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蒺藜 皂苷 检测 方法
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摘要
申请专利号:

CN201010283475.8

申请日:

20100915

公开号:

太阳城集团CN101953868B

公开日:

20110817

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A61K36/28,G01N30/02,G01N30/36,G01N30/06,A61P9/00,A61P9/10 主分类号: A61K36/28,G01N30/02,G01N30/36,G01N30/06,A61P9/00,A61P9/10
申请人: 吉林敖东洮南药业股份有限公司
发明人: 沈丽娟,邹兆鹏,王国栋,孙申国,钱本余,孙东成,刘巍,朱天全,程志国
地址: 137100 吉林省洮南市团结东路16号
优先权: CN201010283475A
专利代理机构: 北京太兆天元知识产权代理有限责任公司 代理人: 刘伟
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法律状态
申请(专利)号:

CN201010283475.8

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种蒺藜提取物的检测方法,该方法为:色谱条件:室温,相对湿度:25-40%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60~90%乙腈溶液为流动相A,以水为流动相B,进行梯度洗脱,流速:0.4~0.6ml/min,柱温:25~45℃;蒸发光散射检测器:漂移管温度:105~120℃,气体流速:1~3L/min。本方法具有良好的精密性、重现性、稳定性。

权利要求书

太阳城集团1.一种蒺藜提取物的指纹图谱检测方法,其特征在于该方法为:色谱条件为:室温,相对湿度:25-40%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60~90%乙腈溶液为流动相A,以水为流动相B,梯度洗脱,流速:0.4~0.6ml/min,柱温:25~45℃;蒸发光散射检测器的条件为:漂移管温度:105~120℃,气体流速:1~3L/min;取蒺藜提取物制成每1ml含3-6mg的溶液;注入液相色谱仪,记录色谱图;所述梯度洗脱过程为:第0.01分钟:流动相A乙腈溶液为24%,流动相B水为76%;第8分钟:流动相A乙腈溶液为32%,流动相B水为68%;第45分钟:流动相A乙腈溶液为40%,流动相B水为60%;第75分钟:流动相A乙腈溶液为55%,流动相B水为45%;所述供试品溶液的制备方法为:称取蒺藜提取物适量,加水适量,超声处理5-20分钟,放冷,滤过,制成每1ml含3-6mg的溶液。2.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法,其特征在于色谱条件中室温为:20℃;相对湿度为:35%。3.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法,其特征在于供试品溶液的制备中超声处理10分钟;制成每1ml含5mg的溶液。4.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法,其特征在于梯度洗脱过程为:第0.01分钟:流动相A乙腈溶液为24%,流动相B水为76%;第8分钟:流动相A乙腈溶液为32%,流动相B水为68%;第45分钟:流动相A乙腈溶液为40%,流动相B水为60%;第75分钟:流动相A乙腈溶液为55%,流动相B水为45%;第80分钟:流动相A乙腈溶液为75%,流动相B水为25%;第120分钟:流动相A乙腈溶液为75%,流动相B水为25%。5.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法,其特征在于蒺藜提取物指纹图谱中为10个共有峰,与蒺藜呋甾皂苷甲为对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留太阳城集团和相对峰面积比值,相对保留太阳城集团:10.35-0.43、20.40-0.48、30.40-0.50、40.65-0.79、50.67-0.81、60.83-1.01、70.87-1.07、81.00、91.21-1.47、101.30-1.60;相对峰面积:10.4~1.0、20.2~0.3、40.2~0.4、60.2~0.4、81.00、100.2~0.4。6.如权利要求4所述的指纹图谱检测方法,其特征在于蒺藜提取物指纹图谱中为13个共有峰,与蒺藜呋甾皂苷甲为对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留太阳城集团和相对峰面积比值,相对保留太阳城集团:10.35-0.43、20.40-0.48、30.40-0.50、40.65-0.79、50.67-0.81、60.83-1.01、70.87-1.07、81.00、91.21-1.47、101.30-1.60、111.38-1.86、121.44-1.94、131.73-2.33;相对峰面积:10.4~1.0、20.2~0.3、40.2~0.4、60.2~0.4、81.00、100.2~0.4、120.5~0.9。7.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法,其特征在于所述蒺藜提取物由如下方法制备:取蒺藜草分别加水5~15倍量,煎煮1~5次,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩放冷,加入乙醇,搅匀,静置,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,加水稀释,滤过,滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱,再用水洗至流出液近无色澄清,继用60%~85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩,即得蒺藜提取物。8.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法,其特征在于所述蒺藜提取物由如下方法制备:取蒺藜草切段,分别加水5~15倍量,煎煮1~5次,每次1~4h,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至50~60℃相对密度1.1~1.25,放冷,加入80%~99%乙醇,搅匀,静置1~5h,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,加水稀释,滤过,滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱,药液流速控制在400~700L/h,再用水洗至流出液近无色澄清,继用60%~85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩至50~60℃相对密度1.05~1.15,得蒺藜皂苷浓缩液,干燥,得蒺藜皂苷。

