太阳城集团

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一种猪精液冻存液及猪精液处理方法.pdf

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种猪 精液 冻存液 处理 方法
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN200810038642.5

申请日:

20080606

公开号:

太阳城集团CN101595866B

公开日:

20130508

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A01N1/02 主分类号: A01N1/02
申请人: 上海市农业科学院
发明人: 张德福,戴建军,殷方芝,吴彩凤,吴华莉,刘东
地址: 201106 上海市北翟路2901号
优先权: CN200810038642A
专利代理机构: 上海专利商标事务所有限公司 代理人: 张睿
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法律状态
申请(专利)号:

CN200810038642.5

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明公开了一种猪精液冻存液,所述的冻存液每100ml中含有:(a)5-20g乳糖;(b)0.005-0.05g?N-乙酰-D-氨基葡萄糖;(c)0.05-0.5gDHA;(d)1.0-5.0ml甘油;(e)0.2-1.5ml?OEP;(f)10-40ml卵黄;和(g)5-20万国际单位的青霉素和/或链霉素。本发明还公开了一种猪精液的处理方法,并提示通过本发明提供的方法处理的猪精液经过检测其精子的活力达到0.3-0.6,精子顶体完整率超过50%,完全符合目前人工授精的要求。

权利要求书

1.一种猪精液冻存液,其特征在于,所述的冻存液每100ml中含有:(a)5-20g乳糖;(b)0.005-0.05g N-乙酰-D-氨基葡萄糖;(c)0.05-0.5g二十二碳六烯酸;(d)1.0-5.0ml甘油;(e)0.2-1.5ml氨基-钠-十二烷基硫酸酯;(f)10-40ml卵黄;和(g)5-20万国际单位的青霉素和/或链霉素。2.如权利要求1所述的冻存液,其特征在于,所述的冻存液每100ml中含有:(a)8-15g乳糖;(b)0.008-0.04g N-乙酰-D-氨基葡萄糖;(c)0.08-0.4g二十二碳六烯酸;(d)1.5-4.0ml甘油;(e)0.3-1.0ml氨基-钠-十二烷基硫酸酯;(f)15-30ml卵黄;和(g)8-15万国际单位的青霉素和/或链霉素。3.一种如权利要求1所述的冻存液的用途,其特征在于,所述的冻存液用于保存猪精液。4.一种猪精液的处理方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:(1)将猪精液和如权利要求1所述的冻存液混合,得到含猪精液的混合物;(2)将步骤(1)得到的混合物加入5ml大管;和(3)将装有猪精液的大管投入液氮中冻存,得到冷冻保存的猪精液。5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,在步骤(1)得到的混合物中,猪精子的密度为0.5-4×10个/ml。6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,在步骤(1)得到的混合物中,猪精子的密度为0.8-3.0×10个/ml。7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1)包括以下步骤:(1′)将猪精液和乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、二十二碳六烯酸、卵黄和青霉素和/或链霉素混合,得到含猪精液的初始混合物,在每100ml初始混合物中含有:1-8g乳糖,0.008-0.05g N-乙酰-D-氨基葡萄糖,0.05-0.6g二十二碳六烯酸,3-20ml卵黄,1.5-10万国际单位的青霉素和/或链霉素;和(1″)将步骤(1′)所得到的含猪精液的初始混合物和乳糖、甘油、氨基-钠-十二烷基硫酸酯、卵黄和青霉素和/或链霉素混合,得到如权利要求4的步骤(1)中所述的含猪精液的混合物。8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1′)在室温下进行;所述的步骤(1″)在2-8℃进行。9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1′)在室温下进行;所述的步骤(1″)在3-6℃进行。10.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(1)中得到的含猪精液的混合物每100ml中含有2-16g乳糖、0.004-0.03gN-乙酰-D-氨基葡萄糖、0.03-0.3g二十二碳六烯酸、0.5-4ml甘油、0.125-1.0ml氨基-钠-十二烷基硫酸酯、5-30ml卵黄和2-10万国际单位的青霉素和/或链霉素。11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,步骤(1)中得到的含猪精液的混合物每100ml中含有3.5-12g乳糖、0.006-0.02g N-乙酰-D-氨基葡萄糖、0.06-0.25g二十二碳六烯酸、0.8-3ml甘油、0.18-0.7ml氨基-钠-十二烷基硫酸酯、8-20ml卵黄和3-8.5万国际单位的青霉素和/或链霉素。12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,步骤(1)中得到的含猪精液的混合物每100ml中含有5.5-8.5g乳糖、0.008-0.013g N-乙酰-D-氨基葡萄糖、0.10-0.15g二十二碳六烯酸、1.0-2.0ml甘油、0.25-0.5ml氨基-钠-十二烷基硫酸酯、10-15ml卵黄和5-7.5万国际单位的青霉素和/或链霉素。13.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的方法还包括步骤:(4)将步骤(3)得到的冷冻保存的猪精液和解冻液在25-70℃混合10-100秒;所述的每100ml解冻液中含有2.0-8.0g葡萄糖、0.05-0.25gEDTA、0.3-1.2g柠檬酸三钠、0.05-0.25g碳酸氢钠、0.03-0.20g氯化钾。14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,在步骤(4)中,将步骤(3)得到的冷冻保存的猪精液和解冻液在37-60℃混合25-80秒。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术,尤其涉及猪精液冻存液和猪精液的处理方法。

