太阳城集团

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用于诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫反应的多肽.pdf

关 键 词:
用于 诱导 针对 金黄色 葡萄球菌 保护性 免疫 反应 多肽
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN200480021391.X

申请日:

20040722

公开号:

CN1980692A

公开日:

20070613

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K39/02,A61K39/09,A61K39/00,C07K1/00,C07K2/00,A01N37/18 主分类号: A61K39/02,A61K39/09,A61K39/00,C07K1/00,C07K2/00,A01N37/18
申请人: 麦克公司
发明人: A·S·安德森,K·U·扬森,R·凯利,L·D·舒尔茨,D·L·蒙特戈梅里,W·L·麦克莱门茨
地址: 美国新泽西州
优先权: 60/489,840,60/520,115
专利代理机构: 中国专利代理(香港)有限公司 代理人: 张轶东;王景朝
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN200480021391.X

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明表征了包含结构上与SEQ ID NO:1有关的氨基酸序列的多肽、这样的多肽的用途、和用于生产这样的多肽的表达系统。SEQ IDNO:1是全长金黄色葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全长多肽在本文中称作全长"ORF0657n"。发现含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽能产生针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫反应。

权利要求书

1.多肽免疫原,其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列,其中所述的多肽能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫,且其中如果存在一个或多个其它的多肽区,则所述的其它区不能提供含有SEQ ID NO:2的氨基酸609-645的羧基末端。2.权利要求1的多肽,其中所述的多肽由与SEQ ID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列或其片段组成,所述的片段包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列。3.权利要求2的多肽,其中所述的多肽由与SEQ ID NO:3具有至少94%同一性的氨基酸序列或其片段组成,所述的片段包含与SEQ ID NO:1具有至少94%同一性的氨基酸序列。4.权利要求3的多肽,其中所述的多肽由与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:42具有至少94%同一性的氨基酸序列组成。5.权利要求1的多肽,其中所述的多肽基本上由SEQ ID NO 1、3、7、17、20或42的氨基酸序列组成。6.权利要求5的多肽,其中所述的多肽由SEQ ID NO 1、3、7、17、20或42的氨基酸序列组成。7.免疫原,其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列,其中所述的免疫原由所述氨基酸序列和一个或多个在羧基末端或氨基末端共价连接到所述序列上的其它区域部分组成,其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种下述性质的区域或部分:能增强免疫反应、能有利于纯化或能有利于多肽的稳定性。8.能在患者中诱导保护性免疫反应的组合物,其包含免疫有效量的权利要求1-7中的任一项的免疫原和药学上可接受的载体。9.权利要求8的组合物,其中所述的组合物还包含佐剂。10.包含重组基因的核酸,所述的重组基因包含能编码权利要求1-6中的任一项的多肽免疫原的核苷酸序列。11.权利要求10的核酸,其中所述的重组基因至少缺少基本上所有的信号肽编码序列和细胞壁分类信号序列。12.权利要求10的核酸,其中所述的重组基因含有一个或多个为酵母表达最优化的密码子。13.权利要求12的核酸,其中所述的核苷酸序列是至少50%为酵母表达密码子最优化的。14.权利要求10的核酸,其中所述的核酸是表达载体。15.权利要求10的核酸,其中所述的核苷酸序列选自:SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53。16.权利要求15的核酸,其中所述的核酸是表达载体。17.重组细胞,其包含权利要求10-16中的任一项的核酸。18.制备能提供保护性免疫的金黄色葡萄球菌多肽的方法,其包含下述步骤:(a)在能表达多肽的条件下,培养权利要求17的重组细胞;和(b)纯化所述的多肽。19.权利要求19的方法,其中所述的重组细胞是啤酒糖酵母。20.在患者中诱导保护性免疫反应的方法,其包含下述步骤:给所述的患者施用免疫有效量的包含多肽的免疫原,其中所述的多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列,且能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。21.权利要求19的方法,其中所述免疫原是权利要求1-7中的任一项的免疫原。22.权利要求21的方法,其中所述的患者是人。23.权利要求22的方法,其中针对金黄色葡萄球菌感染预防性地治疗所述的患者。24.在患者中诱导保护性免疫反应的方法,其包含下述步骤:给所述的患者施用免疫有效量的由权利要求18的方法制备出的多肽。25.在患者中诱导回忆应答的方法,其包含下述步骤:给所述的患者施用有效量的包含多肽的免疫原,其中所述的多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列,并能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。26.权利要求25的方法,其中所述的回忆应答能在3天内产生比已有滴度增加至少3倍的几何滴度。27.酵母最优化的核酸序列,其能编码能提供针对金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫的ORF0657n相关多肽,或它的包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列的片段。28.权利要求27的酵母最优化的核酸,其中所述的核酸序列不能编码ORF0657n信号肽或细胞壁分类信号序列。29.制备能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的多肽的方法,其包含下述步骤:(a)在能表达所述多肽的条件下,培养重组酵母细胞,其中所述的重组酵母细胞包含能编码所述多肽的重组基因,且所述多肽是能提供针对金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫的全长ORF0657n相关多肽,或它的包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列的片段;和(b)纯化所述的多肽。30.权利要求29的方法,其中所述的重组基因不能编码功能性ORF0657n细胞壁分类信号序列。31.权利要求29的方法,其中所述的重组基因不能编码功能性ORF0657n细胞壁分类信号序列或信号肽序列。32.权利要求29的方法,其中所述的重组酵母细胞是啤酒糖酵母,且所述的核苷酸序列能编码SEQ ID NO:1、3、7、17或20的多肽。

说明书

用于诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫反应的多肽

太阳城集团与相关申请的交叉参考

太阳城集团本申请要求享有2003年7月24日提交的美国临时申请号 60/489,840和2003年11月14日提交的美国临时申请号60/520,115的 利益,其内容在这里引作参考。

发明背景

太阳城集团贯穿在本申请中引用的参考文献不能视作要求保护的发明的现有技 术。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是多种疾病和状况的 病原体。由金黄色葡萄球菌造成的疾病和状况的实例包括菌血症、感染 性心内膜炎、毛囊炎、疖、痈、脓疱病、大疱性脓疱病、蜂窝组织炎、 大疱性脓疱病、中毒性休克综合征、皮肤烫伤综合征、中枢神经系统感 染、感染性和炎性眼病、骨髓炎和关节和骨的其它感染和呼吸道感染 (The Staphylococci in Human Disease,Crossley和Archer(编), Churchill Livingstone Inc.1997.)。

太阳城集团可以使用基于免疫学的策略来尝试控制金黄色葡萄球菌感染和金黄 色葡萄球菌的传播。基于免疫学的策略包括被动免疫和主动免疫。被动 免疫采用靶向金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白。主动免疫能诱导针对金黄 色葡萄球菌的免疫反应。

太阳城集团潜在的金黄色葡萄球菌疫苗靶向金黄色葡萄球菌多糖和多肽。使用 合适的金黄色葡萄球菌多糖或多肽作为疫苗组分,可以实现靶向。潜在 的多糖疫苗组分的实例包括金黄色葡萄球菌类型5和类型8荚膜多糖 (Shinefield等,N.Eng.J.Med.346:491-496,2002.)。可以用作 可行的疫苗组分的多肽的实例包括胶原粘附素、纤维蛋白原结合蛋白和 聚集因子(Mamo等,FEMS Immunology and Medical Microbiology 10: 47-54,1994,Nilsson等,J.Clin.Invest.101:2640-2649,1998, Josefsson等,The Journal of Infectious Diseases 184:1572- 1580,2001.)。

已经从金黄色葡萄球菌基因组的测序,得到了涉及金黄色葡萄球菌 多肽序列的太阳城集团(Kuroda等,Lancet 357:1225-1240,2001,Baba等, Lancet 359:1819-1827,2000,Kunsch等,1997年7月30日公开的 欧洲专利公开号EP0786519)。在某种程度上,在表征从基因组测序 得到的多肽序列的努力中,已经使用了生物太阳城集团学(Kunsch等,1997 年7月30日公开的欧洲专利公开号EP0786519)。

可以将包含展示技术的技术和来自感染的患者的血清用作尝试识别 能编码潜在抗原的基因的努力的一部分(Foster等,2001年12月27日 公开的国际公开号WO01/98499,Meinke等,2002年8月1日公开的国 际公开号WO02/059148)。

发明概述

太阳城集团本发明表征了包含结构上与SEQ ID NO:1相关的氨基酸序列的多 肽、这样的多肽的用途、和用于生产这样的多肽的表达系统。SEQ ID NO: 1是全长金黄色葡萄球菌多肽的截短的衍生物。全长多肽在本文中称作 全长“ORF0657n”。发现含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽能产生 针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫反应。

太阳城集团“保护性的”免疫或免疫反应是指可检测水平的针对金黄色葡萄球 菌感染的保护。使用动物模型,例如本文所述的那些,可以评价保护的 水平。

因而,本发明的第一个方面描述了多肽免疫原,其包含与SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽,其中所述多肽不含有SEQ ID NO:2的氨基酸609-645提供的羧基末端,且该多肽能提供针对金黄色 葡萄球菌的保护性免疫。SEQ ID NO:2提供了全长ORF0657n多肽,其 中氨基酸609-645提供了从LPXTG基序(在本文中称作“细胞的良好分类 信号”)开始的羧基末端结构域。

太阳城集团“免疫原”是指提供保护性免疫的能力。

“包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列”是指, 存在SEQ ID NO:1相关区,且可能存在其它的多肽区。如果存在其它的 多肽区,则该多肽不具有SEQ ID NO:2的氨基酸609-645提供的羧基 LPXTG基序。

太阳城集团本发明的另一个方面描述了免疫原,其包含能提供针对金黄色葡萄 球菌的保护性免疫的氨基酸序列。免疫原包含与SEQ ID NO:1具有至少 90%同一性的氨基酸序列和一个或多个其它的在羧基末端或氨基末端共 价连接的区域或部分,其中每个区域或部分独立地选自具有至少一种下 述性质的区域或部分:能增强免疫反应、能有利于纯化或能有利于多肽 的稳定性。

太阳城集团“其它的区域或部分”是指与要在生物宿主(例如原核宿主或真核 宿主)中生产的ORF0657n相关多肽不同的区域或部分。其它的区域或部 分可以是,例如,其它的多肽区或非肽区。

本发明的另一个方面描述了能在患者中诱导针对金黄色葡萄球菌的 保护性免疫的组合物。该组合物包含药学上可接受的载体和免疫有效量 的能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的免疫原。

“免疫有效量”是足以提供针对金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫 的量。该量应当足以显著地预防金黄色葡萄球菌感染的可能性或严重 性。

太阳城集团本发明的另一个方面描述了包含能编码多肽的重组基因的核酸,所 述的多肽能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。重组基因含有能编 码多肽的重组核酸和进行适当转录和加工的调节元件(其可以包括翻译 和翻译后的元件)。重组基因可以独立于宿主基因组存在,或可以是宿主 基因组的一部分。

太阳城集团重组核酸是由于其序列和/或形式不会天然产生的核酸。重组核酸的 实例包括纯化的核酸,组合到一起、提供与天然产生的不同的核酸的2 个或更多个核酸区,和缺少一个或多个天然地彼此相结合的核酸区(例如, 上游或下游区)。

本发明的另一个方面描述了重组的细胞。该细胞包含能编码多肽的 重组基因,所述的多肽能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。

太阳城集团本发明的另一个方面描述了制备能提供针对金黄色葡萄球菌的保护 性免疫的多肽的方法。该方法包括:培养含有能编码该多肽的重组核酸 的重组细胞,和纯化该多肽。

本发明的另一个方面描述了通过包含下述步骤的方法制备出的能提 供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的多肽:在宿主中培养含有能编码 该多肽的重组核酸的重组细胞,和纯化该多肽。可以使用不同的宿主细 胞。在本发明的一个实施方案中,所述宿主细胞是酵母细胞。

太阳城集团本发明的另一个方面描述了在患者中诱导针对金黄色葡萄球菌的保 护性免疫反应的方法。该方法包括下述步骤:给患者施用免疫有效量的、 能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫的免疫原。

太阳城集团本发明的另一个方面描述了在患者中诱导回忆应答的方法。该方法 包括下述步骤:给患者施用有效量的免疫原,以产生回忆应答。

太阳城集团本发明的另一个方面描述了能编码ORF0657n相关多肽的核酸,其被 最优化成用于在酵母中表达。为了酵母中表达,最优化了一个或多个密 码子。

本发明的另一个方面描述了在重组酵母细胞中制备能提供针对金黄 色葡萄球菌的保护性免疫的多肽的方法。该方法包含下述步骤:

(a)在能表达该多肽的条件下培养重组的酵母细胞,其中重组的酵 母细胞包含能编码多肽的重组基因,且该多肽是全长ORF0657n相关的能 提供针对金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫的多肽,或它的包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列的片段;和

(b)纯化该多肽。

除非特定的术语是相互排斥的,“或”是指一种或两种可能性。有 时,使用诸如“和/或”的短语来强调一种或两种可能性。

诸如“包含”的开放式术语考虑到其它的因素或步骤。有时,使用 诸如有或没有开放式术语的“一个或多个”的短语来强调其它因素或步 骤的可能性。

除非清楚地说明,诸如“一个(a)”或“一种(an)”的术语不限于 一。例如“一个细胞”不排除“多个细胞”。有时,使用诸如“一个或多 个”的短语来强调复数的存在。

太阳城集团从本文提供的其它描述,包括不同的实施例,可以明白本发明的其 它特征和优点。提供的实施例解释了用于实现本发明的不同的组分和方 法学。实施例不限制要求保护的发明。在公开的内容的基础上,技术人 员可以识别和使用用于实现本发明的其它组分和方法。

附图简述

太阳城集团图1A、1B、1C和1D提供的示意图解释了为动物中的保护筛选的 ORF0657n相关的多肽区和一些不同的ORF0657n序列。图1A中的示意图 解释了测试且发现有保护性的多肽(以实心矩形显示)、测试且发现无保 护性的多肽(以空心矩形显示)和未测试的多肽(阴影框)。图1B提供了用 作图1A的参照的全长序列(SEQ ID NO:2)。图1C解释了SEQ ID NO:28。 SEQ ID NO:28含有羧基“His-标记”(LEHHHHHH;SEQ ID NO:64)。 含有羧基His-标记的SEQ ID NO:28在本文中也称作“His-标记 ORF0657n”。图1D解释了ORF0657nI+序列。

太阳城集团图2A-2E提供了不同的ORF0657n相关序列越过ORF0657nH区的序列 对比。在图中用“ID”指示SEQ ID NO:。

图3A、3B和3C解释了提供全长序列的ORF0657n相关多肽、 ORF0657nH区和ORF0657nI区提供针对金黄色葡萄球菌Becker的保护性 免疫的能力。将多肽与羟基磷酸铝佐剂(AHP)一起使用。图3A解释了SEQ ID NO:28的结果。图3B解释了含有羧基His-标记的SEQ ID NO:4的 结果。图3C解释了含有羧基His-标记的SEQ ID NO:5的结果。“羧基 His-标记”是指His-标记基团LEHHHHHH(SEQ ID NO:64)存在于羧基 末端。

图4A-4H解释了ORF0657n相关多肽提供针对不同的金黄色葡萄球菌 攻击的保护性免疫的能力。使用SEQ ID NO:28的多肽作为免疫原。图 4A显示了使用攻击菌株CL-10(2.2×108CFU/ml)的结果。图4B显示 了使用攻击菌株CL-10(2.1×108CFU/ml)的结果。图4C显示了使用攻 击菌株CL-13(2.9×108CFU/ml)的结果。图4D显示了使用攻击菌株 CL-13(2.8×108CFU/ml)的结果。图4E显示了使用攻击菌株CL-30(3.1 ×108CFU/ml)的结果。图4F显示了使用攻击菌株CL-30(3.0×108CFU/ml)的结果。图4G显示了使用攻击菌株CL-18(1.0×108CFU/ml) 的结果。图4H显示了使用攻击菌株CL-21(1.6×108CFU/ml)的结果。

图5A和5B解释了啤酒糖酵母(S.cerevisiae)表达质粒的质粒图 谱。图5A提供了载体pGAL110的质粒图谱。图5B提供了piUC-I的质粒 图谱,其显示了在pGAL110的GAL1启动子控制下克隆的酵母密码子-最 优化的序列。

图6A和6B显示的蛋白印迹描述了具有SEQ ID NO:28的氨基酸 1-646的全长ORF0657n(没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28)的细胞内 表达。泳道1,分子大小标准;泳道2,纯化的大肠杆菌(E.coli)生 产的重组全长ORF0657n区(SEQ ID NO:28),100ng;泳道3-6含有 20μg酵母细胞裂解物;泳道3和4,来自只含有载体pGAL110的1260(图 6A)和1309(图6B)的转化体的一式两份发酵的细胞裂解物;泳道5和 6,来自含有能表达全长ORF0657n区(没有羧基His-标记的SEQ ID NO: 28)的pRUnkC-pGAL110的1260(图6A)和1309(图6B)的转化体的一式 两份发酵的细胞裂解物。

图7A和7B分别显示了SDS-PAGE凝胶和蛋白印迹的考马斯染色, 描述了能编码SEQ ID NO:3的核酸在啤酒糖酵母中的细胞内表达。泳道 1,实验组A,BSA,1.25μg;实验组B,纯化的大肠杆菌重组全长 ORF0657n(SEQ ID NO:28),100ng;泳道2,来自大肠杆菌中的 ORF0657nH生产者(具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4)的细胞裂解物;实 验组A,1.25μg,实验组B,0.5μg。泳道3-7,实验组A和B,分别 含有1.25和0.5μg酵母细胞裂解物:泳道3,只含有载体pGAL110的 转化体;泳道4,含有全长ORF0657n(没有羧基His-标记的SEQ ID NO: 28)的转化体;泳道5、6和7,转化体1-1,其含有能表达成熟的 ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的piUC-S(-);泳道7含有冷冻且随后融 化的细胞裂解物(转化体1-1的)。泳道8含有分子大小标准。

图8A-8U提供了能编码ORF0657n相关多肽的不同核酸序列的实例。 图8A提供了能编码带有羧基His-标记的SEQ ID NO:2的核酸序列(SEQ ID NO:29)。图8B提供了能编码带有羧基His-标记的SEQ ID NO:4的 核酸序列(SEQ ID NO:30)。图8C提供了酵母最优化的能编码没有羧基 His-标记的SEQ ID NO:28的核酸序列(SEQ ID NO:31)。图8D提供了 酵母最优化的能编码SEQ ID NO:3的核酸序列(SEQ ID NO:32)。图8E 提供了酵母最优化的能编码SEQ ID NO:1的核酸(SEQ ID NO:33)序列。 图8F-8M提供了酵母最优化的核酸序列(SEQ ID NO:34、35、36、37、 38、39、40和41),其能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:7。 图8N-8U提供了酵母最优化的核酸序列(SEQ ID NO:46-53),其能编码 基于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:20的不同的ORF0657n相关多肽。

图9显示的蛋白印迹对比了ORF0657n相关多肽在啤酒糖酵母中的细 胞内表达。泳道1和18,分子量(MW)大小标准。泳道2和3,分别50 和100ng纯化的在大肠杆菌中生产的ORF0657nH(带有羧基His-标记的 SEQ ID NO:4)。泳道5含有500ng来自啤酒糖酵母载体对照转化体的 细胞裂解物蛋白。泳道7、8和9含有1.0、2.0和4.0μg来自能生产没 有羧基His-标记的SEQ ID NO:28的啤酒糖酵母转化体的细胞裂解物蛋 白。泳道11和12分别含有50和100ng蛋白,是来自能生产ORF0657nH (SEQ ID NO:3)的啤酒糖酵母转化体的细胞裂解物。泳道14和15分别 含有250和500ng蛋白,是来自能生产ORF0657nG(SEQ ID NO:44)的 啤酒糖酵母转化体的细胞裂解物。泳道17含有250ng来自ORF0657nG (带有羧基His-标记的SEQ ID NO:44)大肠杆菌生产者的细胞裂解物蛋 白。泳道4、6、10、13和16是空白的。

图10解释了在大肠杆菌和酵母中生产的ORF0657n相关多肽的保护 性免疫数据。“OFR0657nH(大肠杆菌)”对应着具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4。“OFR0657nI(大肠杆菌)”对应着具有羧基His-Tag的SEQ ID NO:5。“OFR0657nC(大肠杆菌)”对应着SEQ ID NO:28。“OFR0657nH (酵母)”对应着SEQ ID NO:3。

图11显示了ORF0657nI在啤酒糖酵母中的细胞内表达的示例性的蛋 白印迹。泳道1和25:分子量大小标准。泳道2、3和24:分别25、50 和100ng,是纯化的在大肠杆菌中生产的ORF0657nH区(带有羧基His- 标记的SEQ ID NO:4)。泳道4-23含有来自酵母转化体的蛋白细胞裂解 物。泳道13-21代表着从与泳道4-12的裂解物相同的发酵样品制备出的 一式两份细胞裂解物。泳道4和13含有200ng蛋白,其来自含有pGAL110 的载体对照转化体。泳道5和14含有100ng蛋白,其来自能生产 ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的转化体1-1。泳道6和15含有200ng 来自转化体1-1的蛋白。泳道7和16含有100ng蛋白,且泳道8和17 含有200ng来自转化体I1的蛋白。泳道9和18含有100ng蛋白,且 泳道10和19含有200ng来自转化体I2的蛋白。泳道11和20含有100 ng蛋白,且泳道12和21含有200ng来自转化体I3的蛋白。泳道22 和23含有100和200ng以前从预先发酵转化体1-1制备出的蛋白细胞 裂解物。

太阳城集团图12提供了猕猴免疫数据。用与或不与AHP配制的酵母生产的 ORF0657n相关多肽(ORF0657nH,SEQ ID NO:3)或大肠杆菌表达的 ORF0657n相关多肽(全长ORF0657nC,SEQ ID NO:28)免疫了猕猴。在 疫苗组的猴子通过肌内的方式接受了50mcg ORF0657n相关多肽。

发明详述

使用动物模型发现,ORF0657n相关多肽(包括全长和更短长度的含 有ORF0657nI区的衍生物)能提供针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫。 图1a解释了能提供针对金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫的不同的 ORF0657n相关多肽区和不能提供保护性免疫的区域的位置。在图1a中, ORF0657n是指与SEQ ID NO:2相对应的全长序列,ORF0657nI是指与 SEQ ID NO:1相对应的区域(没有氨基末端甲硫氨酸),且ORF0657nH是 指与SEQ ID NO:3相对应的区域(没有氨基末端甲硫氨酸)。

ORF0657n“相关的”多肽含有结构上与全长ORF0657n或其片段相关 的区域。ORF0657n相关多肽是与天然产生的ORF0657n的对应区域具有 至少约90%序列同一性的多肽。在图1中所述的参照ORF0657n对应着来 自金黄色葡萄球菌COL的ORF0657n(SEQ ID NO:2)。

通过将多肽序列与参照序列相比对,并确定相同的氨基酸的数目, 可以确定与参照序列的百分比同一性。该数目除以参照序列中的氨基酸 总数,然后乘以100,并四舍五入到最接近的整数。

