太阳城集团

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用于调节连接蛋白半通道的组合物和方法.pdf

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用于 调节 连接 蛋白 通道 组合 方法
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN200610135509.2

申请日:

20030129

公开号:

CN1939529A

公开日:

20070404

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K38/08,A61P9/06 主分类号: A61K38/08,A61P9/06
申请人: WYETH公司
发明人: J·S·彼得森,S·尼夫,M·S·尼尔森,E·迈耶,E·斯坦内斯,P·H·詹森,B·D·拉森,L·B·L·汉森
地址: 美国新泽西
优先权: 60/352,717
专利代理机构: 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 代理人: 李华英
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法律状态
申请(专利)号:

CN200610135509.2

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团公开了用于调节细胞、组织或器官中的半通道功能的组合物和方法。本发明还涉及用于对该类化合物,特别是那些能调节连接蛋白磷酸化作用的化合物进行检测的有用筛选。还提供了用于预防或治疗哺乳动物受不希望的半通道功能影响的情况如心律不齐的治疗方法。

权利要求书

1.化合物1用于制备用于调节与应激相接触之细胞、组织或器官中的半通道的方法的药物的用途,该方法包括使应激状态的细胞、组织或器官与治疗有效量的化合物1进行接触,其中所说的接触足以调节应激状态的细胞、组织或器官中的半通道;所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2。2.如权利要求1所述的用途,其中所说的方法进一步包括对连接蛋白43(Cx43)的酪氨酸残基磷酸化,其中半通道的功能被降低。3.如权利要求1所述的用途,其中所说的方法进一步包括对连接蛋白43(Cx43)的丝氨酸残基脱磷酸化,其中半通道的功能被增强。4.化合物1用于制备预防或治疗哺乳动物中的组织或器官的应激的方法的药物的用途,该方法包括给予治疗有效量的化合物1,其中的接触足以预防或治疗组织或器官中的应激状态;所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2。5.如权利要求4所述的用途,其中该方法进一步包括使连接蛋白43(Cx43)的酪氨酸残基磷酸化和降低该半通道的功能。6.化合物1用于制备用于增加细胞、组织或器官中的间隙连接细胞内通讯(GJIC)的方法的药物的用途,该方法包括给予治疗有效量的化合物1,其中所说的接触足以增加细胞、组织或器官中的GJIC;所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2。7.化合物1用于制备用于治疗烧伤的方法或者用于治疗或预防血栓形成、呼吸性和代谢性酸中毒、病灶性心律不齐、由血液葡萄糖水平升高所导致的细胞和组织损害、慢性心房纤维性颤动或癫痫的方法的药物的用途,该方法包括给予需要进行该类治疗或预防的患者治疗有效量的调节连接蛋白半通道功能的化合物1,所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2。8.权利要求7的用途,其中所述半通道的功能被降低。9.一种筛选调节半通道功能的候选化合物的方法,该方法包括使体外细胞与化合物1进行接触,该接触是在有益于调节连接蛋白43(Cx43)的磷酸化作用的条件下进行的;并且对Cx43磷酸化作用中的变化进行检测,其中将磷酸化作用中的变化看成是半通道调节化合物的标识,所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2。10.如权利要求9所述的方法,其中所说的试验步骤进一步包括在免疫学或基于细胞分选的测定中对候选化合物进行试验。11.如权利要求9所述的方法,其中所说的方法是在高处理量或超高处理量的筛选形式下进行的。12.如权利要求9所述的方法,其中所说的化合物促进了Cx43细胞内C-末端区域的磷酸化作用。13.一种筛选调节半通道功能的候选化合物的方法,该方法包括:1)对细胞、组织或器官的群体进行培养,2)对该细胞、组织或器官优选地通过剥夺氧气或代谢抑制如通过加入葡萄糖衍生物来对其施加应激,3)加入化合物1,所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2,4)加入可检测的指示剂,5)检测相对于适宜对照而言的细胞、组织或器官中的可检测指示剂的摄取改变;和6)任选地对该作为调节半通道功能化合物的标识的改变进行测量。14.根据权利要求13的方法,其中所述细胞、组织或器官的群体得自心脏或肌肉。15.根据权利要求13或14的方法,其中所述可检测的指示剂为荧光、化学发光、或磷光性化合物。16.根据权利要求13或14的方法,其中所述可检测的指示剂为钙黄绿素。17.一种筛选调节半通道功能的候选化合物的方法,该方法包括:1)对细胞、组织或器官的群体进行培养,2)用可检测的指示剂对细胞、组织或器官进行装填,3)通过对得自可检测指示剂的信号进行检测和定量来对细胞、组织或器官的体积进行估计,4)加入化合物1,所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2,5)对该细胞、组织或器官优选地通过剥夺氧气或代谢抑制如通过加入葡萄糖衍生物来对其施加应激,6)检测相对于适宜对照而言的细胞体积改变;和7)任选地对作为调节半通道功能并任选地调节间隙连接功能化合物的标识的改变进行测量。18.根据权利要求17的方法,其中所述细胞、组织或器官的群体得自心脏或肌肉。19.根据权利要求17或18的方法,其中所述可检测的指示剂为荧光、化学发光、或磷光性化合物。20.根据权利要求17或18的方法,其中所述可检测的指示剂为钙黄绿素。21.化合物1用于制备用于对需要该类治疗的哺乳动物的组织或器官进行细胞保护的方法的药物的用途,该方法包括给予治疗有效量的化合物1,所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2。22.如权利要求21所述的用途,其中该方法进一步包括使所说的哺乳动物的组织或器官面临局部缺血状况。23.化合物1用于制备用于预防或治疗哺乳动物中再灌注性损伤的方法的药物的用途,该方法包括给予治疗有效量的化合物1,所说的化合物1是Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2。24.如权利要求23所述的用途,其中所说的方法进一步包括使哺乳动物的心脏出现梗死情况并且确立冠状动脉灌注。

说明书



太阳城集团本发明申请是申请日为2003年1月29日,申请号为03804968.6, 发明名称为“用于调节连接蛋白半通道的组合物和方法”的中国专利 申请的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求了于2002年1月29日提交的US临时申请序号为 60/352,717的申请的优先权,其公开内容在这里被引入作为参考。

技术领域

太阳城集团本申请一般涉及用于调节连接蛋白半通道的组合物和方法。本申 请还涉及用于检测该类化合物的有用的筛选。

背景技术

公认间隙连接是有助于细胞与其周围环境进行联系的重要的质膜 结构。例如,认为大多数间隙连接可以促进小分子和离子在相互连接的 细胞之间的通行。认为该类活动会对细胞生理学的许多方面产生深远 的影响。认为毗邻细胞的质膜包括由帮助形成该间隙连接的被称为“连 接蛋白”的多聚体蛋白所形成的半通道,“连接子”。此外,半通道在小 分子量化合物在细胞质和细胞周质间隙或细胞外间隙间的交换中起着 独立的作用。一般可参见Bennett,M.等人(1991)Neuron 6:305;Kumar, N.和Gilula,N.B.(1996)Cell 84:381;和Quist,A.P等人(2000)J.Cell Biol.148:1063和其中所引用的参考资料。

特别地,已经有许多间隙连接是具有浓密的叠集通道聚簇的细胞 膜特定区域的报道。认为该类间隙连接通道直接连接两个毗邻细胞的 细胞质隔室。

公认间隙连接通道由两个毗邻细胞各自所提供的两个半通道(连 接子)所组成。已经公开了各连接子(半通道)包括六个被称为连接蛋白 的蛋白。认为各连接蛋白共享四个跨膜结构域、两个细胞外回路、和 一个细胞质回路。认为电脉冲的传导是通过间隙连接而发生的,从而 有助于正常的心脏传导和节律。一般参见P.A.Guerrero,R.B.等人,J Clin Invest 1997,99 1991;D.L.Lerner,K.A.等人,Circulation 1999,99 1508;S.Kirchhoff,E.等人,Curr Biol 1998,8 295。

认为大多数心脏连接蛋白的分布在该器官的各处变化很大。已经 公开了Cx43同种型是主要的心室类型,而Cx40是心房和传导系统中 最丰富的同种型。

有报道称连接蛋白异常和心脏病之间有密切关系,见A.C. deCarvalho,等人,J Cardiovasc Electrophysiol 1994,5 686;R.R. Kaprielian,等人,Circulation 1998,97 651;N.S.Peters,等人, Circulation 1993,88 864;和J.E.Saffitz,R.B.等人,Cardiovasc Res 1999,42 309。

已知在心律不齐中涉及间隙连接的异常表达、分布和调整。据报 道,Larsen,B.等人在PCT/DK01/00127(WO01/62775)中所公开的抗心 律失常的肽可增加脊椎动物组织中间隙连接细胞间通讯(GJIC)。

特别是对由连接蛋白(Cx)基因族所编码的哺乳动物间隙连接蛋白 进行了报道。见Bruzzone,R.等人(1996)Eur.J Biochem.238:1。该Cx 族包括Cx26、30、31、32、37、40、43、45、46和50。在无脊椎动 物体内也发现了间隙连接通道,其中该形成蛋白的通道被称为 “innexins”。

已知除Cx26蛋白外,大多数连接蛋白都可被磷酸化。Cx43蛋白 在组织中被广泛表达。有报道称Cx43蛋白的磷酸化作用可影响间隙 连接细胞内通讯(GJIC)。例如,已知通过磷酸化作用可以影响Cx43的 周转、运输、磷酸化和门控。见Darrow,B.J.,等人(1995).Circ Res 76:381。

太阳城集团例如,Saffitz及同事已经用电导测量表明在局部缺血期间,在15 分钟内,连接蛋白丝氨酸脱磷酸化作用增加。见图1(表示具有一些已 经被确定的磷酸化作用部位的哺乳动物Cx43跨膜蛋白)。

连接蛋白的磷酸化作用和溶解度已经引起了研究者的兴趣。特别 是发现Cx43在大鼠乳腺肌上皮细胞中被磷酸化。见Wang,Y.,等人 (1995).JBiol Chem 270,26581;和Yamanaka,I.,等人(1997).Eur J Cell Biol 72:166。

太阳城集团如上所述,认为间隙连接通道是连接毗邻细胞的细胞质的专门的 孔。半通道与细胞外环境相连通。已经报道了心脏细胞的代谢抑制可 以活化由连接蛋白半通道所构成的流入通道。认为代谢抑制可以打开 该半通道并增加钾的损耗、诱导质子,钠和钙的流入,从而损害心脏 组织。见Kondo等人,J.MoI.Cell.Cardiol.32:1859-72,2000;Li等人,J. Mol.Cell.Cardiol.33:2145-55,2001)。

认为急性心肌局部缺血过程中间隙连接处电的解偶联有助于传导 异常和折返性心律不齐。局部缺血期间细胞内Ca2+和H+水平增加和两 亲性脂质代谢物的积聚促进了解偶联。其它机理可能也起作用。例如, 已经报道了由急性局部缺血所诱发的解偶联与连接蛋白43(Cx43)磷酸 化作用的改变有关。已经报道的结果与在急性局部缺血期间的心肌解 偶联和心律失常形成中起作用的快速可逆的Cx43脱磷酸化作用相一 致。见Beardslee MA等人,Circ Res.2000;87:656和其中所引用的参 考资料。

太阳城集团半通道的结构和功能已经引起了人们的兴趣。例如,原子力显微 镜检查(AFM)、荧光染料摄取试验、和激光同焦点免疫荧光成像已经 表明半通道涉及细胞体积的细胞外钙-依赖性调节。如所报道的那样, 细胞体积的改变取决于连接蛋白43是否被表达。报道用间隙连接的阻 滞剂(例如,油酰胺和β-甘草次酸)来防止这些改变或可以通过使细胞外 的钙恢复到正常水平来逆转这些改变。已经表明作为对其它等渗情况 中细胞外生理学变化的响应,非间隙连接的半通道对细胞体积进行调 节。见Quist,A.P.等人,同上。

已经提出开放半通道,尤其是在局部缺血或代谢应激中开放半通 道可以导致细胞摄取Ca2+、质子和两亲性脂质代谢物在细胞中的积聚, 从而造成细胞膨胀、细胞损害或编程性细胞死亡。见Beardslee等人, 同上和Quist等人,同上。

太阳城集团已经报道了Cx43在体外被Src蛋白在Tyr247(Y247)、 Tyr265(Y265)以及可能的其它部位上被磷酸化。值得注意的是,据报 道,间隙连接细胞间通讯(GJIC)对由v-Src所介导的磷酸化作用所导 致的破坏具有抵抗性。已知Cx43的Y247和Y265上的磷酸化是很重 要的。见Lin R,等人(2001)J Cell Biol 154(4):815。还可参见图1。

太阳城集团还可参见Larsen,B.D等人在于2002年2月22日提交的标题为 “细胞内通讯促进化合物的新医学应用”的PCT申请 PCT/US02/05773(WO 02/077017),其中公开了各种GJIC调节化合物。

希望有可以调节半通道功能的化合物。优选的化合物将帮助打开 或关闭该半通道。尤其希望有一些分子筛选来对该类化合物进行鉴别。

发明内容

本发明的一般特征是涉及一些化合物以及用这些化合物来对半通 道功能进行调节的方法。特别是可以调节半通道磷酸化作用的化合物。 本发明另外的化合物可以调节半通道功能并且在一些情况中还可以影 响间隙连接通讯(GJIC)例如,通过打开或关闭间隙连接通道来对其进 行影响。还提供了用于检测该类化合物和对该类化合物的特性进行描 述的有用的筛选。本发明具有许多有用的应用,包括为由不适宜的半 通道功能所调控的各种情况提供了用于进行治疗或预防的治疗。

急需对可以调节(增加或降低)半通道功能的化合物进行鉴别。“半 通道功能”指的是打开或关闭连接蛋白半通道从而增加或降低分子或 离子通过该半通道进行的流通。短语“间隙连接功能”指的是打开或关 闭间隙连接从而增加或降低分子或离子通过该间隙连接进行的流通。 本发明优选的化合物可以调节半通道的磷酸化作用,并且一般还可以 帮助打开或关闭该半通道。可以通过一种或多种这里所公开的标准测 定来容易地检测半通道功能和间隙连接功能并可以任选地对其进行定 量。

太阳城集团更特定的半通道调节化合物可以调节(增加或降低)所识别的连接 蛋白的磷酸化作用。优选的磷酸化或脱磷酸化的部位包括该连接蛋白 上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。正如下面将要讨论的 那样,已经发现对这些残基中一种或多种的磷酸化进行调节可以影响 半通道功能,特别是可以通过打开和关闭半通道而影响其功能。因此, 如下所述的那样,本发明的目的是提供适于对该连接蛋白的磷酸化状 态进行监测的筛选以及对具有调节半通道功能能力的化合物进行检测 和任选地对其特性进行刻划的方法。

例如,本发明的某些化合物能磷酸化该连接蛋白的至少一个酪氨 酸残基。在这种实施方案中,该连接蛋白的磷酸化作用将帮助关闭该 半通道。其它适宜的半通道调节化合物可以降低该连接蛋白的至少一 个丝氨酸残基的磷酸化作用(脱磷酸)。在这种实例中,该丝氨酸的脱 磷酸化作用将帮助打开该半通道。本发明范围内还有一些其它化物将 增加连接蛋白至少一个苏氨酸残基的磷酸化作用,其一般有助于该半 通道的闭合。本发明另一些适宜的化合物可以促进下面活动中的至少 一种:增加或降低该连接蛋白丝氨酸的磷酸化作用、增加或降低其酪氨 酸的磷酸化作用、和增加或降低其苏氨酸的磷酸化作用。优选地,一 种或多种氨基酸的改变将有助于该半通道可检测的开放或关闭。

因此,本发明一方面提供了一种用于调节半通道功能的方法,优 选地是通过关闭半通道来进行调节。在一个实施方案中,该方法包括 关闭细胞、组织或器官中的半通道,所说的半通道优选地是处于应激 中的半通道,该方法包括使处于应激状态的细胞、组织或器官与治疗 有效量的至少一种下面式I或II所示的化合物进行接触。相对于适宜 对照而言,本发明优选的接触足以在与应激接触前、接触期间或接触 后关闭半通道。该类应激包括一种或多种代谢抑制、缺氧、pH降低、 或如下所述的细胞外钾离子增加。

在一个更特定的实施方案中,该方法进一步包括对所识别的连接 蛋白的磷酸化作用进行监测,所说的所识别的连接蛋白优选地是连接 蛋白43(Cx43)。该方法一般将检测并报告在其上的酪氨酸、丝氨酸、 和苏氨酸残基中的至少一种上Cx43磷酸化作用的任何增加或降低,优 选地检测并报告酪氨酸和苏氨酸中的至少一种中磷酸化作用的增加。 在这种实施方案中,该方法还包括关闭该半通道,并且任选地,相对于 适宜对照而言,打开或关闭间隙连接通道。