背景技术

精液冷冻技术对于充分发挥优良种猪的遗传潜力以及地方猪种遗传资源的保存均有极其重要的应用价值。猪的精液冷冻技术研究始于1956年,Polge等首次报道应用猪冷冻精液获得产仔。但几十年来,与牛、羊等家畜相比,猪的冷冻精液应用还相当有限,部分原因是因为猪冻精活力低、受胎率低、产仔数较鲜精少;部分原因是因为猪精液量大,传统的麦管(0.25/0.5ml)实际应用中操作不便;而颗粒法冷冻,易造成污染且不易标记。

太阳城集团国外畜牧研究人员一直在探索猪大容量包装,如5ml塑料袋、大管(5ml)等精液冷冻技术,使之像牛、羊等家畜一样做到一支麦管精液输一头母猪。但在使用大管法时,目前还没有理想的猪精液的稀释液添加剂、精子密度、冷冻及解冻方法等的提供。

因此,本领域迫切需要从精子活力、活率、弯尾率、顶体完整率等参数检查精子质量,以解冻后的精子质量、人工输精结果作为评价指标,筛选出最佳的猪精液冷冻方法和程序,从而提供高效、实用的猪精液冷冻生产工艺。

发明内容

太阳城集团本发明旨在提供一种猪精液的冻存液。

本发明的另一个目的是提供一种如上述的猪精液的冻存液的用途。

太阳城集团本发明的再一个目的是提供一种猪精液的处理方法。

在本发明的第一方面,提供了一种猪精液冻存液,所述的冻存液每100ml中含有:

(a)5-20g乳糖;

(b)0.005-0.05g N-乙酰-D-氨基葡萄糖;

太阳城集团(c)0.05-0.5g二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA);

(d)1.0-5.0ml甘油;

太阳城集团(e)0.2-1.5ml氨基-钠-十二烷基硫酸脂(Orvus Es Paste,OEP)

太阳城集团(f)10-40ml卵黄;和

(g)5-20万国际单位的青霉素和/或链霉素。

在另一优选例中,所述的冻存液每100ml中含有:

(a)8-15g乳糖;

太阳城集团(b)0.008-0.04g N-乙酰-D-氨基葡萄糖;

太阳城集团(c)0.08-0.4gDHA;

(d)1.5-4.0ml甘油;

(e)0.3-1.0ml OEP;

(f)15-30ml卵黄;和

(g)8-15万国际单位的青霉素和/或链霉素。

在本发明的第二方面,提供了一种如上所述的冻存液的用途,所述的冻存液可用于保存猪精液。

本发明的第三方面,提供了一种猪精液的处理方法,所述的方法包括步骤:

(1)将猪精液和如上所述的冻存液混合,得到含猪精液的混合物;

太阳城集团(2)将步骤(1)得到的混合物加入5ml大管;和

(3)将装有猪精液的大管投入液氮中冻存,得到冷冻保存的猪精液。

在另一优选例中,在步骤(1)得到的混合物中,猪精液的密度为0.5-4×109个/ml;更佳地,密度为0.8-3.0×109个/ml。

太阳城集团在另一优选例中,所述的步骤(1)包括以下步骤:

太阳城集团(1′)将猪精液和乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、DHA、卵黄、和青霉素和/或链霉素混合,得到含猪精液的初始混合物,在每100ml初始混合物中含有:1-8g乳糖,0.008-0.05g N-乙酰-D-氨基葡萄糖,0.05-0.6gDHA,3-20ml卵黄,1.5-10万国际单位的青霉素和/或链霉素;和

(1″)将步骤(1′)所得到的含猪精液的初始混合物和乳糖、甘油、OEP、卵黄、和青霉素和/或链霉素混合,得到如上述步骤(1)中所述的含猪精液的混合物。

太阳城集团在另一优选例中,所述的步骤(1′)在室温下进行;所述的步骤(1″)在2-8℃进行;更佳地,步骤(1″)在3-6℃进行。

在另一优选例中,步骤(1)中得到的含猪精液的混合物每100ml中含有2-16g乳糖、0.004-0.03g N-乙酰-D-氨基葡萄糖、0.03-0.3gDHA、0.5-4ml甘油、0.125-1.0ml OEP、5-30ml卵黄、和2-10万国际单位的青霉素和/或链霉素。

在另一优选例中,步骤(1)中得到的含猪精液的混合物每100ml中含有3.5-12g乳糖、0.006-0.02g N-乙酰-D-氨基葡萄糖、0.06-0.25gDHA、0.8-3ml甘油、0.18-0.7ml OEP、8-20ml卵黄、和3-8.5万国际单位的青霉素和/或链霉素;优选步骤(1)中得到的含猪精液的混合物每100ml中含有5.5-8.5g乳糖、0.008-0.013g N-乙酰-D-氨基葡萄糖、0.10-0.15gDHA、1.0-2.0ml甘油、0.25-0.5ml OEP、10-15ml卵黄、和5-7.5万国际单位的青霉素和/或链霉素。

在另一优选例中,所述的方法还包括步骤:

(4)将步骤(3)得到的冷冻保存的猪精液和解冻液在25-70℃混合10-100秒;所述的每100ml解冻液中含有2.0-8.0g葡萄糖、0.05-0.25gEDTA、0.3-1.2g柠檬酸三钠、0.05-0.25g碳酸氢钠、0.03-0.20g氯化钾;优选在37-60℃混合25-80秒。

据此,本发明提供了最佳的猪精液冷冻方法和程序,从而提供了高效、实用的猪精液冷冻生产工艺。

附图说明

图1显示了大管冷冻工艺。

图2显示了大管冷冻的主要器具。

太阳城集团图3显示了不同解冻温度解冻后精子质量变化曲线。

具体实施方式

太阳城集团发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现了一种猪精液的冷冻保存液,它可以长久而有效地保持猪精液中精子的活力、活率、质膜完整性和顶体完整性。另外,发明人发现使用大管对上述处理的猪精液进行冷冻保存,能克服常规颗粒法易造成污染好不易标记的缺点。进一步地,发明人还发现了解冻温度和太阳城集团对上述冻精活力等的影响。

具体地,发明人发现可以将猪精液和含有DHA的溶液混合后,在大管中进行冻存。较佳地,将猪精液通过两次稀释后所得到的混合溶液进行冻存,所述混合溶液中含有DHA。

如本文所用,“二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,含6个不饱和键)”是一种ω-3脂肪酸,所谓的ω-3脂肪酸是指在多不饱合脂肪酸分子中,距羧基最远端的双键在倒数第3个碳原子上。本发明中的DHA可以由本领域技术人员所熟知的方式获得,例如通过化学合成、或提取自海洋生物(如海鱼)等。本发明所使用的DHA中可以含有少量其它的属于ω-3脂肪酸的物质,例如但不限于二十碳五烯酸(Eicosapen taenoic acid,EPA,含5个不饱和键),所述的少量物质的含量为0-10wt%,较佳地为0-5wt%,更佳地为0-2wt%。

太阳城集团如本文所用,“大管”是指在冷冻猪精液中所使用的放置猪精液和相关处理溶液的管状容器,容器材料可以是本领域技术人员所熟知的;其容量可以是2-10ml,较佳地是4-6ml。在本发明的一个优选例中,所述的大管是本领域熟知的可以通过任何商业渠道所获得的,例如但不限于德国米尼图公司所生产的。

如本文所用,“卵黄”是指鸡蛋黄。

太阳城集团如本文所用,“室温”和“常温”可互换使用,都是指10-30℃,优选15-25℃。

本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于:

1、本发明提供的猪精液冻存液可以使冻存的猪精液保持活力;

2、利用本发明冷冻后的精液经过检测其精子的活力达到0.3-0.6,精子顶体完整率超过50%,完全符合目前人工授精的要求。

太阳城集团下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

精子活力检测方法、精子弯尾率检测方法、和精子顶体完整率检测方法可参阅《动物繁殖学》,江苏科学技术出版社,王元兴,郎介金主编,1997,327-331页。

上述检测方法都是在解冻后进行。

精子活力的测定:采用平板压片法,取一滴精液(10μl)于预热(38℃)的载玻片上,盖上盖玻片,400×相差显微镜下镜检,估测活力(十级评分法)。

太阳城集团质膜完整性的检查:采用低渗肿胀法,取50μl精液加入1ml低渗液(37℃预热)中,37℃恒温水浴30分钟。取一滴(20μl)混合液于血细胞计数板上,40×相差显微镜下观察5个视野,镜检计数200个精子,计算弯尾精子的百分率。

太阳城集团弯尾率=尾部弯曲精子数/总精子数×100%

太阳城集团顶体完整性的检查:姬姆莎染色后,相差显微镜1000×下随机观察200个精子,计算顶体异常率。

姬姆萨染色制片:①制片:取10μl精液于载玻片一头,用一边缘整齐的玻片呈35°角将精液样品均匀拖布于载玻片上,自然风干,制成精液涂片。②固定:立即吸取10%福尔马林固定液1-2ml滴于自然风干的涂片上,固定15min,用水轻轻冲洗,洗去固定液,自然风干。③染色:将姬姆萨染液滴于涂片上,染色1.5h,然后用水轻轻冲洗,晾干备检。

本发明实施例中的主要物质的来源为:

太阳城集团   物质   购自   乳糖   上海恒信化学试剂有限公司   葡萄糖   国药集团化学试剂有限公司   EDTA   Genview公司产品,购自北京鼎国生物技术  有限责任公司   N-乙酰-D-氨基葡萄糖   Sigma公司产品,购自北京鼎国生物技术有  限责任公司   DHA   丽珠医药集团股份有限公司   柠檬酸三钠   上海试剂一厂   碳酸氢钠   上海虹光化工厂   氯化钾   上海试一化学试剂有限公司   甘油   Sigma公司产品,购自北京鼎国生物技术有  限责任公司   Orvus ES Paste   NOVA CHEMICAL SALES,INC.   卵黄   上海农业科学院畜牧兽医研究所所属鸡场   青霉素   上海新先锋药业有限公司   链霉素   上海新先锋药业有限公司

本发明实施例中的通用操作:

一、精液准备

太阳城集团购自上海市南汇区瓦屑猪场的上海白猪,11头成年、体质健康、性欲旺盛、采精频率正常的公猪,轮流采精,共采精23次;

太阳城集团购自上海市嘉定修清猪场的6头小型梅山种公猪精液。

二、精液采集

太阳城集团手握法采精,收集中段精液浓厚部分,经四层纱布过滤,除去胶状物。用HARMONY稀释液(购自上海东晋畜牧技术有限公司)在等温条件下作1∶1稀释,保存于保温瓶中,2小时内运回实验室。

三、精液预处理和品质检查

太阳城集团室温下(15-25℃)静置2小时,使精液缓慢降温到室温(20-23℃)。用显微镜于37℃下进行常规品质检查。选择无异味、色泽乳白色、精子形态正常、活力在0.7以上、密度为“密”(每毫升含2亿精子以上为“密”)的精液供试。

四、精液的稀释与平衡

太阳城集团室温下静置2小时,每隔0.5小时轻轻晃动贮精瓶。用大离心管(250ml)分装精液,室温下离心,1730转/分,10分钟,弃上清液。采用二次稀释法进行稀释,先在室温下用稀释液I液(见表1)作一定体积比的稀释,然后将稀释精液和稀释液II液一起放入4℃冰箱内,缓慢降温到4℃(约2小时)。用稀释液II液(见表1)作一定体积比稀释,得到含猪精液的混合物。检查精子活力,取活力在0.6以上的精液直接进行冷冻。