图1a辅助解释了包含结构上与SEQ ID NO:1相关的氨基酸序列的 核心区的重要性。SEQ ID NO:1包含ORF0657n COL的氨基酸42-486。 SEQ ID NO:1也含有氨基末端甲硫氨酸,以促进表达。由SEQ ID NO:2 氨基酸461-609、氨基酸82-486或氨基酸42-196组成的多肽片段不是 保护性的。

在贯穿本申请中提及不同的氨基酸和核酸序列。表1总结了一些多 肽序列,它们显示了图1区和其它的修饰。表2总结了一些核酸序列。

表1

SEQ ID NO: ORF0657n区 其它修饰/其它太阳城集团 1 ORF0657nI 氨基末端甲硫氨酸 2 全长 3 ORF0657nH 氨基末端甲硫氨酸 4 ORF0657nH 氨基末端甲硫氨酸-甘氨酸 5 ORF0657nI 氨基末端甲硫氨酸-甘氨酸 6 ORF0657nH 7 ORF0657nH 8 ORF0657nH 9 ORF0657nH 10 ORF0657nH 11 ORF0657nH

太阳城集团   12   ORF0657nH   13   ORF0657nH   14   ORF0657nH   15   ORF0657nH   16   ORF0657nH   17   ORF0657nH   18   ORF0657nH   19   ORF0657nH   20   ORF0657nH   21   ORF0657nH   22   ORF0657nH   23   ORF0657nH   24   ORF0657nH   25   ORF0657nH   26   ORF0657nH   27   ORF0657nH   28   全长   修饰的SEQ ID NO:2以含有在氨   基末端甲硫氨酸之后的甘氨酸和羧   基His-标记   42   ORF0657nI+   SEQ ID NO:3的氨基酸1-481   44   ORF0657nG   氨基末端甲硫氨酸加SEQ ID NO:2   的氨基酸42-645   54-63   ORF0657nH   来自不同的金黄色葡萄球菌   106和107   全长   来自不同的金黄色葡萄球菌

表2

  SEQ ID NO:   区域   其它太阳城集团

太阳城集团   29   全长   能编码SEQ ID NO:2(核苷酸1-1935)+羧   基His-标记   30   ORF065   7nH   能编码SEQ ID NO:4(核苷酸1-1710)+羧   基His-标记   31   全长   能编码没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28,   且是密码子最优化的以用于酵母表达(SEQ ID   NO:28的氨基酸1-646)   32   ORF065   7nH   能编码SEQ ID NO:3,且是密码子最优化的   以用于酵母表达   33   ORF065   7nI   能编码SEQ ID NO:1,且是密码子最优化的   以用于酵母表达   34   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   35   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   36   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   37   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   38   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   39   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   40   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   41   ORF065   7nH   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:   7,且是密码子最优化的以用于酵母表达   43   ORF065   7nI+   能编码SEQ ID NO:42,且是密码子最优化的   以用于酵母表达   45   ORF065   7nG   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID   NO:44,且是密码子最优化的以用于酵母表达   46   ORF065   能编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:

太阳城集团  7nH 17,且是密码子最优化的以用于酵母表达 47  ORF065  7nI+ 能编码SEQ ID NO:17I+区,是密码子最优化 的以用于酵母表达,且能编码甲硫氨酸起始 密码子 48  ORF065  7nI 能编码SEQ ID NO:17I区,是密码子最优化 的以用于酵母表达,且能编码甲硫氨酸起始 密码子 49  全长 能编码含有SEQ ID NO:17的全长 ORF0657n(SEQ ID NO:106),其修饰成含有 氨基末端甲硫氨酸之后的甘氨酸,且是密码 子最优化的以用于酵母表达 50  ORF065  7nH 能编码SEQ ID NO:20,是密码子最优化的以 用于酵母表达,且能编码甲硫氨酸起始密码 子 51  ORF065  7nI+ 能编码SEQ ID NO:20 I+区,是密码子最优化 的以用于酵母表达,且能编码甲硫氨酸起始 密码子 52  ORF065  7nI 能编码SEQ ID NO:20I区,是密码子最优化 的以用于酵母表达,且能编码甲硫氨酸起始 密码子 53  全长 能编码含有SEQ ID NO:20的全长ORF0657n (SEQ ID NO:107),其修饰成含有氨基末端 甲硫氨酸之后的甘氨酸,且是密码子最优化 的以用于酵母表达

SEQ ID NO:1相关的多肽

结构上与SEQ ID NO:1相关的多肽区含有与SEQ ID NO:1具有至 少90%同一性的氨基酸。在本文提供的指南的基础上,可以设计含有结 构上与SEQ ID NO:1相关的区域的多肽,以得到针对金黄色葡萄球菌的 保护性的多肽。

使用SEQ ID NO:1作为参照框架,考虑不同的天然产生的ORF0657n 多肽的氨基酸序列和已知的氨基酸性质,可以进行变化。变化包括一个 或多个氨基酸添加、缺失和/或取代。使用本文所述的技术,可以评价不 同变化的总体效果,以证实特定多肽提供保护性免疫的能力。

发现ORF0657n在病理学上和分类学上不同的金黄色葡萄球菌临床 分离物收集物中是非常保守的(见下面的实施例5)。图2提供了含有SEQ ID NO:1的不同序列的氨基酸序列对比。所述的序列对比是针对 ORF0657nH区的。ORF0657nH区包括更小的保护性ORF0657nI区。

图2提供了SEQ ID NO:1和3-27的序列对比。该对比解释了金黄 色葡萄球菌临床分离物之间的氨基酸差异,其可以用于指导设计金黄色 葡萄球菌相关多肽(例如SEQ ID NO:1和3)的潜在变化。另外,考虑 已知的氨基酸性质,可以进行变化。SEQ ID NO:1、3-6和8-26解释了 天然产生的从位置号3开始的序列,位置号1和2解释了甲硫氨酸或甲 硫氨酸-甘氨酸向一些序列的氨基末端的添加。从不同的临床分离物,得 到了SEQ ID NO:11-26。SEQ ID NO:7和27是SEQ ID NO:4 ORF0657nH 区的变体,该区在SEQ ID NO:1核心区之外的区域中含有5个氨基酸取 代。

在序列对比中可以使用其它的ORF0657n序列,以辅助指导变化。SEQ ID NO:54-63提供了其它的金黄色葡萄球菌ORF0657nH区序列的实例, SEQ ID NO:106和107提供了SEQ ID NO:17和20的全长序列。

通常,在取代不同的氨基酸以保留活性时,优选地交换具有类似性 质的氨基酸。在氨基酸取代时可以考虑的因素包括氨基酸大小、电荷、 极性和疏水性。不同的氨基酸R-基团对氨基酸性质的影响是本领域众所 周知的(见,例如,Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley,1987-2002,Appendix 1C.)。

在交换氨基酸以维持活性时,替换氨基酸应当具有一种或多种类似 的性质,例如近似相同的电荷和/或大小和/或极性和/或疏水性。例如, 用缬氨酸替换亮氨酸、用精氨酸替换赖氨酸和用天冬酰胺替换谷氨酰胺 是不会造成多肽功能变化的良好候选方案。

太阳城集团用于实现特定目的的变化包括设计用于促进多肽的生产或功效的那 些;或克隆编码的核酸。通过适用于重组表达的起始密码子(例如,能编 码甲硫氨酸)的应用,可以促进多肽的生产。在后期的细胞加工过程中, 可以去除甲硫氨酸。通过例如限制位点的导入,其可以伴有氨基酸的添 加或变化,可以促进克隆。

太阳城集团通过表位增强,可以增强多肽诱导免疫反应的功效。使用不同的技 术,例如包含改变锚定残基来提高肽对MHC分子的亲和力的那些和能增 强肽-MHC复合物对T-细胞受体的亲和力的那些,可以进行表位增强。 (Berzofsky等,Nature Review 1:209-219,2001.)

在不同的实施方案中,太阳城集团SEQ ID NO:1相关的多肽区,该区与 SEQ ID NO:1具有至少90%、至少94%或至少99%的同一性;与SEQ ID NO: 1存在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24或25个变化,或最多50个变化;或基 本上由选自下述的OFR0657nI相关区组成,或由选自下述的OFR0657nI 相关区组成:

SEQ ID NO:11、15、16、18或54的氨基酸1-442;

太阳城集团SEQ ID NO:63的氨基酸1-443;

太阳城集团SEQ ID NO:57或59的氨基酸1-444;

太阳城集团SEQ ID NO:7、8、9、10、12、13、14、17、19、20、55、56或58 的氨基酸1-445;

太阳城集团SEQ ID NO:23或24的氨基酸1-446;

SEQ ID NO:1或3的氨基酸1-446或2-446;

SEQ ID NO:25或26的氨基酸1-447;或

SEQ ID NO:4、5或27的氨基酸1-447、2-447或3-447;

太阳城集团SEQ ID NO:61或62的氨基酸1-449;

太阳城集团SEQ ID NO:60的氨基酸1-453;和

SEQ ID NO:6、21或22的氨基酸1-454。

太阳城集团“基本上由所示的氨基酸组成”是指存在所述氨基酸,且可以存在 其它的氨基酸。其它的氨基酸可以在羧基或氨基末端。在不同的实施方 案中,存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20个其它的氨基酸。在优选的实施方案中,甲硫氨 酸存在于氨基末端;或甲硫氨酸-甘氨酸存在于氨基末端。

在本发明的一个实施方案中,该多肽由与SEQ ID NO:42或其片段 具有至少90%同一性的氨基酸序列组成,所述的SEQ ID NO:42或其片 段包含结构上与SEQ ID NO:1相关的氨基酸序列。在不同的实施方案中, 太阳城集团SEQ ID NO:42,该多肽与SEQ ID NO:42具有至少94%或至少99% 同一性;与SEQ ID NO:42存在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个 变化,最多50个变化,或最多65个变化;由SEQ ID NO:42或选自下述 的OFR0657nI+相关区组成,或基本上由SEQ ID NO:42或选自下述的 OFR0657nI+相关区组成:

SEQ ID NO:11、15、16、18或54的氨基酸1-477;

太阳城集团SEQ ID NO:63的氨基酸1-478;

太阳城集团SEQ ID NO:57或59的氨基酸1-479;

SEQ ID NO:7、8、9、10、12、13、14、17、19、20、55、56或58 的氨基酸1-480;

SEQ ID NO:23或24的氨基酸1-481;

SEQ ID NO:1或3的氨基酸1-481或2-481;

SEQ ID NO:25或26的氨基酸1-482;

SEQ ID NO:4、5或27的氨基酸1-482、2-482或3-482;

SEQ ID NO:61或62的氨基酸1-484;

SEQ ID NO:60的氨基酸1-488;和

SEQ ID NO:6、21或22的氨基酸1-489;

太阳城集团在本发明的另一个实施方案中,该多肽由与SEQ ID NO:3或其片段 具有至少90%同一性的氨基酸序列组成,所述的SEQ ID NO:3或其片段 包含结构上与SEQ ID NO:1相关的氨基酸序列。在不同的实施方案中, 太阳城集团SEQ ID NO:3,该多肽与SEQ ID NO:3具有至少94%或至少99%同 一性;与SEQ ID NO:3存在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个变化, 最多50个变化,或最多65个变化;由选自下述的氨基酸序列组成,或基 本上由选自下述的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:3、4、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、54、55、56、57、58、59、60、61、62和63。

太阳城集团在另一个实施方案中,该多肽由SEQ ID NO:2的多肽组成,或基 本上由SEQ ID NO:2的多肽组成,其通过在起始甲硫氨酸后插入甘氨 酸进行了修饰,或该多肽没有起始甲硫氨酸。

在另一个实施方案中,该多肽是纯化的多肽。“纯化的多肽”存在于 缺少一种或多种天然与它结合的其它多肽的环境中,和/或表示为至少约 10%存在的总蛋白。在不同的实施方案中,纯化的多肽代表着在样品或制 剂中的至少约50%、至少约75%或至少约95%总蛋白。

在另一个实施方案中,多肽是“基本上纯化的”。基本上纯化的多肽 存在于缺少全部或大多数天然与该多肽结合的其它多肽的环境中。例 如,基本上纯化的金黄色葡萄球菌多肽存在于缺少全部或大多数其它金 黄色葡萄球菌多肽的环境中。环境可以是,例如,样品或制剂。

太阳城集团“纯化的”或“基本上纯化的”不要求对多肽进行任何的纯化,且 可以包括,例如,尚未纯化的化学合成的多肽。

太阳城集团通过修饰多肽的羧基或氨基末端,可以增强多肽的稳定性。可行的 修饰的实例包括氨基末端保护基团,例如乙酰基、丙基、琥珀酰基、苄 基、苄氧羰基或叔丁氧羰基;和羧基末端保护基团,例如酰胺、甲基酰胺 和乙基酰胺。

在本发明的一个实施方案中,保护性多肽是免疫原的一部分,所述 的免疫原由多肽和一个或多个与多肽在羧基末端或氨基末端共价连接的 其它区域或部分组成。每个区域或部分应当独立地选自具有至少一种下 述性质的区域或部分:能增强免疫反应,能有利于纯化,或能有利于多肽 的稳定性。可以增强多肽的稳定性,例如,使用诸如可以存在于氨基或 羧基末端的聚乙二醇的基团。

太阳城集团通过将基团添加到羧基或氨基末端来促进纯化,可以增强多肽的纯 化。可以用于促进纯化的基团的实例包括能提供亲和标记的多肽。亲和 标记的实例包括六-组氨酸标记、trpE、谷胱甘肽和麦芽糖-结合蛋白。

太阳城集团使用一般能增强免疫反应的基团,可以增强多肽产生免疫反应的能 力。可以连接到多肽上来增强针对多肽的免疫反应的基团的实例包括细 胞因子例如IL-2(Buchan等,2000.Molecular Immunology 37: 545-552.)。

多肽生产

使用标准技术,包括包含化学合成的技术和包含从能生产多肽的细 胞纯化的技术,可以生产出多肽。化学合成多肽的技术是本领域众所周 知的(见例如,Vincent,Peptide and Protein Drug Delivery,New York,N.Y.,Decker,1990.)。

在下面提供的实施例中,解释了从细胞纯化多肽的技术。纯化技术 的其它实例是本领域众所周知的(见例如,Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley,1987-2002.)。

太阳城集团使用重组核酸技术来生产多肽,可以促进从细胞获得多肽。用于生 产多肽的重组核酸技术包括在细胞中导入或生产能编码多肽的重组基因 和表达该多肽。

太阳城集团重组基因含有能编码多肽的核酸和用于多肽表达的调节元件。重组 基因可以存在于细胞基因组中,或可以是表达载体的一部分。

可以作为重组基因的一部分而存在的调节元件包括与多肽编码序列 天然结合的那些,和与多肽编码序列不天然结合的外源调节元件。诸如 外源启动子的外源调节元件可以用于在特定宿主中表达重组基因,或提 高表达水平。通常,存在于重组基因中的调节元件包括转录启动子、核 糖体结合位点、终止子和任选地存在的操纵基因。优选的用于在真核细 胞中加工的元件是多腺苷酸化信号。

通过表达载体的应用,可以促进重组基因在细胞中的表达。优选地, 除了重组基因外,表达载体还含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起 点、选择标记、有限数目的有用的限制酶位点和高拷贝数的潜力。表达 载体的实例是克隆载体、修饰的克隆载体、特别设计的质粒和病毒。

由于遗传密码的简并性,可以使用大量不同的编码核酸序列来编码 特定的多肽。遗传密码的简并性的原因是,几乎所有的氨基酸都由不同 组合的核苷酸三联体或“密码子”编码。由密码子编码的氨基酸如下:

A=Ala=丙氨酸:密码子GCA、GCC、GCG、GCU

太阳城集团C=Cys=半胱氨酸:密码子UGC、UGU

太阳城集团D=Asp=天冬氨酸:密码子GAC、GAU

E=Glu=谷氨酸:密码子GAA、GAG

F=Phe=苯丙氨酸:密码子UUC、UUU

太阳城集团G=Gly=甘氨酸:密码子GGA、GGC、GGG、GGU

太阳城集团H=His=组氨酸:密码子CAC、CAU

太阳城集团I=Ile=异亮氨酸:密码子AUA、AUC、AUU

太阳城集团K=Lys=赖氨酸:密码子AAA、AAG

太阳城集团L=Leu=亮氨酸:密码子UUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU

M=Met=甲硫氨酸:密码子AUG

N=Asn=天冬酰胺:密码子AAC、AAU

P=Pro=脯氨酸:密码子CCA、CCC、CCG、CCU

Q=Gln=谷氨酰胺:密码子CAA、CAG

R=Arg=精氨酸:密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU

S=Ser=丝氨酸:密码子AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU

T=Thr=苏氨酸:密码子ACA、ACC、ACG、ACU

V=Val=缬氨酸:密码子GUA、GUC、GUG、GUU

W=Trp=色氨酸:密码子UGG

太阳城集团Y=Tyr=酪氨酸:密码子UAC、UAU

太阳城集团适用于ORF0657n相关多肽的重组核酸表达的细胞是原核生物和真 核生物。原核细胞的实例包括大肠杆菌;葡萄球菌属(Staphylococcus) 的成员,例如金黄色葡萄球菌;乳杆菌属(Lactobacillus)的成员,例如 植物乳杆菌(L.plantarum);乳球菌属(Lactococcus)的成员,例如乳酸 乳球菌(L.lactis);和芽孢杆菌属(Bacillus)的成员,例如枯草芽孢杆 菌(B.subtilis)。真核细胞的实例包括哺乳动物细胞;昆虫细胞;酵母 细胞,例如糖酵母属(Saccharomyces)的成员(例如,啤酒糖酵母),毕 赤氏酵母属(Pichia)的成员(例如,巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)), 汉逊氏酵母属(Hansenula)的成员(例如,多形汉逊氏酵母 (H.polymorpha)),克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)的成员(例如,乳 克鲁维氏(K.lactis)酵母或脆壁克鲁维氏酵母(K.fragilis))和裂殖 糖酵母属(Schizosaccharomyces)属的成员(例如,粟酒裂殖糖酵母 (S.pombe))。

用于重组基因生产、导入细胞和重组基因表达的技术是本领域众所 周知的。在参考文献中提供了这种技术的实例,例如Ausubel,Current Protocols in MolecuIar Biology,John Wiley,1987-2002,和Sambrook 等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。

如果需要,通过密码子最优化,可以增强特定宿主中的表达。密码 子最优化包括更优选的密码子的应用。在不同的宿主中进行密码子最优 化的技术是本领域众所周知的。

ORF0657n相关多肽可以含有翻译后的修饰,例如,N-连接的糖基 化、O-连接的糖基化或乙酰化。“多肽”或多肽的“氨基酸”序列包括含 有一个或多个氨基酸的多肽,所述的氨基酸具有宿主细胞(例如哺乳动 物、昆虫或酵母宿主细胞)翻译后修饰的结构。

可以化学地或使用合适的宿主,产生翻译后修饰。例如,在啤酒糖 酵母中,倒数第二个氨基酸的性质似乎会决定是否去除N-末端甲硫氨 酸。另外,倒数第二个氨基酸的性质还会决定是否使N-末端氨基酸Nα- 乙酰化(Huang等,Biochemistry 26:8242-8246,1987)。另一个实例 包括由于分泌前导序列(例如,信号肽)的存在而靶向分泌的多肽,其中 通过N-连接的或O-连接的糖基化修饰了多肽(Kukuruzinska等,Ann. Rev.Biochem.56:915-944,1987.)。

酵母表达

优选地,在使用含有最优化的用于酵母表达的密码子的编码核酸的 酵母中,表达ORF0657n相关多肽。使用能编码ORF0657n相关多肽的重 组基因和用于酵母表达的调节区,可以进行在酵母中的表达。依赖于使 用的表达系统,产生的蛋白可以维持在细胞内,或者可以分泌到细胞外。

太阳城集团优选地,重组基因表达的启动子是诱导型启动子,例如来自酵母半 乳糖基因簇的启动子(GAL启动子,例如GAL1、GAL7、GAL10、MEL1)或 酸性磷酸酶PH05启动子或醇脱氢酶II ADH2启动子或铜-调节的金属硫 蛋白CUP1启动子。可以使用的“组成型”启动子的实例是GAP(TDH)、 PGK或TPI启动子(Romanos等,YEAST 8:423-488,1992.)。

可以选择或工程改造用于重组表达的酵母宿主细胞,以促进重组基 因表达。突变,例如mnn9、prb1和/或pep4突变一般地是理想的。为 了增强从GAL启动子的表达,可以实现GAL4转录因子的超表达(Hopper 等,美国专利5,068,185)。

通过用高表达水平的密码子替换低或中等使用水平的密码子,可以 进行特定宿主的密码子最优化。存在于编码序列中的最佳密码子的百分 比可以变化。在不同的实施方案中,最佳密码子(包括原始存在的密码子 和导入的密码子)的数目占密码子总数的至少50%、至少75%、至少95% 或100%。

太阳城集团可以如下进行密码子最优化:

1.对于特定的密码子,对比野生型密码子频率和酵母基因使用的总 密码子频率。

2.如果该密码子不是酵母常用密码子之一,则将其替换为在酵母细 胞中高表达的最佳密码子。

太阳城集团3.对于不同的密码子,重复步骤(1)和(2),直到实现理想水平的密 码子最优化。

4.检查新编码序列的非所需的序列,例如不需要的限制酶位点、剪 接位点、启动子、不需要的回文序列或重复序列、转录终止序列和高频 率的GC碱基。使用替代密码子,去除不需要的序列。

太阳城集团Lathe,J.Molec.Biol.,183:1-12,1985提供了替代密码子选 择。不同酵母宿主中的密码子选择是本领域众所周知的。例如,Sharp等, Yeast 7:657-678,1991描述了啤酒糖酵母中的同义密码子选择。

太阳城集团图8C-8M提供了酵母最优化的核酸序列。图8C提供了酵母最优化的 核酸序列(SEQ ID NO:31),其能编码没有羧基His-标记的SEQ ID NO: 28。图8D提供了酵母最优化的能编码SEQ ID NO:3的核酸序列(SEQ ID NO:32)。图8E提供了酵母最优化的能编码SEQ ID NO:1的核酸(SEQ ID NO:33)序列。图8F-8M提供了酵母最优化的核酸序列(SEQ ID NO:34- 41),其能编码含有甲硫氨酸氨基末端的SEQ ID NO:7。图8N-8U提供 了酵母最优化的核酸序列(SEQ ID NO:46-53),其能编码以SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO:20为基础的不同的ORF0657n相关多肽。

使用最优化的序列和未为酵母表达最优化的序列(例如,SEQ ID NO: 29的核苷酸1-1935或124-1458,或SEQ ID NO:30的核苷酸1-1710), 可以实现酵母表达。在下面的实施例中,解释了使用最优化的和未最优 化的序列进行酵母表达的技术。

ORF0657n是一种表面蛋白,其含有带有保守的“LPXTG”基序的36- 氨基酸C-末端细胞壁分类信号(Schneedwind等1993,EMBO,12:4803- 4811,1993)。含有细胞壁分类信号的蛋白通过转肽酶(sortase)(一种 膜结合蛋白)催化的转肽作用机理,连接到细胞壁包膜上(Mazmanian等, Science 299:906-909,2001)。为了连接,该表面蛋白还必须含有N-末 端信号肽,以输出到分泌途径中。在分泌途径中,去除该信号肽,且细 胞壁分类信号有利于保持在分泌途径中。然后,转肽酶在LPXTG基序的 苏氨酸和甘氨酸之间切割,并催化苏氨酸的羧基和肽聚糖交联桥的氨基 之间的酰胺键的形成。