说明书



技术领域

本发明涉及蒺藜提取物的检测方法,属于中药领域。

技术背景

白蒺藜(Tribulus Terrestris L)为蒺藜科蒺藜属植物,具有活血通络、平肝潜阳、祛湿化痰、宣痹通阳、补益肝肾等功效。历代本草多有记载,《本草纲目》日:“蒺藜气味苦温,其性宣通,治胸痹痞满,利肝肾。”《本经》载:“蒺藜主恶血,破积聚。”《本草再新》“益气化痰,散湿。”《本草汇言》谓其“去风下气,行水化瘀之药也。”蒺藜总皂苷临床已被应用多年以治疗心血管疾病。临床及实验药理学都证明可改善心功能、缩小心肌梗塞面积、缓解心绞痛的症状、延长心绞痛的发作间期、减少心绞痛的发作次数,对陈旧性心肌梗塞伴左室功能异常者亦能减轻其胸闷、气促和心悸等症状,增加左室收缩功能和排血量。

目前,现有技术并没有公开蒺藜提取物的指纹图谱的检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种蒺藜提取物的检测方法。

太阳城集团本发明目的在于提供一种蒺藜总皂苷的检测方法。

本发明提供一种蒺藜提取物的高效液相-蒸发光散射指纹图谱检测方法,该方法包括如下步骤:

太阳城集团色谱条件:室温,相对湿度:25-40%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60~90%乙腈溶液为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱,流速:0.4~0.6ml/min,柱温:25~45℃;蒸发光散射检测器:漂移管温度:105~120℃,气体流速:1~3L/min。

太阳城集团所述色谱条件优选室温:20℃,相对湿度:35%;

供试品溶液的制备:称取蒺藜提取物适量,加水适量,超声处理5-20分钟,放冷,滤过,制成每1ml含3-6mg的溶液,即得;其中超声优选分钟10;优选制成每1ml含5mg的溶液;

测定法:精密吸取供试品溶液20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。

太阳城集团本发明检测方法优选采用如下梯度洗脱:

所述蒺藜提取物为蒺藜的有机或无机溶剂提取物,包括但不限于醇提过柱精制物、水提过柱精制物、醇提物或水提物。

所述蒺藜提取物优选为:取蒺藜草分别加水5~15倍量,煎煮1~5次,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩放冷,加入乙醇,搅匀,静置,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,加水稀释,滤过,滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱,再用水洗至流出液近无色澄清,继用60%~85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩,得蒺藜提取物。

太阳城集团本发明提供蒺藜总皂苷的检测方法,该方法包括如下步骤:

太阳城集团色谱条件:室温,相对湿度:25-40%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60~90%乙腈溶液为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱,流速:0.4~0.6ml/min,柱温:25~45℃;蒸发光散射检测器:漂移管温度:105~120℃,气体流速:1~3L/min。

所述色谱条件优选室温:20℃,相对湿度:35%;

太阳城集团供试品溶液的制备:称取蒺藜皂苷适量,加水适量,超声处理5-20分钟,放冷,滤过,制成每1ml含3-6mg的溶液,即得;其中超声优选10分钟;优选制成每1ml含5mg的溶液;

对照品溶液的制备:精密称取蒺藜呋甾皂苷甲对照品适量,加水制成每1ml含0.5mg的溶液,即得。

太阳城集团测定法:精密吸取供试品、对照品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图;

供试品指纹图谱中,指纹图谱应有10个共有峰,与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S),计算各共有峰的相对保留太阳城集团和相对峰面积比值,相对保留太阳城集团:1#0.35-0.43、2#0.40-0.48、3#0.40-0.50、4#0.65-0.79、

太阳城集团5#0.67-0.81、6#0.83-1.01、7#0.87-1.07、8#1.00、9#1.21-1.47、10#1.30-1.60;相对峰面积:1#0.4~1.0、2#0.2~0.3、4#0.2~0.4、6#0.2~0.4、8#1.00、10#0.2~0.4。

本发明检测方法优选采用如下梯度洗脱:

供试品指纹图谱中,指纹图谱应有13个共有峰,与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S),计算各共有峰的相对保留太阳城集团和相对峰面积比值,相对保留太阳城集团:1#0.35-0.43、2#0.40-0.48、3#0.40-0.50、4#0.65-0.79、

太阳城集团5#0.67-0.81、6#0.83-1.01、7#0.87-1.07、8#1.00、9#1.21-1.47、10#1.30-1.60、11#1.38-1.86、12#1.44-1.94、13#1.73-2.33;