表1稀释液I液、稀释液II液和解冻液的成份

太阳城集团   成份   稀释液I液   稀释液II液   BTS(解冻液)   乳糖(g)   √   √   葡萄糖(g)   √   EDTA(g)   √   N-乙酰-D-氨基葡萄  糖(g)   √   DHA(ml)   √   柠檬酸三钠(g)   √   碳酸氢钠(g)   √   氯化钾(g)   √   甘油(ml)   √   Orvus ES Paste(ml)   √   卵黄(ml)   √   √   青霉素、链霉素(IU)   √   √

五、制作冷冻精液

太阳城集团大管法:5ml大管由德国米尼图公司生产。用小钢球先将5ml大管的一端封口,在管壁上做好标记,然后于4℃预冷2小时。用20ml注射器吸取5ml处理好的精液,从大管未封口一端注入,剩约3cm的一段空管时停止注入,也用小钢球将这端封口。擦干大管外面的水珠,倾斜大管,使空气泡段位于大管的中央。将大管置于广口冷冻容器内充分预冷的管架上,距离液氮面以上3-5cm处(以3cm为最佳),熏蒸20分钟,然后投入液氮罐提桶内保存。见图1和图2。

颗粒法(对照):将平衡好的精液,用铝盒盖冷冻。向广口冷冻容器(大泡沫聚苯乙烯盒)内注入2/3左右液氮,将铝饭盒飘浮于液氮面上,再将铝盒盖反盖于饭盒上。待冷却平衡约5分钟,冷冻面充分预冷后,用20ml注射器吸取稀释好的精液,在铝盒盖上连续滴冻,每滴剂量约为0.1ml,滴冻太阳城集团一般在40-50秒,滴30滴左右后,待颗粒充分凝固。将颗粒铲下,放入标记好的纱布袋内投入液氮中保存。

六、解冻操作

大管法:用镊子将大管迅速从液氮罐中取出,于在一定温度的水浴中放置一定太阳城集团。待精液溶解约1/2-2/3时,取出大管,剪开两端,将精液与预热的37℃解冻液混合。

颗粒法(对照):湿解冻法,用试管盛一定量解冻液,39℃水浴,然后,用长镊子将颗粒冻精迅速从液氮罐中取出,空气中停留10秒后投入解冻液中,快速震荡试管使之融化。干解冻法,将干净铝盒于39℃水浴,用长镊子将颗粒冻精迅速从液氮罐中取出,放入铝盒中,待颗粒融化后,与同温解冻液混合。

七、人工授精

取解冻好的精液,倒入输精瓶中,再缓慢倒入同温度的常温保存液,稀释至80ml,冻精解冻后每个输精剂量为40ml,活精子数达30亿以上。以母猪接受爬跨开始计算受体母猪的发情太阳城集团,输精两次,首次输精在发情后12-14小时内进行,12小时后再输一次。

实施例1-4

经过上述通用操作步骤一至四得到如表2的各成分的使用浓度的含有猪精液的混合溶液;然后根据步骤五进行大管法冷冻。

表2

效果例1-4

将实施例1-4得到的冷冻精液经过上述的通用操作步骤六的大管法解冻(45℃70秒)后,进行精子活力、弯尾率和顶体完整率的检测,结果如表3。

表3

太阳城集团   实施例   活力   活率(%)   弯尾率(%)   顶体完整率(%)   实施例1   0.38±0.07a   51.43±7.03   49.28±6.55   49.30±6.31a   实施例2   0.41±0.03a   50.07±3.27   46.64±6.96   50.78±9.85a   实施例3   0.41±0.03b   52.74±6.09   48.60±8.66   61.96±5.76b   实施例4   0.48±0.08b   47.68±8.18   52.08±8.68   59.47±7.53b

注:同列肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),大写字母不同表示差异极显著(P<0.01),试验重复10次。以下各表同。

结果表明,稀释液I液中添加0.15%、0.3%DHA对解冻后精子活力和顶体完整性影响显著(P>0.05)。

实施例5-9

太阳城集团经过上述通用操作步骤一至四得到如表4的各成分的使用浓度的含有猪精液的混合溶液;然后根据步骤五进行大管法冷冻。

表4

效果例5-9

太阳城集团将实施例5-9得到的冷冻精液经过上述的通用操作步骤六的大管法解冻(45℃70秒)后,进行精子活力、弯尾率和顶体完整率的检测,结果如表5。

表5

  实施例   活力   活率(%)   弯尾率(%)   顶体完整率(%)   实施例5   0.36±0.08ab   43.44±8.13ab   53.83±7.03   54.69±4.53ab   实施例6   0.42±0.04a   50.56±2.69a   52.73±7.38   62.72±7.64a   实施例7   0.41±0.06a   50.94±5.49a   53.61±7.40   61.69±7.81a   实施例8   0.36±0.03ab   44.21±1.54ab   44.75±3.92   48.25±6.53b   实施例9   0.32±0.03b   38.74±6.35b   46.23±4.23   47.36±6.92b

