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巴马丁在制备治疗登革病毒感染药物中的应用.pdf

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巴马 制备 治疗 病毒感染 药物 中的 应用
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN200910063164.8

申请日:

20090714

公开号:

CN101596192B

公开日:

20110817

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K31/4375,A61P31/12 主分类号: A61K31/4375,A61P31/12
申请人: 中国科学院武汉病毒研究所
发明人: 袁志明,贾凡,邹罡,李晶,石沛勇,郑大胜,蔡全信,闫建平
地址: 430071 湖北省武汉市武昌小洪山
优先权: CN200910063164A
专利代理机构: 武汉宇晨专利事务所 代理人: 王敏锋
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法律状态
申请(专利)号:

CN200910063164.8

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种巴马丁在治疗登革病毒感染药物中的应用,巴马丁在100μM浓度下对登革病毒(dengue?virus,DENV)抑制率为94.95%,而巴马丁在浓度为100μM条件下,Vero细胞的存活率为92.93%。巴马丁能够有效地抑制登革病毒的增殖,但是对细胞毒性很小,可进一步开发为治疗登革病毒感染引起的疾病的药物,具有广泛的应用前景。

权利要求书

1.一种巴马丁在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用。

说明书



技术领域

本发明属于生物医药领域,更具体涉及一种巴马丁在治疗或预防登革病毒感染药物中的应用。

背景技术

登革病毒(Dengue virus,DENV)能够引起登革热,其通过伊蚊传播,严重感染者出现登革出血热和登革休克综合症,病死率极高。该病毒有四个血清型,血清2型是流行毒株。本病主要在东南亚,太平洋地区和美洲的热带和亚热带国家中流行。中国广东省,海南省,广西省曾经有14次不同规模的登革热流行。中国登革热的主要传播媒介是埃及伊蚊和白蚊伊蚊。前者分布于南方沿海地区,后者则在南北地区广泛存在南北地区。有报道显示已经从蚊子体内分离到登革病毒。但是,目前在临床上还没有有效的治疗药物。

因此,我们应该高度重视对登革病毒的研究,加强对其的科研力度,做好相关知识和药物的储备,为我国在防控登革病毒感染的方面做出一定的贡献。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种巴马丁在作为制备治疗或预防登革病毒感染药物中的应用。巴马丁在100μM浓度下对DENV的抑制率为94.95%。而巴马丁在浓度为100μM条件下,Vero细胞的存活率为92.93%。巴马丁能够有效地抑制登革病毒的增殖,但是对细胞毒性很小,可进一步开发为治疗登革病毒感染疾病的药物,具有广泛的应用前景。

太阳城集团为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

巴马丁来源于中药黄连,是黄连的主要成份之一,目前,巴马丁已经在临床上用于治疗妇科炎症,菌痢,肠炎,呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。

太阳城集团A.巴马丁对Vero细胞的毒性实验:

太阳城集团Vero细胞是DENV的易感细胞。因此,本实验首先检测巴马丁对Vero细胞的细胞毒性,以不同浓度的巴马丁作用于Vero细胞,来了解在细胞存活率为90%以上的巴马丁的最大使用浓度,为后续的巴马丁对DENV的抑制作用实验提供参考数据。

B、巴马丁对DENV的抑制实验:

太阳城集团以不同浓度的巴马丁作用于已经感染了DENV的Vero细胞,来获得巴马丁对病毒的抑制效率。本实验中的巴马丁的使用浓度均在使Vero细胞在90%以上存活率的浓度的范围内,因此,可以排除巴马丁的浓度过高而对实验数据的分析产生影响。

太阳城集团巴马丁在治疗或预防登革病毒感染药物中的(抑制)应用,其基本过程是:

太阳城集团A.巴马丁对Vero细胞的毒性实验:

太阳城集团Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是DENV的易感细胞。实验中的Vero细胞购买于中国科学院上海生科院细胞资源中心;MTT试剂盒购于碧云天生物技术研究所;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)购买于美国GIBCO公司;细胞培养板购买于德国Greiner bio one公司;DMEM培养基和MEM培养基购买于美国GIBCO公司。

实验步骤如下:

太阳城集团1:接种Vero细胞:用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板,每孔接种体积100μl;

太阳城集团2:培养Vero细胞:在37℃,5%(v/v)CO2培养条件下,培养2天;

3:加入巴马丁:吸弃每个孔中的DMEM培养基,向各个孔中加入100μl用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0μM,0.4μM,1.2μM,3.7μM,11μM,33μM,100μM,300μM)的巴马丁,对照孔加不加含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基100μl;

4:呈色:培养48小时后,每孔加MTT溶液10μl,在37℃,5%(v/v)CO2培养条件下继续孵育4小时,然后加入Formazan溶解液,在37℃,5%(v/v)CO2培养条件下继续孵育4小时,直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶 解;

太阳城集团5.测量:在570nm测定吸光值。

太阳城集团表1不同浓度的巴马丁对Vero细胞的毒性实验

B、巴马丁对DENV的抑制实验:

太阳城集团以Vero细胞为培养病毒DENV的细胞,MOI为0.1,实验步骤如下:

在24孔细胞培养板中接入Vero细胞,24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80-90%),吸出培养基,接入病毒样品200μl,37℃吸附2小时。吸附完成后,吸弃各孔中的病毒液,用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0μM,0.4μM,1.2μM,3.7μM,11μM,33μM,100μM)的巴马丁,于37℃、5%(v/v)CO2的培养箱中培养42小时,收集各个孔中的上清,做病毒噬斑实验。

