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一种樟树中黄酮类化合物的提取方法及其用途.pdf

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一种 樟树 中黄 酮类 化合物 提取 方法 及其 用途
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摘要
申请专利号:

CN201210520923.0

申请日:

20121207

公开号:

太阳城集团CN102939997A

公开日:

20130227

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01N65/24,A01P3/00 主分类号: A01N65/24,A01P3/00
申请人: 井冈山大学
发明人: 殷帅文,朱峰,刘刚
地址: 343009 江西省吉安市青原区学苑路28号
优先权: CN201210520923A
专利代理机构: 北京东正专利代理事务所(普通合伙) 代理人: 蔡仲德
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201210520923.0

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明公开的一种樟树中黄酮类化合物的提取方法,该方法包括以下步骤:(1)取樟树的枝条,常温阴干后粉碎,有机溶剂振荡提取,得到的提取液过滤、浓缩,得到粗提物;(2)将上步得到的粗提物加蒸馏水溶解,用乙酸乙酯萃取,加入的蒸馏水与乙酸乙酯的体积比为1:1,萃取时收集乙酸乙酯相;(3)将上步得到的乙酸乙酯相浓缩,得到的乙酸乙酯相萃取物干法上样,经硅胶柱纯化即可,硅胶柱纯化时所用的洗脱液为氯仿与丙酮的混合液,洗脱液中氯仿与丙酮的体积比为20:1,黄酮类化合物存在收集的洗脱液中。本发明的优点提取方法操作简便、节能、提取率高,应用此方法提取出的黄酮类化合物还具有杀菌剂的作用,作用于植物品种广泛,对植物病原菌抑制率高。

权利要求书

1.一种樟树中黄酮类化合物的提取方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)取樟树的枝条,常温阴干后粉碎,用有机溶剂振荡提取,将得到的提取液过滤、浓缩,得到粗提物;(2)将上步得到的粗提物加蒸馏水溶解,再用乙酸乙酯萃取,加入的蒸馏水与乙酸乙酯的体积比为1:1,萃取时收集乙酸乙酯相;(3)将上步得到的乙酸乙酯相浓缩,得到的乙酸乙酯相萃取物干法上样,经硅胶柱纯化即可,硅胶柱纯化时所用的洗脱液为氯仿与丙酮的混合液,洗脱液中氯仿与丙酮的体积比为20:1,黄酮类化合物存在收集的洗脱液中。2.根据权利要求1所述的樟树中黄酮类化合物的提取方法,其特征在于,所述步骤(1)中粉碎的樟树枝条细度为60~80目。3.根据权利要求1所述的樟树中黄酮类化合物的提取方法,其特征在于,所述步骤(1)中振荡提取用的有机溶剂包括氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的一种、两种或两种以上混合。4.根据权利要求1所述的樟树中黄酮类化合物的提取方法,其特征在于,所述步骤(1)中利用空气浴振荡器进行振荡提取,温度在25°C以下,振荡提取2~5次,每次提取3小时。5.根据权利要求1所述的樟树中黄酮类化合物的提取方法,其特征在于,步骤(1)和步骤(3)中的浓缩都是利用旋转蒸发仪,温度在40°C以下进行,至有机溶剂完全蒸发掉时停止。6.根据权利要求1所述的樟树中黄酮类化合物的提取方法,其特征在于,所述步骤(3)的硅胶柱中硅胶的粒度为200~300目。7.应用权利要求1所述樟树中黄酮类化合物提取方法提取出的黄酮类化合物的用途,其特征在于,提取出的黄酮类化合物用作植物病原菌的杀菌剂。8.根据权利要求7所述的应用樟树中黄酮类化合物提取方法提取出的黄酮类化合物的用途,其特征在于,所述植物病原菌为小麦根腐病菌、玉米大斑病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌。

说明书

技术领域

本发明属于从植物中提取化学成份的技术领域,具体涉及樟树中黄酮类化合物的提取方法及其用途。

背景技术

樟树是樟科常绿大乔木,属亚热带常绿阔叶林的代表树种,广泛分布于中国长江以南各地,以台湾最多,植物全体均有樟脑香气,可提取樟脑和樟油。除此之外,樟树中的黄酮类化合物含量也很丰富,现有从植物中提取出的黄酮类化合物常用于消炎、消肿、降压降血脂的中药药材中,用途单一,可提取黄酮类化合物的植物品种不多,导致黄酮类化合物少,从而利用此化合物做成药剂的成本较高。