发现去除细胞壁分类序列,可以显著增强在酵母中的表达。在不同 的实施方案中,能编码多肽的构建体缺少功能性细胞壁分类编码序列, 且更优选地,缺少功能性细胞壁分类和信号肽编码序列。对应的优选的 ORF0657n相关多肽缺少功能性细胞壁分类序列,或细胞壁分类和信号肽 序列两者。

在不同的实施方案中,至少基本上所有的细胞壁分类序列或细胞壁 分类和信号肽序列都不存在于多肽或能编码多肽的核酸中。在不同的实 施方案中,通过去除至少基本上所有的细胞壁分类序列或细胞壁分类和 信号肽序列两者,使蛋白表达提高了至少约10倍、至少约15倍、或至 少约20倍。更优选地,编码构建体还含有一个或多个为酵母(例如,啤 酒糖酵母)表达最优化的密码子。

太阳城集团可以相对于SEQ ID NO:2,解释ORF0657n细胞壁分类和信号肽序 列的近似区域的实例。氨基酸1-42含有信号肽序列。氨基酸609-645 含有细胞壁分类序列。

佐剂

太阳城集团佐剂是能辅助免疫原产生免疫反应的物质。佐剂可以通过不同的机 理起作用,例如下述的一种或多种:提高抗原的生物学的或免疫学的半 衰期;改善抗原向抗原呈递细胞的递送;改善抗原呈递细胞的抗原加工 和呈递;和诱导免疫调制细胞因子的生成(Vogel,Clinical Infectious Diseases 30(suppl.3):S266-270,2000.)。

可以使用许多不同类型的佐剂来辅助免疫反应的产生。具体佐剂的 实例包括氢氧化铝、磷酸铝、或其它铝盐、磷酸钙、DNA CpG基序、单 磷酰基脂类A、霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、百日咳毒素、胞壁 酰二肽、弗氏不完全佐剂、MF59、SAF、免疫刺激复合物、脂质体、可生 物降解的微球、皂苷类、非离子型嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物、聚磷 腈、合成的多核苷酸、IFN-γ、IL-2、IL-12和ISCOMS(Vogel Clinical Infectious Diseases 30(suppl 3):S266-270,2000,Klein等, Journal of Pharmaceutical Sciences 89:311-321,2000, Rimmelzwaan等,Vaccine 19:1180-1187,2001,Kersten Vaccine 21: 915-920,2003,O′Hagen Curr.Drug Target Infect.Disord.,1: 273-286,2001.)。

用于诱导保护性免疫的患者

“患者”是指能被金黄色葡萄球菌感染的哺乳动物。可以预防性地 或治疗性地处理患者。预防性的处理能提供足够的保护性免疫,以减少 金黄色葡萄球菌感染的可能性或严重性。可以进行治疗性的处理,以减 少金黄色葡萄球菌感染的严重性。

太阳城集团使用含有本文所述的免疫原的疫苗,可以进行预防性的处理。优选 地,在人上进行这样的处理。可以将疫苗施用给一般人群,或处于金黄 色葡萄球菌感染的高度危险中的那些人。

具有金黄色葡萄球菌感染的高度危险的人包括健康护理工作人员; 医院患者;免疫系统虚弱的患者;接受手术的患者;接受异物(例如导 管或血管装置)植入的患者;面临会导致弱化的免疫的治疗的患者;具 有烧伤或创伤的人;和从事具有烧伤或创伤高风险职业的人。(The Staphylococci in Human Disease,Crossley and Archer(编), Churchill Livingstone Inc.1997.)

太阳城集团可以被金黄色葡萄球菌感染的非人患者包括母牛、猪、绵羊、山羊、 兔子、马、狗、猫和小鼠。非人患者的处理可以用于保护宠物和家畜, 和用于评价特定处理的功效。

回忆应答

太阳城集团发现ORF0657n相关多肽在单次给药后,能在猕猴中产生迅速且有效 的免疫反应(见下面的实施例17)。观察到的反应与回忆应答相一致。

太阳城集团回忆应答的产生能提供了显著的优点,例如使用单次给药提供有效 的免疫的能力,和在短太阳城集团内提供有效的免疫。在不同的实施方案中, 回忆应答会使几何平均滴度比以前存在的滴度增加至少3-倍、至少5- 倍或至少6-倍;且在3、5、7、9、14或21天内产生倍数增加。

迅速产生有效的免疫反应的能力会比多剂接种疫苗节省成本,且可 以用于给处于金黄色葡萄球菌感染的高度危险中的患者接种疫苗。具有 金黄色葡萄球菌感染的高度危险的人包括健康护理工作人员;医院患 者;免疫系统虚弱的患者;接受手术的患者;接受异物(例如导管或血 管装置)植入的患者;面临会导致弱化的免疫的治疗的患者;具有烧伤 或创伤的人;和从事具有烧伤或创伤高风险职业的人(The Staphylococci in Human Disease,Crossley and Archer(编), Churchill Livingstone Inc.1997.)。在不同的实施方案中,立即地, 或在3、5、7、9、14或21天的医学过程内,给患者接种疫苗。

复合疫苗

可以单独地或与其它免疫原组合地使用能提供保护性免疫的 ORF0657n相关多肽,以诱导免疫反应。可以存在的其它免疫原包括:一 种或多种其它的金黄色葡萄球菌免疫原,例如在上面的发明背景中提及 的那些;一种或多种能靶向一种或多种其它葡萄球菌属生物(例如表皮 葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、沃氏 葡萄球菌(S.warneri)或S.lugunensis)的免疫原;和一种或多种能 靶向其它感染性生物的免疫原。

动物模型系统

使用了动物模型系统来评价多肽产生针对金黄色葡萄球菌的保护性 免疫反应的功效。在建立保护性动物模型时遇到的2个障碍是:(1)需 要非常高的攻击剂量来克服先天免疫,和(2)死亡速度太快,以致于难 以检测保护性反应。更具体地,小鼠在细菌攻击后24小时内就会死于感 染,这不能提供足够的太阳城集团进行特异性的免疫反应来解决感染。当降低 剂量时,对照小鼠和免疫的小鼠都会幸免于感染。

使用慢动力学致死率模型,其包含适度滴定且静脉内施用的由稳定 期的细胞制备出的金黄色葡萄球菌,克服了这些障碍。该死亡的慢动力 学能提供足够的太阳城集团进行特异性的免疫防御,以竭力避免细菌感染(例如, 10天,而不是24小时)。

从生长在固体培养基上的细胞,可以得到稳定期的金黄色葡萄球菌 细胞。也可以从液体得到它们,但是用生长在固体培养基上的细胞得到 的结果是更有重复性的。可以方便地使细胞在固体培养基上生长过夜。 例如,可以在倍增太阳城集团是约20-30分钟的条件下,使金黄色葡萄球菌生 长约18-24小时。

使用标准技术,可以从固体或液体培养基中分离出葡萄球菌,以维 持葡萄球菌潜能。可以将分离的葡萄球菌保藏在例如-70℃,作为洗涤的 在含有甘油的磷酸缓冲盐水中的高密度悬浮液(>109菌落形成单位 (CFU)/mL)。

葡萄球菌攻击应当具有在从第一天或第二天开始经约7-10天的时 间段、在动物模型中提供约80-90%死亡的潜能,可以使用动物模型进行 滴定实验,以监控保藏的葡萄球菌接种物的潜能。可以在接种实验之前 约1-2周,进行滴定实验。

太阳城集团滴定实验的起始潜能可以以以前的实验为基础。太阳城集团动物模型株 Becker,通常在5×108至8×108CFU/mL的范围发现合适的金黄色葡 萄球菌攻击。

施用

使用本文提供的指导和本领域众所周知的技术,可以配制免疫原, 并施用给患者。太阳城集团药物施用的指南通常提供在,例如,Vaccines, Plotkin和Orehstein编,W.B.Sanders Company,1999;Remington′s Pharmaceutical Sciences第20版,Gennaro编,Mack Publishing,2000; 和Modern Pharmaceutics第2版,Banker和Rhodes编,Marcel Dekker, Inc.,1990,每篇都在这里引作参考。

太阳城集团药学上可接受的载体能有利于保藏和免疫原向患者的施用。药学上 可接受的载体可以含有不同的组分,例如缓冲剂、无菌注射用水、生理 盐水或磷酸缓冲盐水、蔗糖、组氨酸、盐和polysorbate。

太阳城集团通过不同的途径,例如皮下的、肌内的或粘膜的,可以施用免疫原。 使用例如针或喷射注射器(jet-injector),可以进行皮下的和肌内的施 用。

太阳城集团优选地,考虑本领域众所周知的因素,包括患者的年龄、体重、性 别和医学状况,施用途径,所需的效果,和采用的具体化合物,可以确 定合适的给药方案。可以以多剂的疫苗形式使用免疫原。可以预期,一 剂由1.0μg至1.0mg总多肽组成。在本发明的不同的实施方案中,该 范围是0.01mg至1.0mg和0.1mg至1.0mg。

给药太阳城集团选择取决于本领域众所周知的因素。初次施用后,如果特 定的个体需要,随后可以施用一个或多个激发剂量,以维持或加强抗体 滴度。给药方案的实例是第1天,1个月,在4、6或12个月时第3次 给药,和根据需要以较远次数的其它激发剂量。

抗体的产生

太阳城集团可以使用能诱导保护性免疫的ORF0657相关多肽来产生抗体和抗体 片段,所述抗体和抗体片段能结合该多肽或金黄色葡萄球菌。这样的抗 体和抗体片段具有不同的用途,包括在多肽纯化、金黄色葡萄球菌识别、 或治疗性地或预防性地处理金黄色葡萄球菌感染中的用途。

抗体可以是多克隆的或单克隆的。用于生产和使用抗体的技术是本 领域众所周知的。这样的技术的实例记载在Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley,1987-1998,Harlow等, Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1988,和Kohler等,Nature 256:495-497,1975。

实施例

太阳城集团下面提供的实施例进一步解释了本发明的不同特征。这些实施例也 解释了有用的用于实现本发明的方法。这些实施例不限制要求保护的发 明。

实施例1:使用ORF0657n区来提供保护性免疫

该实施例解释了全长ORF0657n区提供保护性免疫的能力。

ORF0657n克隆和表达

太阳城集团设计了PCR引物,以扩增能编码ORF0657n的基因,其从第一个天 冬酰胺残基开始,且在位于末端天冬酰胺残基的终止密码子之前结束。 这些PCR引物也具有其它的NcoI(正向引物)和XhoI(反向引物)位点, 以促进向表达载体中的克隆。

太阳城集团设计编码的蛋白以从具有末端His残基和由该载体编码的终止密码 子的pET28载体表达。另外,将甘氨酸残基添加到甲硫氨酸起始密码子 后的蛋白中。得到的扩增的DNA序列能编码羧基His-标记ORF0657n(SEQ ID NO:28)。

使用已经被工程改造在PCR引物中的NcoI/XhoI位点,将PCR扩增 的序列连接进pET28载体(Novagen)中,并通过热休克导入大肠杆菌DH5 α(Invitrogen)。在37℃,使转化混合物在含有100μg/mL卡那霉素 的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上生长过夜。选择菌落,在含有30μg/mL 卡那霉素的LB中生长,制备DNA minipreps(Promega),并通过限制消 化和PCR测定插入片段完整性。使用引物M13F(SEQ ID NO:65)、M13R (SEQ ID NO:66)、ORF0657nF(SEQ ID NO:67)和ORF0657nR(SEQ ID NO: 68),对4个具有正确的插入片段大小的minipreps进行了测序。选择了 与理想序列相比没有DNA变化的克隆。

转化了大肠杆菌HMS174(DE3)细胞(Novagen),并在含有卡那霉素 (30μg/mL)的LB平板上生长;选择了3个菌落(UnkC-1、UnkC-2和 UnkC-3),用于表达测试。在37℃、250rpm温育液体LB(卡那霉素)培 养物,直到A600达到0.6-1.0,然后通过加入IPTG至1mM的终浓度进行 诱导,然后另外温育3小时。通过在4℃、5000xg离心5分钟,收获 培养物。将细胞重新悬浮到500μL裂解缓冲液(Bug Buster,含有蛋白 酶抑制剂,Novagen)中。加入等体积的装载缓冲液(补加了5%终体积的 β-巯基乙醇),然后将样品在70℃加热5分钟。将提取物上Novex 4- 20%Tris-甘氨酸凝胶,并使蛋白可视化(考马斯蓝染色),并在硝酸纤维 素上进行印迹,用抗-HIS6抗体(Zymed)检测。

ORF0657n纯化

太阳城集团将上面的小规模的方法直接按比例放大到50升工作体积的搅拌罐 式发酵罐(75升规模)中。在含有50mL Luria-Bertani(LB)培养基(加 卡那霉素)的250mL烧瓶中培养接种物,并接种1mL冷冻的种子培养物, 培养3小时。使用1mL这样的种子,接种含有500mL LB培养基(加卡 那霉素)的2升烧瓶,并培养16小时。用50升LB培养基(加卡那霉素), 培养大规模发酵罐(75升规模)。发酵罐的发酵参数是:压强=5表压 (psig),搅拌速度=300rpm,气流=15升/分钟,且温度=37℃。 将细胞培养至在600nm波长的光密度(OD)为0.8光密度单位,并用1mM 浓度的异丙基-β-K-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。使用IPTG的诱导太阳城集团 是3小时。如下收获细胞:将温度降低至15℃,穿过500KMWCO中空纤 维盒进行浓缩,在4℃、9,000倍重力离心20分钟。倾析出上清液,并 在-70℃冷冻重组大肠杆菌湿细胞沉淀。

以8mL/g细胞湿重,将重组大肠杆菌细胞(19.2g湿细胞重量)悬 浮在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0,0.1M NaCl,2mM MgCl2,10 mM咪唑,0.1%TweenTM-80和6M盐酸胍)。以0.05mL/g细胞浆,将 与多-(组氨酸)-标记的蛋白(Sigma,P8849)一起使用的蛋白酶抑制剂混 合物加入悬浮液中。另外,加入溶菌酶至1mg/mL,加入BenzonaseTM(EM Ind.)至1μL/mL。通过使悬浮液在4℃穿过在14,000 PSI的微流化仪 (Microfluidics Model 110S)4次,完成细胞裂解。在4℃、11,000x g沉淀细胞碎片30分钟,保留上清液。

太阳城集团从上清液中纯化出携带His-标记的蛋白。在轻度颠倒下,在4℃混 合上清液与20mL Ni+-NTA琼脂糖(Qiagen)2小时。将混合物倒入空心柱 (1.5cm×20cm)中,并将未结合的级分大量收集。用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,0.15M NaCl,0.1%TweenTM-80)洗涤柱子。用300mM 咪唑,20mM Tris-HCl,pH7.5,0.15M NaCl,0.1%TweenTM-80的分级 梯度,洗脱His-标记的ORF0657n。

通过考马斯染色的SDS-PAGE,检测了含有His-标记ORF0657n(SEQ ID NO:28)的级分,并合并。经0.2微米过滤器,过滤合并的级分,以 去除颗粒材料,并应用到大小排阻柱(Sephacryl S-300 26/60柱, Amersham Biosciences)上,用10mM MOPS pH7.1,150mM NaCl,以1 mL/分钟洗脱。通过考马斯染色的SDS-PAGE和蛋白印迹(anti-tetra His Mab,Qiagen),检测了含有His-标记ORF0657n的级分。通过Zeta-PlusTM生物滤器(CUNO),过滤去除了内毒素。通过BCA(Pierce),确定了蛋白 浓度。通过考马斯染色的凝胶的光密度测定法,测定了纯度。

实施例2:金黄色葡萄球菌攻击的制备

太阳城集团使金黄色葡萄球菌在胰胨豆胨琼脂(TSA)(Becton Dickinson, Sparks,MD)平板上、在37℃生长过夜。通过将5mL PBS加到平板上, 从TSA平板上洗涤细菌,并用无菌的涂布器轻柔地重新悬浮细菌。使用 Sorvall RC-5B离心机(Dupont Instruments),在6000rpm离心细菌 悬浮液20分钟。将沉淀重新悬浮到16%甘油中,并将等分试样冷冻储存 在-70℃。

使用之前,融化接种物,适当稀释,并用于感染。将每份原液滴定 至少3次,以确定适用于诱导前次用于实验的小鼠的慢死亡动力学的剂 量。连续监控细菌接种物的潜能(杀死80-90%小鼠的能力),以确定模型 的重复性。在每个攻击实验前10天,攻击并监控了一组10只对照动物 (只用佐剂免疫的)。

实施例3:使用His-标记的ORF0657n相关多肽的保护研究

通过3剂在羟基磷酸铝佐剂(每剂450μg)上的His-标记ORF0657n (SEQ ID NO:28)(每剂20μg),免疫了25只BALB/c小鼠。Klein等, Journal of Pharmaceutical Sciences 89,311-321,2000描述了羟基 磷酸铝佐剂(AHP)。作为在第0、7和21天的2次50μL肌内注射,进 行了给药。在第28天,抽小鼠的血,通过ELISA筛选它们的血清对His- 标记ORF0657n的反应性。

在实验的第35天,以在滴定实验中确定的剂量(7.3×108CFU/mL), 通过静脉内注射生长的金黄色葡萄球菌,攻击了小鼠,以造成在约2-7 天的太阳城集团段的死亡。相对于已经用AHP假免疫的对照组小鼠,评价了具 有慢死亡动力学的该致死模型的存活率。经14天的太阳城集团段,监控小鼠的 存活率(图3A)。在实验结束时,ORF0657n免疫的组中有11只小鼠存 活,与在AHP对照组中有3只存活形成对比。

太阳城集团图3B和3C解释了使用与ORF0657nH和ORF0657nI区相对应的多肽 的保护。图3B解释了用含有羧基His-标记的SEQ ID NO:4的保护。图 3C解释了用含有羧基His-标记的SEQ ID NO:5的结果。

太阳城集团实施例4:得到ORF0657n序列

已经暗示ORF0657n在金黄色葡萄球菌铁获得中起作用(Andrade等, Genome Biology 3(9):47.1-47.5,2003.)。在不同的文献中,已经 为ORF0657n序列给出了不同的名称,其中的一些是不同来源的(例如, 见,Etz等,PNAS USA,99:6573-6578,2002(LPXTGVI);Baba等, The Lancet 359:1819-1827,2002(MW1011);Kuroda,等,The Lancet 357,1225-1240,2001(SA0976);Andrade等,Genome Biology 3(9): 47.1-47.5,2003(S_aur2);Mazmanian等,Science 299:906-909, 2003(isdB);Mazmanian等,Molecular Microbiology 40:1049-1057, 2001(sasJ);和Taylor等,Mol.Microbiol.43:1603-1614,2002 (sirH)。

似乎在不同的专利公开中,提供了与ORF0657n蛋白序列相对应的多 肽序列(Meinke等,2002年8月1日公开的国际公开号WO02/059148, Wang等,2002年10月3日公开的国际公开号WO02/077183,Masignani 等,2002年11月28日公开的国际公开号WO02/094868,Foster等,2002 年12月27日公开的国际公开号WO02/102829,和Foster等,2003年 2月13日公开的国际公开号WO03/011899.)。

太阳城集团从不同的金黄色葡萄球菌临床分离物,得到了基因组DNA。将临床 分离物加入到3mL Difco胰胨豆胨培养液(Becton Dickinson,Sparks, MD)中,并在37℃和150rpm温育过夜。在1.5mL Eppendorf管中,在 14,000rpm离心过夜的培养物5分钟。倾析出培养液,将沉淀重新悬浮 在500μL重新悬浮缓冲液(25%蔗糖,10mM Tris pH7.5)中。将2mg/ml 溶葡萄球菌素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)溶液的5μL等分试样 加入每份重新悬浮的沉淀中。然后,在37℃温育悬浮液1小时。

在温育阶段的末尾,将250μL2%SDS加入每个管中,并涡旋,直 到溶液的粘度显著降低。加入250μL苯酚-氯仿-异戊醇溶液(25∶24∶ 1,v/v)(Gibco/Invitrogen Corporation,Grand Island,NY)。涡旋 混合物30秒,并在14,000rpm离心5分钟。取出上面的水相,重复沉 淀步骤,直到几乎不残留任何界面。向每个管中加入0.1体积的3M NaOAc, pH4.8,并混合。然后加入1体积异丙醇,并再次混合。将管在室温温 育5分钟,然后在14,000rpm离心15分钟。倾析出上清液,并将管在 组织上倒置干燥。将沉淀重新悬浮在50μL无菌的H2O中。

将分离的DNA用作PCR的模板。使用正向引物(ORF0657nF,SEQ ID NO:67)和反向引物(ORF0657nR,SEQ ID NO:68),扩增了该基因。使 用标准的Big Dye方法,对PCR产物进行了测序。

实施例5:来自不同的金黄色葡萄球菌分离物的ORF0657n的对比

太阳城集团发现ORF0657n在病理学上和分类学上不同的金黄色葡萄球菌临床 分离物收集物中是非常保守的。表3总结了不同的分离物(包括临床分 离物)之间的百分比同一性。

表3

 菌株  MLST 来源 国家  CP  ORF0657n  %ID  CL-1  1 高毒性的公共血液分离物 英国 MSSA  8  99  MW2  1 高毒性的公共血液分离物 美国 MRSA  8  99  CL-2  1 左前臂伤 美国 MSSA  8  99  CL-3  1 臂伤 美国 MSSA  8  99  CL-4  5 左脚 美国 MRSA  5  99  CL-5  5 伤口 美国 MRSA  5  100  Mu50  5 脓,手术伤口感染 日本 VISA  5  100  N315  5 咽涂片 日本 MRSA  5  100  CL-6  5 CDC3 美国 MRSA/ VISA  5  97  CL-7  8 血液 德国 MRSA  5  98  NCTC8325  8 MSSA实验室菌株 美国 MSSA  5  99  CL-8  8 右腿伤 美国 MRSA  5  99  CL-90  9 鼻孔 英国 MSSA  5  97  CL-10  9 血液 英国 MSSA  5  97  CL-11  12 血液 荷兰 MSSA  8  97  CL-12  12 鼻孔 英国 MSSA  8  97  CL-13  15 左指皮肤 美国 MSSA  8  99  CL-14  15 Pus left anaresle 美国 MSSA  8  99  CL-15  15 血液 英国 MSSA  8  99  CL-16  22 血液 加拿大 MSSA  5  99  CL-17  22 Bamin MRSA 德国 MRSA  5  98  CL-18  25 血液 加拿大 MRSA  5  97  CL-19  25 血液 英国 MSSA  5  97  CL-20  25 鼻孔 英国 MSSA  5  97  CL-21  30 来源未知的mecIV 瑞典 MRSA  8  94