相对峰面积:1#0.4~1.0、2#0.2~0.3、4#0.2~0.4、6#0.2~0.4、8#1.00、10#0.2~0.4、12#0.5~0.9。

太阳城集团所述蒺藜皂苷可以为市场购买,也可以为蒺藜醇提过柱精制物、水提过柱精制物、醇提物或水提物;所述蒺藜皂苷优选由如下方法制备:取蒺藜草分别加水5~15倍量,煎煮1~5次,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩放冷,加入乙醇,搅匀,静置,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,加水稀释,滤过,滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱,再用水洗至流出液近无色澄清,继用60%~85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩,得蒺藜皂苷;

所述蒺藜皂苷更优选由如下方法制备:取蒺藜草(蒺藜地上干燥部分)切段,分别加水5~15倍量,煎煮1~5次,每次1~4h,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.1~1.25(50~60℃),放冷,加入80%~99%乙醇,搅匀,静置1~5h,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,加水稀释,滤过,滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱,药液流速控制在400~700L/h,再用水洗至流出液近无色澄清,继用60%~85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩至相对密度1.05~1.15(50~60℃),得蒺藜皂苷浓缩液,干燥,得蒺藜皂苷。

太阳城集团本发明对流动相进行了大量的选择工作,如考察甲醇-水溶剂系统,结果发现,在实际可行的测定太阳城集团内,很难得到完全基线分离的色谱图,且梯度的微小变化,对图谱影响较大。

本方法具有良好的精密性、重现性、稳定性。本发明展开剂在75分钟内可以获得10个有效检测峰,在75分钟后,当对展开剂进行探索性调整时,意外的获得3个有效检测峰。

太阳城集团下述实验用于进一步说明本发明的效果,但是对本发明范围的限制。

实验例1精密性试验

对实施例1的检测方法进行重现性试验,按照实施例1的方制成供试液,经微孔滤膜滤过注入液相色谱仪,连续进样测试五次,考察色谱峰的相对保留太阳城集团的一致性及单峰面积大于总峰面积10%的指纹峰(1、8、10号三个峰),2、3号和4、5号未能达基线分离,分别作为峰组计算,其中30分钟以内组峰面积大于5%的指纹峰(2~3#)峰面积或峰面积比值的稳定性,结果列于表1~4。

表1精密度试验绝对保留太阳城集团

太阳城集团表2精密度试验相对保留太阳城集团

表3精密度试验峰面积

太阳城集团*只有8(s)的峰面积>20%。

表4精密度试验相对峰面积比值

结果示出,五次测定图谱的共有峰相对保留太阳城集团非常一致,几无变化。单峰面积占总峰面积20%以上的共有峰只有对照峰(8#),其五次测定的峰面积RSD为4.23%。其余4个考察峰(或峰组)的面积比值RSD依次为4.04、1.18、2.73、2.50%。符合国家药品审评中心于2001年发布的“中药注射液指纹图谱研讨会”纪要规定,“在方法学考察中,对峰面积大于20%的共有峰,其峰面积比值的RSD不得大于5%;峰面积小于20%的共有峰,RSD可不作规定”的意见,认证本方法具有良好的精密性。

实验例2重现性试验

对实施例1的检测方法进行重现性试验,按照实施例1的方法制成5个独立供试液,依法连续测定,结果列于表5~8

太阳城集团表5重现性试验绝对保留太阳城集团

表6重现性试验相对保留太阳城集团

表7重现性试验峰面积

*只有8(s)的峰面积>20%。

表8重现性试验峰面积比值

太阳城集团如表所示,五次独立测定的共有峰相对保留太阳城集团非常一致,单峰面积大于20%的8#(对照峰)峰面积的RSD为2.18%,远小于5%,其余4个考察峰(或峰组)的面积比值RSD依次为3.57、4.54、3.85、5.09%。表明本方法具有良好重现性。

实验例3稳定性试验

对实施例1的检测方法进行稳定性试验,每间隔90分钟测定一次,连续测定6小时(5次),结果列于表9~12。

太阳城集团表9稳定性试验绝对保留太阳城集团

太阳城集团表10稳定性试验相对保留太阳城集团

表11稳定性试验峰面积

太阳城集团*只有8(s)的峰面积>20%。

太阳城集团表12稳定性试验相对峰面积比值

如表所示,单峰面积大于20%的8#(对照峰)峰面积的RSD为2.88%,远小于5%,其余4个考察峰(或峰组)的面积比值RSD依次为2.64、5.23、6.16、7.75%。结果表明,本供试液具有可行的稳定性。