太阳城集团本发明提供了用于调节半通道功能的其它方法。在一个实施方案 中,该方法包括对所识别的连接蛋白,优选地为Cx43的磷酸化作用进 行监测以检测其上的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基中的至少一种上 Cx43磷酸化作用的任何增加或降低,优选地对那些残基如丝氨酸中一 种或多种的磷酸化作用相对于对照而言的降低进行检测。在本发明的 这种实例中,该方法包括打开与应激情况相接触的细胞、组织或器官 中的半通道,其包括将处于应激状态的细胞、组织或器官与治疗有效 量的至少一种下式I或II所示的化合物进行接触。相对于适宜的对照 而言,优选的接触足以打开该半通道,并任选地打开或关闭间隙连接 通道。

需要对该类半通道调节化合物进行检测和更明确地定性的筛选。 具有该类筛选将是对该新的半通道调节化合物进行鉴别和定性的第一 个重要步骤,例如通过将该候选化合物与对照进行比较试验来探测其 帮助关闭半通道的能力,例如其应比对照化合物高至少5%。通过该 类筛选所确定的包括下面式I或II所示的化合物在内的化合物可被用 于促进细胞、组织和器官内环境稳定的治疗,例如,其可以通过预防、 降低细胞组分向细胞外环境的损失或保护细胞组分不损失到细胞外环 境中来起作用。

太阳城集团因此,本发明还提供了用于对具有调节半通道功能能力的候选化 合物进行筛选的特定的体外方法。该方法一般包括将适宜的细胞、组 织或器官与至少一种下面如式I或II所示的化合物进行接触。优选地, 该接触是在用于对所识别的连接蛋白,优选地是连接蛋白43(Cx43)的 磷酸化进行调节并对Cx43磷酸化作用相对于适宜对照而言的改变进 行检测的条件下进行的。该磷酸化作用的改变还优选地被看成是半通 道调节化合物的标识。任选地,根据这里所公开的试验,通过筛选方 法而发现的该类化合物可以打开或关闭间隙连接通道。

在前述方法的各方法中,本发明优选的磷酸化作用的改变几乎全 部发生在细胞内该连接蛋白的C-末端上或附近。Cx43更优选的磷酸 化和脱磷酸化作用部位如图1所示。短语“连接蛋白的C-末端”指的是 如图1所示的跨越约氨基酸残基240至281的区域。

本发明一种用于检测连接蛋白磷酸化作用的特定的体外筛选测定 涉及用来对半通道功能、间隙连接功能(或半通道功能和间隙连接功能) 进行监测的一个或多个步骤。该类测定一般包括下面步骤中的至少一 个并优选地包含下面的所有步骤:

1)将细胞、组织或器官如得自心脏或肌肉的那些物质的群体进 行培养,

2)对该细胞、组织或器官施加应激,优选地通过剥夺氧气或代 谢抑制来对其施加应激,

太阳城集团3)加入已知的或候选的半通道调节化合物如下面式I或II所示 的那些化合物,

4)检测连接蛋白磷酸化作用(优选地为Cx43)相对于适宜对照而 言的改变;和

太阳城集团5)任选地对该作为调节半通道功能并任选地调节间隙连接功能 的化合物的标识的改变进行测量。

该测定可以有效地测量该半通道调节化合物增加或降低优选的 Cx43蛋白的丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸残基中的至少一种的磷酸化作用 的能力。这里所涉及的“标准的体外连接蛋白磷酸化作用测定”或相关 短语指的是上面步骤1)至5)的方案。该测定可以用几乎任何群体的原 代细胞、次代细胞、或无限增殖化细胞如那些得自心脏或肌肉的细胞 来进行。

上述的标准体外测定通常是可变形的。例如,只要可以获得所需 的筛选结果,可以以任何顺序来进行步骤1)-5)。因此,在该测定的一 个实施方案中,可以在步骤1)、步骤2)(或步骤1)和步骤2))加入候 选化合物来代替仅在步骤2)后加入该候选化合物。

本发明提供了用于对候选化合物调节半通道功能的能力进行筛选 的其它方法。在一个实施方案中,该方法包括使适宜的细胞、组织或器 官与至少一种选自下面式I或II所示的化合物进行接触。一般在存在 化合物的情况下对该细胞、组织或器官对可检测指示剂进行的任何摄 取进行监测并且其是在与适宜的对照进行比较的情况下进行的。优选 的可检测指示剂具有有助于通过开放的半通道的分子大小。因此当该 半通道在测定中开放时,该可检测的指示剂进入到细胞、组织或器官 中。但是,当半通道关闭时,阻止了可检测的指示剂通过半通道进行的 流通。该接触优选地是在有益于检测该可检测的指示剂的摄取相对于 适宜对照而言的任何改变的条件下进行的。

正如例如在标准体外连接蛋白磷酸化作用测定中所检测到的那 样,如果连接蛋白,优选Cx43的C-末端区域中至少一个酪氨酸残基 被磷酸化,优选地在至少247位或265位上的酪氨酸被磷酸化,更优 选地247位和265位上的酪氨酸都被磷酸化,则根据本发明半通道是 “关闭”的。“关闭”还意味着该连接蛋白C-末端区域中至少一个苏氨 酸残基被磷酸化,其可以被单独磷酸化,或除酪氨酸磷酸化作用之外 也被磷酸化。如果该连接蛋白C-末端区域中至少一个丝氨酸残基被脱 磷酸化,则半通道是“开放的”。此外,优选的酪氨酸、苏氨酸和丝氨 酸残基在图1中被表示为激酶部位。

一种用于检测可检测的指示剂通过半通道进行的流通的更特定的 体外筛选测定包括一步或多步下面的步骤:

1)对细胞、组织或器官例如那些得自心脏或肌肉的物质的群体 进行培养,

太阳城集团2)对该细胞、组织或器官施加应激,优选地通过剥夺氧气或代 谢抑制如通过加入葡萄糖衍生物来对其施加应激,

3)加入已知或候选的半通道调节化合物如下面式I或II所示的 那些化合物,

4)加入可检测的指示剂如荧光、化学发光、或磷光性化合物如 荧光染料如钙黄绿素及相关化合物,

太阳城集团5)检测相对于适宜对照而言的细胞、组织或器官中的可检测的 指示剂的摄取改变;和

6)任选地对该作为调节半通道功能化合物的标识的改变进行测 量。

该测定可以有效测量候选化合物打开或关闭细胞、组织或器官中 的半通道的能力,其半通道的改变可以通过对该可检测的指示剂进行 目测容易地用显微镜检测出来。这里涉及的“标准的体外摄取测定”或 相关短语指的是上面步骤1)至6)的方案。该测定可以用几乎任何原代 细胞、次代细胞、或无限增殖化细胞如那些得自心脏或肌肉的物质的 群体来进行。其它可接受的指示剂包括也具有允许进行通过该半通道 的流通的大小的适宜的放射性化合物。特定的化合物包括那些用一种 或多种下面的放射性核素进行了标记的化合物:3H、35S、和14C。

重要的是,只要可以获得所需的测定结果,则上面进行了一般性 描述的标准的体外摄取测定并不限于任何特定的步骤次序。因此,在 一个实施方案中,步骤3)和4)的至少一种候选化合物和可检测的指示 剂可以在该方法的步骤2)之前分别被加入或一起被加入。在这种测定 实例中,在存在化合物和可检测的指示剂的情况下对细胞、组织或器 官施加应激。或者,可以将该可检测的指示剂在步骤1)时“负载”到细 胞中以对这些化合物打开半通道的能力进行检测。

太阳城集团本发明还提供了用于对一种或多种候选化合物调节半通道功能的 能力进行筛选的另外的方法。在一个实施方案中,该方法包括使细胞、 组织或器官与至少一种选自下面式I或II所示那些化合物的化合物进 行接触。一般给细胞、组织或器官加载可检测的指示剂以对体积进行 测量。用于测定的优选的可检测的指示剂具有适于通过开放的半通道 的分子大小。正如由可检测的指示剂和适宜的参考对照所提示的那样, 接触优选地是在有助于对细胞、组织或器官体积的任何改变进行检测 的条件下进行的。优选地对细胞、组织或器官施加应激和候选化合物 关闭该半通道,从而使得与适宜对照相比,细胞体积被维持或降低得 十分缓慢。

太阳城集团用于对细胞体积的改变进行检测的一种特定的体外筛选测定包括 一种或多种下面的步骤:

1)对细胞、组织或器官例如那些得自心脏或肌肉的物质的群体 进行培养,

太阳城集团2)用可检测的指示剂如荧光、化学发光、或磷光性化合物如染 料,如钙黄绿素或相关化合物对细胞、组织或器官进行装填,

3)通过对得自可检测的指示剂的信号进行检测和定量来对细 胞、组织或器官的体积进行估计,

4)加入已知的或候选的半通道调节化合物如下面式I或II所示 的那些化合物,

太阳城集团5)对该细胞、组织或器官施加应激,优选地通过剥夺氧气或代 谢抑制如通过加入葡萄糖衍生物来对其施加应激,

6)检测相对于适宜对照而言的细胞体积改变;和

太阳城集团7)任选地对作为调节半通道功能并任选地调节间隙连接功能化 合物的标识的改变进行测量。

该测定可以通过用显微镜对细胞体积变化进行观测来有效地对候 选的半通道化合物打开或关闭细胞、组织或器官中的半通道的能力进 行测量。这里涉及的“标准的体外细胞体积测定”或相关短语指的是上 面步骤1)至7)的方案。该测定可以用得自心脏或肌肉如心肌细胞或相 关细胞或组织的原代细胞或次代细胞的几乎任何群体来进行。

太阳城集团只要可获得所需的测定结果,该标准的体外细胞体积测定不会受 到步骤任何特定次序的束缚。因此,在一个实施方案中,步骤4)的候选 化合物可以在步骤3)中在对细胞施加应激后被加入来对该化合物关闭 在通过细胞体积降低的速率更慢而表现出来已经受到影响的细胞中的 半通道的能力进行监测。因此在一个测定实施方案中,在预定的太阳城集团框 架内对细胞体积降低或增加速率的改变进行监测。但是,在另外的实 施方案中,可以在固定的太阳城集团点例如在对细胞、组织或器官施加应激后 约1至120分钟的太阳城集团内对细胞体积的改变进行监测。

正如所讨论的那样,本发明的体外测定是灵活易变的并且可以对 其进行调整以适合所需的筛选应用。例如,可以用特定的候选半通道 调节化合物,如下面式I或II所示的那些化合物作为唯一的活性物质或 者将其与包括被试验的其它化合物在内的其它物质联用。在大多数但 是不是所有的情况中,该体外测定是参考适宜的对照测定来进行的, 所说的适宜的对照测定通常包括与上面步骤中的条件相同或密切相关 的试验条件,但是没有向培养基质中加入所试验的化合物。在该类情 况中,可以通过在测定中表现出比对照至少高2%的活性来对候选的半 通道调节化合物进行鉴别,该候选化合物的活性更优选地比对照测定 高至少约5%,更优选地高至少约10%或更高,例如比对照测定高约 20%至约40%。

正如这里所讨论的那样,特定的半通道调节化合物还会影响间隙 连接通道。例如,某些化合物可帮助关闭该半通道并有助于间隙连接 通道的开放。但是,其它化合物可帮助打开半通道,同时有助于间隙 连接通道的闭合。还有一些其它的化合物可以既打开半通道又打开间 隙连接,而其他的可以关闭间隙连接和半通道。

因此,本发明还提供了一种增加细胞、组织或器官中的间隙连接 细胞内通讯(GJIC)的方法。在一个实施方案中,该方法包括给予治疗有 效量的至少一种选自如下所述的式I或II所示那些化合物的化合物。 优选地,相对于适宜的对照而言,该接触足以增加细胞、组织或器官 中的GJIC。

太阳城集团还提供了对化合物调节半通道和间隙连接的能力进行选择的体外 测定的组合。在一个实施方案中,将标准体外连接蛋白磷酸化作用测 定、标准体外摄取测定、和标准体外细胞体积测定中的至少一种与 Larsen,B.等人在于2001年2月22日提交的标题为“新型抗心律失常 的肽类”的PCT申请PCT/DK01/00127(WO01/62775)或Larsen,B.等 人在于2002年2月22日提交的标题为“细胞内通讯促进化合物的新医 学应用”的PCT申请PCT/US02/05773(WO 02/077017)中所公开的 GJIC测定中的一种或多种相组合。该类适宜GJIC测定的实例包括通 过膜片钳、钙波测量和染料传递测定进行的对细胞传导进行测量的那 些测定。PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和PCT/US02/05773(WO 02/077017)申请在这里被引入作为参考。

通过非限制性地解释,用上面所述的标准体外连接蛋白磷酸化作 用测定来对一种或多种半通道调节化合物进行选择。随后可以用 PCT/US02/05773(WO 02/077017)申请中所描述的心肌细胞膜片钳测 定对一种或多种该化合物进行进一步筛选。在两种测定中都提供了适 宜活性的化合物对半通道和间隙连接具有调节能力。

太阳城集团本发明还提供了帮助对调节心脏心律不齐的治疗能力进行检测并 任选地对其进行定量的候选半通道调节化合物的体内试验。正如这里 所讨论的这样,其认为可以通过使用一种本发明的化合物或本发明化 合物的组合来预防、缓解或治疗大多数心律不齐。在 PCT/DK01/00127(WO01/62775)以及PCT/US02/05773(WO 02/077017) 中公开了在这里被称为“标准的体外小鼠心律不齐测定”或相关短语的 优选的体内试验模型。在测定中,本发明的某些化合物将令人满意地 将所诱导的房室(AV)阻滞(至少2的得分)开始的太阳城集团延长至少约20%。 其它一些化合物表现出将试验中所诱导的AV阻滞(至少3的得分) 开始的太阳城集团延长至少约60%。在广义上,该测定包括将一种或多种化 合物给予注射了用于诱导心律不齐的氯化钙的适宜小鼠,并对与适宜 对照相比的心律不齐(优选第2级AV阻滞)开始的太阳城集团进行检测。

值得注意的是,使用多种检测形式(即,至少一种这里所公开的标 准体外测定和体内心律不齐测定的组合)可以有效进行复合分析,从而 可以增加对具有良好治疗能力的半通道调节化合物(例如式I和II所示 的化合物)进行确定的准确度和概率。当对大量化合物进行试验时,本 发明的这种特性尤其有用。例如,可以对一些或几乎所有的式I或II 的化合物进行试验。供替代地或者此外,可以用包括组合型化学操作 在内的标准合成方法来制备适宜的化合物并根据本发明对其进行试 验。

在进行复合检测形式的实施方案中,重要的是要注意通过这里所 描述的测定所测得的显著的体外和体内活性不是该半通道调节化合物 的必需特征。即,这里所描述的某些化合物在这里所述的至少一种标 准体外测定中会表现出良好的活性,但是在标准的体内心律不齐测定 中可能不会表现出显著的活性。或者,某些其它化合物将在体内心律 不齐测定中表现出显著的活性,而在一种或多种标准体外测定中将不 会表现出良好的活性。但是,优选的半通道调节化合物将在本申请所 描述的体外和体内测定中的至少一种中表现出良好的活性。

太阳城集团在标准体内心律不齐测定中表现出良好活性的化合物有时被称为 “抗心律失常化合物”或用于表示其可在测定中延长至心律不齐的太阳城集团 的类似短语。

正如在下面更详细地讨论的那样,本发明的化合物可用来预防或 治疗与分子和/或离子通过细胞膜进行的不希望出现或异常流通有关 或怀疑与之有关的广泛的医学情况。例如,可以以这种方式影响 PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和PCT/US02/05773(WO 02/077017) 中所公开的几乎所有医学情况。所说的医学适应征中的一些在这里被 公开。通过使用本发明所公开的化合物中的一种或其组合,可以对这 些医学适应征进行预防、缓解或治疗,所说的化合物特别是这些在这 里所提供的体外和体内测定的至少一种中表现出良好的活性的化合 物。

Larsen,B.D等人在PCT/US02/05773(WO 02/077017)中公开了适 于进行试验和本发明应用的另外的化合物。

太阳城集团另一方面,本发明提供了一种预防或治疗哺乳动物组织或器官应 激的方法。在一个实施方案中,该方法包括给予治疗有效量的至少一种 选自上面式I和II所示化合物的化合物。优选地,该接触足以对组织 或器官中的应激进行预防或治疗。

本发明还提供了一种治疗烧伤的方法,其包括给予需要进行该类 治疗的患者治疗有效量的可以阻滞连接蛋白半通道开放的化合物。

太阳城集团还提供了一种治疗血栓形成的方法。在一个实施方案中,该方法包 括给予需要进行该类治疗的患者治疗有效量的可以阻滞连接蛋白半通 道开放的化合物。

在另一方面,本发明还提供了一种治疗呼吸性和代谢性酸中毒的 方法。在一个实施方案中,该方法包括给予需要进行该类治疗的患者治 疗有效量的可以阻滞连接蛋白半通道开放的化合物。