发明内容

为解决上述现有技术问题,本发明提供了一种从樟树中提取黄酮类化合物的方法,且发现利用此方法提取出的黄酮类化合物还具有杀菌剂的新用途。

为达到上述目的,本发明所采用的技术方案是:一种樟树中黄酮类化合物的提取方法,该方法包括以下步骤:(1)取樟树的枝条,常温阴干后粉碎,用有机溶剂振荡提取,将得到的提取液过滤、浓缩,得到粗提物;(2)将上步得到的粗提物加蒸馏水溶解,再用乙酸乙酯萃取,加入的蒸馏水与乙酸乙酯的体积比为1:1,萃取时收集乙酸乙酯相;(3)将上步得到的乙酸乙酯相浓缩,得到的乙酸乙酯相萃取物干法上样,经硅胶柱纯化即可,硅胶柱纯化时所用的洗脱液为氯仿与丙酮的混合液,洗脱液中氯仿与丙酮的体积比为20:1,黄酮类化合物存在收集的洗脱液中。

上述樟树中黄酮类化合物的提取方法,步骤(1)中粉碎的樟树枝条细度为60~80目。

上述樟树中黄酮类化合物的提取方法,步骤(1)中振荡提取所用的有机溶剂包括氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的一种或两种或两种以上混合。

太阳城集团上述步骤(1)中利用空气浴振荡器进行振荡提取,温度在25°C以下,振荡提取2~5次,每次提取3小时。

上述的方法中步骤(1)和步骤(3)中的浓缩都是利用旋转蒸发仪,温度在40°C以下进行,至有机溶剂完全蒸发掉时停止。黄酮类化合物不易溶于水,但是非常易于溶解于有机溶剂,先将枝条粉碎再浸入有机溶剂,有利于有机溶剂能够充分提取出枝条中的黄酮类化合物,采用空气浴振荡器振荡提取,避免了用水浴振荡时会把水引入有机溶剂中,水的沸点是100°C,所以再下一步利用旋转蒸发仪浓缩时,杂质水不能挥发出去,从而严重影响提取率,在利用空气振荡器提取时的温度为25°C以下,在振荡时也会产生少许热量,有机溶剂极易挥发,所以在此温度下最大限度的保证有机溶剂挥发量少,有利于有机溶剂从樟树条中提取黄酮类化合物充分,提高提取率。

本发明樟树中黄酮类化合物的提取方法步骤中,振荡提取后再进行过滤,此时可将樟树的枝条碎渣完全过滤掉,从而保证提取液的纯净、杂质少,再将粗提物用乙酸乙酯萃取,是因为第一步用有机溶剂提取时,有机溶剂能够溶解樟树中其它大部分的化合物,用乙酸乙酯萃取时,水相中溶解极性大的杂质,保证乙酸乙酯相中的黄酮类化合物纯净,经萃取后再一次在40°C以下进行浓缩,这样就会得到杂质更少的黄酮类化合物。 

太阳城集团上述步骤(3)的硅胶柱中硅胶的粒度为200~300目。

采用硅胶柱纯化是因为硅胶柱的主要特点是通过对混合物中的不同成份吸附保留太阳城集团的差异,达到分离提纯的目的,选择合适粒度的硅胶柱,利用干法上样,干法上样是指经步骤(2)得到的乙酸乙酯相萃取物再用丙酮、氯仿等有机溶剂溶解,在溶解液中放入适量的硅胶,拌匀,待有机溶剂完全挥发干后,转移至硅胶柱,倒入洗脱液洗脱,从而把黄酮类化合物分离出来,使提取率能够达到95%以上。

