋白和壳聚糖的微粒

将在“一般方法”的III部分描述的4mL的细菌悬液(1.2×1012CFU/mL)添加到25mL的2mg/mL酪蛋白钠的水溶液中,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的2mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中。在5分钟培养之后,添加2mL的2%乙酸钙(w/v)溶液和2mL 2%氯化钙溶液(w/v)溶液。

在5分钟后,将100mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是类似于在Ap部分描述的。

再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。

太阳城集团图3显示获得的所述微粒的荧光性光学显微图像,其中没有观察到游离细菌的存在。

表1总结了植物乳杆菌的死亡周期,其源自在酪蛋白和壳聚糖微粒中的包封工艺。

表1.酪蛋白微粒制备方法对于植物乳杆菌存活的影响

SD:喷雾干燥

太阳城集团获得的微粒的尺寸在所有制剂中是相似的,范围在大约7±4μm。然而,当香草醛或TPP用作交联剂时,细菌死亡周期是较短。

根据所获得的结果,制剂Bp和Cp在用于获得微粒的加工期间提供更好的益生菌保护。因此,选择两种制剂来进行对于胃肠的耐受性和在存储期间存活的研究。

实施例2

包封的植物乳杆菌在环境条件下随存储太阳城集团的推移的稳定性的评估

在实施例1中描述的所述制剂Ap,Bp,Cp和Dp用于评价细菌在环境条件(25℃)下随着太阳城集团的推移的存活情况,其使用新鲜的混悬液和冷冻干燥产品作为比较对照。图4显示所获得的结果。

所述结果清楚显示在研究的第一个月,在悬浮液中,新鲜的细菌计数损失7对数单位,在第三个月,观察到以冻干形式的细菌损失4.5对数单位。然而,当这些益生菌包封在如实施例1描述的任何酪蛋白和壳聚糖微粒中时,它们的数量保持恒定,在研究的8个月期间没有观察到明显的损失。这些结果证实在本发明中描述的制剂在环境条件下容许至少增加细菌存活率至两倍于冻干的细菌。

实施例3

太阳城集团植物乳杆菌属的包封的益生菌对于模拟胃肠的介质的耐受性的评估

在实施例1描述的所述制剂Ap,Bp,Cp和Dp,按照在“一般方法”的第VII部分描述的方法用来评估包封细菌在模拟胃肠的介质中的耐受性。图5显示在整个加工期间获得的两种制剂的结果,以及获得的游离非包封细菌的耐受性。就游离细菌来说(非包封冻干细菌),存活的细菌数量在研究期间逐渐地降低,最终平均损失4对数单位。就制剂Ap和Dp来说,在整个试验期间,数量几乎保持恒定,比冷冻干燥产品在胃的模拟物试验结束时(2小时)和在肠的模拟物试验结束时(8小时)显著更高。在制剂Bp和Cp中,在滞留在胃的模拟物期间观察到浓度减少,在2小时的数量与冷冻干燥产品显著地相似。然而,一旦将微粒转移到肠的模拟物,就可观察到数量的增加,在试验结束时(8小时)比冷冻干燥产品显著地更高。其它的作者在用双歧杆菌进行的研究中,预先描述在最终数量的增加,其中他们推断所述现象应归于一种事实,细菌在低pH应力期间经历的损伤仅仅是暂时的,没有杀死细菌,其容许它们在进入肠的介质时恢复(Lacroix and Picot,2004)。

总之,在胃的模拟物介质的研究之后(2小时),当细菌包封在制剂Ap和Dp中时比当细菌是游离时观察到更高的存活率,所述差异是显著的。相反,这些差异没有在制剂Bp和Cp中观察到。然而,在研究结束后(在8小时之后,在通过胃的模拟物介质然后模拟肠的介质之后),对于所有的微粒制剂(Ap,Bp,Cp和Dp)来说,差异更大更显著,相对于冷冻干燥产品达到高达三个周期的差异。

这些结果证明描述的微粒显著地增加研究的细菌对于模拟胃肠的条件的耐受性。

另一方面,鉴定所述微粒用于评估它们在随着太阳城集团推移的降解过程中的状态。图6观察到细菌收容在微粒内部,当所述微粒随着太阳城集团推移降解时释放到介质中。

实施例4

包含包封的干酪乳杆菌属益生菌的酪蛋白微粒或酪蛋白和壳聚糖微粒的制备和鉴定

太阳城集团制备包含细菌的不同的类型的微粒,均用作为基础聚合物的酪蛋白和壳聚糖。用于制备所述微粒的方法取决于使用的交联剂的类型。

(Ac)在不使用交联剂的情况下壳聚糖修饰的酪蛋白微粒

将在“一般方法”的III部分描述的2mL的细菌悬液(2.2×1010CFU/mL)添加到25mL的10mg/mL酪蛋白钠的水溶液中,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的10mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中,所述壳聚糖溶液是通过添加400mg壳聚糖到250ml的纯净水的方式在搅拌下和用0.1N HCl调节pH得到。在5分钟培养之后,将100mg甘露醇添加到前述混合物,然后使用喷雾干燥技术干燥所述制剂。所述加工条件是:

-空气进口温度:85℃

-空气出口温度:40-45℃

太阳城集团-空气压力:6bar(6×105Pa)

-样品泵速:3.5mL/min

-抽取:100%

-气流:600L/h

再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。在缺少细菌的情况下进行同样的研究来核查益生菌的存在如何影响所述颗粒的物理化学特性。

太阳城集团 (Bc)在存在钙盐的情况下酪蛋白和壳聚糖微粒

将在“一般方法”的III部分描述的1.8mL的细菌悬液(9.4×1010CFU/mL)添加到150mL的10mg/mL酪蛋白钠的水溶液,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的25.5mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中。将钙盐(12ml的2%乙酸钙w/v和12ml的0.9%氯化钙w/v)的混合物添加所述溶液中。

太阳城集团在5分钟的培养之后,将1,500mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是∶

-空气进口温度:75℃

太阳城集团-空气出口温度:38℃

太阳城集团-空气压力:6bar(6×105Pa)

太阳城集团-样品泵速:3.5mL/min

-抽取:100%

-气流:600L/h

太阳城集团再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。

(Cc)使用香草醛交联的酪蛋白和壳聚糖微粒

太阳城集团将0.5mL的香草醛(5mg/mL)的水溶液添加到25mL的10mg/mL酪蛋白钠的水溶液中。在(至少)15分钟培养之后,将在“一般方法”的III部分描述的3mL的细菌悬液(1.2×109CFU/mL)添加到所述混合物中,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的10mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中。

太阳城集团在5分钟的培养后,将200mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是类似于在Bc部分描述的。

再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。

(Dc)使用三聚磷酸盐交联的酪蛋白和壳聚糖微粒

将在“一般方法”的III部分描述的1.2mL的细菌悬液(9.4×1010CFU/mL)添加到100mL的10mg/mL酪蛋白钠的水溶液,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的20mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中。此外添加1.6mL的TPP(1mg/ml)。

在5分钟的培养后,将1,000mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是类似于在Bc部分描述的。

再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。

表2总结了包含包封的干酪乳杆菌的酪蛋白和壳聚糖微粒的物理化学特性,以及源自颗粒制备过程的细菌死亡周期。

表2.具有包封的干酪乳杆菌的酪蛋白和壳聚糖微粒的物理化学特性

SD:喷雾干燥

获得的微粒的尺寸在所有情况下是相似的,范围大约7±4μm。太阳城集团制备过程,数据显示,在整个加工过程中,相比植物乳杆菌,改进的制剂通常更好地保护干酪乳杆菌,此外制剂Cc和Dc给予最好的保护。

太阳城集团虽然没有太阳城集团每克或毫升产品的存活细菌的最低量的共识,普遍接受在货架期结束时,107-108CFU/mL(CFU/g)的浓度为存活益生菌的最低计数。同样确定益生菌产品必须以大约100g/天的量定量摄入,以使109CFU的量释放进入肠道(Karimi等,2011;Mohammadi等,2011;Vinderola等,2000a)。因此,本发明提供的方法认为是一种合适的方法,因为它维持细菌量在109CFU/g(表2),其容许制剂在食品占比例约为1%,例如维持必要的益生菌浓度107CFU/g。

为了获知包封的细菌在存储期间对胃肠的耐受性和存活率,选择制剂Cc和Dc,因为它们提供最好的保护结果,且不需要使用高压,简化了生产过程。

实施例5

包封的干酪乳杆菌在环境条件下随存储太阳城集团推移的稳定性的评估

太阳城集团在实施例4中描述的所述制Ac,Cc和Dc用于评估细菌在环境条件下随着太阳城集团推移的存活率,其使用新鲜的混悬液和冷冻干燥产品作为比较对照。图7概括了所获得的结果。

太阳城集团所述结果显示在研究的第一个月,在悬浮液中的新鲜的细菌数量损失5对数单位,且在第三个月,观察到冻干形式的细菌损失3对数单位,在第5个月达到5对数单位的损失。根据制剂Ac,Cc和Dc,包封在酪蛋白和壳聚糖微粒中的细菌,在3个月之后损失是大约0.5对数单位,且制剂Ac在6月之后损失3对数单位,制剂Dc损失2对数单位以及制剂Cc损失1对数单位。

这些结果证实本发明描述的制剂容许相对于冻干细菌,增加所述细菌在环境条件下的存活率,以类似于植物乳杆菌的情况中观察到的方式。

实施例6

干酪乳杆菌属的包封的益生菌对于模拟胃肠的介质的耐受性的评估

太阳城集团在实施例4中描述的制剂Ac,Cc和Dc,按照“一般方法”第VII部分描述的方法来评估包封的细菌在模拟胃肠的介质中的耐受性。图8显示整个研究中对于微粒所获得的结果,以及获得的非包封冻干细菌的耐受性。