 菌株  MLST 来源 国家  CP  ORF0657n  %ID  CL-22  30 来源未知的mecIV 德国 MRSA  8  94  CL-23  36 传染性MRSA血液 英国 MRSA  8  94  CL-24  45 左腿残肢脓 美国 MRSA  8  95  CL-25  45 鼻孔 美国 MRSA  8  95  Becker  45 原型荚膜8菌株 美国 MSSA  8  95  COL  88 MRSA实验室菌株 美国 MRSA  5  100  CL-26  97 血液 荷兰 MSSA  5  98  CL-27  97 血液 加拿大 MSSA  5  99  CL-28  97 鼻孔 英国 MSSA  5  99  CL-29  121 鼻孔,公共疾病 英国 MSSA  8  96  CL-30  121 血液 英国 MSSA  8  96

太阳城集团CP,荚膜类型;MLST,多基因座序列分型分类学的分组;MRSA二甲 氧基苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌;MSSA,二甲氧基苯青霉素敏感的 金黄色葡萄球菌;“CL”是指临床分离物。“ID”是指同一性。“VISA”是 指万古霉素中间的金黄色葡萄球菌。

通过比对多肽序列和SEQ ID NO:2,并确定相同的氨基酸的数目, 确定了百分比同一性(%ID)。该数目除以(SEQ ID NO:2的)氨基酸总数, 然后乘以100,并四舍五入到最接近的整数。

太阳城集团实施例6:针对不同的金黄色葡萄球菌临床分离物的保护

使用His-标记ORF0657n作为免疫原(SEQ ID NO:28),评价了 ORF0657n作为针对不同的金黄色葡萄球菌临床分离物的免疫原的功 效。使用表3所述的分类学上不同的分离物的亚群作为攻击接种物。在 这些不同的分离物中的ORF0657n序列与采用的疫苗OFR0657n序列不 同。

太阳城集团使用实施例2所述的技术,制备了得到的攻击菌株。使用实施例3 所述的技术,免疫和攻击了小鼠,并监控了10天。在该模型中常规地使 用的攻击接种物远远超过了在人感染中一般遇到的那些。

证实了针对二甲氧基苯青霉素敏感的和抗性的菌株的保护。结果显 示在图4A-4H中。

太阳城集团实施例7:用于酵母表达的SEQ ID NO:28的密码子最优化

太阳城集团为了在酵母中表达,密码子最优化了能编码SEQ ID NO:28的氨基 酸1-646的核酸序列。SEQ ID NO:28的氨基酸1-646密码子最优化的 序列显示在图8C(SEQ ID NO:31)中。

使用没有羧基His-标记编码区的SEQ ID NO:29作为最优化的起始 构建体。最优化之前的编码序列的总密码子选择是:28%密码子(179)是 非常罕见的,或从未被高表达的酵母基因所使用,且20%(126)是中等罕 见的。

太阳城集团进行了能编码SEQ ID NO:28的氨基酸1-646的核酸的密码子最优 化,以将具有低或中等表达的密码子替换为在酵母中高表达的密码子。 另外,将甘氨酸密码子加入到第二个位置。使用软件程序MacDNAsis Pro V3.0,进行了密码子最优化。使用的用于反向翻译(backtranslate)蛋 白的参数表指示着高表达的啤酒糖酵母密码子。在MacDNAsis Pro中, 使用的功能是“翻译>[蛋白-->DNA]”。将输出称作“氨基酸转变”。

太阳城集团在一些情况下,对于给定的氨基酸,存在不只一个高表达的密码子。 例如,丝氨酸可以由“TCT”或“TCC”编码。在这些情况中,使用了近 似相等数目的2种不同的密码子。表4提供了高表达的啤酒糖酵母密码 子的密码子表。

表4

 氨基酸  最佳密码子  氨基酸  最佳密码子  Phe  TTC  His  CAC  Leu  TTG  Gln  CAA  Ile  ATT,ATC  Asn  AAC  Met  ATG  Lys  AAG  Val  GTT,GTC  Asp  GAC  Ser  TCT,TCC  Glu  GAA  Pro  CCA  Cys  TGT  Thr  ACT,ACC  Trp  TGG  Ala  GCT  Arg  AGA  Tyr  TAC  Gly  GGT

将非最佳的所有密码子都替换成了在高表达的酵母基因中出现的密 码子,只是除了将2个丙氨酸密码子改变成在中等表达的SEQ ID NO:31 的基因中出现的密码子外(GCG开始于核苷酸505和1546)。

通过设计用于编码最终所需序列的25个寡聚物(SEQ ID NO:69-93) 的退火和延伸,制备了能编码ORF0657n的全序列。该寡聚物是85-110bp 对长。该寡聚物是交替的ORF0657n编码序列。每个寡聚物与邻接寡聚物 具有25-29bp的互补重叠,且双链体具有80-84℃的Tm。通过给GC碱 基对指定4℃的值,给AT碱基对指定2℃,可以手工计算出该值。

使用3或4个邻接的重叠寡聚物和(23-26)个核苷酸长的有义和反义 PCR引物,其中双链体Tm=70-72℃,进行了几个分开的延伸反应。在如 下所述的“着地(touch down)”方法中,使用自然的Pfu DNA聚合酶 (STRATAGENE,La Jolla,CA)进行了PCR反应:95℃,90秒,一个循环; 95℃,30秒,55℃,30秒,68℃,3分钟,进行5个循环,然后马上进 行第二系列的反应;95℃,30秒,52℃,30秒,68℃,3分钟,进行20 个循环。通过在68℃温育7分钟,结束反应。作为这些PCR反应的结果, 生成了的7个共线性片段(为了方便,在本文中称作1、2、3、4、5、6 和7)。

太阳城集团通过琼脂糖凝胶电泳,分离了片段,并按照生产商所推荐的,使用 GENE CLEAN_II方法(QBIOgene,Carlsbad,CA),切离和纯化了适当 大小的产物。在随后的PCR反应中,使用适当的引物,组合共线性片段 1、2和3,共线性片段4和5,和共线性片段6和7,分别生成片段A、 B和C。然后通过其它的PCR反应,其中使用远端的有义和反义引物,组 合了片段A、B和C,组装了ORF0657n的完整基因。凝胶分离了最终的 PCR产物,并按照生产商所推荐的,将其克隆进pCR_-Blunt N-TOPO_(INVITROGEN,Carlsbad,CA)。得到了几个独立的克隆的DNA序列,并 识别了错误。

太阳城集团根据生产商的推荐,依次使用QUIK-CHANGE定点诱变试剂盒,或同 时使用QUIK-CHANGE定点多重诱变试剂盒(STRATAGENE,La Jolla,CA), 在3个独立的克隆pUC3、pUC4和pUC6的不同的片段上,校正了错误。 通过交换来自3个克隆的修复的限制片段,得到了最终的校正的序列。 用克隆pUC4的修复的1.1-kb XmnI片段交换pUC3的对应的XmnI片段, 以构建pUnkC13。用pUC6的修复的456-bp AccI片段交换pUnkC13的 对应片段,以构建pUnkCR1,并检验了DNA序列。

实施例8:用于重组基因表达的啤酒糖酵母菌株的构建

太阳城集团该实施例解释了可以用于得到重组基因表达的啤酒糖酵母菌株的技 术。下面描述了命名为1260和1309的菌株的生成。由于菌株的遗传背 景可以极大地影响菌株的异源蛋白表达的性质,所以需要构建具有不同 遗传背景的酵母菌株,其也含有几种理想的遗传标记:(1)mnn9突变, 以预防分泌的蛋白的过度糖基化,(2)prb1和/或pep4蛋白酶突变,以 减少蛋白水解的问题,和(3)GAL4转录因子的超表达,以增强GAL启 动子的表达。

太阳城集团命名为1260的啤酒糖酵母菌株的构建

以下述的方式,构建了原始的啤酒糖酵母菌株。使啤酒糖酵母菌株 Y379-5D(MATα、cyh2、nib1、rho-、cir°)(Livingston,Genetics 86: 73-84,1977)与菌株DC04(MATα、ade1、adeX、leu2-04、cir°)(Broach 等,Cell 21:501-508,1980)杂交。使得到的二倍体菌株产生孢子,并 通过标准方法,解剖四联体。一个单倍体孢子生成菌株2150-2-3(MATα、 ade1、leu2-04、cir°)。α-交配型酒糖酵母菌株LB-347-1C(MATα、mnn9) 是含有mnn9突变的啤酒糖酵母菌株X2180-1B(MATα、SUC2、ma1、me1、 ga12、CUP1;ATCC号204504)。通过在YEHD完全培养基琼脂平板上混 合菌株(Carty等,J.Ind.Micro 2:117-121,1987),使LB-347-1C 与模式2150-2-3(MATα、leu2-04、ade1)交配。为了选择二倍体,将交 配的菌株影印铺板到不含亮氨酸、且含有2%蔗糖作为唯一碳源的基本培 养基上。分离单个的菌落后,使二倍体产生孢子,并通过标准技术解剖 子囊。将KHY-107菌株分离成单个的单倍体孢子,并鉴别为ADE1、leu2 和mnn9(通过Schiff染色技术)。建立了在甘油中的冷冻原种,并保藏 在-70℃。

太阳城集团从-70℃原种生长了KHY-107(cir+),并用酵母载体pC1/1进行了 转化,后者含有酵母LEU2-d基因,且与pJDB219相关(Beggs,Nature 275:104-109,1978),只是除了pMB9 DNA被替换为pBR322 DNA。使 分离的转化体在选择性液体培养基(缺少亮氨酸,且含有1M山梨醇)中 生长,然后在丰富培养基(含有1M山梨醇)中多次传代,以丢失pC1/1 和2μDNA。通过DNA-DNA杂交,检查了已经丢失了pC1/1的菌落(不能 在缺少亮氨酸的培养基上生长)中2μDNA的存在。选择了分离的没有显 示出2μDNA的克隆KHY-107(cir°)-1,并建立了在甘油中的冷冻原种 (-70℃)。

太阳城集团通过基因破坏,将KHY-107(cir°)-1制成ura3。构建了质粒,其 含有被来自Tn903的Aph3′I基因的2个拷贝所破坏的啤酒糖酵母URA3 基因。从载体切割了5′-URA3-Aph3′I-URA3-3′盒,并用于转化KHY-107 (cir°)-1。在5-氟-乳清酸平板上,选择了已经整合了破坏的ura3盒的 转化体(Kaiser,C.等,Methods in Yeast Genetics-1994版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(Cold Spring Harbor,New York; 1994)第214-215页),并随后显示其不能在缺少尿嘧啶的培养基上生 长。选择了一个分离的克隆KHY-107ura3(PN2),并建立了在甘油中的 冷冻原种(-70℃)。

使KHY-107ura3(PN2)在复合培养基(含有1M山梨醇)上生长,然 后铺板到含有刀豆氨酸(而不是精氨酸)的合成培养基上,得到了刀豆 氨酸-抗性的(canR)突变体。将自发的canR突变体划线为在含有刀豆氨酸 (而不是精氨酸)的固体合成培养基上分离的菌落。通过标准的遗传互 补实验,显示分离的菌落是can1。选择了一个分离的can1菌落DMY10, 并作为在甘油中的冷冻原种(-70℃)进行保藏。

太阳城集团为了超表达酵母GAL4转录因子,将GAL10p-GAL4融合基因整合进 了DMY10的HIS3基因中。从pKHint-C切离了5′-HIS3-GAL10p-GAL4- URA3-HIS3-3′盒(Schultz等,Gene 61:123-133,1987),并用于转 化DMY10。在缺少尿嘧啶的固体合成培养基上,选择了已经整合了该盒 的转化体,并随后显示其不能在缺少组氨酸的培养基上生长。通过DNA 杂交,验证了该盒仅仅在HIS3基因座的整合。选择了一种分离的整合体 DMY10int-3,并建立了在甘油中的冷冻原种(-70℃)。将该菌株命名为 CF52。

用HindIII和XhoI消化了携带啤酒糖酵母PRB1基因的质粒FP8ΔH (Moehle等,Genetics 115:255-263,1987),并凝胶纯化了携带PRB1 基因的3.2-kbp DNA片段,通过用T4 DNA聚合酶处理,造成平端。用 BamHI消化了质粒pUC18,经凝胶纯化,并通过用T4 DNA聚合酶处理, 造成平端。用上面的PRB1基因片段,连接得到的载体片段,以产生质粒 pUC18-PRB1。用BamHI消化了含有HIS3基因的质粒YEp6(Struhl等, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 76:1035,1979)。凝胶纯化了得到的 携带功能性HIS3基因的1.7-kbp BamHI片段,然后通过用T4 DNA聚 合酶处理,造成平端。用EcoRV和NcoI消化了pUC18-PRB1载体,其能 剪切PRB1编码序列,并去除蛋白酶B活性位点和侧翼序列。凝胶纯化了 携带pUC18中的PRB1编码序列的残余的5′和3′-部分的5.7-kbp EcoRV-NcoI片段,通过用T4 DNA聚合酶处理,造成平端,用碱性磷酸 酶去磷酸化,并与上述的平端的HIS3片段相连。得到的质粒(命名为 pUC18-prb1::HIS3,原种#1245)含有功能性HIS3基因,其替代了上 面已经缺失的PRB1基因的部分。

太阳城集团用SacI和XbaI消化了PRB1基因破坏载体(pUC18-prb1::HIS3), 以产生线性的prb1::HIS3破坏盒,并通过乙酸锂方法,用于转化菌 株CF52(Ito等,J Bacteriol.153:163,1983)。在缺少组氨酸的合 成琼脂培养基上,选择了His+转化体,并在相同的培养基上重新划线, 进行克隆分离。从许多得到的His+分离物制备了基因组DNA,用EcoRI 消化,然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。DNA印迹分析证实了需要的 prb1Δ::HIS3基因破坏的存在。

太阳城集团选择了一个含有需要的prb1Δ::HIS3破坏的分离物,用于其它用 途,并命名为菌株#1260。制备了菌株#1260在甘油中的冷冻原种,以保 藏在-70℃。得到的菌株1260的基因型如下:MATα、leu2-2、112、mnn9、 ura3Δ、can1、his3Δ::GAL10p-GAL4-URA3、prb1Δ::HIS3、cir°。

太阳城集团命名为1309的啤酒糖酵母菌株的构建

以前已经描述了啤酒糖酵母菌株BJ1995(MATα、leu2、trp1、 ura3-52、prb1-1122、pep4-3、ga12)(Jones,E.W.,Tackling the Protease Problem in Saccharomyces cerevisiae,Methods in Enzymology 194(1991),第428-453页)。使用公开的构建菌株1260 的方法,分离了缺少内源性2μDNA质粒的BJ1995的cir°衍生物。将 得到的cir°分离物命名为菌株91,并作为在甘油中的冷冻原种(-70℃) 进行保藏。

然后,构建了菌株91的衍生物,其能过量生产GAL4转录因子,以 增强从GAL启动子的转录。用BamHI消化了质粒pKHint-C(Schultz等, Gene 61:123-133,1987),并使用得到的5′-HIS3-GAL10p-GAL4- URA3-HIS3-3′盒转化菌株91。在缺少尿嘧啶的固体合成培养基上,选择 了已经整合了该盒的转化体,随后显示其不能在缺少组氨酸的培养基上 生长。使用酵母HIS3基因的探针,通过DNA印迹杂交,确认了该盒在 HIS3基因座中的理想整合。选择了一个分离的整合体BJ1995cir°int #22,并建立了在甘油中的冷冻原种(-70℃)。将该分离物命名为菌株 1282。

太阳城集团然后,按照下面的一系列步骤,分离了含有破坏的MNN9基因的菌株 1282的衍生物。为了破坏MNN9基因,必须首先从啤酒糖酵母基因组DNA 克隆出MNN9基因,以制备基因破坏载体。这可以通过标准的PCR技术来 实现。在公开的酵母MNN9基因的序列的基础上(MacKay等,欧洲公开号 EP0314096,国际公开日1989年5月3日),设计了用于全长MNN9编码 序列的PCR的5′有义引物和3′反义引物。使用了下面的含有侧翼 HindIII位点(标有下划线)的寡脱氧核苷酸引物:

太阳城集团有义引物(SEQ ID NO:94):5′-CTT AA A GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3′

太阳城集团反义引物(SEQ ID NO:95):5′-TGA T AA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3′

太阳城集团用粗体突出了MNN9基因的起始甲硫氨酸密码子。

太阳城集团使用来自啤酒糖酵母的基因组DNA作为模板,进行了PCR。用HindIII 消化了得到的携带MNN9基因的1.2-kbp PCR片段,进行了凝胶纯化,并 与HindIII-消化的、碱性磷酸酶处理的pUC13进行连接。将得到的质粒 命名为p1183。从YRp7分离了酵母TRP1基因(Struhl等,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 76:1035-1039,1979),作为0.85-kb EcoRI-BglII 片段,使其产生平端,然后插入p1183的PmlI位点。PmlI位点位于MNN9 编码序列的中央,因此TRP1基因在该位点的插入会导致基因破坏。然 后,用HpaI和EcoRI消化了得到的质粒pUC13-mnn9::TRP1 (p11885-239-1),并通过乙酸锂方法,使用5′-mnn9-TRP1-mnn9-3′盒转 化了菌株1282(Ito等,J Bacteriol.153:163,1983.)。

太阳城集团在缺少色氨酸的合成培养基琼脂平板上,选择了Trp+转化体,并在 相同的平板上重新划线,进行单菌落分离。从许多得到的Trp+分离物制 备了基因组DNA,用HindIII消化,然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。DNA 印迹分析证实了需要的mnn9::TRP1基因破坏的存在。选择了一个含 有需要的mnn9::TRP1破坏的分离物,用于其它用途,并命名为菌株 1309。制备了菌株1309在甘油中的冷冻原种,保藏在-70℃。得到的菌 株1309的基因型如下:MATα、leu2、mnn9::TRP1、trp1、ura3-52、 his3Δ::GAL10p-GAL4-URA3、prb1-1122、pep4-3、ga12、cir°。

太阳城集团实施例9:全长ORF0657n区的表达

太阳城集团在大肠杆菌(SEQ ID NO:28;His-标记ORF0657n)和啤酒糖酵母(SEQ ID NO:28的氨基酸1-646)中表达了全长ORF0657n,并对比了表达产物。

啤酒糖酵母表达

使用下面的含有侧翼BamHI限制位点的有义和反义引物,分别是 UnkCY-F(SEQ ID NO;96),5′AAC CGG TTT  GGA TCC CAC AAA ACA AAA TGG GTA ACA AGC AAC AAA AGG AAT TC3′和UnkCY-R(SEQ ID NO:97), 5′AAC CGG TTT  GGA TCC TTA GTT CTT TCT CTT TCT TGG CAA GAC3′, 从最后校正的克隆pUnkCR1(实施例7)扩增了能编码ORF0657n蛋白的 DNA,其具有为酵母表达最优化的密码子。该有义引物含有5′非翻译序 列和ATG密码子,该反义引物含有TAA作为终止密码子。凝胶分离了得 到的1.9-kb产物,并根据生产商的说明,将其克隆进TOPO TA载体pCR2.1 (INVITROGEN CORPORATION,Carlsbad,CA),以构建质粒UnkC-B1。随 后,验证了插入片段的DNA序列。凝胶分离了BamHI片段,并将其以适 当的方向亚克隆进酵母载体(pGAL110,图5A)中,以构建pRUnkC- pGAL110。通过DNA测序,验证了插入片段的序列。

使用原生质球转化方法(Hinnen等,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,75:1929-33,1978),使用来自pRUnkC-pGAL110的质粒DNA将含 有leu2突变的啤酒糖酵母菌株转化成亮氨酸原养型(Leu+)。在上面的实 施例8中,提供了菌株1260和1309的构建。

在缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的合成琼脂培养基上,选择了转 化体。从REMEL,Lenexa,KS得到了缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的 顶层和底层合成琼脂培养基(目录号分别是09459和92155)。通过在SD 负型亮氨酸平板(KD MEDICAL,Columbia MD)上的系列生长,得到了克 隆的Leu+分离物。

为了筛选多个转化体,使5.0mL生产培养物在30℃、在缓慢旋转 的培养管中生长。随后,在125-mL烧瓶内的25-ml培养物中,证实了选 择的转化体的生产。对于2种情况,使5-mL种子培养物在30℃、在含 有4.0%葡萄糖和0.1M山梨醇的5X负型亮氨酸培养基中生长18-24小 时,至OD600为1.5-3.0/mL。5X负型亮氨酸培养基含有下面的组分(每 升):没有添加氨基酸或硫酸铵的酵母含氮碱基,8.5g;腺嘌呤,0.40g; L-酪氨酸,0.25g;尿嘧啶,0.20g,琥珀酸,10.0g,硫酸铵,5.0g 和50ml亮氨酸负型的溶液#3。亮氨酸负型的溶液#3在每升蒸馏水中 含有L-精氨酸,2g;L-组氨酸,1.0g;L-异亮氨酸,6g;L-赖氨酸4.0 g;L-甲硫氨酸,1.0g;L-苯丙氨酸,6.0g;L-色氨酸,4.0g。用50% 氢氧化钠,将培养基的pH调节至5.3。

为了管内的生产,将0.3mL种子培养物的等分试样转移到5.0mL 5X 负型亮氨酸培养基(含有2%葡萄糖、4%半乳糖)或YEHDG培养基中72 小时,至最终OD600为5-16.0/mL。每升YEHDG培养基含有:L-Hy-大豆 蛋白胨-Sheffield,10g;酵母提取物,20g;L-葡萄糖,16g;D(+) 半乳糖,40g。为了烧瓶内的生产,将1.5mL种子培养物的等分试样转 移到25-mL培养基中,并在220rpm摇动下,如上所述生长。

太阳城集团每个样品收获10 OD单位后,在0.3mL裂解缓冲液(0.1M磷酸钠 缓冲液,pH7.2,0.5M NaCl,2mM PMSF)中,用玻璃珠破碎细胞沉淀。 离心回收裂解物。用0.3mL裂解缓冲液洗涤未破碎的细胞/珠子,并合 并澄清的上清液。根据生产商的说明,通过BIO-RAD蛋白测定染料试剂 系统(BIO-RAD,Hercules,CA),确定了蛋白浓度。在还原和变性条件下, 在1X Tris-甘氨酸SDS缓冲液(BIO-RAD)中进行4-20%梯度Tris-甘氨酸 凝胶(INVITROGEN,Carlsbad,CA)电泳后,通过免疫印迹分析,分析了 细胞裂解物中的ORF0657n表达。样品含有20μg总细胞蛋白。将凝胶电 印迹在0.45微米硝酸纤维素膜过滤器(从Schleicher和Schuell,Keene, NH得到的Optitran)上。为了估计蛋白大小,与裂解物平行地运行了预 染色的6.4至203kDa的标准(广范围的预染色的SDS-PAGE标准,BIO- RAD)。

大肠杆菌标准

太阳城集团从诱导生产ORF0657n的大肠杆菌生产培养物(大肠杆菌宿主 HMS174(DE3),NOVAGEN,Madison,WI)纯化了His-标记ORF0657n(SEQ ID NO:28),并使用细胞裂解物作为标准。用能表达His-标记ORF0657n 的表达载体转化了大肠杆菌。使大肠杆菌培养物在含有30μg/mL卡那 霉素的LB液体培养基中,在37℃生长过夜。次日,使用60μL过夜培 养物接种6.0mL含有30μg/mL卡那霉素的LB。使培养物在37℃生长约 3小时,直到OD600达到0.4-1.0。用1mM IPTG在37℃诱导表达2小时。 收获细胞,将细胞沉淀保藏在-80℃。