太阳城集团本发明的技术方案还包括应用所述樟树中黄酮类化合物提取方法提取出的黄酮类化合物的用途,提取出的黄酮类化合物用作植物病原菌的杀菌剂。打破了现在把黄酮类化合物单一的用在治疗消炎、消肿、降压降血脂的中药药材中的常规,发现其对植物病原菌也有抑制的作用,由于是在植物中提取出的,属于生物源杀菌剂,具有低毒、低残留、对环境影响小的优点,同时,也很少产生抗药性及药害,成本低,操作方法简便、节能、可实现规模化的工业生产,增加了现有杀菌剂的品种,推动了杀菌剂从高毒化学制剂逐步向低毒生物源制剂的转化。

上述黄酮类化合物的用途中,所述被抑制的植物病原菌为小麦根腐病菌、玉米大斑病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌。应用本发明的提取方法提取出的黄酮类化合物作为杀菌剂的应用,作用于植物的品种广泛,抑菌效果好,普遍的抑制率都能达到50%以上,由于属于生物源杀菌剂,和其它杀菌剂复配时,不会产生抗结作用,会增强杀菌效果。

综上所述,本发明公开的樟树中黄酮类化合物的提取方法,操作简便、节能、提取率高,应用此方法提取出的黄酮类化合物还具有杀菌剂的作用,作用于植物品种广泛,对植物病原菌抑制率高。

具体实施方式

下面结合具体实施例对发明内容做进一步的说明。

太阳城集团实施例一:本发明樟树中黄酮类化合物的提取方法,该方法包括以下步骤:(1)取樟树的枝条,常温阴干后粉碎,粉碎的枝条细度为60~80目,粉碎好的枝条浸入乙酸乙酯中,加入有机溶剂的量以高出枝条2~5厘米为准,利用空气浴振荡器进行振荡提取,温度在25°C以下,振荡提取2~5次,每次提取3小时,将得到的提取液过滤,完全滤掉枝条碎渣后浓缩,得到粗提物;

(2)将上步得到的粗提物加蒸馏水溶解,再用乙酸乙酯萃取三次,加入的蒸馏水与乙酸乙酯的体积比为1:1,萃取时收集乙酸乙酯相;

(3)将上步得到的乙酸乙酯相浓缩,得到的乙酸乙酯相萃取物干法上样,经硅胶柱纯化即可,硅胶柱纯化时所用的洗脱液为氯仿与丙酮的混合液,洗脱液中氯仿与丙酮的体积比为20:1,黄酮类化合物存在收集的洗脱液中。

上述步骤(3)的硅胶柱中的硅胶粒度为200~300目。

本发明试验时在选取合适的有机溶剂做萃取时,用各种溶剂做了大量的萃取试验,本实施例选取了三个例子说明用乙酸乙酯萃取出的化合物抑菌作用最强,步骤(1)均相同,经过步骤(1)后得到三份一样的粗提取,步骤(2)分别用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯把三份粗提物萃取,得到石油醚相、正丁醇相、乙酸乙酯相,后续步骤相同,把最终得到的石油醚相化合物、正丁醇相化合物、乙酸乙酯相化合物做抑菌试验。

抑菌试验的步骤:在无菌条件下,各取最终得到的石油醚相化合物、正丁醇相化合物、乙酸乙酯相化合物0.5ml,置于灭菌的10ml试管中,加入9.5ml50°C左右的PDA培养基,摇匀,倒入灭菌培养皿中制成平板,每种化合物制成三个平板重复为一组,每种化合物共有五组,平板凝固后放入生长一致的菌饼(直径约为6mm),选取小麦根腐病菌、玉米大斑病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌作为试验菌种,五种菌饼,每种菌饼置于每种化合物制成的三个重复平板上,同时采用上述步骤(3)中最后溶解萃取物的相应溶剂作为对照,27°C下培养4天观察结果,用十字交叉法测量供试真菌菌落生长的直径,用下述公式计算抑制率:

菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)×100%

太阳城集团(对照菌落直径-菌饼直径)