本发明还提供了一种治疗病灶性心律不齐的方法。在该方法的一 个实例中,其包括给予需要进行该类治疗的患者治疗有效量的可以阻 滞连接蛋白半通道开放的化合物。

本发明还提供了一种治疗或预防由血液葡萄糖水平升高所导致的 细胞和组织损害的方法。在一个实施方案中,该方法包括给予需要进行 该类治疗的患者治疗有效量的可以阻滞连接蛋白半通道开放的化合 物。

本发明还提供了一种治疗慢性心房纤维性颤动的方法。在一个实 施方案中,该方法包括给予需要进行该类治疗的患者治疗有效量的可 以阻滞连接蛋白半通道开放的化合物。

还提供了一种治疗癫痫的方法。该方法通常包括给予需要进行该 类治疗的患者治疗有效量的可以促进连接蛋白半通道开放的化合物。

还提供了一种对需要进行该类治疗的哺乳动物的组织或器官进行 细胞保护的方法,该方法包括给予治疗有效量的至少一种选自式I或 II所示化合物的化合物。

本发明还提供了一种预防或治疗哺乳动物再灌注性损伤的方法, 该方法包括给予治疗有效量的至少一种选自式I或II所示化合物的化 合物。

在上述各治疗方法中,本发明化合物的特征为通过标准体外小鼠 心律不齐测定进行测定时具有良好的抗心律不齐活性(即至少2分)。 该类化合物在这里有时被称为“抗心律失常”化合物或相关短语。

太阳城集团本发明另外的应用和优点将随着下面的讨论和实例而变得显而易 见。在下面还对本发明的其它方面进行了讨论。

附图说明

太阳城集团图1是表示连接蛋白(Cx43)上的磷酸化作用部位的图(Hossain M Z 等人(Science’s stke 2000;第1-5页))。正如可以看到的那样,Cx43跨膜 蛋白的胞质结构域具有一些潜在的丝氨酸和酪氨酸磷酸化作用部位。

太阳城集团图2是表示由除去葡萄糖所诱导的代谢应激的图。正如可以从图 中看出来的那样,化合物1的给药降低了应激,这可由相对传导延迟 的降低来证明。

太阳城集团图3A-B表示表明在连接蛋白43(Cx43)中检测酪氨酸磷酸化作用 的免疫印迹。图3A表示了给予化合物1所获得的结果。图3B表示了 给予化合物1和化合物2所获得的结果。

图4A-B表示表明检测Cx43酪氨酸磷酸化作用(8A)和丝氨酸磷酸 化作用(8B)的免疫印迹。

太阳城集团图5是表示10nM化合物1对所培养的心肌细胞中局部缺血-诱 导的钙黄绿素摄取的影响的图。

太阳城集团图6A是表示优选的ELISA测定形式的图。图6B是表示在HeLa 细胞中在Tyr-P上的磷酸化Cx43的ELISA结果的图。图6C是说明 在CHO细胞中在Tyr-P上磷酸化Cx43的ELISA结果的图。

图7A-C是表示所培养的心肌细胞中的染料摄取的显微照片。图 7A:光学显微镜下的心肌细胞;图7B:对照条件下(与图7A中的细胞相 同)的荧光;图7C代谢抑制30分钟后的荧光。

图8是表示化合物1以剂量依赖方式降低了应激诱导的钙黄绿素 摄取的图。

太阳城集团图9A-B是表示化合物1对应激诱导的细胞膨胀的作用的图。图 9A在存在或不存在化合物1(0.1nM)情况下代谢抑制期间的相对体 积。图9B表示对照数据。

图10是表示化合物1(0.1nM)对应激诱导的细胞膨胀的作用的图。

太阳城集团图11是表示在给予患有心肌梗死的大鼠化合物1后心脏重量与体 重比例降低的图。

太阳城集团图12是表示给予化合物1后大鼠梗死大小降低的图。

太阳城集团图13是表示给予患有心肌梗死的大鼠化合物1后心肌功能得到改 善的图。

本发明的详细描述

太阳城集团正如所讨论的那样,本发明提供了一些化合物和用其来对半通道 功能进行调节的方法。更特定的化合物可以调节半通道磷酸化作用以 帮助打开或关闭半通道。还提供了用于对该类化合物进行检测和定性 描述的有用筛选,该筛选包括体外测定、体内测定、或其组合。还提 供了用于治疗或预防受不适当的半通道功能影响的情况的治疗方法。

本发明的目的是第一次证明通过关闭和打开半通道可以对细胞、 组织和器官应激产生相反的影响。不希望受到理论束缚,其认为代谢 应激,如局部缺血期间缺氧、缺葡萄糖、由HCN所造成的氧化磷酸化 作用的解偶联、或枸橼酸循环的解偶联可能有助于细胞间间隙连接通 讯(GJIC)的解偶联。还认为这种解偶联与连接蛋白磷酸化作用的调节 有关,更特定地是与间隙连接中连接蛋白-酪氨酸残基和/或连接蛋白- 丝氨酸残基和/或苏氨酸残基的脱磷酸化作用有关。作为解释,其认为 在心房纤维性颤动期间,由于高频率的速度,心房细胞代谢需求增加。 认为这会导致乳酸盐酸中毒,从而开放半通道和使间隙连接解偶联。

本发明的目的还在于要提供对半通道功能并且任选地对间隙连接 细胞间通讯(GJIC)进行调节的方法,该方法包括使细胞、组织和器官 与治疗有效量的一种或多种具有该类活性的化合物进行接触。B. Larsen等人在PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和 PCT/US02/05773(WO02/077017)中已经公开了优选的化合物。

适用于本发明的更有选的化合物包括下面式I所示的那些化合物 及其盐:

其中

R1表示H或乙酰基(Ac)

太阳城集团R2表示氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F中的一种的侧链,

太阳城集团R3表示任何氨基酸侧链

R4表示氨基酸氨基酸G、Y、D-Y、F和D-F中的一种的侧链,

R5表示OH或NH2

和a、S、T、P和Q是整数并且分别=0或1。

太阳城集团更特定的化合物包括那些具有下面式II的化合物及其盐:

R1-X1-X2-X3-R2

II

其中,

X1是0、Ala、Gly、β-Ala、Tyr、D-Tyr、Asp,

X2是0;Ala-Gly-T4c-Pro;Ala-Sar-Hyp-Pro;;Ala-Asn; D-Asn-D-Ala;D-Asn;;Gly,Ala;D-Ala;β-Ala;;Asn;或;

太阳城集团X3是Tyr;D-Tyr;Gly,,或Phe;和

太阳城集团R1是H或Ac,前提是x1和x2不能都是0。

R2是OH或NH2

太阳城集团上面式I或II所示的更特定的化合物包括下面的化合物及其盐:

太阳城集团G-(DBF)-Y-NH2,,H-GA-Sar-Hyp-PY-NH2,H-GAG-T4c-PY-NH2, Gly-Ala-Asn-Tyr,D-Tyr-D-Asn-D-Ala-Gly,D-Tyr-D-Asn-Gly,,,Gly-Gly- Tyr,Gly-Ala-Tyr,D-Tyr-D-Ala-Gly,Gly-D-Asn-Tyr,Gly-βAla-Tyr,βAla- βAla-Tyr,,Gly-βAla-Phe,Gly-Asn-Phe,,Asn-Tyr,Ac-Gly-Tyr,Ac-Ala-Tyr ,(被还原的Gly)-Gly-Tyr(H2N-CH2-CH2-NH-CH2-C(O)-Tyr),

太阳城集团本发明另外优选的候选化合物的特征为通过可接受的口服生物利 用度测定进行测定时其口服生物利用度高于约5%。优选的测定一般 包括将候选化合物十二指肠内给药于适宜的试验个体。然后优选地对 该化合物在生物学样品,优选血液样品中的利用度进行检测并优选地 对其进行定量。

进一步优选的候选化合物一般满足Lipinski′s规则5。在应用时, 其对生物利用度进行了规定。根据该规则,当一种特别优选的化合物 具有一种或多种下面的特征时其更可能具有较不令人满意的吸收:1) 多于5个H-键供体(被表示为OH′s和NH′s的和),2)分子量高于 500,3)Log P高于5,4)多于10个H-键受体(被表示为N′s和O′s的和), 和5。对于许多本发明的实施方案而言应避免两个参数在该范围之外。

本发明更优选的化合物在血浆中相对稳定。可接受的测定包括使 所需的候选化合物与血浆(例如啮齿动物、兔子或灵长类动物血清)进 行接触,用血浆对该化合物进行培养,然后在一段太阳城集团内对该化合物进 行检测并优选地对其稳定性进行定量。优选的血浆来源是大鼠、狗、 猫、小鼠、猪、牛、马、和人。在PCT申请PCT/US02/05773(WO 02/077017)中已经公开了优选的测定,其在这里有时被称为“标准的血 浆稳定性测定”。在测定中给出了良好活性的典型化合物的特征为C- 末端酰胺化或酯化、使用D-氨基酸以及天然氨基酸的衍生物、N-末端 修饰、以及环状结构。该类改变中的一种或其组合可以增加稳定性而 同时仍基本保留其生物学活性。

太阳城集团本发明使用的尤其优选的半通道调节化合物包 括:Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1);Ac-Gly- Asn-Tyr-NH2(化合物2);以及它们的盐。

优选的半通道调节化合物在这里所公开的标准体外和体内测定的 一种或组合中表现出显著的活性。该类化合物还具有关闭或打开半通 道的能力,并任选地具有调节GJIC的能力。优选地,在用标准的体 外连接蛋白磷酸化作用测定进行测定时,适宜的化合物增加或降低了 连接蛋白43(Cx43)的磷酸化作用。更特定的测定对图1所示的酪氨酸、 丝氨酸和苏氨酸氨基酸残基中一种或多种的磷酸化作用和/或脱磷酸 化作用进行了监测。一种更特定的测定如下。

1)将约105个细胞的群体在培养基中进行培养如融合或半融合 的大鼠心肌细胞或H9c2细胞,

2)通过对其进行洗涤对细胞施加应激并随后将其在缺乏葡萄糖 的培养基中培养约1小时或更短的太阳城集团,

3)在约10分钟至8小时内将化合物1加入到培养基中至约0.1 至约200nM的浓度,

太阳城集团4)将细胞溶解,然后对Cx43酪氨酸、丝氨酸、和/或苏氨酸磷 酸化作用相对于适宜对照而言的改变进行检测;和

5)测量作为调节半通道功能化合物的标识的磷酸化作用的改 变。

在该方法的一个实施方案中,检测步骤4)还包括用免疫学或基于 细胞分选的测定对候选化合物进行试验。在使用免疫学测定的情况中, 该测定一般包括将细胞与候选化合物在足以增加或降低连接蛋白的磷 酸化作用的情况下进行接触。优选地,该方法进一步包括产生细胞的 溶胞产物;并检测细胞溶胞产物中连接蛋白磷酸化作用的增加或降低。 将该增加或降低看成是该半通道调节化合物的另一个标识。

太阳城集团已经对用于该方法的优选的免疫学测定进行了描述,并且包括免 疫沉淀法测定、抗体捕捉测定、双-抗体夹层测定、抗原捕捉测定、放 射免疫测定(RIAs)等等。一般可参见E.Harlow和D.Lane, Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988);Ausubel等人(1989),Current Protocols in Molecular Biology,J.Wiley & Sons,New York,其涉及许多标准的免 疫方法讨论,其公开内容在这里引入作为参考。

太阳城集团优选的免疫学测定是ELISA测定。因此,在一个实施方案中,上 述方法还包括下面步骤中的至少一步,优选地包括下面步骤的全部:

a)用与连接蛋白,优选地为连接蛋白43(Cx43)特异性结合的第 一抗体对固体支撑物进行涂布,

太阳城集团b)使细胞溶胞产物与该固体支撑物在足以在第一抗体和连接 蛋白之间形成结合复合体的条件下进行接触,

太阳城集团c)使该第一抗体:连接蛋白结合复合体与第二抗体进行接触, 该接触是在足以在第二抗体和第一抗体:连接蛋白结合复合体中的任 何被磷酸化的连接蛋白之间形成特定的结合复合体的情况下进行的,

d)将该第一抗体:连接蛋白:第二抗体结合复合体与进行了可检 测标记的可以与第二抗体结合的第三抗体进行接触;和

太阳城集团e)检测作为该化合物的另一个标识的该固体支撑物上所存在 的进行了可检测标记的第三抗体。

在该方法的一个实施方案中,用生物素、FITC、TRITC、放射性 碘或过氧化物酶中的至少一种对该方法的第三抗体进行可检测性标 记。在另一个实施方案,该第二抗体是抗-磷酸酪氨酸抗体。在另一个 实施方案中,该第二抗体是抗-磷酸丝氨酸抗体。在一些情况中,该进 行了可检测标记的第三抗体的检测是通过放射性-或γ闪烁计数来进 行的。

在另一个实施方案中,被用作检测步骤的免疫学方法是放射免疫 测定(RIA)。优选地,该类RIA包括下面步骤中的至少一步并优选地 包括下面的全部步骤:

太阳城集团a)在产生细胞溶胞产物之前对细胞进行可检测的标记,其中所 说的标记是在有助于对磷酸化连接蛋白,优选地为连接蛋白43(Cx43) 进行标记的条件下进行的,

太阳城集团b)使该细胞溶解产物与可以与该连接蛋白形成特定的结合复合 体的抗体进行接触,

c)将该结合复合体与该进行了可检测标记的细胞溶胞产物分开; 和

d)对作为该间隙连接调节化合物的另一个标识的进行了标记和 磷酸化的连接蛋白进行检测。

在该方法的一个实施方案中,该抗体是抗-连接蛋白抗体。在另一 个实施方案中,该检测步骤还包括进行蛋白免疫印迹测定。该RIA方 法可以与许多可检测的标记相容,但是对于许多应用而言,优选地使 用放射性无机磷。

包括抗-磷酸酪氨酸、抗-磷酸丝氨酸、和抗-Cx43抗体在内的用于 上述本发明方法的抗体可以通过各种来源通过商业途径获得,例如可 以得自the American Type Culture Collection(ATCC);Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;Zymed Lab,Inc.,of California;和 Amersham Biosciences,U.K.。

用上面标准的体外试验所确定的优选的半通道调节化合物表现出 良好的调节Cx43磷酸化作用的能力,特别是对图1所示的酪氨酸、 丝氨酸和苏氨酸残基中的一个或多个上的磷酸化进行调节的能力。更 优选的该类化合物在该类磷酸化作用(以Cx43上磷酸酪氨酸、磷酸 丝氨酸、和/或磷酸苏氨酸中的一种或多种的出现的降低的增加来进行 测量)上相对于应激的细胞而言表现出至少5%的改变,优选地表现出 至少约10%,更优选至少约50%的改变,其中化合物的存在浓度为约 0.1nM至约200nM。

太阳城集团见下面的实施例2-5,其是标准体外连接蛋白磷酸化测定的特定 实例。

正如所讨论的这样,本发明的特征还在于可用于对半通道调节化 合物进行检测并任选地对其进行定性的标准的体外摄取测定。该测定 可以被单独使用或者可以与标准的体外连接蛋白磷酸化作用测定联合 应用。该标准体外摄取测定特定实施方案的描述如下。

1)将约105个融合大鼠心室肌细胞在培养基中进行培养,

太阳城集团2)通过将该培养基用缺乏葡萄糖的培养基进行替换培养约2小 时以下,优选约30分钟来对该细胞施加应激,

3)向该培养基中加入化合物1至约0.01pM至100nM的浓度,

太阳城集团4)向该培养基中加入钙黄绿素染料至约10至约500微摩尔的浓 度,小于约2小时并且优选地为约30分钟,

5)对进入细胞的钙黄绿素的摄取变化进行检测;和

太阳城集团6)对该作为调节半通道功能化合物的标识的改变进行测量

可以用一种或多种标准方法来进行检测钙黄绿素摄取改变的步 骤,所说的方法包括荧光光学显微镜和/或相关的细胞分选方法。见实 施例6,一种标准体外摄取测定的特定实例。

用上述标准的体外摄取测定所检测到的优选化合物在存在约0.01 pM至100nM试验化合物的情况下相对于应激状态的细胞而言,在染 料摄取(关闭细胞半通道)方面表现出至少约5%的降低,优选至少约20 %的降低并且更优选至少约50%的降低。

正如所讨论的那样,本发明还提供了体外细胞体积测定,该测定 可以单独进行或者可以与该标准体外连接蛋白磷酸化作用和标准体外 摄取测定中的一种联用或者可以与二者同时联用。该标准的体外细胞 体积测定的一个特定实施方案如下。