按照生产商的方案,使用Bugbuster蛋白提取试剂(NOVAGEN, Madison,WI),制备了大肠杆菌裂解物。使用针对ORF0657n的鼠单克隆 抗体(命名为“2H2B8”)作为第一抗体,且使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣 根过氧化物酶-连接的全抗体(ZYMED LABORATORIES,South San Francisco,CA)作为第二抗体,通过蛋白印迹,免疫检测了蛋白。通过 用纯化的大肠杆菌生产的全长ORF0657n免疫小鼠,产生了Mab 2H2B8。 通过ELISA选择了Mab 2H2B8,并显示其对ORF0657n是特异性的。使用 BIO-RAD HRP缀合底物试剂盒,处理了过滤器。

太阳城集团来自大肠杆菌和啤酒糖酵母的表达产物

从酵母转化体的初次筛选,选择了每种酵母菌株1260和1309的一 个转化体,作为全长ORF0657n区(没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28) 的最佳生产者。在图6A和6B中,显示了与ORF0657n区(SEQ ID NO:28) 在大肠杆菌中的生产相比,在YEHDG培养基中发酵72小时后,它们生产 全长ORF0657n区的实例。

太阳城集团通过用mAb 2H2B8进行的蛋白印迹分析检测到的主要蛋白是约105- 110-kDa,如图6A(菌株1260)和6B(菌株1309)所示:泳道5和6。约 105-110-kDa蛋白在大小上对应着在大肠杆菌中生产的纯化的重组 ORF0657n的样品中检测到的最大蛋白(SEQ ID NO:28;泳道2)或诱导的 大肠杆菌ORF0657n-生产培养物的提取物(后者未包含在图6所示的凝胶 中)。105-110-kDa大肠杆菌和啤酒糖酵母生产的蛋白的分子量大于在我 们的凝胶-电泳系统中预测的大小。应当指出,在大肠杆菌对照中检测的 优势种类更小,约95kDa,且与少量在酵母中产生的蛋白共迁移。认为 约105-110-kDa蛋白对应着全长ORF0657n,在大肠杆菌和啤酒糖酵母中 表达的所述全长ORF0657n带有大肠杆菌分泌前导序列,且认为95-kDa 蛋白是降解产物。用单独的载体pGAL110得到的对照转化体的提取物, 没有观察到检测结果(泳道3和4)。

太阳城集团估计由1260和1309的转化体生产的ORF0657n区(没有羧基His- 标记的SEQ ID NO:28)的量是约10微克ORF0657n/mL YEHDG培养基, 其ORF0657n区包含约2%总蛋白,如通过使用100ng纯化的ORF0657n (SEQ ID NO:28)作为标准的半定量蛋白印迹所确定的。在2种菌株中, 在72小时时的总蛋白的表达量和%ORF0657n区(没有羧基His-标记的 SEQ ID NO:28)都大于在48小时时(未显示数据)。1260的转化体在5X 亮氨酸培养基(含有2%葡萄糖,4%半乳糖)中生产的ORF0657n区(没 有羧基His-标记的SEQ ID NO:28)的滴度是约8.0μg/mL,且%总蛋白 是2.0。

实施例10:分泌的密码于最优化的能编码ORF0657nH区的序列的表 达

太阳城集团载体pKH4-3B(Carty等,Biotechnol.Lett.12:879-884,1990) 含有酵母α因子(MFα1)前分泌前导序列原。需要的蛋白与该前导序列的 融合会产生翻译产物,其首先由啤酒糖酵母的信号肽酶切割。随后,Kex2 蛋白酶会在分泌前导序列中的“Lys Arg残基”后切割,并释放出成熟 的蛋白。使用啤酒糖酵母诱导型GAL10启动子来驱动蛋白表达。

太阳城集团使用载体pKH4-3B来表达密码子最优化的能编码改变的SEQ ID NO: 3的基因。通过去除氨基末端甲硫氨酸和添加氨基末端前导序列,改变 了SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:32的核苷酸4-1710提供了密码子最优化 的SEQ ID NO:3编码区,且如下所述制备的载体pKH4-3B提供了前导序 列编码序列。

太阳城集团进行了pKH4-3B的α因子前分泌前导序列原与SEQ ID NO:3的 ORF0657nH区的框内融合。这通过下述的方法实现:用SphI消化载体 pKH4-3B,然后用T4 DNA聚合酶处理,以去除SphI-突出端,从而在5′ 末端生成具有适当的前导序列密码子的平端。随后,用BamHI消化载体, 以生成3′克隆位点。该构建体需要具有与重建的ORF0657nH区(SEQ ID NO: 32)的第二个密码子相对应的5′平端的PCR产物、和具有终止密码子和 BamHI限制位点的3′末端。

使用下面的有义和反义引物,分别是UCKHS2(SEQ ID NO:98),5′ GCTGAAGAAACTGGTGGTACCAAC 3′和UCKHA2,(SEQ ID NO:99)5′ GTCAC GGATCCTTAAGACTTAGCCTTGTTTTCTTGAGTGTTC 3′,从pUnkCR1(实施 例7)扩增了能编码具有为酵母表达最优化的密码子的ORF0657nH区的 DNA。有义引物的5′末端GCT能编码丙氨酸,即预测的ORF0657nH区的 N-末端。反义引物含有TAA终止密码子和BamHI位点(标有下划线)。凝 胶分离了得到的1.7-kb PCR产物,并克隆进pKH4-3B(如上所述制备 的),以构建pUS38。验证了插入片段的完整的DNA序列和载体的部分序 列,并显示产生了与分泌前导序列的理想融合。用Kex2p适当切割从该 构建体表达的起始蛋白,会产生与缺少N-末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:3 相对应的蛋白。

通过使用原生质球转化方法(Hinnen等,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.75:1929-33,1978),使用质粒pUS38将啤酒糖酵母菌株1260 和1309转化成亮氨酸原养型(Leu+)。在缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇 的合成琼脂培养基上,选择了转化体。从REMEL,Lenexa,KS得到了缺 少亮氨酸、且含有1M山梨醇的顶层和底层合成琼脂培养基(目录号分别 是09459和92155)。通过在SD负型亮氨酸平板(KD MEDICAL,Columbia MD)上的系列生长,得到了克隆的Leu+分离物。

太阳城集团为了筛选多个转化体,使5mL种子培养物在30℃、在5X负型亮氨 酸培养基(含有4.0%葡萄糖和0.1M山梨醇培养基)中生长18-24小 时,至OD600为1.5-3.0/mL。5X负型亮氨酸培养基含有下面的组分(每 升):没有添加氨基酸或硫酸铵的酵母含氮碱基,8.5g;腺嘌呤,0.40g; L-酪氨酸,0.25g;尿嘧啶,0.20g,琥珀酸,10.0g,硫酸铵,5.0g 和50ml亮氨酸负型的溶液#3。亮氨酸负型的溶液#3在每升蒸馏水中 含有L-精氨酸,2g;L-组氨酸,1.0g;L-异亮氨酸,6g;L-赖氨酸4.0 g;L-甲硫氨酸,1.0g;L-苯丙氨酸,6.0g;L-色氨酸,4.0g。用50% 氢氧化钠,将培养基的pH调节至5.3。将0.3mL等分试样转移到5.0mL 5X负型亮氨酸培养基(含有2%葡萄糖加4%半乳糖)或YEHDG培养基中 72小时,至最终OD600为10-20.0/mL。每升YEHDG培养基含有:L-Hy- 大豆蛋白胨-Sheffield,10g;酵母提取物,20g;L-葡萄糖,16g;D (+)半乳糖,40g。

太阳城集团通过去除酵母细胞,并通过SDS-PAGE凝胶的蛋白印迹分析或考马斯 染色直接分析上清液中的ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的表达,收获了 发酵产物。为了进行免疫印迹分析,在还原和变性条件下,将10-25μL 样品在1X Tris甘氨酸SDS缓冲液(BIORAD,Hercules,CA)中进行4- 15%梯度Tris-HCl凝胶(BIORAD,Hercules,CA)电泳。将凝胶电印迹 到0.2微米PVDF膜过滤器上。使用单克隆抗体2H2B8作为第一抗体, 且使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根过氧化物酶-连接的全抗体(ZYMED LABORATORIES,South San Francisco,CA)作为第二抗体,免疫检测了 蛋白。实施例9描述了Mab 2H2B8。使用WESTERN LIGHTNINGTM Chemiluminesence Reagent Plus kit(PERKIN ELMER,Wellesley,MA), 处理了过滤器。

为了通过SDS-PAGE凝胶的考马斯染色分析重组酵母ORF0657nH区 (SEQ ID NO:3)的表达,在还原和变性条件下,在1X Tris甘氨酸SDS 缓冲液(BIO-RAD)中,对样品进行了4-15%梯度Tris-HCl凝胶(BIO-RAD) 电泳。按照生产商的方案(BIO-RAD),凝胶被染上了Bio-Safe考马斯, 即一种考马斯G250染料。

使用来自能生产ORF0657nH(具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4) 的大肠杆菌培养物的细胞裂解物作为定性标准。预测的大肠杆菌表达的 ORF0657nH区的氨基酸序列与预测的啤酒糖酵母内部表达的ORF0657nH 区(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列一致,只是除了在大肠杆菌构建体的 N-末端甲硫氨酸之后存在甘氨酸以外。

为了在大肠杆菌中生产ORF0657nH区,使生产培养物在37℃、在含 有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中生长过夜。使用了能编码具有 羧基His-标记的SEQ ID NO:4的pET28,以得到蛋白的表达。次日,使 用500μL过夜培养物接种5.0mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培 养基。使培养物在37℃生长约3小时,直到OD600达到0.6。用1mMIPTG 在37℃诱导表达3.5小时。收获细胞,将细胞沉淀保藏在-80℃。按照 生产商的方案,使用Bugbuster蛋白提取试剂(NOVAGEN,Madison,WI), 制备了大肠杆菌裂解物。

如下面的实施例11所述,描述和制备了来自能表达内部ORF0657nH 区(SEQ ID NO:3)的啤酒糖酵母转化体1-1的细胞裂解物的蛋白,并 用作标准。为了估计蛋白大小,与进行考马斯染色和蛋白评价的SDS- PAGE凝胶上的样品平行地运行了预染色的10至250kDa的标准(BIO- RAD)。

太阳城集团在5X负型亮氨酸培养基(含有2%葡萄糖和4%半乳糖)中,生产了 需要的种类。含有菌株1260和1309的pUS38的转化体分泌了约80-kDa 蛋白,其能与酵母内部表达的ORF0657nH区(来自能编码SEQ ID NO:3 的核酸)非常接近地共迁移,且大肠杆菌表达了ORF0657nH(来自能编码 具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4的核酸),其可以通过蛋白印迹和考 马斯染色检测到。在一般的实验中,对500ng这种对照裂解物和25μL 培养基上清液进行了电泳。检测是特异性的;在只含有载体的转化体的 上清液中,通过蛋白印迹或考马斯染色没有检测到80-kDa蛋白。分泌的 约80-kDa蛋白对应着成熟的未糖基化的ORF0657nH区(SEQ ID NO:3), 或者,它含有少量糖基残基。通过抗体,检测到了上清液中的更高分子 量的种类和2种更小分子量的蛋白,它们都被考马斯蓝染色。该更高分 子量的种类含有未加工的前导序列,和/或是糖基化的。小分子量的种类 可能是降解产物。

估计由菌株1260和1309的转化体分泌的80-kDa种类的量是约2 μg/mL培养基。这可以通过对比在80kDa的蛋白印迹信号和含有 0RF0657nH区(SEQ ID NO:3)的酵母细胞裂解物样品来确定,表明 ORF0657nH区包含至少50%总蛋白。估计ORF0657n区的剩余种类的合并 滴度是约50μg/mL培养基。

实施例11:ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)在啤酒糖酵母中的细胞内表达

通过SEQ ID NO:3在啤酒糖酵母中的细胞内表达,获得了非常高水 平的离散大小的蛋白的生产。使用酵母最优化的编码核酸序列,实现了 表达。

使用下面的含有侧翼BamHI限制位点(标有下划线)的有义和反义引 物,分别是(SEQ ID NO:100)5′GGGG  GGATCC CACAAAACAAA ATG GCT GAA GAA ACT GGT GG3′和(SEQ ID NO:101)5′GGG GGG  GGATCC TTA AGA CTT AGC CTT GTT TTC TTG AGT3′,从pUnkCR1(实施例7)扩增了能编码 ORF0657n区的DNA,其具有为酵母表达最优化的密码子(SEQ ID NO:32)。 该有义引物含有5′非翻译前导序列和ATG密码子,且该反义引物含有TAA 作为终止密码子。

太阳城集团凝胶分离了得到的1.7-kb产物,并根据生产商的说明,将其克隆进 TOPO TA载体pCR2.1(INVITROGEN CORPORATION,Carlsbad,CA),以 构建质粒pCR_iUC-S。随后,从2个独立的克隆pCR_iUCS2.2和 pCR_iUCS-2.4,确定了插入片段的DNA序列。在每个插入片段中,发现 了单个的PCR错误,其位于每个质粒的不同的HindIII片段上。通过用 对应的pCR_iUC-S2.4片段的正确序列交换pCR_iUC-S2.2的1.3-kb HindIII片段,得到了具有正确序列的质粒。

太阳城集团凝胶分离并连接了pCR_iUC-S2.2的1.3-kb片段和pCR_iUC-S2.4 的4.3-kb片段。选择了具有理想片段的克隆pCR_iUC-S,并通过DNA测 序,验证了适当的方向和核苷酸序列。随后,将1.7-kb BamHI片段亚克 隆进了pGAL110(图5A),以构建piUCS-S(-)。

太阳城集团使用原生质球转化方法,使用来自piUC-S(-)的质粒DNA将啤酒糖 酵母菌株1260和1309转化成亮氨酸原养型(Leu+)(Hinnen等,Proc. Natl.Acad.Sci.U S A,75:1929-33,1978)。在缺少亮氨酸、且 含有1M山梨醇的合成琼脂培养基上,选择了转化体。从REMEL,Lenexa, KS得到了缺少亮氨酸、且含有1M山梨醇的顶层和底层合成琼脂培养基 (目录号分别是09459和92155)。通过在SD负型亮氨酸平板(KD MEDICAL, Columbia MD)上的系列生长,得到了克隆的Leu+分离物。

为使用实施例9所述的发酵条件生产ORF0657nH区,筛选了多个转 化体。通过蛋白印迹分析,或通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的分 析,分析了细胞裂解物中的ORF0657nH区的生产。

对于蛋白印迹分析,在还原和变性条件下,在1X Tris甘氨酸SDS 缓冲液(BIO-RAD)中,对样品进行了4-15%梯度Tris-HCl标准凝胶 (BIO-RAD,Hercules,CA)电泳。将凝胶电印迹在0.2微米PVDF膜过滤 器上。使用针对全长ORF0657n(SEQ ID NO:28)的单克隆抗体2H2B8作 为第一抗体,且使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根过氧化物酶-连接的全 抗体(ZYMED LABORATORIES,South San Francisco,CA)作为第二抗体, 通过蛋白印迹免疫检测了蛋白。实施例9描述了Mab 2H2B8。使用 WESTERN LIGHTNINGTM Chemiluminesence Reagent Plus kit(PERKIN ELMER,Wellesley,MA),处理了过滤器。

太阳城集团为了通过SDS-PAGE凝胶的考马斯染色分析重组酵母ORF0657nH(由 SEQ ID NO:32编码)的表达,在还原和变性条件下,在1X Tris甘氨酸 SDS缓冲液(BIO-RAD)中,对样品进行了4-15%梯度Tris-HCl标准凝胶 (BIO-RAD)电泳。按照生产商的方案,凝胶被染上了Bio-Safe考马斯, 即一种考马斯G250染料(BIO-RAD)。

进行电泳的酵母细胞裂解物的样品分别含有0.5和1.25μg总细胞 酵母蛋白,用于蛋白印迹和考马斯染色。使用纯化的BSA(100X,NEW ENGLAND BIOLABS,Beverly,MA)作为考马斯染色的定量标准。使用纯 化的大肠杆菌全长重组ORF0657n区(SEQ ID NO:28)作为蛋白印迹的定 量标准。在2个评价中,使用来自能生产0RF0657nH区(具有羧基His- 标记的SEQ ID NO:4)的大肠杆菌培养物的细胞裂解物作为定性标准, 其可诱导生产ORF0657nH。

为了在大肠杆菌中生产ORF0657nH区(带有羧基His-标记的SEQ ID NO:4),使生产培养物在37℃、在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体 培养基中生长过夜。次日,使用500μL过夜培养物接种5.0mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基。使培养物在37℃生长约3小时,直到 OD600达到0.6。用1mM IPTG在37℃诱导表达3.5小时。收获细胞,将 细胞沉淀保藏在-80℃。按照生产商的方案,使用Bugbuster蛋白提取试 剂(NOVAGEN,Madison,WI),制备了大肠杆菌裂解物。为了估计蛋白大 小,与裂解物平行地运行了预染色的10至250kDa的标准(BIO-RAD)。

从初次筛选,选择了酵母菌株1260的一个转化体(命名为1-1)作 为ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的最佳生产者。在图7A和7B中,显示 了在摇瓶内的复合培养基YEHDG中发酵72小时后,生产ORF0657nH区的 实例。通过考马斯染色(A)或通过抗体(B)检测到的主要蛋白是约85kDa (见泳道5、6和7),且与大肠杆菌ORF0657nH(具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4;泳道2)共迁移。大肠杆菌表达的ORF0657n和酵母表达的 ORF0657n的分子量大于我们在凝胶电泳系统中预测的大小。约85-kDa 蛋白的检测是特异性的;在只含有载体pGAL110的转化体的细胞裂解物 中,没有检测到(泳道3)。将泳道5、6和7与泳道4相比较可以发现, 与全长ORF0657n区(没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28)相比,生产 了明显更多的ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)。与含有ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的转化体同时,且在相同条件下,发酵了含有全长ORF0657n 的转化体。观察到了很少降解成熟的酵母表达的ORF0657nH的证据。

为了评价蛋白稳定性,将来自已经冷冻几天并随后未解冻(unthaw) 的转化体1-1的细胞裂解物的样品包含在凝胶上(图7,泳道7)。可以 看出,该样品的完整性和量类似于新鲜样品(泳道5和6)。使用针对全 长大肠杆菌ORF0657n(SEQ ID NO:28)的山羊多克隆抗体,通过蛋白印 迹,确认了没有降解和ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的稳定性(未显示 数据)。

从蛋白印迹和考马斯凝胶估计,ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的量 是约360μg/mL YEHD培养基,且估计%总蛋白是约50。在限定的培养 基中生产的量是225μg/mL培养基,且%总蛋白也是约50。与全长 ORF0657n区(没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28)的量相比,ORF0657nH 区(SEQ ID NO:3)的量更高(分别是350对10μg/mL),且%总蛋白也 更高(50对2.0)。

实施例12:ORF0657nG区(SEQ ID NO:44)在啤酒糖酵母中的细胞内表达

在下面的实施例中,使用能编码ORF0657nG区(SEQ ID NO:44)的 DNA构建体,评价了ORF0657n相关多肽的细胞内表达。ORF0657n6(SEQ ID NO:44)是截短形式的SEQ ID NO:2,其缺少氨基-末端信号序列。 SEQ ID NO:44保留了SEQ ID NO:2的N-末端甲硫氨酸和氨基酸42-645。

使用下面的含有侧翼BamHI限制位点的有义和反义引物,分别是 5′GGGG GGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTGGTGG3′(SEQ ID NO:102) 和5′GGGGG GGATCCTTAGTTCTTTCTCTTT CTTGG 3′(SEQ ID NO:103),从 pUnkCR1(实施例7)扩增了能编码ORF0657nG区(SEQ ID NO:44)的酵 母最优化的DNA。该有义引物含有5′非翻译前导序列和ATG密码子,且 该反义引物含有TAA作为终止密码子。凝胶分离了得到的1.8-kb产物, 并根据生产商的说明,将其克隆进TOPO TA载体pCR2.1(INVITROGEN CORPORATION,Carlsbad,CA),以构建质粒pCR_iUC-L4。随后,DNA序 列分析确认了在5′-末端发生的单个缺失。

通过用含有正确序列的pCR_iUC-S2.2的1.3-kb HindIII-HindIII 片段交换对应的pCR_iUC-L4的片段,得到了具有正确序列的克隆(见实 施例11)。凝胶分离并连接了pCR_iUC-S2.2的1.3-kb片段和 pCR_iUC-L4的4.4-kb片段。选择了具有理想片段的克隆pCR_iUC-L,并 通过DNA测序,验证了适当的方向和核苷酸序列。随后,将1.8-kb BamHI 片段亚克隆进了pGAL110,以构建piUC-L(-),并确认了DNA序列。

太阳城集团如实施例9所述,使用来自piUC-L(-)的质粒DNA将啤酒糖酵母菌 株1260转化成亮氨酸原养型(Leu+)。使用如实施例11所述的发酵条件 和细胞破碎,筛选了几个用于细胞内生产ORF0657nG区(SEQ ID NO:44) 的酵母转化体。通过如实施例11所述的蛋白印迹分析,分析了0.25-0.5 μg细胞-裂解物蛋白中的ORF0657nG区的生产。使用纯化的大肠杆菌 ORF0657nH区(具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4)作为定量标准,并 使用来自能生产ORF0657nG区(具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4)的大 肠杆菌培养物的细胞裂解物作为定性标准,其可诱导生产ORF0657nG 区。在还原和变性条件下,在1X Tris甘氨酸SDS缓冲液(BIO-RAD)中, 对样品进行了4-15%梯度Tris-HCl标准凝胶(BIO-RAD,Hercules,CA) 电泳。将凝胶电印迹在0.2微米PVDF膜过滤器上(BIO-RAD)。

使用针对纯化的大肠杆菌生产的全长ORF0657n(没有羧基His-标记 的SEQ ID NO:28)的多克隆抗体作为第一抗体,且使用山羊抗-小鼠IgG (H+L)辣根过氧化物酶-连接的全抗体(ZYMED LABORATORIES,South San Francisco,CA)作为第二抗体,通过蛋白印迹免疫检测了蛋白。通过用 纯化的大肠杆菌生产的全长ORF0657n区(SEQ ID NO:28)进行免疫,生 产了多克隆抗体。使用WESTERN LIGHTNINGTM Chemiluminesence Reagent Plus kit(PERKIN ELMER,Wellesley,MA),处理了过滤器。

为了对比目的,将ORF0657nG区(具有羧基His-标记的SEQ ID NO: 4)克隆进了如实施例1所述的大肠杆菌表达载体中,并进行表达。为了 在大肠杆菌中生产ORF0657nG区,使生产培养物在37℃、在含有50μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中生长过夜。次日,使用500μL过夜培养物 接种5.0mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基。使培养物在37 ℃生长约3小时,直到OD600达到0.6。用1mM IPTG在37℃诱导表达 3.5小时。收获细胞,并将细胞沉淀保藏在-80℃。按照生产商的方案, 使用Bugbuster蛋白提取试剂(NOVAGEN,Madison,WI),制备了大肠杆 菌裂解物。为了估计蛋白大小,与裂解物平行地运行了预染色的10至 250kDa的标准(BIO-RAD)。