太阳城集团实验例4指纹图谱相似度分析

选用中南大学指纹图谱相似度评价软件,对10批蒺藜粗皂苷(制备方法同实施例3的方法)的采用实施例1高效液相-蒸发光散射指纹图谱方法,取其平均色谱或中位数色谱作为对比标样,进行全谱相似度分析。蒺藜粗皂苷指纹图谱的全谱相似度,均大于0.9,表明各组内10批样品的指纹图谱具有良好的相似性。

实验例5展开剂调整后的指纹图谱

太阳城集团取蒺藜粗皂苷(制备方法同实施例3的方法)2批,根据实施例2的方法测定指纹图谱,计算共有峰相对保留太阳城集团、峰面积及峰面积比值13,结果示出,十批粗皂苷的共有峰及其相对保留太阳城集团基本一致,其峰面积比值基本相同,也与蒺藜草的指纹图谱相吻合。

具体实施方式

实施例1:

色谱条件:室温:20℃,相对湿度:35%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60~90%乙腈溶液为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱,流速:0.4~0.6ml/min,柱温:25~45℃;蒸发光散射检测器:漂移管温度:105~120℃,气体流速:1~3L/min。

太阳城集团供试品溶液的制备:精密称取实施例3的蒺藜粗皂苷适量,加水适量,超声处理10分钟,放冷,滤过,制成每1ml含5mg的溶液,即得。

太阳城集团对照品溶液的制备:精密称取蒺藜呋甾皂苷甲对照品适量,加水制成每1ml含0.5mg的溶液,即得。

测定法:精密吸取供试品、对照品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。

蒸发光散射检测器检测,经HPLC分离的液体组分,进入检测器,经雾化,流动相被气化,检测组分形成的微小颗粒,对检测光形成散射作用,进而转化为电信号,转变为响应值。

供试品指纹图谱中,指纹图谱应有10个共有峰,与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S),计算各共有峰的相对保留太阳城集团和相对峰面积比值,相对保留太阳城集团为0.38,0.45,0.47,0.75,0.79,0.93,0.98,1.00,1.30,1.42。相对保留面积:1#0.62、2#0.4、4#0.3、6#0.32、8#1.00、10#0.26。

实施例2:

色谱条件:室温:20℃,相对湿度:35%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60~90%乙腈溶液为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱,流速:0.4~0.6ml/min,柱温:25~45℃;蒸发光散射检测器:漂移管温度:105~120℃,气体流速:1~3L/min。

太阳城集团供试品溶液的制备:精密称取实施例3的蒺藜粗皂苷适量,加水适量,超声处理10分钟,放冷,滤过,制成每1ml含5mg的溶液,即得。

对照品溶液的制备:精密称取蒺藜呋甾皂苷甲对照品适量,加水制成每1ml含0.5mg的溶液,即得。

测定法:精密吸取对照品、供试品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。

供试品指纹图谱中,指纹图谱应有13个共有峰,与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S),计算各共有峰的相对保留太阳城集团和相对峰面积比值,0.37,0.45,0.46,0.75,0.78,0.92,0.98,1.00,1.29,1.41,1.59,1.65,1.99。相对峰面积比值:1#0.62、2#0.4、4#0.3、6#0.32、8#1.00、10#0.26、12#0.69。

太阳城集团实施例3:蒺藜皂苷制备

取蒺藜草(蒺藜地上干燥部分)切段,分别加水5~15倍量,煎煮1~5次,每次1~4h,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.1~1.25(50~60℃),放冷,加入80%~99%乙醇,搅匀,静置1~5h,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,加水稀释,滤过,滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱,药液流速控制在400~700L/h,再用水洗至流出液近无色澄清,继用60%~85%乙醇洗脱至洗脱液无苦味,收集洗脱液,减压回收乙醇,浓缩至相对密度1.05~1.15(50~60℃),得蒺藜皂苷浓缩液,干燥,得蒺藜皂苷。

实施例4:

色谱条件:室温:20℃,相对湿度:35%;以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以60~90%乙腈溶液为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱,流速:0.4~0.6ml/min,柱温:25~45℃;蒸发光散射检测器:漂移管温度:105~120℃,气体流速:1~3L/min。

供试品溶液的制备:精密称取实施例5的蒺藜提取物适量,加水适量,超声处理10分钟,放冷,滤过,制成每1ml含5mg的溶液,即得。

测定法:精密吸取供试品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。

实施例5:

太阳城集团取蒺藜草(蒺藜地上干燥部分)切段,分别加水5~15倍量,煎煮1~5次,每次3h,合并煎液,滤过,滤液减压浓缩至相对密度1.1~1.25(50~60℃),放冷,加入85%乙醇,搅匀,静置4h,滤过,滤液减压回收乙醇至无醇味,干燥即得提取物。

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