太阳城集团就游离细菌来说(非包封冻干细菌),在胃的介质中在研究的前两个小时中,存活细菌数目显著地降低(4对数单位),此后它保持恒定。然而,数据显示包封细菌显著更耐受于胃的介质的处理,处理结束时平均损失大约1.5对数单位。此外,就制剂Ac和Cc来说,在进入到肠的介质之后,虽然保持显著大于冻干对照,但是细菌的耐受性降低,对于制剂Dc没有观察到效果。

这些结果证明描述的微粒增加研究的细菌对于模拟胃肠的情况的耐受性。

实施例7

与植物乳杆菌有关的酪蛋白生物胶囊的免疫学研究

为了实施这个实施例,使用在实施例1(参考Bp)描述的在香草醛存在的情况下壳聚糖修饰的酪蛋白微粒。为此,将0.5mL的香草醛(5mg/mL)添加到25mL的10mg/mL酪蛋白钠的水溶液中。在(至少)15分钟的培养之后,将在“一般方法”的III部分描述的1mL的细菌悬液(4.6×1010CFU/mL)添加到所述混合物中,离心后在2%蔗糖(w/v)溶液中再悬浮。然后将具有1.6mg/mL浓度的在pH 5.5-6的水介质中制备的2mL壳聚糖溶液添加到所述混合物中。

太阳城集团在5分钟之后,将100mg甘露醇添加到之前的混合物中,然后使用喷雾干燥技术来干燥所述制剂。加工条件是∶

-空气进口温度:85℃

太阳城集团-空气出口温度:40-45℃

太阳城集团-气压:6bar(6×105Pa)

太阳城集团-样品泵速:3.5mL/min

-抽取:100%

-气流:600L/h.

太阳城集团再次收集获得的粉剂形式的微粒用于鉴定和量化。所获得的微粒的平均尺寸是7±4μm。另一方面,细菌数给出每克微粒5.1×1010CFU的值。

根据伦理学委员会(Ethics Committee of the Institution)的规定以及对于实验动物的欧洲法律(European legislation)(86/609/EU)进行免疫学研究。为此,使用平均重量20g的24只雄性CD1小鼠(Charles River),使它们经历正常白天黑夜环境(12小时-12小时)。将动物分成4个不同的组(每组6只小鼠)和每组接受连续21天的不同的每日处理。

将0.1mL的PBS(pH 7.4的磷酸盐缓冲液)口服给药于第一组(对照)。第二组用在2%蔗糖中植物乳杆菌的混悬液处理,剂量107CFU/小鼠(游离LP)。第三组用在2%蔗糖(107CFU/小鼠)中植物乳杆菌与壳聚糖修饰的空白酪蛋白微粒混合形成的混悬液形式的物理状态混合物处理,并用香草醛交联(100ug/小鼠)(物理状态混合物,MF)。最后,第四组接受制剂(Bp),所述制剂由植物乳杆菌结合入预先描述的壳聚糖修饰的酪蛋白微粒,并用香草醛交联(107CFU/小鼠)。

在第22天,使用血清分离管(SARSTEDT Microtube 1.1mL Z-Gel)汲取大约250μL的血液。然后处死所述动物,并取出脾脏,4℃下在具有甘氨酸的RPMI 1640介质中分解脾细胞。溶解红血球,计算脾细胞,在完全的RPMI介质中调整其浓度。添加植物乳杆菌(以相对于脾细胞10:1的比值)作为刺激物,对100ul的细胞悬液进行复制。在37℃培育48小时之后,离心所述细胞悬液并在-80℃保存包含细胞因子的上层清液。通过BD流式微球分析法(cytometric bead array)Th1/Th2/Th17CBA试剂盒(BD,USA)捕获细胞因子,使用流式细胞仪(Acoustic Focusing Cytometer)测定。

太阳城集团图9显示植物乳杆菌的口服给药(游离,包封或以物理状态混合物)如何导致细胞毒素的淋巴细胞数目的轻微的增加,其通过CD4+/CD8+比值的减少显现。这个效果与参考文献较早地描述的涉及通过细菌肠道移植效果的增加的数据相一致[Herias等,1999;Smelt等,2012]。另一方面,观察到包封不影响细菌对于改变CD4+/CD8+比值的能力。

太阳城集团图10显示干扰素-γ/白细胞间介素-6(IL-6)比值取决于接受的治疗。在所有情况中,植物乳杆菌的给药增加干扰素-γ(IFN-g)的合成。然而,用包封在所述微粒中的细菌处理的动物显示出比值显著地大于通过余下方式处理所获得的比值(p<0.001;ANOVA,post hoc Tukey)。在植物乳杆菌给药之后,对于Th1的免疫应答的这个转变与其他作者获得的结果一致[Smelt等,2012;Wiese等,2012]。

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