病毒噬斑实验:在24孔板中接入Vero细胞,24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80-90%),吸弃各孔中的培养基,接入用含3%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200μl,37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃,用10%(v/v)FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[A成分:3%(v/v)FBS,2×MEM培养基,青霉素(美国AMRESCO)和链霉素(美国AMRESCO)终浓度分别为100U/ml,0.1mg/ml;B成分:1%(w/v)的琼脂糖(法国Biowest)。A成分∶B成分=1∶1(v/v)],于37℃、5%(v/v)CO2的培养箱中培养48~72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国AMRESCO)染色[2%(w/v)结晶紫溶于10%(v/v)甲醛],2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖,在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑,根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml,PFU:plaque formation unit 噬斑形成单位)。PFU=病毒稀释度×P/V,(P:空蚀斑数目;V:接种量)。在2次不同的太阳城集团进行实验。

表2不同浓度的巴马丁对DENV滴度降低实验

太阳城集团本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:本发明通过对DENV的抑制实验证实了巴马丁对DENV具有很好的抑制作用,从本质上证明了该药物在治疗DENV感染疾病中具有广泛的应用前景。同时,巴马丁来源于中药黄连,获取十分方便,同时巴马丁在临床上已经使用多年,因此,其临床使用很安全性。加强对黄病毒科黄病毒属病毒引起的疾病重视程度,增强对药物和疫苗的研发力度,十分重要。研制治疗登革病毒引起的疾病的药物,以便对疾病进行有效的预防和治疗,具有巨大的社会效益和研究价值。巴马丁来源于中药黄连(现有中药),由于中药是中国重要的自然资源,具有很强的民族特色,而且一些报道也显示:中药在预防和治疗一些疾病的过程中发挥着重要的作用。中药在一定程度上能有效地增强机体的免疫力,毒副作用较小甚至无毒副作用。同时,由于巴马丁已经用于临床治疗妇科炎症,菌痢,肠炎,呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。因此该发明能够为临床治疗由DENV引起的疾病提供很好的后选药物,具有十分良好的应用前景。

附图说明

太阳城集团图1巴马丁对Vero细胞的毒性实验

巴马丁对Vero的细胞毒性实验,在0μM,0.4μM,1.2μM,3.7μM,11μM,33μM,100μM,300μM浓度下,Vero细胞的平均存活率分别为100%,96.87%,98.70%,93.77%,96.56%,95.04%,92.93%,83.88%。

太阳城集团图2巴马丁对DENV的抑制作用

巴马丁对DENV的抑制作用,在0μM,0.4μM,1.2μM,3.7μM,11μM,33μM,100μM浓度下,分别在不同的太阳城集团进行实验,病毒的滴度分别为6.4×106PFU/mL,5.3×106PFU/mL,5.2×106PFU/mL,4.6×106,4.9×106PFU/mL,2.0×106PFU/mL,3.7×105PFU/mL和9.5×106PFU/mL,8.3×106PFU/mL,7.2×106PFU/mL,6.6×106,5.9×106PFU/mL,3.2×106PFU/mL,4.1×105PFU/mL,起平均抑制率分别为0%,14.91%,21.48%,29.33%,30.67%,67.53%,94.95%。

图3巴马丁的结构和分子式

中文名:巴马丁

太阳城集团英文名:Palmatine

分子式:C21H22NO4

分子量:352.40

CAS号:3486-67-7

具体实施方式

实施例1:

太阳城集团巴马丁作为在制备治疗或预防登革病毒感染药物中的(抑制)应用,其基本过程是:

A.巴马丁对Vero细胞的毒性实验:

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是DENV的易感细胞。

实验步骤如下:

1:接种Vero细胞:用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔细胞培养板,每孔接种体积100μl;

太阳城集团2:培养Vero细胞:在37℃,5%(v/v)CO2培养条件下,培养2天;

太阳城集团3:加入巴马丁:吸弃每个孔中的DMEM培养基,向各个孔中加入100μl用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0μM,0.4μM,1.2μM,3.7μM,11μM,33μM,100μM,300μM)的巴马丁,对照孔加不加含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基100μl;

4:呈色:培养48小时后,每孔加MTT溶液10μl,在37℃,5%(v/v)CO2 培养条件下继续孵育4小时,然后加入Formazan溶解液,在37℃,5%(v/v)CO2培养条件下继续孵育4小时,直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解;

太阳城集团5.测量:在570nm测定吸光值。

太阳城集团6.实验结果见图1。

太阳城集团B、巴马丁对DENV的抑制作用:

以Vero细胞为培养病毒DENV的细胞,MOI为0.1,实验步骤如下:

1.在24孔细胞培养板中接入Vero细胞,24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80-90%),吸出孔中的DMEM培养基,接入病毒样品200μl,37℃吸附2小时。吸附完成后,吸弃各孔中的病毒液,用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0μM,0.4μM,1.2μM,3.7μM,11μM,33μM,100μM)的巴马丁,于37℃、5%(v/v)CO2的培养箱中培养42小时,收集各个孔中的上清,做病毒噬斑实验。

2.病毒噬斑实验:在24孔板中接入Vero细胞,24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80-90%),吸弃各孔中的培养基,接入用含3%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200μl,37℃吸附2小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸弃,用10%(v/v)FBS的DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的45℃预热的半固定培养基[A成分:3%(v/v)FBS,2×MEM培养基,青霉素和链霉素终浓度分别为100U/ml,0.1mg/ml;B成分:1%(w/v)的琼脂糖(法国Biowest)。A成分∶B成分=1∶1(v/v)],于37℃、5%(v/v)CO2的培养箱中培养48~72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国AMRESCO)染色(2%(w/v)结晶紫溶于10%(v/v)甲醛),2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖,在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑,根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml,PFU:plaque formation unit噬斑形成单位)。PFU=病毒稀释度×P/V,(P:空蚀斑数目;V:接种量)。

太阳城集团3.实验结果见图2。

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