太阳城集团结果表明,稀释精液中1%-3%的甘油浓度能有效保护精子质膜,精子冻后弯尾率高于甘油浓度为4%、5%的稀释精液,但差异不显著(P>0.05)。2%、3%的甘油浓度对精子顶体有较好的保护作用,顶体完整性显著高于4%、5%甘油浓度(P<0.05)。

实施例10-14

太阳城集团经过上述通用操作步骤一至四得到如表6的各成分的使用浓度的含有猪精液的混合溶液;然后根据步骤五进行大管法冷冻。

表6

效果例10-14

将实施例10-14得到的冷冻精液经过上述的通用操作步骤六的大管法解冻(45℃70秒)后,进行精子活力、弯尾率和顶体完整率的检测,结果如表7。

表7

太阳城集团   实施例   活力   活率(%)   弯尾率(%)   顶体完整率(%)   实施例10   0.42±0.04   51.59±8.87   50.85±2.97   57.88±9.92b   实施例11   0.43±0.04   48.68±6.94   53.30±7.47   61.58±6.63ab   实施例12   0.40±0.05   54.21±3.11   49.97±3.19   70.83±7.80a   实施例13   0.45±0.05   53.76±5.80   48.24±7.47   73.59±4.87a   实施例14   0.40±0.06   48.22±6.18   51.64±5.15   61.41±3.37ab

结果表明,稀释液中添加不同剂量的N-乙酰-D-氨基葡萄糖对精子的活力、活率和弯尾率影响不显著(P>0.05),终浓度为0.05%和0.1%组N-乙酰-D-氨基葡萄糖对精子顶体有保护作用,顶体完整率显著高于未添加组(P<0.05)。

实施例15-19

太阳城集团经过上述通用操作步骤一至四得到如表8的各成分的使用浓度的含有猪精液的混合溶液;然后根据步骤五进行大管法冷冻。

表8

效果例15-19

将实施例15-19得到的冷冻精液经过上述的通用操作步骤六的大管法解冻(45℃70秒)后,进行精子活力、弯尾率和顶体完整率的检测,结果如表9。

表9

  实施例   活力   弯尾率(%)   顶体完整率(%)   实施例15   0.03±0.06c   8.31±1.81c   59.92±2.94a   实施例16   0.40±0.10a   28.25±5.67a   55.47±5.28a   实施例17   0.41±0.05a   19.81±4.62b   47.14±7.69ab   实施例18   0.28±0.05b   11.83±2.17c   19.97±11.85b   实施例19   0.30±0.10ab   13.74±8.03bc   32.70±12.49b

太阳城集团结果表明,冷冻保护液中添加的卵黄终浓度分别为5%、10%、20%、25%和30%。由表3可知,10%和20%的卵黄能有效保护精子活力、质膜和顶体,显著高于卵黄浓度为25%和30%组(P<0.05)。

实施例20-22

经过上述通用操作步骤一至四得到如表10的各成分的使用浓度的含有猪精液的混合溶液;然后根据步骤五进行大管法冷冻。

表10

效果例20-22

将实施例20-22得到的冷冻精液经过上述的通用操作步骤六的大管法解冻(45℃70秒)后,进行精子活力、弯尾率和顶体完整率的检测,结果如表11。

表11

  实施例   活力   活率(%)   弯尾率(%)   顶体完整率(%)   实施例20   0.44±0.05   55.35±4.95   53.61±4.11   62.84±9.04   实施例21   0.41±0.05   52.14±7.51   57.91±3.74   67.92±9.84   实施例22   0.41±0.05   54.18±8.59   49.75±7.04   60.02±8.01