每种化合物抑制菌种的平均抑制率如下表所示,可以看出乙酸乙酯相的化合物对各种病菌都有很好的抑制作用,均达到50%以上,而其它两种有机相中的化合物抑制作用不大。

太阳城集团 化合物种类 抑制菌种 平均抑制率(%) 乙酸乙酯相化合物 小麦根腐病菌 71.12 乙酸乙酯相化合物 玉米大斑病菌 55.76 乙酸乙酯相化合物 棉花枯萎病菌 64.55 乙酸乙酯相化合物 西瓜枯萎病菌 52.86 乙酸乙酯相化合物 番茄早疫病菌 100.00 石油醚相化合物 小麦根腐病菌 21.12 石油醚相化合物 玉米大斑病菌 16.83 石油醚相化合物 棉花枯萎病菌 10.23 石油醚相化合物 西瓜枯萎病菌 11.85 石油醚相化合物 番茄早疫病菌 10.42 正丁醇相化合物 小麦根腐病菌 11.23 正丁醇相化合物 玉米大斑病菌 10.86 正丁醇相化合物 棉花枯萎病菌 9.57 正丁醇相化合物 西瓜枯萎病菌 12.56 正丁醇相化合物 番茄早疫病菌 13.87

实施例二:本发明樟树中黄酮类化合物的提取方法,该方法包括以下步骤:(1)取樟树的枝条,常温阴干后粉碎,粉碎的枝条细度为60~80目,粉碎好的枝条浸入丙酮中,也可浸入氯仿和丙酮按任意比例混合的有机溶剂中,加入有机溶剂的量以高出枝条2~5厘米为准,利用空气浴振荡器进行振荡提取,温度在25°C以下,振荡提取2~5次,每次提取3小时,将得到的提取液过滤,完全滤掉枝条碎渣后浓缩,得到粗提物;

太阳城集团(2)将上步得到的粗提物加蒸馏水溶解,再用乙酸乙酯萃取三次,加入的蒸馏水与乙酸乙酯的体积比为1:1,萃取时收集乙酸乙酯相;

(3)将上步得到的乙酸乙酯相浓缩,得到的乙酸乙酯相萃取物干法上样,经硅胶柱纯化即可,硅胶柱纯化时所用的洗脱液为氯仿与丙酮的混合液,洗脱液中氯仿与丙酮的体积比为20:1,黄酮类化合物存在收集的洗脱液中。

上述步骤(3)的硅胶柱中的硅胶粒度为200~300目。

步骤(3)中的干法上样是指经步骤(2)得到的乙酸乙酯相萃取物再用丙酮、氯仿等有机溶剂溶解,有机溶剂的用量取决于乙酸乙酯相的多少,一般是有机溶剂的量与乙酸乙酯相量的比为1~1.5:1,在溶解液中放入适量的硅胶,放入硅胶的量与乙酸乙酯相的量比为1.5~2:1,吸收有机溶剂,待有机溶剂完全挥发干掉后,转移至硅胶柱,倒入洗脱液洗脱,从而把黄酮类化合物分离出来。

上述步骤(3)中用氯仿与丙酮的混合液洗脱是经过大量试验得出的最佳条件,在本实施例中列举几个例子来说明选取的洗脱液及洗脱液的比例会得到黄酮类化合物。

洗脱液选取体积比为10:1的石油醚:乙酸乙酯、体积比为15:1的正丁醇:丙酮、体积比为10:1的氯仿:丙酮、体积比为20:1的氯仿:丙酮,各种洗脱液经薄层层析(TLC)检测, 其中薄层层析(TLC)检测时用茴香醛-硫酸作为显色剂,展开剂为:体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯,根据Rf值来判断洗脱液中的化合物是否为黄酮类化合物,黄酮类化合物的Rf值为0.5~0.6,只有体积比为20:1的氯仿:丙酮组成的洗脱液中化合物的Rf值为0.5~0.6,该化合物具有以下理化和波谱特性:核磁共振氢谱1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ: 6.69(1H, s, H-3), 7.94 (2H, m, H-2’, 6’), 7.56 (3H, m, H-3’,4’,5’), 4.05 (3H, s, OCH3), 4.03 (3H, s, OCH3), 12.71 (2H, s, OH);核磁共振碳谱 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ: 163.5 (C-2), 104.6 (C-3), 183.0 (C-4), 144.6 (C-5), 128.4 (C-6), 141.4 (C-7), 136.2 (C-8), 148.2 (C-9), 106.5 (C-10), 130.7 (C-1’),126.6 (C-2’,6’), 129.0 (C-3’,5’), 132.1 (C-4’), 60.4 (OMe ),61.1 (OMe).低分辨质谱 ESIMS m / z (rel. int.): [M+H]+ 315;经检定,化合物中主要成份为5,8-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮。