1)将约105个融合大鼠心室肌细胞群体在培养基中进行培养,

2)在小于约2小时并且优选约15分钟内以约0.5至约100微摩 尔,优选约5微摩尔的量给细胞加载钙黄绿素-AM

太阳城集团3)通过对得自钙黄绿素-AM的信号进行检测并优选地对其进 行定量来对细胞体积进行估计,

4)将化合物1加入到培养基中至约0.01nM至约100nM的浓度,

太阳城集团5)通过在缺乏葡萄糖的培养基中进行培养来对细胞施加应激,

6)对相对于适宜对照而言的细胞体积改变进行检测;和

7)对该作为调节半通道功能化合物的标识改变进行测量。

对细胞体积的变化进行检测的步骤可以通过一种或多种标准方法 来进行,包括激光同焦点显微镜检查和/或相关的细胞分选方法。实施 例7提供了该标准的体外细胞体积测定的一个特定实例。

太阳城集团在存在约0.01nM至100nM试验化合物的情况下,由上述标准 体外细胞体积测定所检测出的优选化合物将在细胞体积中相对于应激 细胞而言表现出至少约5%的降低(关闭半通道),优选至少约20%的 降低并且最优选至少约50%的降低。按照本测定所选择的化合物可抑 制渗压剂通过半通道流动并在产生细胞膨胀的情况下帮助维持正常的 细胞体积。重要的是,细胞膨胀与被纤维性囊所围绕着的器官(例如心、 肾、骨骼肌)或被骨所围绕着的器官(脑、脊髓)中灌注受损有关,从而, 具有半通道阻滞性质的化合物可用于治疗与细胞膨胀有关的疾病。

适宜的对照实验一般与使用的特定测定形式相适应。例如,大多数 对照试验包括将试验样品(例如所培养的大鼠心肌细胞群体)用非应激 性条件进行处理例如在培养基中进行培养。一般平行或单独地向该测 定中加入水、缓冲剂、磷酸盐缓冲的盐水等等来代替向其中加入试验 化合物(试验化合物)。然后根据本发明的方法进行所需的测定。在实 施例部分提供了适宜对照的特定实例。

本发明的实践可以与许多常规检查测定相容。可以根据需要用手 动、半手动或以自动方式来进行该类测定。对于需要进行迅速或大规 模筛选策略的应用而言,本发明还可以与标准的“高-处理量”和/或“超 高处理量”筛选方法相容。该类方法的实例包括免疫学和细胞分选型测 定如这里所描述的那些测定。

正如所讨论的这样,本发明可以与许多试验策略相容。因此,在 一些实施方案中,可以对候选化合物进行另外的体内试验,优选地对 该半通道改变活性进行确证。例如,可以用这里所述标准体外方法中 的一种或其组合来对标准体内心律不齐模型中半通道调节活性的化合 物进行进一步试验。B.Larsen等人在PCT/DK01/00127(WO01/62775) 和PCT/US02/05773(WO02/077017)中公开了标准的体内小鼠心律不 齐测定,在下面以参考实施例1的形式对其进行了描述。

太阳城集团用一种或多种本发明的方法所确定的候选化合物具有各种重要的 应用,包括用作用于确定细胞、组织和器官中间隙连接并且特别是半 通道的探针。该类化合物可以用作检测各种进程和疾病状态中的间隙 连接和半通道的探针并且可以用作检测具有不同碳水化合物装饰和/ 或磷酸化作用模式的那些结构的探针。发现该类化合物可用作用于根 据标准色谱操作对间隙连接组分进行纯化的固体支撑组分。

通过这里所描述体外和/或体内试验所选择的化合物可以用作预 防或治疗受半通道开放增加(细胞膜对细胞外隔室的渗透性增加)影响 的情况的药物,所说的情况例如,创伤如烧伤、血栓形成、呼吸性和代 谢性酸中毒、组织肿胀例如,由于细菌毒素或环境毒素所导致的组织肿 胀、和病灶性心律不齐。可以用本发明的其它药物来保护细胞不发生 破坏性体积改变。包括过热、局部缺血、毒素、炎症、水肿、电解质 失调、葡萄糖水平增加、和糖尿病晚期并发症在内的因素中的一种或 多种可以加速该类改变。还考虑治疗与丝氨酸磷酸化作用增加有关的 慢性心房纤维性颤动。可以用另外的化合物作为用于预防、治疗、缓 解或降低下面情况的严重程度的药物。还可以参见 PCT/DK01/00127(WO 01/62775)和PCT/US02/05773(WO 02/077017) 申请。

太阳城集团本发明的治疗方法一般包括给予需要进行该类治疗的个体如哺乳 动物并且特别是灵长类动物如人治疗有效量的这里所公开的半通道调 节化合物中的一种或其组合。本发明的治疗方法还包括给予需要进行 对这里所公开的适应症进行该类治疗的个体,特别是哺乳动物如人有 效量的上面所定义的式I或II的化合物。

典型的个体包括患有一种或多种这里在下面部分A-R中所描述的 病症的哺乳动物。

A.神经组织

太阳城集团公所周知的是,小神经胶质细胞是中枢神经系统(CNS)中主要的 免疫效应器,其被许多触发脑炎症响应的损伤所激活,所说的损伤包括 头部损伤和局部缺血、神经变性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、 朊病毒病、和脑肿瘤。活化的小神经胶质细胞会移动至CNS区域,在 该区域中其发生增生并且逐渐除去细胞碎片。Eugenin等人表明小神 经胶质细胞可以彼此通过被炎性细胞因子所诱导的间隙连接来进行交 流(Eugenin,E A,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第98 卷,4190-4195,2001)。这一点在下面的试验中得到了证明。在脑戳伤中, 小神经胶质细胞在几天中逐渐积聚并形成在细胞间接触面上常常表现 出Cx43免疫反应性的聚集体。在原代培养中,小神经胶质细胞表现出 蛋白质印迹测定所测定的低水平的Cx43、弥散的细胞内Cx43免疫反 应性、和低发生率的染料偶合。在用免疫促进剂细菌脂多糖(LPS)或细 胞因子干扰素-γ(INF-γ)或肿瘤坏死因子-α(TNF-α)进行一次治疗时并 不会增加染料偶合的发生率。但是,用INF-γ加LPS进行处理的小神 经胶质细胞表现出被抗-TNF-α抗体的共同应用所阻止的染料偶合的 显著增加,其表明TNF-α的释放和自分泌作用。用INF-γ加TNF-α进 行的治疗也可以大大增加染料偶合的发生率和具有细胞-细胞接触易 位的Cx43的Cx43水平。18-甘草次酸——一种间隙连接阻滞剂可以 可逆性抑制细胞因子-诱导的染料偶合。所培养的小鼠小神经胶质细胞 也表达Cx43并且在用细胞因子进行处理时也形成染料偶合,但是得 自纯合的Cx43缺陷小鼠的小神经胶质细胞在用INF-γ加LPS或INF-γ 加TNF-α进行处理后并没有形成显著的染料偶合。

太阳城集团间隙连接蛋白、连接蛋白的强迫表达确保了间隙连接-缺陷的细胞 系可以传播细胞间的钙波。Cotrina等人证明连接蛋白表达可以将由 偶合差的细胞系,C6神经胶质瘤、HeLa、和U373成胶质细胞瘤分 泌的ATP增加5-至15倍。这些观察表明与连接蛋白表达有关的细胞- 至-细胞信号是由通过连接蛋白半通道所介导的增强的ATP释放所产 生的(Cotrina ML等人,ProcNatl Acad Sci USA 1998 Dec 22; 95(26):15735-40;Cotrina等人,:JNeurosci 2000 Apr 15; 20(8):2835-44)。此外,在具有代谢应激(例如,局部缺血)的情况中, 得自星形胶质细胞的半通道-介导的ATP释放的情况可能会影响毗邻 神经原并引起细胞内钙升高,其又可能导致编程性细胞死亡和神经原 死亡。

太阳城集团例如,由于化合物1和化合物2对Cx43酪氨酸的磷酸化作用,给 予这些化合物将有助于半通道关闭并促进小神经胶质细胞的细胞间通 讯,从而增加或加速了上述疾病(脑炎性反应,包括脑损伤和局部缺血、 神经变性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、朊病毒病、和脑肿瘤) 中的“愈合”过程。此外,其期望半通道的关闭将阻止ATP释放并从而 降低了原发性损伤的扩张。

太阳城集团B.肺组织:肺泡细胞

通过肺泡细胞间的间隙连接进行的肺泡的细胞间通讯对于离子迁 移的传播、机械化学信号转导、细胞生长的调节和表面因子的分泌而 言都是很重要的(Ashino Y,等人,(AmJPhysiol Lung Mol Physiol 2000; 279:L5-L13))。在肺的肺泡区域的急性和慢性炎性损害后的体内修复 包括作为细胞外基质的一部分的纤连蛋白的形成(Charash WE,等人 (Am RevRespir Dis 1993;148:467-476)和Torikata C,等人(Lab Invest 1985;52:399-408))。肺泡上皮细胞培养研究已经证明间隙连接数目的 增加与细胞外纤连蛋白浓度的增加平行(Alford AI,Rannels DE.(Am.J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001;280;L680-L688))。体内动物研究 已经发现在二氧化氮在肺泡组织、终末细支气管壁、肺泡小管和细支 气管周小泡中都诱发了严重的肺炎后,间隙连接数目降低。这些结果 是剂量依赖性的。但是,如果用牛磺酸进行预处理,则与产生炎性反 应显著降低相平行地防止了这种间隙连接的损失。在对大鼠的肺进行 放疗和用化疗化合物博莱霉素进行治疗后,看到了相似的结果。

因此,在肺组织中维持间隙连接通讯对于防止肺纤维化而言是很 重要的,并且作为对炎性进程、各种毒性刺激物如气体吸入、气管阻 塞物和放疗的反应,看到连接蛋白数量降低。在肺出现例如肺癌、乳 癌治疗、甲状腺和食管癌的情况中,在进行治疗性放疗之前,表明可 以用可以磷酸化Cx43酪氨酸残基并可以促进半通道关闭和/或间隙连 接开放或间隙连接通讯的本发明的化合物进行预处理。

太阳城集团用可以促进或介导半通道关闭和/或间隙连接开放的化合物进行 治疗将进一步防止肺气肿、石棉肺、矽肺、肺纤维化、肺炎、药物诱 导的肺纤维化中和与肺毒性气体如二氧化氮接触的患者中的肺功能衰 退。优选地在这些情况的常规治疗中加入该治疗。这些化合物可以被 口服给药、胃肠外给药、鼻给药、或通过肺吸入来进行给药。

C.平滑肌

1.血管系统

通过间隙连接通道进行的细胞间通讯在整个血管树血管肌细胞紧 张度调节和调控中起着基础性的作用(Christ GJ等人,Circ Res. 1996;79:631-646)。间隙连接通讯另一种重要的作用是在血管松弛反应 中所涉及的平滑肌细胞中的超极化的传播(Benny JL等人,Physiol Heart Circ Physiol 1994;266:H1465-72))。

内皮的特定功能需要单层中的内皮细胞间和内皮以及存在于血管 壁中的其它细胞间的间隙连接细胞间通讯。在一些研究中已经证明了 在冠状毛细管以及所有其它血管中通过间隙连接进行的这些不同细胞 类型之间的通讯。还已经证明在在适应动脉形成中涉及的迹象(Cai W-J等人,J Mol Cell Cardiol 2001;33:957-67),Wang H-Z等人,Am J Physiol Cell Physiol.2001;281:C75-88),Schuster A等人,Am J Physiol Heart Circ Physiol.2001;280:H1088-96))。

在其中当在饮食诱导的高胆固醇血症(hypercholestrolemic)损害 中内皮单层被破裂的不同血管病理生理学(patophysiological)情况中, 血管平滑肌中的间隙连接交流被降低(Polacek D等人.J Vasc Res 1997;34:19-30)。在静脉停滞过程中和当形成血栓性静脉炎时在内皮细 胞层上看到了损伤。Kwak BR等人,Molec Biol Cell 2001;12:831-845 已经清楚地证明了间隙连接通讯可协调内皮修复期间的细胞移行并且 对于血管形成期间的毛细管萌芽而言也很重要。

太阳城集团用本发明可以促进半通道关闭和/或间隙连接通讯的化合物进行 的治疗将改善受影响的血管区域中受损的细胞间通讯并且在器官局部 缺血,例如claudicatio intermittns和心肌梗死中特别有用。

但是,在大鼠颈动脉中囊(baloon)导管损伤后,血管愈合过程的 特征为间隙连接通讯增加。(Yeh HI等人Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-84)。将在囊干预前给予本发明适宜的化合物并且其 优选地是这种情况常规医学治疗的附加治疗。该化合物的给药优选地 是胃肠外给药。可以在囊导管损伤前、损伤后的不同太阳城集团在组织样品 中对其作用进行试验。用常规的显微镜检查可以看到内皮表面愈合加 速。还将发现间隙连接通讯得到了改善。还可参见Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17:3174-84)。

2.勃起机能障碍

在海绵体中,通过间隙连接建立了合胞体的细胞网,该细胞网对 于勃起功能而言很关键并且可以确保阴茎的体和动脉平滑肌细胞可以 以均一和协调的方式做出响应。(Christ GJ.(Int JImpot Res.2000;12 增刊4:S15-25),Melman A,ChristJC.(Urolog ClinNorthAmerica.2001; 28:217-31))。在糖尿病、动脉硬化、不同的神经病学疾病和许多慢性 疾病中可以看到勃起功能失调。从糖尿病研究来看,虽然没有确立通 过间隙连接进行的功能细胞间的通讯,但是在神经支配和细胞间偶合 之间的反相相关指向了体环境的潜在的功能塑性。

太阳城集团用促进半通道关闭和/或间隙连接开放的化合物进行治疗将改善 通过间隙连接进行的通讯,从而使海绵体中平滑肌细胞和脉管之间的 复杂协调正常化。

太阳城集团可以如Rehman J,等人,(Am JPhysiol 1997;272:H1960-71)所述的 那样在用链脲霉素(35mg/kg i.p.)在大鼠(8周大)体内诱导糖尿病后进 行该化合物的勃起功能体内药理学试验。在不同剂量不同半通道调节 化合物的局部或全身给药过程中用由相同研究人员所描述的测量和技 术对阴茎反射和海绵体内的压力进行测量。可以看到阴茎反射和海绵 体内的压力增加25%或更多。

太阳城集团可以通过皮下注射形式的阴茎体局部给药或通过口服给药来对勃 起机能障碍进行治疗。该治疗可以是单一治疗或可以是这种情况常规 治疗的附加治疗。

3.失禁

尿囊中的平滑肌的特征为阶段性收缩并表现出自发性的阶段性收 缩。但是,健康情况下的膀胱能包含数百毫升的尿而不表现出膀胱内 压力的增加。与正常的膀胱相反,在尿失禁中所涉及不稳定的膀胱形 成膀胱内压力自发性增加(TurnerWH,Brading AE.(Pharmacol Therap.1997;75:77-110)。与胃肠道平滑肌相比,膀胱平滑肌不会自 动产生协调性收缩(Stevens RJ,等人,(Am JPhysiol.199;2777:C448-60), Hashitani H,等人(JPhysiol.2001;530:273-86))。已经证明膀胱平滑肌 细胞之间通过间隙连接进行电和形态学交流(Hashitani H等人(J Physiol.2001;530:273-86),Wang H-Z等人(Urology.2001;增刊 6A:111))。通过特定的通讯抑制试验已经证明了这些间隙连接的重要 性。膀胱平滑肌中自动激发的波通过间隙连接进行传播。

因此,可以通过用半通道关闭化合物或间隙连接开放剂进行治疗 来调节不受控制的急促失禁。可以胃肠外、口服给药或者可以给药于 尿囊内。该给药优选地作为用使尿囊内肌肉收缩正常化的药物进行治 疗的附加治疗。

太阳城集团因为存在于下颌下腺管、urether、胆管、胰腺管、泪小管中的肌 上皮细胞用间隙连接相连,所以细胞间通讯对于肌上皮细胞收缩功能 的同步而言是必需的(Taugner R,Schiller A.(Cell Tissue Res.1980;206:65-72)。可以通过用半通道关闭化合物或间隙连接开放 剂胃肠外或口服给药进行治疗来使这些管中失调的收缩性正常化。

D.治愈

可以用如Yeh HI等人(Arterioscle Thromb Vasc Biol 1997;17: 3174-84)所述那样建立的实验来对用半通道关闭剂或间隙连接开放 剂,如化合物1和化合物2进行的治疗的预防作用进行试验。可以在 囊干预之前给予化合物1或化合物2,其剂量范围为10-11至10-8的 范围,其将取决于化合物的生物动力学,例如在上面所述的氯化钙诱 导的心律不齐模型中所测定的动力学。可以在囊导管损伤前和损伤后 的不同太阳城集团点对组织进行取样。用常规显微镜检查可以发现内皮表面 愈合加快。该化合物可以被例如胃肠外给药。