太阳城集团从初次筛选,在如实施例11所述在培养管内的复合培养基YEHDG 中发酵72小时后,选择了酵母菌株1260的一个转化体(命名为iUC-L3) 作为ORF0657nG区的良好生产者。通过考马斯染色或通过抗体检测到的 主要蛋白是约85kDa,且与大肠杆菌表达的ORF0657nG区(具有羧基 His-标记的SEQ ID NO:44)共迁移。大肠杆菌表达的ORF0657nG区和酵 母表达的ORF0657nG区的分子量大于我们在凝胶电泳系统中预测的大 小。约85-kDa蛋白的检测是特异性的;在只含有载体pGAL110的转化体 的细胞裂解物中,没有检测到。从3个蛋白印迹实验测定的ORF0657nG 的平均滴度是30μg/mL YEHDG培养基,且估计%总蛋白是10.0(见下 面的实施例13)。

实施例13:去除细胞壁分类信号能增强细胞内表达

使用密码子-最优化的ORF0657n基因SEQ ID NO:31、32和45,检 查了单独去除ORF0657n羧基细胞转肽酶C-末端编码区和组合去除N-末 端信号区的影响。SEQ ID NO:31能编码全长ORF0657n区。SEQ ID NO: 32能编码ORF0657nH区,其缺少N-末端信号序列和C-末端细胞壁分类 区。SEQ ID NO:45能编码ORF0657nG区,其只缺少信号肽序列。

发酵了能表达全长ORF0657n区(没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28; 转化体rUnkC1)、ORF0657nH区(SEQ ID NO:3;转化体1-1)和 ORF0657nG区(SEQ ID NO:44;转化体iUC-L3)的各一个转化体,制备 了细胞裂解物,并如实施例11所述进行了分析。图9显示了代表性的 蛋白印迹。装载在凝胶上的来自不同转化体的蛋白细胞裂解物的量是不 同的,以补偿3个构建体编码ORF0657n区的不同的表达水平。在每种 情况下,装载了至少2种不同量的来自各含有ORF0657n的转化体的蛋白 细胞裂解物。

在图9中显示了一般的结果,证实了ORF0657nH区(SEQ ID NO:3) 能比全长ORF0657n区(没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28)或 ORF0657nG区(SEQ ID NO:44)明显更好地表达。如泳道11和12所示, 仅仅用50和100ng来自ORF0657nH区-生产者的细胞裂解物蛋白,就 检测到了相当大信号。相反地,分别使用了1.0和2.0μg全长ORF0657nC 区-生产者的细胞裂解物蛋白,泳道7和8。使用更少的蛋白,检测到了 ORF0657nG区的良好信号,如泳道14和15所示,其中装载了250和500 ng蛋白。

表4对比了3个ORF中的每一个的平均滴度和从3个独立的蛋白印 迹测定的%总蛋白。为每个蛋白印迹,新制备了细胞裂解物。平均值包括 从2次独立发酵得到的结果。相对于纯化的大肠杆菌ORF0657nH(带有 羧基His-标记的SEQ ID NO:4)标准,确定了特异性的ORF0657n的量。

表4

太阳城集团     生产的ORF0657n     滴度,μg/mL YEHDG培养基     %总蛋白     C     10.0     4.0     G     30.0     10.0     H     425.0     80.0

如通过对比全长ORF0657n区(没有羧基His-标记的SEQ ID NO:28) 和ORF0657nG区(SEQ ID NO:44)的表达所确定的,信号肽序列的去除, 使%总蛋白和滴度增强了2.5-3倍。信号肽和细胞壁分类序列两者的去 除,使表达比仅仅去除信号肽序列增强了8-14倍(对比G和H区),使 表达比全长蛋白增强了20-42.5倍(对比C和H区)。没有预见到细胞壁 分类序列的去除使表达增强的量级。

太阳城集团实施例14:ORF0657nI区在啤酒糖酵母中的细胞内表达

使用下面的含有侧翼BamHI限制位点(标有下划线)的有义和反义引 物,分别是5′CTCC GGATCCCACAAAACAAAATGGCTGAAGAAACTGGT 3′(SEQ ID NO:104)和5′GCTGCCG GGATCCTTATGGGGTTGGCTTAGATGGGGTAG 3′(SEQ ID NO:105),从pUnkCR1(实施例7)扩增了能编码ORF0657nI区的DNA,其 具有为酵母表达最优化的密码子(SEQ ID NO:33)。该有义引物含有5′ 非翻译前导序列和ATG密码子,且该反义引物含有TAA作为终止密码 子。凝胶分离了得到的1.3-kb产物,并将其克隆进pGAL110(图5A), 以构建piUC-I(图5B),并验证了DNA序列。

如实施例9所述,使用来自piUC-I的质粒DNA将啤酒糖酵母菌株 1260转化成亮氨酸原养型(Leu+)。使用如实施例9所述的小规模的发酵 条件(5.0mL培养物),筛选了3个Leu+转化体的ORF0657nI区(SEQ ID NO:1)的细胞内生产。

将生产与啤酒糖酵母转化体1-1生产的ORF0657nH区(SEQ ID NO: 3)进行了对比(见实施例11)。如实施例9所述,制备了细胞裂解物, 通过如实施例11所述的半定量蛋白印迹分析,分析了100和200ng酵 母细胞裂解物蛋白的ORF0657nI和ORF0657nH的生产。使用纯化的大肠 杆菌ORF0657nH(具有羧基His-标记的SEQ ID NO:4)作为定量标准。 在还原和变性条件下,在1X Tris甘氨酸SDS缓冲液(BIO-RAD)中,对 样品进行了10-20%梯度Tris-HCl标准凝胶(BIO-RAD,Hercules,CA) 电泳。将凝胶电印迹在0.2微米PVDF膜过滤器(BIO-RAD)上。使用针对 纯化的大肠杆菌全长ORF0657n(SEQ ID NO:28)的多克隆抗体作为第一 抗体,并使用山羊抗-小鼠IgG(H+L)辣根过氧化物酶-连接的全抗体 (ZYMED LABORATORIES,South San Francisco,CA)作为第二抗体,通 过蛋白印迹免疫检测了蛋白。通过用纯化的大肠杆菌生产的全长 ORF0657n(SEQ ID NO:28)免疫,生产了多克隆抗体。使用WESTERN LIGHTNINGTM Chemiluminesence Reagent Plus kit(PERKIN ELMER, Wellesley,MA),处理了过滤器。为了估计蛋白大小,与裂解物平行地 运行了预染色的10至250kDa的标准(BIO-RAD)。

图11显示了在培养管内的复合YEHDG培养基中发酵72小时得到的 结果。得到了酵母表达的ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)的强检测,如泳 道5、6、14、15、21和22所示。还容易地检测到了构建的用于表达 ORF0657nI(SEQ ID NO:1)的转化体中的约60-kDa蛋白,如泳道7-12 和16-21所示。酵母表达的ORF0657nI(SEQ ID NO:1)与从大肠杆菌中 表达和纯化的ORF0657nI(具有羧基His-标记的SEQ ID NO:5)共迁移(未 显示数据)。大肠杆菌表达的ORF0657nI区和酵母表达的ORF0657nI区的 分子量大于在我们的凝胶电泳系统中预测的大小。在构建的用于表达 ORF0657nI(SEQ ID NO:1)的转化体中的60-kDa蛋白是特异性的;在来 自载体对照转化体的细胞裂解物中没有检测到蛋白(泳道4和13)。

通过与已知量的纯化的ORF0657nH(具有羧基His-标记的SEQ ID NO: 4)进行对比,通过半定量蛋白印迹估计了凝胶上的ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)和ORF0657nI区(SEQ ID NO:1)的量。从凝胶上的含有2种不同 量的蛋白的一式两份裂解物确定的平均值,计算出了滴度和%总蛋白。 从新解发酵的样品和冷冻的细胞裂解物确定的ORF0657nH区(SEQ ID NO: 3)的容量滴度是可比较的,为约500和约550μg/mL培养基,且每mL培 养基生产了320μg ORF0657nI区(SEQ ID NO:1)(ORF0657nI区的滴 度是针对转化体I1的)。估计ORF0657nH区(SEQ ID NO:3)占总蛋白 的百分比分别是78%和80%,ORF0657nI(SEQ ID NO:1)占总蛋白的45%。

因而,ORF0657nI区能在啤酒糖酵母中较好地表达,其滴度比 ORF0657nH(SEQ ID NO:3)低约1.5倍,且%总蛋白低约1.3倍。通过考 马斯染色含有细胞裂解物的SDS-PAGE凝胶,确认了ORF0657nI区在酵母 中的良好表达。ORF0657nI区在YEDHG培养基中的表达是可放大的:在 125mL或2L摇瓶中的生产可以与在培养管中的小规模表达相比较。

ORF0657nI区(SEQ ID NO:1)还在限定的5X负型亮氨酸培养基(实 施例9所述的培养基)中较好地表达。其滴度仅仅比在复合培养基YEHDG 中的滴度低约1.5倍,而在两种培养基中的%总蛋白是可比较的。在两种 培养基中,ORF0657nI具有良好的完整性,未检测到明显的降解。当在 摇瓶发酵中测试时,在复合的和5X负型亮氨酸培养基两者中,在72小 时时的ORF0657nI生产高于在96小时时的。

实施例15:能生产ORF0657nH(SEO ID NO:3)的酵母菌株的大规模发酵

太阳城集团使用冷冻的酵母菌株1-1(用质粒piUC-S(-)转化的菌株1260;如 实施例11所述)的种子原种进大规模发酵,并进行纯化。解冻一瓶种子 原种,并用1.0mL接种装有50mL含有4%葡萄糖、无亮氨酸的选择培 养基(5X Leu-培养基,Bayne等,Gene 66(2):235-44,1988)的250-mL 锥形瓶。在28℃,在250rpm旋转振荡器上温育烧瓶。24小时后(残余 葡萄糖23.5g/L),将13mL培养体积加入装有877mL相同培养基的2-L 烧瓶中。再次在28℃,在250rpm搅拌下,温育烧瓶。24小时后(残余 葡萄糖4.04g/L),使用2-L烧瓶的内容物接种20-L反应器,后者装有 为使用的菌株最优化的化学上限定的培养基(Oura,Biotechnol. Bioengineer.16:1197,1974)。该培养基含有20g/L葡萄糖,随后 为25g/L半乳糖以进行诱导。在28℃,4.7L/分钟,15表压和300rpm, 运行反应器。在这些条件下,溶解氧水平维持在高于30%饱和。通过葡 萄糖消耗、光密度(A600nm,1-cm比色皿)、干细胞重量、半乳糖利用和 乙醇生产,监控细胞生长。培养持续90小时,达到33.9的A600和17.5g/L 的干细胞重量。

太阳城集团使用AMICON DC-10收获垫架(MILLIPORE,Billerica,MA),经中 空纤维切向流过滤(AMICON H5MP01-43筒),收获培养物。抛弃渗透物, 浓缩细胞,用PBS进行渗滤,并使用Sorvall Evolution RC(SLA-3000 转子),在8000rpm,4℃离心20分钟进行收集。将细胞保藏在-70℃。

为了评价菌株1-1在大规模发酵中对ORF0657nH的生产,从10 OD600单位的收获的培养物制备了细胞裂解物,并如实施例11所述进行了评 价(未显示结果)。还评价了从摇瓶发酵(72小时,复合YEHDG培养基) 生产ORF0657nH。蛋白印迹分析(如实施例11所述进行)的结果证实了, 大规模发酵生产的蛋白能与在摇瓶发酵中生产的ORF0657nH共迁移(未 显示结果)。估计大规模(20-L)发酵生产的ORF0657nH的滴度是739 μg/mL,且估计%总蛋白是55%,与摇瓶发酵(使用实施例11所述的半定 量蛋白印迹方法)的732μg/mL和58%总蛋白相比。这些结果证实了,可 以按比例放大ORF0657n在酵母中的生产。

太阳城集团实施例16:在酵母中生产的ORF0657n相关多肽的保护性免疫

通过在酵母中表达SEQ ID NO:3的多肽,评价了酵母生产的 ORF0657n相关多肽提供保护性免疫的能力。使用单独的大肠杆菌表达的 全长ORF0657nC(SEQ ID NO:28)、ORF0657nH(具有羧基-末端His-标 记的SEQ ID NO:4)、ORF0657nI(具有羧基-末端His-标记的SEQ ID NO: 5)和佐剂作为对照。

从酵母中得到了SEQ ID N0:3的ORF0657n相关多肽,并用于动物 模型,以提供保护性免疫。如实施例11所述,表达了SEQ ID NO:3的 多肽。

以5mL/g湿细胞重,将冷冻的能表达ORF657nH(SEQ ID NO:3) 的重组啤酒糖酵母细胞重新悬浮在0.2M MOPS,pH7.0中,后者含有蛋 白酶抑制剂(无EDTA)。通过穿过14,000磅/英寸2的微流化仪 (Microfluidics Model 110S)4次,制备了裂解物。如下所述澄清了裂 解物:离心(10,000Xg,20分钟,2-8℃),然后粗滤(玻璃纤维预过滤 器,Millipore)和细滤(0.2μm醋酸纤维素,Whatman)。

太阳城集团在尺寸排阻色谱(SEC)柱(Pharmacia HiPrep 26/60 Sephacryl S-300HR,流动相:0.2M MOPS,pH7.0)上,对澄清的裂解物进行了 分级分离。通过含有考马斯检测的SDS-PAGE和使用对抗血清(针对全长 ORF0657n,SEQ ID NO:28)特异性的ORF0657n蛋白的蛋白印迹,分析 了级分。合并含有产物的级分。

在无菌条件下,使SEC产物经0.2μm醋酸纤维素无菌过滤。经SDS- PAGE和蛋白印迹,无菌过滤产物的纯度是≥或高于94%。以0.2mg/ml, 用AHP和硫柳汞配制了无菌过滤产物。

图10解释了在酵母中生产的ORF0657n相关多肽提供保护性免疫的 能力。酵母表达的ORF0657nH(SEQ ID NO:3)提供了与大肠杆菌表达的 多肽相当的保护性免疫。

太阳城集团实施例17:在非人灵长类动物中的回忆应答

使用用或不用AHP配制的酵母生产的ORF0657n相关多肽(ORF0657nH, SEQ ID NO:3)或大肠杆菌表达的ORF0657相关多肽(全长ORF0657n,SEQ ID NO:28),免疫了3组猕猴。疫苗组的猴子通过肌内的方式,接受了 50mcg ORF0657n相关多肽。

如图12所示,单次给药后,疫苗组动物以比适度的已有滴度增强约 3至6倍的几何平均滴度进行反应,暗示着回忆应答。相反地,对照组 中的动物的几何平均滴度保持相同(在抗体测定的变动范围内)。第二次 施用疫苗后,疫苗组和对照组的第一次给药后的几何平均滴度与给药后 的滴度相比有非常小的变化。

太阳城集团为了观察仅仅一次给药后的抗体反应的发展,对接受酵母表达的 ORF0657H区(SEQ ID NO:3)的组进行了3个月(测试的最后太阳城集团点)。 抗体滴度持续升高,9天后,达到即使施用疫苗2或3次也不能超过的 水平。

这些结果表明,一次施用疫苗,可以在自然地引发免疫系统后、引 起相当大的且持久的抗体反应,这可能是由于环境地暴露于金黄色葡萄 球菌。对人体中的已有抗体滴度的测量,证实了在所有测试的样品中都 存在针对ORF0657n的适度抗体滴度(未显示数据)。

其它实施方案包含在下面的权利要求书中。尽管已经证实和描述了 几个实施方案,但可以进行不同的修改,而不背离本发明的精神和范围。

序列表

<110>Merck&Co.,Inc.

<120>用于诱导针对金黄色葡萄球菌的保护性免疫反应的多肽

<130>21569Y PCT

太阳城集团<150>60/489,840

<151>2003-07-24

<150>60/520,115

<151>2003-11-14

<160>107

<170>FastSEQ for Windows Version4.0

太阳城集团<210>1

<211>446

太阳城集团<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有氨基末端甲硫氨酸的ORF0657n

太阳城集团<400>1

Met Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr

 1               5                  10                  15

Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala

        35                  40                  45

太阳城集团Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro

                85                  90                  95

Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp

            100                 105                 110

Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala

        115                 120                 125

Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val

太阳城集团145                 150                 155                 160

Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr

                165                 170                 175

太阳城集团Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys

            180                 185                 190

Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys

        195                 200                 205

Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala

    210                 215                 220

Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala

太阳城集团225                 230                 235                 240

Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn

                245                 250                 255

Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala

        275                 280                 285

Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp

    290                 295                 300

Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu

太阳城集团305                 310                 315                 320

太阳城集团Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu

                325                 330                 335

Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp

            340                 345                 350

太阳城集团Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp

        355                 360                 365

太阳城集团Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys

    370                 375                 380

Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr

太阳城集团385                 390                 395                 400

Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys

太阳城集团                405                 410                 415

Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala

            420                 425                 430

Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro

        435                 440                 445

<210>2

<211>645

<212>PRT

太阳城集团<213>金黄色葡萄球菌(S.aureus)

太阳城集团<400>2

Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys

太阳城集团 1               5                  10                  15

太阳城集团Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu

            20                  25                  30

Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr

太阳城集团        35                  40                  45

Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr

    50                  55                  60

Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser

65                  70                  75                  80

Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala

                85                  90                  95

Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys

            100                 105                 110

Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu

        115                 120                 125

Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser

    130                 135                 140

太阳城集团Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly

145                 150                 155                 160

Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val

太阳城集团                165                 170                 175

Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly

            180                 185                 190

太阳城集团Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro

        195                 200                 205

太阳城集团Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg

太阳城集团    210                 215                 220

太阳城集团Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr

225                 230                 235                 240

His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe

                245                 250                 255

太阳城集团Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp

            260                 265                 270

Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu

        275                 280                 285

Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu

    290                 295                 300

Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala

太阳城集团305                 310                 315                 320

太阳城集团Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln

太阳城集团                325                 330                 335

Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val

太阳城集团            340                 345                 350

Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys

        355                 360                 365

太阳城集团His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met

    370                 375                 380

Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln

385                 390                 395                 400

Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile

                405                 410                 415

太阳城集团Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys

            420                 425                 430

Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile

太阳城集团        435                 440                 445

Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys

    450                 455                 460

Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr

465                 470                 475                 480

太阳城集团Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln

                485                 490                 495

Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu

            500                 505                 510

太阳城集团Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys

太阳城集团        515                 520                 525

Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val

    530                 535                 540

太阳城集团Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys

太阳城集团545                 550                 555                 560

太阳城集团Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys

                565                 570                 575

Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly

            580                 585                 590

His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys

        595                 600                 605

Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro

太阳城集团    610                 615                 620

Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro

625                 630                 635                 640

Arg Lys Arg Lys Asn

太阳城集团                645

太阳城集团<210>3

太阳城集团<211>569

<212>PRT

太阳城集团<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>具有氨基末端甲硫氨酸的ORF0657nH

<400>3

Met Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr

 1               5                  10                  15

太阳城集团Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr

太阳城集团            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala

太阳城集团        35                  40                  45

太阳城集团Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala

太阳城集团    50                  55                  60

Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn

太阳城集团65                  70                  75                  80

Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro

太阳城集团                85                  90                  95

太阳城集团Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp

            100                 105                 110

Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala

        115                 120                 125

Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu

    130                 135                 140

Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val

太阳城集团145                 150                 155                 160

Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr

                165                 170                 175

Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys

            180                 185                 190

太阳城集团Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys

太阳城集团        195                 200                 205

Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala

    210                 215                 220

Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala

太阳城集团225                 230                 235                 240

太阳城集团Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn

太阳城集团                245                 250                 255

Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys

            260                 265                 270

Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp

    290                 295                 300

Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu

305                 310                 315                 320

太阳城集团Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu

太阳城集团                325                 330                 335

Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp

太阳城集团            340                 345                 350

太阳城集团Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp

        355                 360                 365

Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys

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太阳城集团Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr

385                 390                 395                 400

Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys

太阳城集团                405                 410                 415

Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala

            420                 425                 430

Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro

        435                 440                 445

太阳城集团Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys

太阳城集团    450                 455                 460

太阳城集团Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly

465                 470                 475                 480

Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser

                485                 490                 495

Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala

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Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr

        515                 520                 525

太阳城集团Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala

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太阳城集团Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys

545                 550                 555                 560

Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565

<210>4

太阳城集团<211>570

<212>PRT

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>具有氨基末端甲硫氨酸-甘氨酸的ORF0657nH

<400>4

Met Gly Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys

 1               5                  10                  15

太阳城集团Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu

太阳城集团            20                  25                  30

Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu

        35                  40                  45

Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys

    50                  55                  60

太阳城集团Ala Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn

65                  70                  75                  80

Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn

太阳城集团                85                  90                  95

Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile

太阳城集团            100                 105                 110

太阳城集团Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr

太阳城集团        115                 120                 125

Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro

    130                 135                 140

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太阳城集团145                 150                 155                 160

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太阳城集团                165                 170                 175

太阳城集团Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr

            180                 185                 190

Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu

太阳城集团        195                 200                 205

太阳城集团Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser

    210                 215                 220

太阳城集团Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu

225                 230                 235                 240

太阳城集团Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu

                245                 250                 255

Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys

            260                 265                 270

Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr

太阳城集团    290                 295                 300

Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn

305                 310                 315                 320

太阳城集团Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met

太阳城集团                325                 330                 335

Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr

            340                 345                 350

Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys

        355                 360                 365

Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly

太阳城集团    370                 375                 380

Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp

太阳城集团385                 390                 395                 400

太阳城集团Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr

太阳城集团                405                 410                 415

太阳城集团Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser

太阳城集团            420                 425                 430

太阳城集团Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser

        435                 440                 445

太阳城集团Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn

    450                 455                 460

Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser

465                 470                 475                 480

Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val

            500                 505                 510

Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln

        515                 520                 525

太阳城集团Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys

太阳城集团    530                 535                 540

Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn

545                 550                 555                 560

Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

                565                 570

<210>5

太阳城集团<211>447

<212>PRT

<213>人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>具有氨基末端甲硫氨酸-甘氨酸的ORF0657nH

太阳城集团<400>5

太阳城集团Met Gly Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys

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太阳城集团Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu

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太阳城集团Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu

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太阳城集团Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys

    50                  55                  60

Ala Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn

65                  70                  75                  80

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Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile

            100                 105                 110

太阳城集团Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr

太阳城集团        115                 120                 125

Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro

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太阳城集团Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu

太阳城集团145                 150                 155                 160

Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp

太阳城集团                165                 170                 175

太阳城集团Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr

太阳城集团            180                 185                 190

Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu

        195                 200                 205

Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser

    210                 215                 220

太阳城集团Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu

225                 230                 235                 240

Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu

                245                 250                 255

太阳城集团Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys

太阳城集团            260                 265                 270

太阳城集团Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr

    290                 295                 300

太阳城集团Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn

太阳城集团305                 310                 315                 320

Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met

太阳城集团                325                 330                 335

Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr

            340                 345                 350

Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys

        355                 360                 365

Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly

    370                 375                 380

Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp

385                 390                 395                 400

Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr

                405                 410                 415

太阳城集团Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser

太阳城集团            420                 425                 430

Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro

太阳城集团        435                 440                 445

太阳城集团<210>6

太阳城集团<211>576

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657nH

<400>6

Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

 1               5                  10                  15

Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys

        35                  40                  45

Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys

太阳城集团    50                  55                  60

Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro

65                  70                  75                  80

Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu

                85                  90                  95

Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala

太阳城集团            100                 105                 110

太阳城集团Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr

太阳城集团        115                 120                 125

太阳城集团Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile

    130                 135                 140

Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln

太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile

                165                 170                 175

Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe

太阳城集团            180                 185                 190

Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His

        195                 200                 205

Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala

    210                 215                 220

太阳城集团Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr

225                 230                 235                 240

Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu

                245                 250                 255

太阳城集团Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys

太阳城集团            260                 265                 270

Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu

        275                 280                 285

太阳城集团Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro

    290                 295                 300

Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr

305                 310                 315                 320

Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Ala Phe Val Lys His

                325                 330                 335

Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu

太阳城集团            340                 345                 350

太阳城集团Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg

        355                 360                 365

Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile

    370                 375                 380

太阳城集团Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val

385                 390                 395                 400

His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val

太阳城集团                405                 410                 415

太阳城集团Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Ala Asp Lys Thr Asn Lys Lys