实施例三:一种樟树中黄酮类化合物的提取方法,该方法包括以下步骤:(1)、取樟树的枝条,常温阴干后粉碎,粉碎的枝条细度为60~80目,粉碎好的枝条浸入甲醇或乙醇中,加入有机溶剂的量以高出枝条2~5厘米为准,利用空气浴振荡器进行振荡提取,温度在25°C以下,振荡提取2~5次,每次提取3小时,将得到的提取液过滤,完全滤掉枝条碎渣后浓缩,得到粗提物;

太阳城集团(2)将上步得到的粗提物加蒸馏水溶解,再用乙酸乙酯萃取三次,加入的蒸馏水与乙酸乙酯的体积比为1:1,萃取时收集乙酸乙酯相;

(3)将上步得到的乙酸乙酯相浓缩,得到的乙酸乙酯相萃取物干法上样,经硅胶柱纯化即可,硅胶柱纯化时所用的洗脱液为氯仿与丙酮的混合液,洗脱液中氯仿与丙酮的体积比为20:1,黄酮类化合物存在收集的洗脱液中。

上述步骤(3)的硅胶柱中的硅胶粒度为200~300目。

太阳城集团根据实施例二,可得知最终提取到的黄酮类化合物中主要有5,8-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮,为了验证本发明方法能够得到95%以上的提取率,可以将已知浓度的5,8-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮标液添加到空白土壤中,利用本发明的提取方法,得到洗脱液中的黄酮类化合物,再经色谱仪器检测,根据峰面积计算出其浓度,得到的浓度比上标准液的浓度,就可得出方法的提取回收率。

验证试验的具体操作步骤:首先,选取的土壤里要不能含有农药等其它化学物质,经烘干后再用甲醇或乙醇溶解;

太阳城集团其次,选取5,8-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮标准品配置出一些列浓度的标准液,进入色谱仪器,根据各个浓度的峰面积,绘制出浓度与峰面积的曲线图;

最后,配制出已知浓度的5,8-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮标准液,如质量浓度为0.5ppm的5,8-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮标准液,将此标准液添加到土壤中重复步骤(1)~(3),步骤(3)的洗脱液用旋转蒸发仪,在温度40°C以下进行浓缩,直至洗脱液全部蒸发出去后,用乙酸乙酯溶解,取2ml溶解液进入色谱仪器,把其峰面积带入到上步做好的浓度与峰面积的曲线图中得出浓度,整个试验重复多次,最终经本发明方法回收得到标准液的平均浓度为0.48ppm,证明本方法的提取回收率超过95%,且可实现重复操作,提取回收率稳定。

太阳城集团实施例四:本发明樟树中黄酮类化合物的提取方法,该方法包括以下步骤:(1)取樟树的枝条,常温阴干后粉碎,粉碎的枝条细度为60~80目,粉碎好的枝条浸入有机溶剂中,加入有机溶剂的量以高出枝条2~5厘米为准,利用空气浴振荡器进行振荡提取,温度在25°C以下,振荡提取2~5次,每次提取3小时,将得到的提取液过滤,完全滤掉枝条碎渣后浓缩,得到粗提物;

(2)将上步得到的粗提物加蒸馏水溶解,再用乙酸乙酯萃取三次,加入的蒸馏水与乙酸乙酯的体积比为1:1,萃取时收集乙酸乙酯相;

(3)将上步得到的乙酸乙酯相浓缩,得到的乙酸乙酯相萃取物干法上样,经硅胶柱纯化即可,硅胶柱纯化时所用的洗脱液为氯仿与丙酮的混合液,洗脱液中氯仿与丙酮的体积比为20:1,黄酮类化合物存在收集的洗脱液中。

上述步骤(1)中的有机溶剂包括氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇中的一种或两种或两种以上混合。

太阳城集团上述步骤(3)的硅胶柱中的硅胶粒度为200~300目。

太阳城集团本实施例仅为进一步说明本发明,并非对发明做出的任何限制,凡在本发明实质上内容做出的简单修改和改进均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

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