太阳城集团愈合进行一系列从止血(血凝固)开始的重叠过程。愈合过程的第 二阶段是炎性反应的级联,在所说的炎性反应中小噬细胞在伤口旁边 积聚并且开始形成除其它组分外还包含成纤维细胞和淋巴细胞的肉芽 组织。然后上皮细胞开始从伤口边缘进行移动从而覆盖该创伤区域。 还涉及从正常组织向伤口中进行的毛细管喷涌以确保营养物、氧气和 不同细胞的供应。所有的细胞和毛细管内皮细胞都具有通过间隙连接 进行的活跃的细胞间通讯(AbdullahKM,等人(内分泌.1999; 10:35-41)。在具有坏死组织的伤口、糖尿病、动脉硬化、手术创伤、 水肿、感染、烧伤和静脉机能不全中常常看到的氧供应量低和/或自由 基浓度高的区域的间隙连接通讯降低(Nagy JI,等人Cell Growth Diff 1996;7:745-51))。

用半通道关闭化合物或间隙连接开放剂进行治疗将确保认为在复 杂的修复过程中起重要作用的不同细胞间的最大程度的间隙连接通 讯,从而改善了伤口修复。该化合物可以被局部给药、全身给药或口 服给药。

E.糖尿病视网膜病

通过确定血流速度的改变(Bursell S-V等人(Curr Eye Res.1992; 11:287-95)、血-视网膜屏障的破裂(Cunha-Vaz JG等人,(BrJ Ophthalmol 1975;59:649-56),Do Carmo A等人(Exp Eye Res.1998; 67:569-75))和/或自体调节的损失(Kohner EM,Patel V,Rassam SMB.(Diabetes 1995;44:603-607))可以在该疾病开始后十分早地对糖 尿病视网膜病进行诊断。通过同时使用示踪剂转运和双细胞膜片钳技 术,Oku H等人(Invest Ophthalmol Vis Sci.2001;42:1915-1920)已经 证明了广泛的细胞-至-细胞偶合。间隙连接途径的关闭干扰了视网膜 微管的多细胞结构并有助于产生糖尿病性视网膜血管机能障碍。Zhou ZY等人(Neuroscience.2001;102:959-67)进一步证明当供给 gluthation时在视网膜间隙连接的解偶联和复偶联中涉及活性氧。

太阳城集团可以用上面所描述的链脲霉素诱导的糖尿病大鼠模型对半通道关 闭剂对糖尿病视网膜病的作用进行体外研究。如Oku H,等人 (InvestOphthalmol Vis Sci.2001;42:1915-1920)所述的那样将新分离 出来的视网膜微管(Sakagami K等人J Physiol(Lond).1999; 521:637-50)转移到盖玻片上。在这种制剂中,用染料或示踪剂对血管 壁细胞之间的细胞间通讯进行测量。可以对本发明的化合物例如间隙 开放剂化合物1或2在10-10-10-7M的不同浓度范围内进行试验, 在糖尿病视网膜中将发现与基准相比,细胞间通讯显著增加。当与对 照(健康的动物)相比时可以看到相似的改善。可以通过全身、局部或 口服来进行治疗。该治疗优选地是常规抗糖尿病治疗的附加治疗。

不仅糖尿病视网膜病,而且视网膜中的其它血管异常例如动脉硬 化也可以从用有助于Cx酪氨酸磷酸化的化合物进行的治疗而产生的 半通道关闭增加或间隙连接通讯的改善而获益。化合物一般被胃肠外 给药。

F.心脏病症

太阳城集团1.心房-心室(AV)阻滞

太阳城集团心脏av结中的细胞间通讯是通过间隙连接被维持的。功能降低导 致传导降低,并且可导致整个a-v阻滞。

太阳城集团在急性心肌梗死、局部缺血性心脏病、洋地黄中毒、钙通道阻滞 剂中毒中可以看到AV阻滞,半通道关闭化合物能改善av传导。半通 道关闭化合物应被胃肠外或口服给药。

2.心房纤维性颤动

太阳城集团Nao等人2001已经发现患有慢性心房纤维性颤动(AF)的患者的 心肌细胞中连接蛋白40的丝氨酸磷酸化作用降低。已知连接蛋白的丝 氨酸磷酸化作用降低与可导致AF的细胞的解偶联有关。如果这种慢 性AF情况的特征还有连接蛋白的酪氨酸磷酸化作用降低,则用化合 物如这里的化合物1或2进行治疗可增加酪氨酸磷酸化作用、关闭半 通道、打开间隙连接通道并除去AF的原因。

太阳城集团3.局部缺血/再灌注性损伤

在局部缺血过程中,心脏出现代谢应激,其造成细胞膨胀,该细胞 膨胀又增加了组织压力并降低了局部缺血边界区域组织的灌注。认为 局部缺血边界区域的灌注降低有助于梗死的逐渐扩展,其与心脏功能 的进一步损害有关。如实施例7和8所示的那样,化合物1预防了局 部缺血过程中的细胞膨胀,降低了梗死的大小并防止了心肌 (mypocardial)梗死后心脏功能的损伤。

此外,通过给予溶栓剂或通过经皮的经腔冠状血管成形术 (PTCA),在心肌梗死患者体内再建了冠状灌注。虽然血流的恢复是心 肌获救的先决条件,但是再灌注本身也可以导致除由局部缺血单独产 生的组织损伤之外的另外的组织损伤——这被称为“再灌注性损伤”。 提出了许多再灌注性损伤的机理,包括氧自由基超载、嗜中性白细胞 介导的心肌损伤、细胞内钙超载、和渗透环境的改变(Wang等 人,Cardiovasc Res.2002 Jul;55(1):25-37.Review)。

公认体液的克分子渗透压浓度受到了严格控制,从而使得大多数 细胞在正常情况下不会经历渗透压的变化,但是,在病理学状态如局 部缺血、脓毒性休克、糖尿病性昏迷中渗透压可能会发生变化。克分 子渗透压浓度改变的主要影响是急剧改变细胞体积。如果细胞周围的 克分子渗透压浓度降低,则细胞膨胀,如果增加,则其萎缩。为了耐 受克分子渗透压浓度的变化,细胞形成了被渗透性激发所激活的体积 调节机理以将细胞体积正常化并维持正常功能。在心脏中,在当代谢 物如乳酸盐在细胞内积聚并在细胞外达到一定程度时出现渗透性应激 并且造成细胞膨胀。在再灌注时,当高渗的细胞外环境被正常渗透压 的血液替代时这种膨胀进一步加剧,其甚至能造成心脏细胞膜破裂 (Wright AR,Rees SA.:Pharmacol Ther.1998 Oct;80(1):89-121. Review)。因此,认为本发明所选择的化合物可以防止再灌注期间的心 肌损伤,例如可以通过与实施例7中所述的作用相似的机理来防止损 伤(图9A)。

此外,已经报道了在常用的PCTA方法中,动脉粥样硬化斑块破 裂,其在PTCA部位的远侧微循环中造成了微栓塞,其与心衰进程加快 和死亡率增加有关Henriques JP等人:.Eur Heart J 2002 Jul; 23(14):1112-7)。如实施例7和8所示的那样,化合物1防止了局部缺 血期间的细胞膨胀、降低了梗死大小并防止了心肌梗死后心脏功能的 损害,并且化合物的这些性质将降低再灌注期间的损伤。

因此,本发明提供了一种对需要该类治疗的哺乳动物的组织和器 官进行细胞保护的方法。在一个实施方案中,该方法包括给予治疗有效 量的至少一种选自式I或II所示化合物的化合物。短语“细胞保护”指 的是降低、预防和缓解与不希望的细胞膨胀有关的症状。将从该方法 获益的特定组织和器官包括狭窄的或者受纤维囊(fiborous capsule)影 响的这些组织和器官如心脏或肾。还包括与骨有关的组织如脑、脊髓 和骨髓。

太阳城集团在一个实施方案中,该方法还包括使哺乳动物的该组织或器官出 现局部缺血情况如这里所描述的那些情况。一个实例是其中局部缺血 与有害的心肌细胞膨胀有关的心梗(心脏病发作)。在一个实施方案中, 可以通过给予哺乳动物Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp- Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)和Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物2)中的 至少一种来降低或避免该类膨胀。

正如所讨论的那样,本发明还提供了预防或治疗再灌注性损伤的 方法。在一个实施方案中,该方法包括给予治疗有效量的至少一种选自 式I或II所示化合物的化合物。在更特定的实施方案中,该方法还包 括哺乳动物心脏出现梗死的情况。根据该方法,其希望尽可能快地建 立冠状动脉灌注。在一些实施方案中,该方法还包括给予出现梗死的心 脏溶栓剂(例如组织纤溶酶原活化剂(“TPA”))或进行冠状血管成形 术以帮助进行冠状动脉的灌注。在一个实施方案中,该化合物是 Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)和 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物2)中的至少一种。

太阳城集团G.免疫学:细胞成熟

太阳城集团细胞-至-细胞的相互作用对于淋巴细胞的成熟和活化而言是很重 要的。膜分子广泛的激动(rage)确保了细胞间的粘合并确保了免疫系 统中细胞迁移和活化过程中细胞-细胞的信号传输。循环的人T、B和 NK淋巴细胞表达Cx43并且已经用前面所述的染料法证明了这些细 胞之间的有效的间隙连接。还证明了细胞间间隙连接的偶联的降低显 著降低了IgM、IgG和IgA的分泌,其表明穿越间隙连接的细胞间的 信号传输是经历免疫系统中代谢协作机理的重要组成(Oviedo-Orta E, 等人(Immunology.2000;99:578-90),Oviedo-Orta E,等人(FASEB. 2001;15:768-774))。

太阳城集团在亚慢性或慢性炎症中,免疫球蛋白合成的局部增加令人希望地 独立于aethiology。在炎症中的组织常常与正常的健康组织不同并且 低的氧张力产生了细胞间间隙连接通讯的解偶联。在一些不同的细胞 系统中已经证明了低氧对于GJIC解偶联而言的重要性,其表明氧张 力是GJIC的普通调节剂。所说的解偶联是间隙连接通道中连接蛋白 的酪氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸磷酸化作用改变的结果,本发明化合 物如这里的化合物1或2的给药将抵消这种作用、关闭半通道并恢复 GJIC。

H.改善GJIC

主要有两种方法可以维持GJIC——保持间隙连接通道的开放或 促进半通道的对接。在特征为存在局部缺血情况的疾病状态的治疗或 预防中,优选或推荐同时使用这两种方法。

在新生大鼠心室心肌细胞的原代培养中,剥夺氧和葡萄糖可以将 去甲肾上腺素诱导的磷酸肌醇(IP)兴奋周转降低至正常大气压和营养 情况下的水平的约50%。已经表明该间隙连接改性剂化合物1可以通 过将PI周转升高至正常水平的约90%而将这种缺氧和葡萄糖期间受 损的去甲肾上腺素-诱导的PI周转正常化。此外,已经表明化合物1 不会改变正常大气压和营养情况过程中去甲肾上腺素-诱导的PI周转 水平(Meier,E和Beck,M M:2001 International Gap Junction Conference,Aug 4-9,2001,Hawaii,USA,文摘号132)。同样,在进行培 养的人成骨细胞培养物和成骨细胞的大鼠骨肉瘤细胞系中,在注射 Lucifer Yellow后用染料转移来进行测量时,发现低氧降低了细胞内的 钙波传播。可以通过用化合物1进行治疗来完全逆转这种降低 (Teilmann,S C,等人,:2001 International Gap Junction Conference, Aug 4-9,2001,Hawaii,USA,文摘号176)。

例如,由于炎症期间的细胞解偶联,可以关闭半通道和打开间隙 连接的化合物将可以改善炎症期间免疫球蛋白的合成。

I.外周神经病和神经病性疼痛

太阳城集团据报道,在糖尿病中、透析期间、肝硬化和许多其它情况中看到 的外周神经病和疼痛既涉及体干神经又涉及植物性神经。正在对各种 情况中的外周神经损伤的确切机理进行研究,但是已经对神经末端破 坏、传导降低、脱髓鞘作用和炎症反应增加进行了描述。对于所确定 试验中各种情况而言通常发现自由基增加、一氧化氮增加、氧气应激 和缺乏自由基清除剂并且记录了间隙连接通讯的降低(Pitre DA,等人 (Neurosci Lett.2001;303:67-71),Bolanos JP,Medina JM.(JNeurochem.1996;66:2019-9),Low PA,Nickander, KK.(Diabetes.1991;40:873-7),Levy D,等人(Neurosci Lett.1999; 260:207-9),Bruzzone R,Ressot C.JEur Neurosci.1997;9:1-6))。因此, 通过将半通道连接蛋白磷酸化来帮助关闭半通道的本发明的化合物在 外周神经病的治疗中是有益的。一般进行胃肠外给药。

J.听力不足

噪音诱导的听力丧失、已知与自由基的产生有关的老年性耳聋都 与得自耳蜗中的Corti’s器官的Hensen细胞和Deiters细胞间的间隙 连接偶合的抑制有关(TodtI,等人,(JMembran Biol.2001;181:107-114), Blasits S,等人,(Phlugers Arch.2000;440:710-12)Lagostena L,等 人,(JPhysiol.2001;531:693-707))。这些支撑耳蜗细胞间的间隙连接通 讯为感觉细胞提供了重要的内环境稳定并且从而为外毛细胞提供了正 常的神经活性(Johnstone BM,等人(JPhysiol 1989;408:77-92))。这种 通讯在氧化应激期间被破坏(Todt I等人(J Membrane Biol.2001;181:107-114)。当用可以增加连接蛋白半通道中酪氨酸残基 磷酸化作用(关闭半通道)并可以维持支撑细胞中间隙连接通讯的化合 物进行处理时将防止获得性或年龄依赖性听力丧失。本发明的适宜化 合物可以被胃肠外给药。

前庭器官暗细胞区域中的黑素细胞可以通过间隙连接大量进行通 讯,并且可以在内淋巴和外淋巴间的物质转运中起重要作用,并且对 于维持内耳中微环境的内环境稳定而言也很重要(Masuda M,等人 (Anat Rec.2001;262;137-146))。在特征为头晕和听力下降的各种临床 情况中涉及内淋巴水肿。间隙连接通讯能力降低在通过特定类型的运 输器调节一些最初分泌或排泄物质的跨膜转运中也很重要。

K.年龄依赖性贫血和骨髓移植

造血微环境的造血祖细胞和基质细胞之间是否存在功能性间隙连 接许多年来一直有争议,但是现在研究证明存在人间隙连接通讯 (Rosendaal M,等人,Tissue Cell.1991;23:457-470),Dürig J,等人(Brit JHaematol.2000;111:416-25))。还已经证明该通讯是双相有利的假说, 基质细胞不仅控制造血祖细胞的增生行为,而且还可以通过不成熟的 造血细胞来调节其功能状态(Gupta P,等人(Blood.1998; 91:3724-3733))。

随着年龄的增加,该造血组织的功能性降低并且在老年人中常常 看到贫血。在血液学恶性肿瘤中和用化疗剂进行治疗后也可以发现造 血组织能力降低。用得自供体的骨髓移植来防止各类血细胞减少。

太阳城集团使用用高剂量环磷酰胺进行了预处理的大鼠对有助于半通道关闭 和/或促进间隙连接通讯的本发明化合物的作用进行研究。在这些动物 中,骨髓停止产生成熟的造血细胞。在使用环磷酰胺后,与未进行预 处理的动物相比,使用剂量为约100μL 10-10M至约10-8M的化合物1, 在用连接蛋白酪氨酸磷酸化化合物1进行了预处理的动物中,不同时 间间隔的网状细胞数目显著更高。本发明的适宜化合物可被胃肠外给 药。

太阳城集团L.脑垂体和下丘脑机能减退

得自垂体前叶腺的激素在数分钟、小时、天和季节中表现出24 小时昼夜节律分泌。神经系统负责大多数昼夜节律的部分位于被称为 视交叉上核的丘脑下部中的结构对中。在这种中心中,这种生物学时 钟是各细胞固有的。但是,协调的电活性是通过间隙连接通讯被介导 到毗邻细胞中的。(Colwell CS.(JNeurobiol.2000;43:379-88))。因为垂 体前叶也缺乏直接神经分布,所以该腺体内间隙连接-介导的细胞-至- 细胞通讯对于可确保适宜的和定时的激素分泌所需的充分的细胞-至- 细胞协调和同步而言是必需的。(Vitale ML等人(Biol Reporo.2001;64:625-633))。Guerineau NC等人(J Biol Chem.1998;273:10389-95)推断自发活化的内分泌细胞是单一单元或 排列在分散在垂体前叶腺中的同步的间隙连接-偶合的集合中。自发兴 奋细胞之间的同步可以帮助形成基础分泌的模式。在下丘脑刺激激素 控制下,从垂体前叶腺中合成生长激素、催乳素、肾上腺皮质激素、 甲状腺激素、和促性腺激素。因此,在一种轴内的复杂的下丘脑-脑垂 体-内分泌腺的dysrhythm机理中的一种还涉及通过间隙连接降低通 讯。该疾病是尿崩症、hypogonadotrope hypogonadism、粘液性水肿、 肾上腺类皮质激素机能减退、和侏儒症。用本发明适宜化合物,优选 地为间隙连接开放剂进行治疗可以改善这些症状。

太阳城集团丘脑下部视交叉上核中的神经元也依赖于最佳的间隙连接通讯。 在上述轴中,在这种区域中具有作用模式的间隙连接开放剂也对患有 昼夜节律失调的患者有益(Shinohara K等人(Neusosci Lett.2000;286:107-10)).