太阳城集团            420                 425                 430

Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro

        435                 440                 445

太阳城集团Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp

太阳城集团    450                 455                 460

太阳城集团Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn

465                 470                 475                 480

Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro

                485                 490                 495

Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val

            500                 505                 510

太阳城集团Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr

太阳城集团        515                 520                 525

太阳城集团Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp

太阳城集团    530                 535                 540

Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His

太阳城集团545                 550                 555                 560

Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565                 570                 575

太阳城集团<210>7

太阳城集团<211>568

<212>PRT

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>ORF0657nH

太阳城集团<400>7

Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

 1               5                  10                  15

太阳城集团Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys

            20                  25                  30

Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

太阳城集团        35                  40                  45

太阳城集团Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

                85                  90                  95

太阳城集团Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

            100                 105                 110

Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

        115                 120                 125

太阳城集团Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

    130                 135                 140

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

太阳城集团            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

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太阳城集团    210                 215                 220

太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

225                 230                 235                 240

太阳城集团Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

太阳城集团                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

太阳城集团            260                 265                 270

太阳城集团Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

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太阳城集团Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

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太阳城集团Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

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太阳城集团    450                 455                 460

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太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

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Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

太阳城集团            180                 185                 190

太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

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太阳城集团Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

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太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

225                 230                 235                 240

太阳城集团Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

        275                 280                 285

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太阳城集团Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

太阳城集团                325                 330                 335

Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

太阳城集团            340                 345                 350

太阳城集团Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

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Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

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Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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太阳城集团Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

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太阳城集团Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

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太阳城集团Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

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太阳城集团    50                  55                  60

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太阳城集团Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

太阳城集团            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

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太阳城集团Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

太阳城集团    210                 215                 220

太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

225                 230                 235                 240

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

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Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

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Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

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Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

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Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

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Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

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太阳城集团Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

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太阳城集团Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

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太阳城集团    450                 455                 460

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太阳城集团Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr

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太阳城集团Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

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太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

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太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

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太阳城集团Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

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                565

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Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

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Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr

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太阳城集团Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys

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Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp

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Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr

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Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr

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太阳城集团Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp

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太阳城集团Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp

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太阳城集团Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe

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太阳城集团Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr

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太阳城集团Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp

太阳城集团305                 310                 315                 320

太阳城集团Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys

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太阳城集团Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

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太阳城集团Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

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太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

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Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

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太阳城集团Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

太阳城集团            180                 185                 190

太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

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太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

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太阳城集团Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

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Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

太阳城集团    290                 295                 300

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Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

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太阳城集团Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

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太阳城集团    450                 455                 460

太阳城集团Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

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太阳城集团Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Lys Val Glu Ser Ser

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太阳城集团    530                 535                 540

Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

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太阳城集团        35                  40                  45

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太阳城集团Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Ala Ser Tyr Asp Thr Val

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太阳城集团Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

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Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

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Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

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太阳城集团Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

太阳城集团            340                 345                 350

Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

        355                 360                 365

Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

    370                 375                 380

Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

385                 390                 395                 400

太阳城集团Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

                405                 410                 415

Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

            420                 425                 430

太阳城集团Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

太阳城集团        435                 440                 445

太阳城集团Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

太阳城集团    450                 455                 460

太阳城集团Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

465                 470                 475                 480

Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Val Lys

            500                 505                 510

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

太阳城集团        515                 520                 525

Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

    530                 535                 540

Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

545                 550                 555                 560

Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565

<210>15

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<212>PRT

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657nH

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太阳城集团 1               5                  10                  15

Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys

            20                  25                  30

Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

        35                  40                  45

太阳城集团Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Lys Ala Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile

65                  70                  75                  80

Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp

                85                  90                  95

Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys

            100                 105                 110

太阳城集团Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys

太阳城集团        115                 120                 125

Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly

    130                 135                 140

太阳城集团Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp

145                 150                 155                 160

太阳城集团Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr

                165                 170                 175

Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile

太阳城集团            180                 185                 190

Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr

太阳城集团        195                 200                 205

太阳城集团Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys

    210                 215                 220

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225                 230                 235                 240

太阳城集团Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp

                245                 250                 255

Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp

            260                 265                 270

Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr

    290                 295                 300

Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp

太阳城集团305                 310                 315                 320

Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys

太阳城集团                325                 330                 335

太阳城集团Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met

太阳城集团            340                 345                 350

Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn

        355                 360                 365

太阳城集团Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp

    370                 375                 380

Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr

385                 390                 395                 400

His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp

                405                 410                 415

Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala

太阳城集团            420                 425                 430

太阳城集团Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu

        435                 440                 445

Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser

太阳城集团    450                 455                 460

Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr

465                 470                 475                 480

Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr

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太阳城集团Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Ala

            500                 505                 510

Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Ser Ser Ser

太阳城集团        515                 520                 525

太阳城集团Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr

    530                 535                 540

太阳城集团Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn

545                 550                 555                 560

太阳城集团Lys Ala Lys Ser

<210>16

太阳城集团<211>565

<212>PRT

<213>人工序列

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Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

        35                  40                  45

太阳城集团Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr

    50                  55                  60

Lys Ala Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile

65                  70                  75                  80

Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp

                85                  90                  95

Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys

            100                 105                 110

Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys

        115                 120                 125

Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp

145                 150                 155                 160

Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr

                165                 170                 175

Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile

            180                 185                 190

太阳城集团Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr

太阳城集团        195                 200                 205

Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys

    210                 215                 220

太阳城集团Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys

225                 230                 235                 240

太阳城集团Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp

                245                 250                 255

太阳城集团Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp

            260                 265                 270

Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe

太阳城集团        275                 280                 285

Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr

    290                 295                 300

Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp

305                 310                 315                 320

Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys

                325                 330                 335

太阳城集团Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met

            340                 345                 350

Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn

太阳城集团        355                 360                 365

Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp

太阳城集团    370                 375                 380

太阳城集团Ala Ile Val Arg Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr

385                 390                 395                 400

太阳城集团His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp

                405                 410                 415

Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala

太阳城集团            420                 425                 430

太阳城集团Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu

        435                 440                 445

太阳城集团Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser

太阳城集团    450                 455                 460

太阳城集团Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr

465                 470                 475                 480

Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr

太阳城集团                485                 490                 495

Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr

太阳城集团            500                 505                 510

太阳城集团Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser

太阳城集团        515                 520                 525

Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn

太阳城集团    530                 535                 540

太阳城集团Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu

545                 550                 555                 560

Asn Lys Ala Lys Ser

                565

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太阳城集团<211>568

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<213>人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>ORF0657nH

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太阳城集团Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

太阳城集团 1               5                  10                  15

Ala Leu Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys

            20                  25                  30

Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

太阳城集团        35                  40                  45

Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

    50                  55                  60

太阳城集团Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr

太阳城集团65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

太阳城集团                85                  90                  95

Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

            100                 105                 110

Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

        115                 120                 125

太阳城集团Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

    130                 135                 140

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

太阳城集团145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

太阳城集团        195                 200                 205

Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

    210                 215                 220

太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

太阳城集团225                 230                 235                 240

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

    290                 295                 300

太阳城集团Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

305                 310                 315                 320

Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

太阳城集团                325                 330                 335

太阳城集团Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

            340                 345                 350

太阳城集团Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

太阳城集团        355                 360                 365

太阳城集团Ile Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

太阳城集团    370                 375                 380

Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

385                 390                 395                 400

Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

太阳城集团                405                 410                 415

Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

            420                 425                 430

Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

太阳城集团        435                 440                 445

Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

    450                 455                 460

Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

太阳城集团465                 470                 475                 480

Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

                485                 490                 495

Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

太阳城集团            500                 505                 510

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

太阳城集团        515                 520                 525

太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

    530                 535                 540

太阳城集团Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

545                 550                 555                 560

Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565

太阳城集团<210>18

太阳城集团<211>565

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<213>人工序列

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Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

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太阳城集团Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys

太阳城集团            20                  25                  30

Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

        35                  40                  45

太阳城集团Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Lys Ala Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile

65                  70                  75                  80

太阳城集团Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp

                85                  90                  95

太阳城集团Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys

太阳城集团            100                 105                 110

Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys

太阳城集团        115                 120                 125

Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly

    130                 135                 140

太阳城集团Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp

太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr

太阳城集团                165                 170                 175

太阳城集团Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile

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Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp

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太阳城集团Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe

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Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys

太阳城集团                325                 330                 335

Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met

            340                 345                 350

Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn

        355                 360                 365

Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp

太阳城集团    370                 375                 380

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Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Pro Leu Pro Ser

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太阳城集团Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr

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太阳城集团Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu

太阳城集团545                 550                 555                 560

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太阳城集团Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

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太阳城集团Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro Ala Thr Lys Ala Asp Asn Asn Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

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太阳城集团Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

太阳城集团                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

            180                 185                 190

太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

        195                 200                 205

太阳城集团Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

    210                 215                 220

太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

太阳城集团225                 230                 235                 240

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

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Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

太阳城集团    290                 295                 300

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305                 310                 315                 320

太阳城集团Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

太阳城集团                325                 330                 335

Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

太阳城集团            340                 345                 350

Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

        355                 360                 365

Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

太阳城集团    370                 375                 380

Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

太阳城集团385                 390                 395                 400

Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

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Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

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太阳城集团Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

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太阳城集团Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

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太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

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Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

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太阳城集团Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys

太阳城集团            20                  25                  30

Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

        35                  40                  45

Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

    50                  55                  60

Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro Ala Thr Lys Ala Asp Asn Asn Thr

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

太阳城集团                85                  90                  95

Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

            100                 105                 110

Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

太阳城集团        115                 120                 125

Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

            180                 185                 190

太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

太阳城集团        195                 200                 205

Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

    210                 215                 220

Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

太阳城集团225                 230                 235                 240

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

太阳城集团                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

    290                 295                 300

太阳城集团Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

305                 310                 315                 320

太阳城集团Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

                325                 330                 335

太阳城集团Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

            340                 345                 350

Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

        355                 360                 365

太阳城集团Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

太阳城集团    370                 375                 380

太阳城集团Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

385                 390                 395                 400

Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

                405                 410                 415

Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

太阳城集团            420                 425                 430

Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

太阳城集团        435                 440                 445

Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

    450                 455                 460

太阳城集团Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

465                 470                 475                 480

Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

                485                 490                 495

太阳城集团Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

            500                 505                 510

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

        515                 520                 525

太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

太阳城集团    530                 535                 540

太阳城集团Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

545                 550                 555                 560

Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

                565

太阳城集团<210>21

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太阳城集团<213>人工序列

太阳城集团<220>

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Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

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Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys

太阳城集团        35                  40                  45

Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys

    50                  55                  60

Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro

65                  70                  75                  80

太阳城集团Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu

太阳城集团                85                  90                  95

Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala

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Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr

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太阳城集团Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Gly Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile

    130                 135                 140

Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln

太阳城集团145                 150                 155                 160

Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile

太阳城集团                165                 170                 175

太阳城集团Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe

            180                 185                 190

太阳城集团Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His

太阳城集团        195                 200                 205

太阳城集团Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala

    210                 215                 220

Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr

太阳城集团225                 230                 235                 240

太阳城集团Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu

                245                 250                 255

Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys

            260                 265                 270

Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu

        275                 280                 285

Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro

太阳城集团    290                 295                 300

Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr

305                 3l0                 315                 320

Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His

太阳城集团                325                 330                 335

Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu

            340                 345                 350

太阳城集团Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg

太阳城集团        355                 360                 365

太阳城集团Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile

太阳城集团    370                 375                 380

Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val

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His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val

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Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Ala Asp Lys Thr Asn Lys Lys

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Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro

太阳城集团        435                 440                 445

Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp

    450                 455                 460

Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Ser Pro Gly Val Glu Lys Glu Asn

太阳城集团465                 470                 475                 480

Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val

太阳城集团            500                 505                 510

太阳城集团Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr

太阳城集团        515                 520                 525

Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp

太阳城集团    530                 535                 540

太阳城集团Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His

545                 550                 555                 560

Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

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Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys

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Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu

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太阳城集团Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala

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太阳城集团    130                 135                 140

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太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile

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Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe

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Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His

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太阳城集团Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu

太阳城集团                245                 250                 255

Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys

太阳城集团            260                 265                 270

Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu

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Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro

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太阳城集团Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr

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Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His

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Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu

太阳城集团            340                 345                 350

太阳城集团Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg

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Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile

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Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro

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太阳城集团Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp

太阳城集团    450                 455                 460

Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn

太阳城集团465                 470                 475                 480

Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro

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Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val

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太阳城集团Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr

太阳城集团        515                 520                 525

Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp

太阳城集团    530                 535                 540

太阳城集团Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His

545                 550                 555                 560

Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565                 570                 575

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太阳城集团Ala Val Ala Ser Pro Ser Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys

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Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

太阳城集团        35                  40                  45

Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Thr Lys Ala Asp Asn Asn Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

太阳城集团                85                  90                  95

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太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Glu Gly Asn Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

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Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

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Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

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太阳城集团305                 310                 315                 320

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太阳城集团Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

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太阳城集团Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

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Asn Ala Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

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Lys Glu Thr Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val

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Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

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Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

太阳城集团465                 470                 475                 480

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太阳城集团Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

太阳城集团            500                 505                 510

太阳城集团Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Ile Asp Val Val Gln Thr Ser

太阳城集团        515                 520                 525

太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

太阳城集团    530                 535                 540

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Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

                565

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太阳城集团<220>

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太阳城集团Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

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太阳城集团Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

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Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Thr Lys Ala Asp Asn Asn Thr

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

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太阳城集团Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

太阳城集团        115                 120                 125

太阳城集团Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

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Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

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太阳城集团Glu Gly Asn Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

太阳城集团                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

            180                 185                 190

太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

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Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ser Pro

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太阳城集团Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

太阳城集团                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

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Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

        275                 280                 285

太阳城集团Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

    290                 295                 300

太阳城集团Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

305                 310                 315                 320

Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

太阳城集团                325                 330                 335

Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

太阳城集团            340                 345                 350

Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

太阳城集团        355                 360                 365

太阳城集团Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

太阳城集团    370                 375                 380

太阳城集团Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

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Asn Ala Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

太阳城集团            420                 425                 430

Lys Glu Thr Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val

太阳城集团        435                 440                 445

Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

    450                 455                 460

Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

太阳城集团465                 470                 475                 480

太阳城集团Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

太阳城集团            500                 505                 510

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Ile Asp Val Val Gln Thr Ser

        515                 520                 525

太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

    530                 535                 540

Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Glu Asn Asn Lys Asn

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Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

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太阳城集团<210>25

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太阳城集团Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys

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Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Ala Ala Pro

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太阳城集团Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

    50                  55                  60

太阳城集团Asn Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ser Asp Asn Asn Thr

太阳城集团65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

太阳城集团                85                  90                  95

Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

太阳城集团            100                 105                 110

太阳城集团Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

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Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

太阳城集团145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

太阳城集团                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

太阳城集团            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

太阳城集团        195                 200                 205

太阳城集团Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

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太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

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Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

太阳城集团                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

        275                 280                 285

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

    290                 295                 300

太阳城集团Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

太阳城集团305                 310                 315                 320

Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

太阳城集团                325                 330                 335

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Asp Phe Met Val Glu Gly Glu Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

太阳城集团        355                 360                 365

Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

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Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

                405                 410                 415

Asn Ala Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

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Lys Glu Thr Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Thr Ala Pro Val

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Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Ala Thr Gln Asn Val Ala Lys

太阳城集团            500                 505                 510

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Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565

<210>26

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<213>人工序列

<220>

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            20                  25                  30

太阳城集团Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala Pro

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太阳城集团                85                  90                  95

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太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

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太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

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    210                 215                 220

太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

太阳城集团225                 230                 235                 240

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

                245                 250                 255

太阳城集团Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

太阳城集团            260                 265                 270

Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

    290                 295                 300

Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

305                 310                 315                 320

太阳城集团Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

                325                 330                 335

太阳城集团Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

太阳城集团            340                 345                 350

太阳城集团Asp Phe Met Val Glu Gly Glu Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

太阳城集团        355                 360                 365

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太阳城集团Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

太阳城集团                405                 410                 415

太阳城集团Asn Ala Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

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太阳城集团Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

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太阳城集团Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

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太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Asn Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

    530                 535                 540

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<213>人工序列

<220>

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太阳城集团65                  70                  75                  80

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太阳城集团145                 150                 155                 160

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太阳城集团                165                 170                 175

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Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu

太阳城集团        195                 200                 205

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    210                 215                 220

Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu

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太阳城集团Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu

太阳城集团                245                 250                 255

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            260                 265                 270

Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser

太阳城集团        275                 280                 285

Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr

    290                 295                 300

太阳城集团Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn

305                 310                 315                 320

太阳城集团Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met

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太阳城集团Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys

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太阳城集团    370                 375                 380

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太阳城集团Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser

太阳城集团            420                 425                 430

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太阳城集团        435                 440                 445

太阳城集团Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn

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太阳城集团465                 470                 475                 480

太阳城集团Gly Lys Gly Val Thr Leu Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu

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Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val

太阳城集团            500                 505                 510

太阳城集团Ala Lys Pro Thr Thr Gly Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln

        515                 520                 525

太阳城集团Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys

    530                 535                 540

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545                 550                 555                 560

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<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>SEQ ID NO:2修饰成含有氨基末端甲硫氨酸之后的甘氨酸和羧基His-标记

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太阳城集团Leu Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly

太阳城集团        35                  40                  45

太阳城集团Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val

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Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu

太阳城集团                85                  90                  95

Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val

太阳城集团            100                 105                 110

Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln

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    130                 135                 140

Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp

太阳城集团145                 150                 155                 160

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                165                 170                 175

Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser

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太阳城集团Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu

        195                 200                 205

Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile

太阳城集团    210                 215                 220

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225                 230                 235                 240

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Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu

太阳城集团            260                 265                 270

Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr

        275                 280                 285

太阳城集团Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro

    290                 295                 300

Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys

太阳城集团305                 310                 315                 320

Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val

太阳城集团                325                 330                 335

Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val

            340                 345                 350

Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val

太阳城集团        355                 360                 365

Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val

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Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr

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太阳城集团Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val

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Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg

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Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn

太阳城集团    450                 455                 460

太阳城集团Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala

太阳城集团465                 470                 475                 480

太阳城集团Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys

太阳城集团                485                 490                 495

Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys

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太阳城集团Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr

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Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys

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太阳城集团Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser

太阳城集团545                 550                 555                 560

Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala

太阳城集团                565                 570                 575

太阳城集团Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp

            580                 585                 590

Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala

        595                 600                 605

Lys Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu

    610                 615                 620

Pro Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu

太阳城集团625                 630                 635                 640

Pro Arg Lys Arg Lys Asn Leu Glu His His His His His His

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太阳城集团<211>481

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太阳城集团 1               5                  10                  15

太阳城集团Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala

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太阳城集团Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala

    50                  55                  60

Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro

                85                  90                  95

太阳城集团Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp

            100                 105                 110

Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala

太阳城集团        115                 120                 125

太阳城集团Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu

    130                 135                 140

太阳城集团Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val

145                 150                 155                 160

太阳城集团Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr

太阳城集团                165                 170                 175

太阳城集团Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys

太阳城集团            180                 185                 190

Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys

        195                 200                 205

Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala

太阳城集团    210                 215                 220

太阳城集团Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala

太阳城集团225                 230                 235                 240

Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn

太阳城集团                245                 250                 255

太阳城集团Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp

    290                 295                 300

太阳城集团Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu

305                 310                 315                 320

太阳城集团Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu

                325                 330                 335

太阳城集团Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp

太阳城集团            340                 345                 350

Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp

        355                 360                 365

Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys

    370                 375                 380

太阳城集团Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr

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太阳城集团Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys

太阳城集团                405                 410                 415

Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala

太阳城集团            420                 425                 430

Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro

        435                 440                 445

Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys

太阳城集团    450                 455                 460

Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly

465                 470                 475                 480

Lys

<210>43

<211>1452

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>编码SEQ ID NO:42且是密码子最优化的以用于酵母表达

太阳城集团<400>43

atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctgtcgct 60

太阳城集团tccccaacca ctacctctga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120

太阳城集团gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180

太阳城集团gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggaa gtcaagccag ctgctaaggc taccaacaac 240

太阳城集团acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300

aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa gaaggacggt 360

acccaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420

tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480

太阳城集团tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540

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太阳城集团cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660

太阳城集团tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720

ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780

aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840

ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900

太阳城集团aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 960

太阳城集团tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1020

tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080

太阳城集团agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140

太阳城集团gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200

太阳城集团gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260

aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320

ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1380

gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1440

aagtaaggat cc                                                     1452

<210>44

<211>605

<212>PRT

太阳城集团<213>ORF0657nG

<400>44

Met Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr

 1               5                  10                  15

Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr

太阳城集团            20                  25                  30

太阳城集团Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala

        35                  40                  45

Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala

    50                  55                  60

Pro Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn

65                  70                  75                  80

太阳城集团Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro

太阳城集团                85                  90                  95

Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp

            100                 105                 110

太阳城集团Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala

        115                 120                 125

太阳城集团Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu

    130                 135                 140

Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val

145                 150                 155                 160

太阳城集团Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr

                165                 170                 175

太阳城集团Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys

            180                 185                 190

太阳城集团Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys

        195                 200                 205

Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala

    210                 215                 220

太阳城集团Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala

225                 230                 235                 240

太阳城集团Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn

                245                 250                 255

太阳城集团Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala

        275                 280                 285

Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp

    290                 295                 300

Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu

太阳城集团305                 310                 315                 320

太阳城集团Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu

太阳城集团                325                 330                 335

Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp

            340                 345                 350

太阳城集团Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp

        355                 360                 365

太阳城集团Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys

太阳城集团    370                 375                 380

太阳城集团Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr

太阳城集团385                 390                 395                 400

Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys

                405                 410                 415

太阳城集团Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala

            420                 425                 430

Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro

        435                 440                 445

Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys

    450                 455                 460

太阳城集团Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly

465                 470                 475                 480

太阳城集团Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser

                485                 490                 495

Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala

            500                 505                 510

Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr

        515                 520                 525

Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala

    530                 535                 540

Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys

545                 550                 555                 560

太阳城集团Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu

太阳城集团                565                 570                 575

Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser

            580                 585                 590

Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro Arg Lys Arg Lys Asn

        595                 600                 605

太阳城集团<210>45

太阳城集团<211>1818

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:44且是密码子最优化的以用于酵母表达

<400>45

太阳城集团atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctgtcgct 60

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太阳城集团gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggaa gtcaagccag ctgctaaggc taccaacaac 240

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太阳城集团aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa gaaggacggt 360

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太阳城集团tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720

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太阳城集团agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140

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ccaaccaagg ttgtctccac tacccaaaac gtcgctaagc caactaccgc ttcttccaag 1560

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太阳城集团aacactcaag aaaacaaggc taagtctttg ccacaaaccg gtgaagaatc caacaaggac 1740

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agaaagagaa agaactaa                                               1818

太阳城集团<210>46

<211>1710

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码含有氨基末端甲硫氨酸的SEQ ID NO:17且是密码子最优化的以用于酵母表达