结果表明,精子密度为1.0×109个/ml时,解冻后精子活力和活率最高,但与其他两组相比差异不显著(P>0.05)。精子密度为1.5×109个/ml时,解冻后精子弯尾率和顶体完整率最高,与其他两组相比差异也不显著(P>0.05),三个密度下冷冻猪精子效果差异不显著,在此范围内用高密度精子进行冷冻是可行的。

实施例23

太阳城集团经过上述通用操作步骤一至四得到如表12的各成分的使用浓度的含有猪精液的混合溶液;然后根据步骤五进行大管法冷冻。

表12

太阳城集团将上述得到的冷冻精液经过上述的通用操作步骤六的大管法解冻,但解冻条件如表13所示,然后进行精子活力、弯尾率和顶体完整率的检测,结果如表13和图3。

表13

  解冻温度(℃)  和解冻太阳城集团  (s)   融后温度  (℃)   活力   活率(%)   弯尾率(%)   顶体完整率  (%)   37℃ 30s   8.6   0.23±0.05De   33.43±  7.55Cd   31.50±  8.34Dd   56.44±  8.65ABab   37℃ 60s   23.4   0.34±  0.07BCDcd   43.76±  6.24ABCbc   40.64±  5.36ABCDbcd   58.90±  7.76Aab   37℃ 90s   29.2   0.43±  0.07ABabc   52.54±  8.14Aab   48.03±  3.90ABCab   56.35±  3.60ABab   45℃ 50s   22.3   0.29±  0.04CDde   39.10±  7.72BCcd   42.69±  8.60ABCDbc   58.63±  5.43Aab   45℃ 60s   26.8   0.39±  0.03ABCbc   47.89±  2.43ABabc   51.36±  7.07ABab   62.51±  6.61Aa   45℃ 70s   31.6   0.45±  0.04ABab   55.98±  4.69Aa   51.49±  2.79ABab   63.70±  5.70Aa   52℃ 25s   8.9   0.39±  0.06ABCbc   48.65±  4.92ABab   51.27±  4.90ABab   65.40±  4.86Aa   52℃ 35s   21.6   0.46±  0.04ABab   55.54±  3.68Aa   54.35±  8.14Aa   65.40±  4.86Aa   52℃ 45s   32.4   0.45±   46.82±   51.49±   55.40±

  0.09ABab   7.10ABabc   2.79ABab   9.51ABab   60℃ 20s   11.0   0.43±  0.07ABabc   45.34±  4.29ABCbc   34.01±  7.73CDcd   56.61±  7.56ABab   60℃ 30s   21.4   0.48±0.05Aab   47.58±  6.13ABabc   43.76±  6.24ABCDabc   48.76±  6.18ABCbcd   60℃ 40s   27.1   0.49±0.05Aa   53.21±  5.07Aab   53.86±  5.88Aa   53.71±  8.50ABCab   68℃ 20s   14.2   0.49±0.07Aa   52.07±  7.55Aab   35.77±  5.58CDcd   40.47±  5.45BCd   68℃ 30s   24.3   0.46±  0.03ABab   47.89±  2.43ABabc   37.22±  7.83BCDcd   41.23±  9.25BCcd   68℃ 40s   30.8   0.47±0.07Aab   51.21±  4.06ABab   33.86±  6.51CDcd   37.45±  9.16Cd

太阳城集团结果表明,45℃、70s、52℃、35s是5ml大管解冻效果较好的组合。

实施例24

太阳城集团经过上述通用操作步骤一至四得到如表14的各成分的使用浓度的含有猪精液的混合溶液;然后根据步骤五进行大管法冷冻。

表14

太阳城集团将上述得到的冷冻精液经过上述的通用操作步骤六的大管法解冻(45℃70秒)后,精液经过检测其精子的活力达到0.3-0.6,精子顶体完整率超过50%,完全符合目前人工授精的要求,在进行上述的通用操作步骤七的人工授精后,效果显示如下:

上海白猪:应用上述程序制备的精液进行人工输精,一共输精18头母猪。结果13头母猪妊娠产仔(受胎率72.2%),平均每窝产仔7.8头,最少的产2头,最多的产12头。

小型梅山猪:输精22头母猪。结果18头母猪妊娠产仔(受胎率81.8%),平均每窝产仔8.6头,最少的产4头,最多的产13头。

太阳城集团以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用以限定本发明的实质技术内容范围,本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中,任何他人完成的技术实体或方法,若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同,也或是一种等效的变更,均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

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