太阳城集团M.肾血管高血压和肾毒性

肾和内皮的特异性间隙连接广泛分布于存在于肾中的包括肾小球 内系膜细胞毛细管和近肾小球(juxaglomerular)小动脉在内的肾小球、 小管和脉管系统中(Haefliger J-A,等人(KidneyInt.2001;60:190-201))。 在该项研究中,作者证明存在连接入球小动脉的肾素分泌细胞的间隙 连接。间隙连接的作用可能有助于血负荷信号如由血压增加所激发的 信号的检测和传播。在肾中,该类信号需要通过入球小动脉的内皮细 胞被转化成自分泌、旁分泌和内分泌刺激并被传递到肾素分泌细胞中。 因此,间隙连接通讯在形成相互连接的近肾小球装置中起着重要的作 用。间隙连接通道从开放到关闭的迅速转变进一步意味着易于对局部 改变发生响应,从而确保了使肾小球和小管功能以及肾素分泌与生理 学需要相匹配所需的连续反馈。特征为肾间隙连接通讯受损的疾病将 从用本发明化合物口服给药或胃肠外给药进行的治疗获益,所说的本 发明的化合物优选的是特定的间隙连接开放剂。

太阳城集团重金属可以使肾中毒并造成肾损伤。已经证明得自大鼠近小管的 原代细胞培养物中的有毒的金属镉(Fukumoto M,等人(Life Sciences. 2001;69:247-54))以及汞(Yoshida M,等人(Arch Toxicol.1998; 72:192-96))使间隙连接解偶联并且两组都表明肾机能障碍与细胞间通 讯下降有关。用连接蛋白酪氨酸磷酸化化合物对重金属中毒进行治疗 将降低组织损害并防止渐进性组织毁坏。

太阳城集团可以在得自小管细胞的细胞培养物中进行体外试验,并且当与重 金属相接触时对预防间隙连接解偶联的化合物(浓度为约10-10-10-7M 的化合物1或化合物2)进行了试验。用前面所述的Lucifer染料法对 间隙连接通讯进行了试验。

在用重金属进行长期处理前和处理后的不同太阳城集团点,在将重金属 全身给予实验动物(大鼠)后,用3H-胰岛素作为肾小球过滤速度的清除 标记,用14C-标记的四乙基铵作为肾血流的清除标记并用锂作为近小 管功能的标记来进行测量(Petersen JS,等人,J.Pharmacol.Esp.Ther. 1991,258:1-7)。当在处理后看到肾功能受损和肾功能参数(肾小球滤过 速度和血压)发生显著的改变时,开始用本发明的特定化合物如化合物 1进行长期治疗。适宜化合物被胃肠外给药。

在肾功能方面诱发了显著的非特异性慢性变化的非感染性炎症以 及不同微生物感染的特征还在于肾小球滤过速率降低、电解质和水的 排泄降低和血压变化。这些症状中的一些也可以用特异的连接蛋白酪 氨酸磷酸化化合物进行治疗,并且症状将降低。

N.牙齿的形成和改变

太阳城集团Murakami S和Muramatsu T(Anat Embryol.2001;203:367-374) 以前的研究确证了成牙质细胞间存在间隙连接通讯和细胞活性是通过 这些细胞间的桥梁来进行协调的(Iguchi Y,等人(Arch Oral Biol.1984; 29:489-497)),但是其最近的研究还证明了在牙齿形成早期(前牙质细 胞)以及这些年轻和老年的成牙质细胞中的成牙质细胞中存在间隙连 接通讯。成牙质细胞下的髓细胞也具有间隙连接。这些发现表明细胞 间的间隙连接通讯在牙齿形成期间和牙齿改型和有虫(wormed)期间 都很重要。

太阳城集团用本发明的连接蛋白磷酸化化合物如化合物2进行的治疗将可以 使牙齿受干扰的发育正常化,可以对所说化合物对成牙质细胞细胞间 通讯的作用进行体外试验,该测定基本可以与这里所述的成骨细胞测 定相提并论。治疗还可以促进牙齿的成型并且可以使牙齿更耐受龋。

O.干细胞

太阳城集团Lumelsky等人(2001)由小鼠胚胎干细胞产生了表达胰岛素和其它 胰腺内分泌激素的细胞。见Nadya Lumelsky等人,Differentiation of Embryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similar to Pancreatic Islets.Science,292,1389-1394,2001)。该细胞自身集合形成 在局部解剖学结构上与正常的胰岛相似的其中胰腺细胞类型与神经原 紧密相连的三维簇。葡萄糖通过与那些体内所用机理相似的机理触发 了胰岛素从这些细胞簇中的释放。当被注射到糖尿病小鼠体内时,产 生胰岛素的细胞经受了快速的血管形成并维持了成簇的岛状结构。

太阳城集团在临床背景中,这种以胚胎干细胞-为基础的系统将使得同时发生 分泌胰岛素和已知在调节胰岛素分泌到功能结构单位中起重要作用的 其它岛细胞类型的产生和装配。这些单位可以提供用于将胰岛素的产 生最优化的物质并可以对葡萄糖内环境稳定的良好控制进行分析。胚 胎干细胞对于这些研究而言是很理想的,这是因为可以用遗传工具来 确定胰岛形成和功能的分子基础。可能可以以细胞为基础来进行治疗 对于涉及人和非人胚胎干细胞和胚细胞的应用而言显然是有吸引力的 目标。还可以用成熟的组织作为功能性胰腺细胞的来源。这里所述的 分化系统可以提供用于治疗糖尿病的功能性胰岛的来源。这是表明可 以从体外胚胎干细胞产生一些内分泌胰腺的细胞类型的第一次报道。 虽然得自尸体的胰岛在移植后可以在肝中起作用,但是仍然有待解决 组织排斥和有效性的争论。显然,用于战胜这种争论和与糖尿病有关 的其它问题的争论的用胚胎干细胞作为制备免疫学可相容的用于移植 的组织的丰富来源的工程学越来越有前途。

肌梗死导致组织损失和心脏行为的损害。剩余的肌细胞不能重构 坏死的组织,并且梗死后的心脏随着太阳城集团的流逝而恶化。通过远离的 干细胞来对靶器官的损伤进行检测,干细胞迁移到损害部位并且进行 交替的干细胞分化;这些事件促进了结构和功能的修复。Orlic等人 (Nature 410,701-705(2001))提出用这种干细胞的高度可塑性来对是否 可以通过移植骨髓细胞来修复梗死小鼠中死亡的心肌进行试验。他们 通过以c-试剂盒表达为基础的荧光活化细胞分选把得自表现出绿荧光 蛋白升高的转基因小鼠的系-阴性(Lin-)骨髓细胞进行分类。在对冠状 动脉进行结扎不久,将Lin-α-kitPOS细胞注射到该梗死边界的收缩壁 中。在移植骨髓细胞后9天,其发现新形成的心肌占心室梗死部分的 68%。形成组织包含增生的肌细胞和血管结构。其研究表明局部传递 的骨髓细胞产生了新生的心肌、改善了冠状动脉疾病的结果。

为了对这些肌细胞的性质进行进一步定性,其对连接蛋白43的表 达进行了测定。这种蛋白对细胞间的连接和肌细胞间通过产生浆膜通 道而进行的电偶合负责;连接蛋白43出现在细胞质中和紧密排列的分 化细胞表面上。这些结果与所预期的心肌表型的功能型活性相一致。

太阳城集团因为功能性细胞是由胚胎干细胞产生的,并且因为在梗死心脏组 织中的这些细胞中的确表达了连接蛋白,所以认为其对于由胚胎干细 胞分化的其它细胞的情况而言也是如此。因为连接蛋白在这些组织(包 括胰腺β细胞和心肌细胞)的功能中起着重要的作用,所以增加连接蛋 白酪氨酸磷酸化作用和半通道关闭(最终还可增加间隙连接通讯)的 本发明的化合物如化合物1和化合物2将增加已经移植了干细胞的器 官中胚胎干细胞向功能性细胞的增生。

因此,本发明的目的是提供可以刺激移植器官如用于糖尿病治疗 的胰腺、用于心梗治疗的心脏、和用于帕金森氏病治疗的脑基底神经 节中的干细胞转变成功能性细胞的连接蛋白酪氨酸磷酸化化合物如化 合物1和化合物2。一般认为这些化合物将加速干细胞的分化,其可 以加速所有器官如心脏、脑、皮肤、骨、胰腺、肝、和其它内脏器官 的愈合过程。可以用Orlic等人,同上,所述的心肌梗死的一般试验 方案来进行实验,例如,在增生过程中将化合物1和化合物2重复进 行给药。认为这些实验表明通过化合物1和化合物2或加快再生过程 增加了连接蛋白43的表达。

P.癌

1.肿瘤进展

太阳城集团在肿瘤形成过程中,正常细胞与其毗邻细胞生理学相互作用的中 断和分化特征的丧失是肿瘤进行中常见的共同特性。认为间隙连接通 讯的变化是细胞肿瘤形成过程中最早的变化(Wolburg H,Rohlmann A. Int Rev Cytol.1995;157:315-73),Klaunig JE,Ruch RJ.1990; 135-46))。

Kyung-Sun Kang,等人(Cancer Letters 166(2001)147-153)已经表 明在TAP处理的大鼠肝上皮细胞中用GeO2进行培养前或共同培养时 取消了由TPA造成的GJIC的向下调节,表明可以恢复GJIC抑制的 物质可用于预防或抑制肿瘤的升级。Suzuki J,Na H-K,等人(Nutrition and Cancer,第36卷第1期第122-8页)已经表明食品添加剂λ-角叉菜 胶与得到良好证明的肿瘤促进剂佛波醇酯(TPA)相似地抑制了肝表皮 细胞中的GJIC,从而可以作为肿瘤促进剂在癌形成中起重要的作用。 因此,本发明的化合物可用于预防或治疗由肿瘤促进剂如TPA和λ- 角叉菜胶所造成的癌症。

2.药物灵敏度耐受性

间隙连接通讯增加改善了肿瘤中的微环境。见Chen等人,:Chem Biol Interact 1998年4月24;111-112:263-75

3.转移

太阳城集团细胞间的间隙连接通讯的损失与具有转移可能性的所有癌症中的 高转移可能性有关。(Saunders MM,等人,Cancer-Res.2001; 61:1765-1767),Nicolson GI,等人Proc.Natl Acad Sci USA.1988; 85:473-6))。通过用有助于维持肿瘤中间隙连接交流的连接蛋白酪氨酸 磷酸化化合物进行治疗来预防转移。该治疗是常规化疗的附加治疗。

太阳城集团认为将本发明化合物中的一种或其组合(例如化合物1或化合物 2)以治疗有效量进行给药可以预防或治疗癌症。

Q.各种细胞

间隙连接也在胃粘膜细胞的细胞间通讯、增生和分化中起着重要 作用。在诱导损伤后,间隙连接开放剂可刺激再生过程(Endo K,等人 (J Gastroenterol Hepatol.1995;10:589-94))。

半月板细胞的细胞结构部分依赖于间隙连接通讯。半月板的纤维 软骨部分以及腱的纤维软骨结构依赖于细胞间通讯。在损伤期间,间 隙连接开放剂将提高修复的速度。

R.癫痫症

希望用半通道开放剂来对特征为GJIC高度异常的疾病状态如癫 痫进行治疗,其优选地作为辅助治疗以使得可以摄取作为将间隙连接 通道解偶合的药物或小分子调节剂。

本发明的目的是要提供对这里所述的医学适应症或情况中的一种 或多种进行治疗或预防的方法。一般,但不是唯一地,该类方法包括 以足以治疗、预防或降低该适应症或情况的严重程度的量给予至少一 种上述化合物,优选地给予上述化合物中的一种。已经通过一种或多 种这里所述的体外和体内测定来对优选的化合物进行选择。特定的给 药策略对于本领域技术人员而言是显而易见的并且可以根据例如性 别、重量、一般健康、和被治疗或预防的特定适宜症或情况而变化。 正如所讨论的那样,这里所公开的化合物可以在本发明的方法中被用 作唯一的活性成分。或者,其可以被用作“附加”治疗,如其中表明将 该化合物与公认的治疗方法联用的那些治疗。本发明治疗或预防的优 选的适应症或情况一般与细胞间通讯受损或间隙连接功能受损有关。 已经在上面对本发明所涉及的更特定的适应症和情况进行了讨论。

太阳城集团本发明的治疗方法可以用一种或多种这里所公开的化合物作为唯 一的活性成分。优选地,使用该化合物中的一种。如果需要,预防性 使用该类化合物,即用于预防或降低特定适应症或情况的严重程度。 或者,可以将该化合物与公认的治疗方法联合使用。正如在一个用放 疗进行治疗的实施方案中所说明的那样,一般优选地该治疗方法是“附 加的”,即,与公认可以对该情况进行治疗的方法联用。可以根据需要 与该公认的治疗同时进行本发明的该类“附加”治疗方法或在不同的时 间进行该类“附加”治疗方法。已经对已经确立的用于各种疾病和医学 情况的治疗方法进行了描述。一般可参见,例如Harrison′s Principles of Internal Medicine(1991),第12版,McGraw-Hill,Inc.和The Pharmacological Basis of Therapeutics(1996)Goodman,Louis S.第9 版,Pergammon Press;该公开物在这里被引入作为参考。

太阳城集团治疗组合物中的一种或多种治疗化合物的浓度将随着许多因素而 变化,所说的因素包括被给药的半通道调节化合物的剂量、所使用组 合物的化学特性(例如,疏水性)和所需的给药方式和途径。一般而言, 可以在包含约0.1至10%w/v化合物的用于胃肠外给药的生理缓冲剂 水溶液提供一种或一种以上的半通道调节化合物。

可以意识到在给定治疗中所用的活性化合物的实际优选用量将根 据例如所用的特定化合物、所制备的特定组合物、给药的方式和个体 的特性例如个体的种属、性别、体重、一般健康和年龄而变化。本领 域技术人员可以用根据上述规则所进行的常规的剂量判定试验容易地 确定对于给定的给药方案而言最佳的给药比率。适宜的剂量范围包括 每天约1μg/kg体重至约100mg/kg体重(“治疗有效量”)。

太阳城集团本发明的治疗化合物可以以质子化和水溶性形式进行适宜的给 药,所说的形式例如可以是可药用的盐,一般是酸加成盐如无机酸加 成盐例如盐酸盐、硫酸盐、或磷酸盐或有机酸加成盐如醋酸盐、马来 酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、或枸橼酸盐的形式。本发明治疗化合 物的可药用的盐还包括金属盐,特别是碱金属盐如钠盐或钾盐;碱土金 属盐如镁或钙盐;铵盐如铵或四甲基铵盐;或氨基酸加成盐如赖氨酸、 甘氨酸、或苯丙氨酸盐。在下面提供了另外的适宜的盐。

更特定的本发明的半通道调节化合物是以可药用盐、与直链化合 物的C-末端羧酸官能团或如果存在的话的环状化合物的游离羧酸官 能团形成的烷基酯、酰胺、烷基酰胺、二烷基酰胺、或酰肼的形式。 酰胺和直链化合物的低级烷基酰胺是本发明优选的化合物。盐包括可 药用的盐,如酸加成盐和碱盐。已经对酸加成盐的实例进行了描述, 并且包括盐酸盐、钠盐、钙盐、钾盐等等。碱盐的实例有其中阳离子 选自碱金属如钠和钾、碱土金属如钙、和铵离子+N(R3)3(R4)的盐,其中 R3和R4独立地是任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任 选取代的芳基、或任选取代的杂芳基。可药用盐的其它实例有例如在 Remington′s Pharmaceutical Sciences 17.Ed.Alfonso R. Gennaro(Ed.),Mark Publishing Company,Easton,PA,U.S.A.,1985 和更新版本,以及在Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中所 描述的那些盐。

太阳城集团在本发明的治疗方法中,可以以一些方法中的任何一种方法将治 疗化合物给药于个体。例如,可以将用所提供的体外和/或体内测定中 的一种或其组合所选择的半通道调节化合物预防性进行给药以预防靶 向情况的开始或降低其严重程度。或者,可以在靶向情况的过程中将 该化合物进行给药。

太阳城集团可以单独或者与一种或多种治疗剂联合地将治疗化合物给药于个 体,其可以为混有常规赋形剂的药物组合物,所说的常规赋形剂即适 于胃肠外、肠内或鼻内应用的不会与活性化合物进行有害反应并且不 会对其接受者造成危害的可药用的有机或无机载体物质。适宜的可药 用载体非限制性地包括水、盐溶液、醇、植物油、聚乙二醇、明胶、 乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂 肪酸单甘油酯和二甘油酯、petroethral脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚 乙烯吡咯烷酮等等。可以对该药物制剂进行灭菌,并且如果需要的话, 可以将其与不会与活性化合物发生有害反应的辅助物质进行混合,所 说的辅助物质例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于 影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、矫味剂和/或芳香物质等等。

太阳城集团该类组合物可以被制备成用于胃肠外给药,特别是可以被制备成 液体溶液或混悬液的形式;被制备成用于口服给药的形式,特别是片剂 或胶囊的形式;被制备成鼻内给药的形式,特别是粉末、滴鼻剂、或气 雾剂形式;阴道给药的形式;局部给药例如乳膏形式;直肠给药例如栓剂 形式;等等。

太阳城集团该药学物质可以方便地以单位剂量的形式被给药并且可以用药学 领域中众所周知的方法来进行制备,例如可以如在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.,1980)中所述的 那样来进行制备。用于胃肠外给药的制剂可以包含普通赋形剂如无菌 的水或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、氢化萘等等。 特别是可以用可生物相容、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交 酯共聚物、或聚氧化乙烯-聚氧化乙烯共聚物作为用于控制本发明某些 半通道调节化合物的释放的赋形剂。

太阳城集团可能有用的其它胃肠外传递系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗 粒、渗透泵、可植入的输入系统、以及脂质体。用于吸入给药的制剂 包含赋形剂如乳糖,或者是可以包含例如聚氧化乙烯-9-月桂基醚、甘 氨胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液、或者是油溶液,其可以是滴鼻剂的 形式或者可以是可被鼻内应用的凝胶形式。用于胃肠外给药的制剂还 可以包括用于口腔给药的甘氨胆酸盐、用于直肠给药的甲氧基水杨酸 酯、或用于阴道给药的枸橼酸。其它传递系统可以将治疗剂(治疗剂们) 直接给药到手术部位,例如在囊血管成形术后可以通过使用斯滕特固 定模将半通道调节化合物进行给药。

缩写和公式:

太阳城集团在说明书和权利要求中,用三个字母代码来表示天然氨基酸,一 般可接受的用于表示其它α-氨基酸的三个字母代码如Sarcosin(Sar)、 α-氨基-异-丁酸(Aib)、萘基丙氨酸(Nal),包括-萘基丙氨酸(lNal)和2- 萘基丙氨酸(2Nal)、苯基甘氨酸Phg、2,4-二氨基丁酸(Dab)、2,3-二氨 基丙酸(Dapa)、和羟脯氨酸(Hyp)。在没有详细说明的情况中,Hyp 表示4-羟脯氨酸。天然或必需氨基酸是蛋白的氨基酸组分。芳族氨基 酸是Phe、Tyr、Trp、1Nal、2Nal和His。在没有详细说明L或D型 的情况中,应当清楚的是所怀疑的氨基酸具有天然的L型,cf.Pure & Appl.Chem.第56(5)卷第595-624页(1984)。在没有详细说明的情况中, 应当清楚的是本发明化合物的C-末端氨基酸是以游离羧酸的形式存 在地,这也可以被指定为“-OH”。本发明化合物的C-末端氨基酸可以 表现出具有“-OH/NH2”的末端官能团,其指的是该化合物有两种优选 的形式:游离酸酸和酰胺化衍生物。

除非特别说明,否则使用下面的特定定义:ASAL指的是4-叠氮基 水杨酰基;AB指的是4-叠氮基苯甲酰基;Fmoc指的是9-芴基甲氧基羰 基;Ac指的是乙酰基。除非特别说明,否则在本公开物中使用下面的 定义;Acm指的是乙酰氨基甲基;T4c指的是L-噻唑烷-4-羧酸基;Pc指 的是L-哌啶酸基;DNP指的是二硝基苯基;;DBF被定义为2-氨基乙基 -6-二苯并呋喃丙酸;;Acm指的是乙酰氨基甲基;和Sar指的是肌氨酸 基;DNP官能团是用于抗体识别的半抗原,和包含DNP部分的本发明的 化合物可以优选地被用作研究工具。

另外的太阳城集团还可以见PCT/DK01/00127(WO01/62775)和 PCT/US02/05773(WO 02/077017)。

这里所公开的所有参考资料在这里都被引入作为参考。用下面的 实施例来对本发明进行说明。

参考实施例1:标准的小鼠心律失常(Arrythmia)体内测定

用钙诱导的小鼠心律失常模型来对抗心律失常作用进行试验。

简要地说,可以用根据J.J.Lynch,R.G等人JCardiovasc. Pharmacol.1981,3 49-60的模型的钙诱导的心律失常体内模型对化合 物的抗心律失常作用进行试验。用neurolept麻醉剂组合 (Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟阿尼酮(fuanisone)10 mg/ml)+咪达唑仑(5mg/ml))对小鼠(25-30g)进行麻醉。将可以通过商 业途径获得的Hypnorm和咪达唑仑的溶液用蒸馏水以1∶1的比例进行 稀释并且将一份进行了稀释的Hypnorm与一份进行了稀释的咪达唑 仑进行混合。

通过以0.05-0.075μl/10克的剂量给小鼠进行皮下给药来诱导麻 醉。将i.v.套管插入到尾静脉中。通过将不锈钢ECG电极放在右前肢 和左前肢上来连续记录开头的II ECG信号。将接地电极放在右后肢 上。通过Hugo Sachs Electronic model 689 ECG组件将该信号放大(x 5.000-10.000)和过滤(0.1-150Hz)。通过12位数字采集板(Data Translation model DT321)将类似的信号数字化并在1000Hz下用 Windows NT的Notocord HEM 3.1软件进行取样。在10-分钟平衡期 后,将药物的试验样品注射到尾静脉中。对用基质进行预处理的小鼠 进行试验,将其作为未进行处理的动物中对照水平的测量值。在所有 实验中,注射体积为100μl。在将药物或基质进行i.v.给药后3分钟开 始输入CaCl2(30mg/ml,0.1ml/分钟≈100mg/kg/分钟(氯化钙-2-水合物, Riedel-de Han,德国))。对从开始CaCl2输入至发生第一次心律失常 太阳城集团的第2级AV-阻滞时的时滞进行测量。将第2级AV-阻滞事件定 义为特征为不伴有QRS复合体的P-波的AV传导的间歇性失败。

将反应表示为相对于直至在用基质进行处理的小鼠中发生第2级 AV-阻滞的太阳城集团。已经对各试验物质的最大作用进行了概括。

太阳城集团用于检测具有良好间隙连接改性活性的候选化合物的更特定的方 法进一步包括对可以在标准的小鼠心律失常体内测定中将至所诱导的 心房心室(AV)阻滞开始的太阳城集团延长至少约20%(得分至少为2)的候选 化合物进行选择。更优选的化合物将在该测定中至所诱导的AV阻滞 (得分至少为3)开始的太阳城集团延长至少约60%。

具体实施方式

下面的实施例提供了表明化合物1在大鼠新生的心肌细胞中具有 打开间隙连接通道和关闭半通道的能力的功能性测定。因此,可通过 半通道和间隙连接通道的酪氨酸磷酸化作用获得对GJIC的区分调 节。

太阳城集团实施例1-抗心律失常化合物

太阳城集团用于本发明的化合物包括

太阳城集团Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH2(化合物1)和 Ac-Gly-Asn-Tyr-NH2(化合物2)。根据WO 01/62775中所述的标准固 相合成来对化合物进行合成。用于本发明化合物的另外的实例是反- 白藜芦醇和CAPE(咖啡酸苯乙酯)。已经对制备该化合物的方法进行 了描述。见例如PCT/DKO1/00127(WO01/62775)和 PCT/US02/05773(WO02/077017)申请。

实施例2-对由除去葡萄糖所诱导的代谢应激进行的分析

太阳城集团可以通过既对动作电位的形成进行干扰,又对其传导进行干扰来 造成心律不齐。动作电位从细胞到细胞之间的传播是由细胞间的间隙 连接所介导的。这些间隙连接包括通道,其是通过被称为连接蛋白的特 定蛋白所构成的。有一些迹象线表明连接蛋白的表达降低和/或分布受 到干扰对于正常脉冲的传播而言是有害的,并且从而导致心律失常。 一个实例是在局部缺血期间和局部缺血后看到了这种改变。在急性局 部缺血期间,认为细胞的解偶联主要是由细胞内酸化、细胞内Ca2+增 加、细胞内ATP降低和长链酰基肉毒碱和脂肪酸[1,2]浓度升高所造成 的。在局部缺血的急性期后,梗死区域及其边界区域的体系结构发生 改变。这种改变与连接蛋白紊乱区域和电位折返回路的形成有关,认为 其可作为致心律失常底物[3]。体内和体外研究已经表明一组抗心律失 常的肽可以延迟和抑制心律不齐的开始,并且随后的研究已经表明这 些肽可以增加细胞之间的电偶合。

A方法

1.细胞培养:简而言之,将得自20只新生大鼠(1-2天的大鼠)的心 脏无菌切除。将心室分离出来并将其切成4-6片,在具有胰蛋白酶和 DNAse的Hanks缓冲盐水中用一些步骤对其进行消化。然后将该细胞 进行离心并将其重新混悬于具有5%FCS的MEM中。为了除去非-肌 细胞,将该混悬液预先涂布在陪替氏培养皿中将其在37℃下培养30 分钟。然后,将混悬液中的细胞接种到用胶原涂布的盖玻片上。对接 种密度进行调整以产生融合的培养物。

2.电生理学:将具有融合心肌细胞的盖玻片安放在位于倒置显微 镜(inverted microscope)载物台上的开放室中并通过重力驱动以1ml/ 分钟的速度在37℃用Dulbeccos磷酸盐缓冲的盐水(PBS)对其进行浇 盖。该溶液(PBS)包含(以mM为单位):Na+152、K+4.2、Cl-141.5、 PO43-9.5、Ca2+0.9、Mg2+0.5,pH 7.4。在Sutter FlamingBrown P-87 微电极拔出器上从1.5mm玻璃毛细管(GC150F-15,Harvard Apparatus)中拔出膜片钳移液管并将其火抛光(fire polished)至4-6 MW的电阻。将移液管填充上包含(以mM为单位)K+150、Na+15、 Cl-5、葡萄糖酸盐-150.2、EGTA 5、HEPES 5、Ca2+2mM、Mg2+1.6,pH 7.2的细胞内样溶液。

太阳城集团该膜片钳装置包括同步的非连续放大器(SEC-05LX,NPI electronics),并且用INT-10接口(NPI electronics)和PC1200数字采集 板(National Instruments)来将数据数字化。用该放大器的内部滤器将 电流和电压信号低通滤过并在10kHz下将其数字化。

太阳城集团用PatchMan 5173纤维操作器(Eppendorf)使细胞接近电极。当 与细胞接触时(被看成输入电阻突然增加),进行抽吸直至确立Giga密 封结构。然后,进行简短地抽吸脉冲以将移液管下的膜弄破。然后, 将放大器放到零-电流钳方式以对膜电位进行监测。

在双极铂电级之间保留一些距离(>>1cm)以放置培养物。然后, 在人工刺激和修补细胞中出现动作电位之间的延迟是电导速率的量度 器。

用具有0.1g/lBSA的对照溶液对细胞进行灌注直至在刺激-活化 间隔(SAI)中确立了稳定的基线。然后,将灌注液变成没有葡萄糖的溶 液,用其灌注15分钟,随后用化合物1(10-8M)对其激发20分钟。平 行地,在不加入化合物1的情况下用相似的太阳城集团刻度来进行对照实验。 将日期表示为相对于从培养基中除去葡萄糖前的基线而言的变化百分 比。

B.结果

如图2所示的那样,通过除去葡萄糖所诱导的代谢应激在刺激- 活化间隔中产生了轻微增加,这表明除去葡萄糖延迟了传导速度。相 反,用浓度为10nM的化合物1进行浇盖降低了刺激-活化间隔,即 化合物1增加了原代培养的心肌细胞中的传导速度。这些数据表明化 合物1增加了心肌细胞中细胞-至-细胞的偶合。

参考资料:

太阳城集团[1]Carmeliet,E.心脏离子电流和急性局部缺血:从通道到心律不 齐.Physiol Rev.,1999,79:917-1017。

太阳城集团[2]Dhein,S.心脏间隙连接.生理学,调节,病理生理学和药理 学.Karger,Basel,1998.

太阳城集团[3]Peters,N.S.和Wit,A.L.心肌体系结构和心室心律失常形 成.Circulation,1998,97:1746-1754.

太阳城集团实施例3-免疫沉淀法和磷酸化连接蛋白的分析

本实施例中所用的化合物是用标准的固相Fmoc化学过程制备 的。见前面的实施例。用质谱来进行鉴定,用RP-HPLC对纯度进行 测定。原位结合和动物研究表明下面的肽(化合物1)与受体在毫微摩尔 范围内进行结合。用1nM、l0nM、50nM和100nM的化合物1进行 的初始研究将决定是否进行用下面的肽化合物3 (H-GAG-4-Hyp-PY-NH2)和化合物4(H-GNY-NH2)进行的研究。这些 研究还将决定是否进行涉及特定的激酶抑制剂的研究。

将H9c2细胞以7,900个细胞/cm2(约~15,000个细胞/孔)的密度接 种在24-多孔皿中并使其在添加有10%胎牛血清(FCS)和1000单位青 霉素/100μg链霉素(pen/strep)的MEM中在5%的CO2大气和100% 的湿度下在37℃下生长3天。

将进行了标记的细胞在Triton X-100溶解缓冲剂(~5*107个细胞 /ml)中在4℃下培养1小时。将该溶胞产物在30分钟20,000*g下离心 30分钟。通过给每200μl上清液加入10μl琼脂糖来将上清液预澄清 (precleared)。然后,将进行了预澄清的上清液加入0.5-lμg磷酸酪氨 酸或磷酸丝氨酸抗体(Sigma)并将其在轨道摇动器中在4℃下培养1.5 小时。然后,通过用50μl 1∶1蛋白G琼脂糖的浆液培养1.5小时来 获得抗体-复合体。最后,用0.1%(w/v)Triton X-100,50mM Tris,pH 7.4,300mM NaCl和5mM EDTA对该复合体进行广泛洗涤。

太阳城集团将该复合体装载到12%SDS凝胶上并将其点到PVDF膜上。将该 膜用0.1%吐温20,50mM Tris,pH 7.4,300mM NaCl,5%干乳(TBST) 阻滞2小时。随后,将该膜用连接蛋白43特异抗体(Zymed)在室温下 培养1.5小时并用ECL+(Amersham)使其生长。

图3A-B表示其中使用抗-磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹。对与化合 物1(3A-B)和化合物2(3B)浓度有函数关系的Cx43片段磷酸化进行了 描述。

太阳城集团图4A-B表示其中使用抗-磷酸丝氨酸抗体(4A)或抗-磷酸酪氨酸 (4B)抗体的免疫印迹。

太阳城集团实施例4:化合物1肽对融合心肌细胞中半通道活性的影响

1.细胞培养:简单地说,将得自20只新生大鼠(1-2天的大鼠)的心 脏无菌切除。将心室分离出来并将其切成4-6片,在具有胰蛋白酶和 DNAse的Hanks缓冲盐水中用一些步骤对其进行消化。然后将该细胞 进行离心并将其重新混悬于具有5%FCS的MEM中。为了除去非-肌 细胞,将该混悬液预涂布在陪替氏培养皿中将其在37℃下培养30分 钟。然后,将该细胞混悬液接种到胶原涂布的盖玻片上。

太阳城集团2.染料-摄取:将该具有心肌细胞的盖玻片用包含(以mM为单 位):Na+152,K+4.2,Cl-141.5,PO43-9.5,Ca2+0.9,Mg2+0.5,葡萄糖6, pH 7.4的对照溶液(PBS)或局部缺血模拟(ischmia mimicking)(损伤)溶 液(作为对照,仅包含K+8.2,没有葡萄糖,10mM脱氧-葡萄糖,pH 6.5)培养30分钟,两种溶液都包含200μM钙黄绿素。然后将该细胞 用对照溶液洗涤10分钟。

将该盖玻片放到倒置显微镜载物台上的开放室中。选择10个随机 区域,并在常规光学显微镜下从各区域中选择三个细胞。然后用480 nm的光对这些细胞进行激发,在510nm下对荧光发射进行测量,其 中该发射强度是染料摄取的量度器。

在下面两个条件下对化合物1对染料摄取的作用进行研究:

实验l:在这一系列实验中,将细胞用具有钙黄绿素的对照溶液培 养30分钟,并用不含染料的溶液将其洗涤10分钟。在成对的实验中, 进行相同的实验,其中在30分钟培养过程中加入肽。

实验2:如实验1那样,但是仅仅是用损伤溶液代替对照溶液进行。

太阳城集团3.结果用钙黄绿素在得自新生大鼠的心肌细胞培养物中进行的摄 取实验表明,当细胞进行代谢应激(形式为低pH、细胞外K+增加和 脱氧葡萄糖5-10mM)时,染料摄取比对照细胞高38%。当将细胞与 化合物1(10nM,在成对t-检验中与只接触脱氧葡萄糖的细胞相比P< 0.017,n=6)共同进行培养时,这种作用被显著降低。这些结果表明,在 代谢应激后发现的通过连接蛋白半通道的膜渗透性增加可被化合物1 抑制。很可能这种作用对于细胞功能和存活是有益的。此外,用培养 的H9c2心肌细胞进行的磷酸化作用实验已经表明化合物1介导了连 接蛋白43的酪氨酸磷酸化作用。此外,与0、1、10、50和100nM化 合物1接触4小时的心肌细胞增加了连接蛋白43酪氨酸磷酸化作用。 已经报道了酪氨酸磷酸化作用介导了间隙连接细胞间通讯的紊乱并且 可以容易地解释在钙黄绿素实验中所看到的膜渗透性降低。在一些实 验中,发现化合物1可以降低Ser-磷酸化作用。

图5表示了10nM化合物1对局部缺血-诱导的所培养的心肌细胞 中的钙黄绿素的摄取的影响。

实施例5-部位特异性连接蛋白磷酸化作用的ELISA测定

太阳城集团已经确立了ELISA夹层测定,其使得可以测量组织样品以及位于 多孔形式(24-96孔)中的细胞培养物中连接蛋白的部位特异性磷酸化 作用。将这些孔用对抗所讨论的连接蛋白类型的抗体(捕获抗体)进行 涂布。然后,使细胞或组织提取物与用捕获抗体-涂布的板在4℃下o/n 进行反应。用直接作用于特异磷酸化作用部位的抗体对所捕获的被磷 酸化的连接蛋白进行检测或者使所捕获的被磷酸化的连接蛋白与生物 素、FITC、TRITC或过氧化物酶进行轭合。

太阳城集团或者可以用作用于检测抗体的IgG种类的放射性标记的或酶轭合 的抗体对与特定磷酸化作用部位相结合的抗体数量进行测量。

太阳城集团已经用作为捕获抗体的小鼠抗Cx43、作为检测抗体的兔抗 -Tyr-P(酪氨酸磷酸化作用部位)和用于对所结合的抗-Tyr-P的数量进 行测量的用125I或HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗-兔IgG证明了该原 理。

太阳城集团还用作为捕获抗体的兔抗Cx43(5μ/ml;cat.no.710700,Zymed Lab.Inc.,California,USA)、作为检测抗体的单克隆小鼠抗-磷酸酪氨 酸(50μg/ml;cat.no.P-3300,clone pt66,Sigma,MO,USA)和用于对 被结合的抗-磷酸酪氨酸的数量进行测量的用125I标记的抗-小鼠完全 抗体(绵羊抗-小鼠Ig cat.no.IM131,Amersham Biosciences,Wales, UK)或用过氧化物酶标记的抗-小鼠完全抗体(驴抗-小鼠Ig;cat. no.715-035-151)证明了该原理。

太阳城集团图6A表示优选ELISA检测形式的图解形式。图6B和6C表示本

实施例的结果。

本实施例和讨论提供了代谢应激打开心脏细胞中连接蛋白半通道 以及这种打开可以通过用化合物1进行培养被挫败的证据。此外,实 施例2-5表明化合物1在代谢应激过程中关闭半通道。与化合物1对 半通道对钙黄绿素摄取的抑制作用,即关闭半通道的作用相一致,这 些实施例还表明化合物1有助于调节连接蛋白43的酪氨酸磷酸化状 态。已知化合物1可以打开间隙连接,参考WO01/62775并且已知连接 蛋白脱磷酸化作用的抑制可以防止间隙连接通道的关闭。因此,认为 这里所提供的已经表明具有化合物1的有益的间隙连接开放或调节作 用的化合物,即在WO 01/62775中所公开的所有抗心律失常的肽和已 知的肽如AAP、AAP10、HP5等等可作为半通道开放或关闭调节剂而 用于本发明。还认为化合物1可以维持或增加Cx43的酪氨酸磷酸化 作用,从而可以调节半通道功能。

实施例6-心肌细胞中的染料摄取。

1.方法.通过胰蛋白酶消化将心室肌细胞从新生大鼠中分离出来并 将其接种到用胶原覆盖的盖玻片上。在4天后,肌细胞形成融合并同 时将细胞的薄片进行敲打。为了测量染料摄取,将细胞在室温下在包含 200μM钙黄绿素的缓冲剂中培养30分钟。然后将盖玻片用对照缓冲 剂仔细进行洗涤,并将其放置在开放浴的室中并用对照缓冲剂对其进 行浇盖(RT)。用氙灯和单色仪在480nm光下对细胞进行激发。用冷 却CCD照相机(Sensicam)收集510nm下所发射的荧光图象。用成像 工作台(Axon)来控制激发控制和图象收集。

太阳城集团在光学显微镜下在图象中在心肌细胞上确定出三个区域。然后对 平均荧光强度进行测量,重复进行该操作直至在10副照片上测量了 30个区域。用这些测量的均值作为给定实验条件的值,即n=1。在各系 列中,进行一个对照培养并且所有的实验值都是相对于这一值被给出 的。

溶液:对照缓冲剂(以mM为单位):NaCl136,KCl 4,MgCl2 0.8, CaCl2 1.8 HEPES 5,MES 5,葡萄糖6,pH 7.3应激缓冲剂(以mM为 单位):NaCl 136,KCl 8,MgCl2 0.8,CaCl2 1.8 HEPES 5,MES 5,脱氧- 葡萄糖10,pH 6.2

太阳城集团2.结果在对照条件下用钙黄绿素进行的细胞培养给出了一些荧光 染色,其主要是定位微粒性质(见图7A-C,小组B)。在所培养的肌细胞 上,常常发现立即被台盼蓝染色的卷起的细胞。这些细胞被钙黄绿素 严重染色,并且应当注意不在这些细胞上设置测量区域。当细胞发生 代谢抑制时,染色方式发生变化,并且观察到染料通过胞质溶胶进行 扩散(图7C)。应激期间的平均强度比对照高36.2±4.18%(n=5,在成对 t-检验中P<0.001)。

这证实了在心脏和其它细胞类型中的发现,即代谢抑制活化了荧 光染料的摄取,其可能是通过连接蛋白半通道进行的。我们假设肽的 AAP族可以对心脏组织发挥积极作用的机理之一可能是中断了半通 道的活性,从而改善了细胞内环境的稳定。为了对此进行研究,使细 胞在存在ZP123的情况下在0.1pM至10mM的浓度间进行应激。结 果如图8所示,其中各数据点表示5次实验。正如可以看出来的那样, ZP123剂量依赖性地降低了钙黄绿素的摄取。使用S形函数,估计 ED50为3.3±5.3pM,Hill系数为2.5±1.0。在化合物1的最大抑制期 间的平均强度比对照高6.9±1.7%。

太阳城集团实施例7-心肌细胞中的体积测量

太阳城集团1.方法:通过胰蛋白酶消化将心室肌细胞从新生大鼠中分离出来 并将其涂布到用胶原覆盖的盖玻片上。在4天后,肌细胞形成融合并 同时将细胞的薄片进行敲打。为了对细胞体积进行测量,使细胞在37℃ 下用钙黄绿素-AM(在对照缓冲剂中为5μM)负载15分钟并将盖玻片 放置在开放浴的室中。在室温下进行下面的试验。在实验过程中,用 Leica激光同焦显微镜,每隔20秒进行一次光学横截。

用Metamorph(Universal Imaging)对该光学横截进行分析。将细 胞区域确定为荧光强度高于阈值的像素区域以将背景诱导的波动最小 化。通过用各值除以对照情况下(代谢应激前进行的最后测量)的平均 面积来将数据表示为相对体积。

溶液:对照缓冲剂(以mM为单位):NaCl 136,KCl 4,MgCl20.8,CaCl2 1.8 HEPES 5,MES 5,葡萄糖6,pH 7.3应激缓冲剂(以mM 为单位):NaCl 136,KCl 8,MgCl2 0.8,CaCl2 1.8 HEPES 5,MES 5,脱 氧-葡萄糖10,pH 6.2

2.结果在对照情况下,细胞一般倾向于随着太阳城集团的流逝体积略微 降低(图9B表示得自5个试验的平均数据)。当用代谢抑制对细胞进行 激发时,体积下降被逆转至净增加(图9A中的实心方块)。一般而言, 相对体积为1.06±0.02(最后一个5分钟应激,n=5),而这一时期对照细胞 的体积为0.94±0.04。

太阳城集团肌细胞中的染料摄取测量已经表明化合物1抑制了连接蛋白半通 道的开放。认为半通道可能有助于所观察到的膨胀。为了对此进行监 验,在应激介质和体积检测中包含化合物1(0.1nM)。得自6个实验的 数据如图9A所示(空心的方块)并且正如可以看出的那样,防止了应激 诱导的膨胀。在存在化合物1的情况下应激过程中的平均相对体积为 0.93±0.05。

太阳城集团当用单侧ANOVA对得自对照、应激和应激加化合物1的数据进 行比较时,检测到显著差异(见图10)。Post.hoc.试验(LSD)表明应激 与对照(P<0.05)和应激加化合物1(P<0.05)具有显著差异,而对照与应 激加化合物1之间没有显著差异(P>0.76)。

太阳城集团实施例8-大鼠体内心肌梗死后梗死大小的降低

1.方法:

太阳城集团将雄性Lewis大鼠(300-350g;M & B,Ll.Skendsved,Denmark) 用neurolept麻醉剂组合(Hypnorm(枸橼酸芬太尼0.315mg/ml和氟 阿尼酮10mg/ml)+咪达唑仑(5mg/ml))进行麻醉。将可以通过商业途 径获得的咪达唑仑的溶液用蒸馏水以1∶2的比例进行稀释。将三份进 行了稀释的咪达唑仑与一份hypnorm进行混合。通过每100克大鼠 皮下给予0.2ml这种溶液来诱导麻醉。当确定已经建立了手术麻醉时, 插入气管内导管并用被调节至可以将手术期间动脉pH维持在7.3-7.5 的Harvard啮齿动物通风机对动物人工通风。

太阳城集团就在诱导心肌梗死前用插入到腹膜腔(i.p.)中的微型渗透泵(Alzet model 2ML4)来传递化合物1。将泵充满基质(等张的盐水)或化合物1。 为了确保在梗死时已经获得了治疗的血浆浓度,在对LAD结扎前皮下 给予化合物1的负载剂量。在皮下给予负载剂量时,在3分钟后就达到 了稳态血浆水平。

在皮下给予负载剂量的化合物1后和在腹膜内插入渗透微型泵 后,进行左侧胸廓切开术,用6-0号丝缝合线对左前下行动脉进行结 扎。将胸廓逐层关闭,并在胸膜腔内诱导负压以使肺展开。将进行伪 操作的动物用相同的操作进行处理,只是不进行LAD结扎。手术后, 使动物在具有50%氧气的30℃下的进行了加热的柜子中进行恢复直 至下一个早晨。为了防止恢复期间的脱水,在手术结束后立即给大鼠 皮下给予5ml 5%的葡萄糖并在4p.m时再给予5ml 5%葡萄糖。为 了缓解手术后的疼痛,在心肌梗死后,将大鼠用丁丙诺啡(20μg/100g, 一日两次皮下给药)和美洛昔康(0.1mg/100g,一日一次皮下给药)处理 三天。在这项研究中,对给予患有心肌梗死(MI)大鼠的输入剂量进行 调节以产生在0[基质=等渗的盐水],1.7±0.4nM[剂量1]、5.7±0.4[剂量 2]、或93.7±12.3nM[剂量3]下的血浆浓度。在固相萃取后用质谱对化 合物1的血浆浓度进行测量。所用的剂量如下面表1所示:

表1   组  3周后的血浆浓度nM  化合物1的皮下负载   剂量(nmol/kg)   化合物1的腹膜内输入   剂量(pmol/kg/分钟)  伪-MI   0   0   0   MI   0   0   0   MI   1.7±0.4   0.25   11   MI   5.7±0.4   2.5   110   MI   93.7±12.3   25   1100

太阳城集团在LAD结扎后3周,通过腹膜内注射戊巴比妥(50mg/kg)对大鼠 进行麻醉。将动物放置到加热毯上以将其体温维持在37℃。进行气管 切开术,并用Harvard啮齿动物通风机用给大鼠通氧气。对通风机进 行调节以将动脉pH维持在7.35-7.45。将PE50导管放置到股静脉和 动脉中以分别用于静脉内给药和动脉压力测量。在插入股静脉内导管 后,通过静脉内给予泮库溴铵(pancuronium),1mg/kg来使动物麻痹。 通过连续静脉内输入等渗盐水(50μl/分钟)传递的的戊巴比妥(2.5 mg/kg/h)和泮库溴铵(1mg/kg/h)来维持麻醉和呼吸麻痹。通过右颈动 脉将聚乙烯导管插入到左心室中以测定左心室的末端舒张压。在记录 左心室末端舒张压后(LVEDP),通过从离心脏几毫米处切断静脉和动 脉来将心脏从身体上取下。用等渗的盐水仔细对心脏上的血液进行洗 涤,对其进行称重,并将其放置在4%的中性的缓冲的福尔马林中。

在固定后,将紧挨着心脏的大血管切割下来。其后,用由距离为 1.5mm的平行的刀刃所组成的集合体将心脏平行地切成厚度为1.5 mm的片。该薄片与心脏的长轴相垂直。

将这些薄片放置到两个组织学囊中,使得第一个薄片被放置到被 随机编号的囊中的一个中,第二个被放到另一个中,第三个被放到第 一个中,以此类推。在包埋后,将这些薄片切成4μm厚的切片,将 其用苏木精-曙红和Masson-trichrome进行染色。

太阳城集团用具有按照预定步骤移动的载物台的显微镜,对用 Masson-trichrome染色的载玻片进行检测并对击中纤维组织(被 Masson-trichrome染蓝)和正常组织的点数进行计数。将显微镜与视频 照相机相连并在屏幕上对图象进行显示。所用的形态测定法系统是得 自Olympus,丹麦的Cast2。将梗死大小计算为心脏中纤维组织的%。

2.结果:

如图11所示的那样,化合物1的两个最高剂量降低了心脏重量- 体重比例,表明该化合物降低了心肌梗死的肥大后果(即,改型)。

太阳城集团如图12所示的那样,相对于患有心肌梗死但是用基质进行治疗的 大鼠而言,用化合物1治疗3周将患有心肌梗死大鼠的梗死大小降低 了20-50%。Tyhis表明化合物1在心肌局部缺血期间具有细胞保护作 用。与这里所描述的相一致,这些数据表明化合物1通过可能涉及预 防细胞膨胀的机理降低了心肌梗死的大小。因此,预防细胞膨胀可以 预防围绕着心脏组织的压迫,从而防止了围绕着健康组织的微循环的 压迫。因此,在本申请中,我们断言这种原理可以预防任何器官中任 何局部缺血损害的后果,所说器官优选但是非限制性地是具有狭窄的 纤维囊的器官(例如心脏、肾)或被骨所围绕着的器官(例如,脑、脊髓、 骨髓)。

太阳城集团如图13所示的那样,患有心肌梗死但是用化合物1的任何一种剂 量治疗了3周的大鼠在心脏功能方面得到了更好的改善,正如通过左 心室舒张压降低所证明的那样,左心室的充血减少。这种数据表明化 合物1防止了心肌梗死后心脏功能的损害。

这里所公开的所有参考资料都在这里被引入作为参考。已经参考 其优选的实施方案对本发明进行了描述。但是,本领域技术人员会意 识到,在考虑本公开物时,可以在本发明主旨和范围内对其进行改变 和改进。

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