太阳城集团<400>46

太阳城集团atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctttggct 60

tccccaacca ctaccactga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120

太阳城集团gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180

太阳城集团gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctgctaaggc tgacaacaac 240

太阳城集团acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300

aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 360

gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420

太阳城集团tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480

太阳城集团tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540

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太阳城集团tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720

太阳城集团ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780

太阳城集团aagttgccag aaaagttgaa ggctgaatac aagaagaagt tggaagacac caagaaggct 840

太阳城集团ttggacgaac aagtcaagtc cgctatcacc gaattccaaa acgttcaacc aactaacgaa 900

aagatgactg acttgcaaga cactaagtac gtcgtctacg aatccgtcga aaacaacgaa 960

太阳城集团tccatgatgg acaccttcgt taagcaccca attaagactg gtatgttgaa cggtaagaag 1020

太阳城集团tacatggtca tggaaaccac taacgacgac tactggaagg acttcatggt tgaaggtcaa 1080

太阳城集团agagtcagaa ccatctccaa ggacgctaag aacaacacta gaaccattat cttcccatac 1140

gttgaaggta agactttgta cgacgctatc gtcaaggttc acgtcaagac tattgactac 1200

gacggtcaat accacgttag aattgttgac aaggaagctt tcaccaaggc taacaccgac 1260

aagtccaaca agaaggaaca acaagacaac tctgctaaga aggaagctac cccagctacc 1320

ccatctaagc caaccccatc tccagttgaa aaggaatctc aaaagcaaga ctcccaaaag 1380

gacgacaaca agcaattgcc atccgtcgaa aaggaaaacg acgcgtcttc tgaatccggt 1440

太阳城集团aaggacaaga ctccagctac caagccagct aagggtgaag ttgaatcttc ctctactact 1500

ccaaccaagg ttgtctccac tacccaaaac gtcgctaagc caactaccgc ttcttccaag 1560

太阳城集团actaccaagg acgttgtcca aacttctgct ggttcctctg aagctaagga ctctgctcca 1620

ttgcaaaagg ctaacatcaa gaacaccaac gacggtcaca cccaatccca aaacaacaag 1680

太阳城集团aacactcaag aaaacaaggc taagtcttaa                                  1710

太阳城集团<210>47

太阳城集团<211>1446

<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>编码SEQ ID NO:17I+区,是密码子最优化的以用于酵母表达,且编码甲硫氨酸起 始密码子

<400>47

atggctgaag aaactggtgg taccaacact gaagctcaac caaagaccga agctttggct 60

tccccaacca ctaccactga aaaggctcca gaaactaagc cagttgctaa cgctgtctcc 120

gtttctaaca aggaagtcga agctccaacc tccgaaacta aggaagctaa ggaagttaag 180

太阳城集团gaagtcaagg ctccaaagga aactaaggct gtcaagccag ctgctaaggc tgacaacaac 240

acttacccaa ttttgaacca agaattgaga gaagctatta agaacccagc tatcaaggac 300

aaggaccact ccgctccaaa ctctagacca atcgacttcg aaatgaagaa ggaaaacggt 360

gaacaacaat tctaccacta cgcgtcctct gtcaagccag ctagagttat tttcaccgac 420

tctaagccag aaatcgaatt gggtttgcaa tccggtcaat tctggagaaa gttcgaagtc 480

太阳城集团tacgaaggtg acaagaagtt gccaattaag ttggtttcct acgacaccgt caaggactac 540

太阳城集团gcttacatca gattctccgt ttctaacggt actaaggctg tcaagattgt ctcttccacc 600

太阳城集团cacttcaaca acaaggaaga aaagtacgac tacactttga tggaattcgc tcaaccaatt 660

tacaactctg ctgacaagtt caagaccgaa gaagactaca aggctgaaaa gttgttggct 720

ccatacaaga aggctaagac tttggaaaga caagtttacg aattgaacaa gatccaagac 780

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Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala Lys

            20                  25                  30

Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

        35                  40                  45

太阳城集团Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Lys Ala Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile

65                  70                  75                  80

太阳城集团Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp

                85                  90                  95

太阳城集团Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys

太阳城集团            100                 105                 110

太阳城集团Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys

        115                 120                 125

Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly

太阳城集团    130                 135                 140

Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp

145                 150                 155                 160

Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr

                165                 170                 175

太阳城集团Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile

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太阳城集团Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr

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太阳城集团    210                 215                 220

Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys

太阳城集团225                 230                 235                 240

太阳城集团Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp

                245                 250                 255

Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp

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太阳城集团    290                 295                 300

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太阳城集团Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys

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Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn

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太阳城集团Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp

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太阳城集团His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp

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Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala

太阳城集团            420                 425                 430

太阳城集团Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu

太阳城集团        435                 440                 445

太阳城集团Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser

太阳城集团    450                 455                 460

Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr

太阳城集团465                 470                 475                 480

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太阳城集团545                 550                 555                 560

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太阳城集团                565

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<212>PRT

<213>人工序列

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太阳城集团Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys

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Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

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Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Gly Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

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太阳城集团Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

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Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

太阳城集团        115                 120                 125

太阳城集团Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

太阳城集团145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

太阳城集团Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

太阳城集团            180                 185                 190

太阳城集团Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

        195                 200                 205

Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

太阳城集团    210                 215                 220

太阳城集团Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

225                 230                 235                 240

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

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Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Pro Ala Ile

        275                 280                 285

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

太阳城集团    290                 295                 300

Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

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Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

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Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

            340                 345                 350

太阳城集团Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

        355                 360                 365

Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

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Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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太阳城集团Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

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太阳城集团Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

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    450                 455                 460

太阳城集团Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

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太阳城集团Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

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太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

    530                 535                 540

Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

太阳城集团545                 550                 555                 560

Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565

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太阳城集团Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

        35                  40                  45

太阳城集团Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr

太阳城集团65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Glu

太阳城集团                85                  90                  95

Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

            100                 105                 110

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        115                 120                 125

Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Ile Ser Asn Gly Thr Lys Ala

太阳城集团            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

太阳城集团        195                 200                 205

太阳城集团Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

太阳城集团    210                 215                 220

Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

太阳城集团225                 230                 235                 240

Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

太阳城集团                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

太阳城集团            260                 265                 270

Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

太阳城集团    290                 295                 300

太阳城集团Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

太阳城集团305                 310                 315                 320

太阳城集团Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

太阳城集团                325                 330                 335

Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

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Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

        355                 360                 365

太阳城集团Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

太阳城集团    370                 375                 380

太阳城集团Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

385                 390                 395                 400

太阳城集团Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

                405                 410                 415

太阳城集团Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

太阳城集团            420                 425                 430

Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

        435                 440                 445

Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

太阳城集团    450                 455                 460

Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

太阳城集团465                 470                 475                 480

Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

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太阳城集团Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Val Lys

太阳城集团            500                 505                 510

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

        515                 520                 525

Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

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        35                  40                  45

Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Thr Lys Asn Pro Glu

太阳城集团                85                  90                  95

Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Thr Asp Phe

太阳城集团            100                 105                 110

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        115                 120                 125

Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Ile Ser Asn Gly Thr Lys Ala

            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

        195                 200                 205

Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

太阳城集团    210                 215                 220

Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

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Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Xaa Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

太阳城集团                245                 250                 255

太阳城集团Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

        275                 280                 285

太阳城集团Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

    290                 295                 300

Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

305                 310                 315                 320

太阳城集团Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

                325                 330                 335

太阳城集团Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

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太阳城集团Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

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太阳城集团Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

太阳城集团    370                 375                 380

太阳城集团Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

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Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

太阳城集团                405                 410                 415

太阳城集团Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

太阳城集团            420                 425                 430

Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

太阳城集团        435                 440                 445

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太阳城集团    450                 455                 460

Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

太阳城集团465                 470                 475                 480

Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

            500                 505                 510

太阳城集团Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

太阳城集团        515                 520                 525

太阳城集团Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

太阳城集团    530                 535                 540

太阳城集团Leu Leu Lys Thr His Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Ile Lys Asn

太阳城集团545                 550                 555                 560

Thr Lys Lys Asp Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565

<210>58

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<212>PRT

太阳城集团<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>ORF0657nH

<400>58

Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

太阳城集团 1               5                  10                  15

Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys

            20                  25                  30

太阳城集团Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

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Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

    50                  55                  60

Lys Glu Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

太阳城集团                85                  90                  95

太阳城集团Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

太阳城集团            100                 105                 110

Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly Thr Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

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Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

太阳城集团Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr

太阳城集团        195                 200                 205

Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp

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Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro

225                 230                 235                 240

太阳城集团Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys

                245                 250                 255

Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys

            260                 265                 270

Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu

太阳城集团    290                 295                 300

太阳城集团Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser

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Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn

太阳城集团                325                 330                 335

太阳城集团Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys

太阳城集团            340                 345                 350

Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala

太阳城集团        355                 360                 365

太阳城集团Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr

    370                 375                 380

Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp

385                 390                 395                 400

Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala

                405                 410                 415

Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys

太阳城集团            420                 425                 430

Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val

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Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln

    450                 455                 460

Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys

465                 470                 475                 480

Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser

                485                 490                 495

太阳城集团Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys

           500                 505                 510

Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser

        515                 520                 525

Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn

    530                 535                 540

太阳城集团Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn

太阳城集团545                 550                 555                 560

Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

                565

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<213>人工序列

<220>

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太阳城集团 1               5                  10                  15

Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys

            20                  25                  30

Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro

太阳城集团        35                  40                  45

Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro

太阳城集团    50                  55                  60

Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr

65                  70                  75                  80

Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala

                85                  90                  95

太阳城集团Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe

太阳城集团            100                 105                 110

太阳城集团Glu Met Asn Lys Lys Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser

太阳城集团        115                 120                 125

Ser Ala Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr

145                 150                 155                 160

Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val

                165                 170                 175

Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala

            180                 185                 190

Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Asp

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太阳城集团Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile

太阳城集团                245                 250                 255

Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu

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太阳城集团Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr

        275                 280                 285

Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln

    290                 295                 300

Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met

305                 310                 315                 320

Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly

                325                 330                 335

太阳城集团Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp

            340                 345                 350

太阳城集团Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys

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太阳城集团Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu

太阳城集团    370                 375                 380

Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly

太阳城集团385                 390                 395                 400

Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn

太阳城集团                405                 410                 415

太阳城集团Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys

            420                 425                 430

Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu

太阳城集团        435                 440                 445

Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu

太阳城集团    450                 455                 460

太阳城集团Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp

太阳城集团465                 470                 475                 480

太阳城集团Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro

            500                 505                 510

Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala

        515                 520                 525

Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile

    530                 535                 540

太阳城集团Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr

545                 550                 555                 560

Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

太阳城集团                565

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<212>PRT

太阳城集团<213>人工序列

<220>

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太阳城集团<400>60

Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

太阳城集团 1               5                  10                  15

Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys

太阳城集团        35                  40                  45

Glu Val Val Ala Pro Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys

太阳城集团    50                  55                  60

Ala Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu

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Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala

            100                 105                 110

太阳城集团Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr

        115                 120                 125

Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile

    130                 135                 140

太阳城集团Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln

145                 150                 155                 160

Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile

                165                 170                 175

Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe

太阳城集团            180                 185                 190

太阳城集团Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His

        195                 200                 205

太阳城集团Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala

    210                 215                 220

Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr

太阳城集团225                 230                 235                 240

太阳城集团Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu

                245                 250                 255

太阳城集团Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys

            260                 265                 270

太阳城集团Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu

太阳城集团        275                 280                 285

Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro

太阳城集团    290                 295                 300

太阳城集团Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Ala Tyr

太阳城集团305                 310                 315                 320

太阳城集团Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His

                325                 330                 335

太阳城集团Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu

            340                 345                 350

Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg

        355                 360                 365

Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile

    370                 375                 380

Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val

太阳城集团385                 390                 395                 400

His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val

                405                 410                 415

太阳城集团Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Ala Asp Lys Thr Asn Lys Lys

            420                 425                 430

Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro

太阳城集团        435                 440                 445

太阳城集团Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp

太阳城集团    450                 455                 460

Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn

465                 470                 475                 480

Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Ala Lys Ala Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val

            500                 505                 510

Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr

        515                 520                 525

Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp

    530                 535                 540

Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His

545                 550                 555                 560

Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

                565                 570                 575

太阳城集团<210>61

太阳城集团<211>572

<212>PRT

太阳城集团<213>人工序列

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太阳城集团Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

太阳城集团 1               5                  10                  15

Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala

        35                  40                  45

Pro Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Val Lys Glu

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Val Lys Ala Pro Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro Ala Ala Lys Ala

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile

                85                  90                  95

Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg

            100                 105                 110

Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr

太阳城集团        115                 120                 125

His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys

145                 150                 155                 160

太阳城集团Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser

太阳城集团                165                 170                 175

Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn

            180                 185                 190

Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys

太阳城集团        195                 200                 205

太阳城集团Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr

    210                 215                 220

太阳城集团Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys

太阳城集团225                 230                 235                 240

太阳城集团Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr

太阳城集团                245                 250                 255

Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu

            260                 265                 270

Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val

        275                 280                 285

太阳城集团Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys

    290                 295                 300

Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu

太阳城集团305                 310                 315                 320

太阳城集团Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr

                325                 330                 335

Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp

            340                 345                 350

太阳城集团Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile

        355                 360                 365

太阳城集团Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Cys Val

太阳城集团    370                 375                 380

Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr

385                 390                 395                 400

Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala

太阳城集团                405                 410                 415

Phe Thr Lys Ala Asn Ala Asp Lys Thr Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp

            420                 425                 430

太阳城集团Asn Ser Ala Lys Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro Ser Lys Pro Thr

        435                 440                 445

太阳城集团Thr Pro Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp

    450                 455                 460

太阳城集团Asp Asn Lys Gln Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser

465                 470                 475                 480

Glu Ser Gly Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro Ala Lys Ala Glu

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln

太阳城集团            500                 505                 510

Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Lys Asp Val

        515                 520                 525

太阳城集团Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu

    530                 535                 540

Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln

545                 550                 555                 560

太阳城集团Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

                565                 570

<210>62

太阳城集团<211>572

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657nH

<400>62

Ala Glu Glu Thr Gly Val Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

太阳城集团 1               5                  10                  15

Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala

太阳城集团        35                  40                  45

太阳城集团Pro Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Val Lys Glu

    50                  55                  60

太阳城集团Val Lys Ala Pro Lys Glu Ala Lys Glu Glu Lys Pro Ala Ala Lys Ala

太阳城集团65                  70                  75                  80

Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu Arg Glu Ala Ile

                85                  90                  95

太阳城集团Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg

太阳城集团            100                 105                 110

太阳城集团Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Lys Asp Gly Thr Gln Gln Phe Tyr

        115                 120                 125

His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys

145                 150                 155                 160

太阳城集团Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser

                165                 170                 175

太阳城集团Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn

太阳城集团            180                 185                 190

太阳城集团Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys

太阳城集团        195                 200                 205

太阳城集团Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr

    210                 215                 220

太阳城集团Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys

225                 230                 235                 240

Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr

太阳城集团                245                 250                 255

太阳城集团Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu

太阳城集团            260                 265                 270

太阳城集团Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val

        275                 280                 285

Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys

太阳城集团    290                 295                 300

Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu

太阳城集团305                 310                 315                 320

Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr

太阳城集团                325                 330                 335

Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp

            340                 345                 350

Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile

        355                 360                 365

太阳城集团Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Val

太阳城集团    370                 375                 380

太阳城集团Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr

385                 390                 395                 400

Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala

太阳城集团                405                 410                 415

太阳城集团Phe Thr Lys Ala Asn Ala Asp Lys Thr Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp

太阳城集团            420                 425                 430

太阳城集团Asn Ser Ala Lys Lys Glu Thr Thr Pro Ala Met Pro Ser Lys Pro Thr

        435                 440                 445

Thr Pro Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp

    450                 455                 460

Asp Asn Lys Gln Ser Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser

太阳城集团465                 470                 475                 480

Glu Ser Gly Lys Asp Lys Met Pro Val Thr Lys Pro Ala Lys Ala Glu

太阳城集团                485                 490                 495

太阳城集团Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln

太阳城集团            500                 505                 510

Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Lys Asp Val

        515                 520                 525

Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu

    530                 535                 540

太阳城集团Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln

545                 550                 555                 560

太阳城集团Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

                565                 570

<210>63

太阳城集团<211>566

<212>PRT

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>ORF0657nH

太阳城集团<400>63

太阳城集团Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu

太阳城集团 1               5                  10                  15

太阳城集团Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Thr Glu Lys Ala Pro Glu Ala

            20                  25                  30

Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val Ser Asn Lys Glu Val Val Ala

太阳城集团        35                  40                  45

太阳城集团Pro Thr Thr Glu Thr Lys Glu Ala Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu

    50                  55                  60

Thr Lys Glu Val Lys Pro Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro

太阳城集团65                  70                  75                  80

太阳城集团Ile Leu Asn Lys Glu Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys

                85                  90                  95

Asp Lys Asp His Ser Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met

            100                 105                 110

太阳城集团Lys Lys Glu Asn Gly Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val

太阳城集团        115                 120                 125

Lys Pro Ala Arg Val Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu

太阳城集团    130                 135                 140

Gly Leu Gln Ser Gly Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly

145                 150                 155                 160

太阳城集团Asp Lys Lys Leu Pro Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp

                165                 170                 175

Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys

            180                 185                 190

Ile Val Ser Ser Thr His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr

        195                 200                 205

太阳城集团Thr Leu Met Glu Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe

    210                 215                 220

Lys Thr Glu Glu Asp Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys

225                 230                 235                 240

太阳城集团Lys Ala Lys Thr Leu Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln

                245                 250                 255

Asp Lys Leu Pro Glu Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu

            260                 265                 270

太阳城集团Glu Thr Lys Lys Ala Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu

太阳城集团        275                 280                 285

Phe Gln Asn Val Gln Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp

    290                 295                 300

Thr Lys Tyr Val Val Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met

太阳城集团305                 310                 315                 320

Asp Thr Phe Val Lys His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys

                325                 330                 335

Lys Tyr Met Val Met Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe

            340                 345                 350

Met Val Glu Gly Gln Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn

        355                 360                 365

Asn Thr Arg Thr Ile Ile Phe Pro Tyr Ile Glu Gly Lys Thr Leu Tyr

    370                 375                 380

Asp Ala Ile Val Lys Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln

太阳城集团385                 390                 395                 400

太阳城集团Tyr His Val Arg Ile Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Ala

                405                 410                 415

Asp Lys Ser Asn Lys Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu

太阳城集团            420                 425                 430

Thr Thr Pro Ala Thr Pro Ser Lys Pro Thr Thr Pro Pro Val Glu Lys

        435                 440                 445

Glu Ser Gln Lys Gln Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Thr Gln Ser Pro

太阳城集团    450                 455                 460

Ser Val Glu Lys Glu Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys

太阳城集团465                 470                 475                 480

Thr Pro Ala Thr Lys Pro Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr

                485                 490                 495

Thr Pro Thr Lys Val Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr

            500                 505                 510

Thr Ala Ser Ser Glu Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly

        515                 520                 525

太阳城集团Pro Ser Glu Ala Lys Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys

太阳城集团    530                 535                 540

Asn Thr Asn Asp Gly His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln

太阳城集团545                 550                 555                 560

太阳城集团Glu Asp Lys Ala Lys Ser

                565

太阳城集团<210>64

太阳城集团<211>8

太阳城集团<212>PRT

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>His-标记

太阳城集团<400>64

Leu Glu His His His His His His

太阳城集团 1               5

太阳城集团<210>65

<211>16

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>引物

<400>65

ctggccgtcg ttttac                                     16

太阳城集团<210>66

<211>17

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>引物

<400>66

caggaaacag ctatgac                                                 17

<210>67

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>引物

<400>67

太阳城集团aaccggtttt ccatggggaa caaacagcaa aaagaattt                         39

<210>68

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>引物

太阳城集团<400>68

太阳城集团accggtttct cgaggttttt acgttttcta ggtaatac                          38

<210>69

太阳城集团<211>109

<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

<400>69

太阳城集团atgggtaaca agcaacaaaa ggaattcaag tctttctact ccattagaaa gtcttccttg  60

ggtgttgctt ctgtcgctat ctccaccttg ttgttgttga tgtctaacg              109

太阳城集团<210>70

太阳城集团<211>110

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

<400>70

gttggggaag cgacagcttc ggtctttggt tgagcttcag tgttggtacc accagtttct 60

tcagcagcag cttgagcttc accgttagac atcaacaaca acaaggtgga            110

太阳城集团<210>71

<211>110

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>71

agaccgaagc tgtcgcttcc ccaaccacta cctctgaaaa ggctccagaa actaagccag 60

ttgctaacgc tgtctccgtt tctaacaagg aagtcgaagc tccaacctcc            110

<210>72

<211>109

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>72

太阳城集团tggtagcctt agcagctggc ttgacttcct tagtttcctt tggagccttg acttccttaa 60

太阳城集团cttccttagc ttccttagtt tcggaggttg gagcttcgac ttccttgtt             109

<210>73

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>73

太阳城集团aagtcaagcc agctgctaag gctaccaaca acacttaccc aattttgaac caagaattga 60

太阳城集团gagaagctat taagaaccca gctatcaagg acaaggacca ctccgctc              108

太阳城集团<210>74

<211>109

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

<400>74

tggcttgaca gaggacgcgt agtggtagaa ttgttgggta ccgtccttct tcttcatttc 60

太阳城集团gaagtcgatt ggtctagagt ttggagcgga gtggtccttg tccttgata             109

太阳城集团<210>75

<211>102

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>75

accactacgc gtcctctgtc aagccagcta gagttatttt caccgactct aagccagaaa 60

tcgaattggg tttgcaatcc ggtcaattct ggagaaagtt cg                    102

<210>76

<211>104

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>76

ctgatgtaag cgtagtcctt gacggtgtcg taggaaacca acttaattgg caacttcttg 60

太阳城集团tcaccttcgt agacttcgaa ctttctccag aattgaccgg attg                  104

太阳城集团<210>77

<211>109

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>77

太阳城集团caccgtcaag gactacgctt acatcagatt ctccgtttct aacggtacta aggctgtcaa 60

gattgtctct tccacccact tcaacaacaa ggaagaaaag tacgactac             109

<210>78

太阳城集团<211>109

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>78

太阳城集团aacttttcag ccttgtagtc ttcttcggtc ttgaacttgt cagcagagtt gtaaattggt 60

太阳城集团tgagcgaatt ccatcaaagt gtagtcgtac ttttcttcct tgttgttga             109

<210>79

太阳城集团<211>106

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>79

ccgaagaaga ctacaaggct gaaaagttgt tggctccata caagaaggct aagactttgg 60

太阳城集团aaagacaagt ttacgaattg aacaagatcc aagacaagtt gccaga                106

<210>80

<211>109

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>80

太阳城集团tcggtgatag cggacttgac ttgttcgtcc aaagccttct tggtgtcttc caacttcttc 60

太阳城集团ttgtattcag ccttcaactt ttctggcaac ttgtcttgga tcttgttca             109

<210>81

<211>109

太阳城集团<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>81

cgaacaagtc aagtccgcta tcaccgaatt ccaaaacgtt caaccaacta acgaaaagat 60

gactgacttg caagacacta agtacgtcgt ctacgaatcc gtcgaaaac             109

<210>82

<211>109

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>82

tttccatgac catgtacttc ttaccgttca acataccagt cttaattggg tgcttaacga 60

aggtgtccat catggattcg ttgttttcga cggattcgta gacgacgta             109

太阳城集团<210>83

<211>109

<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>83

太阳城集团gaacggtaag aagtacatgg tcatggaaac cactaacgac gactactgga aggacttcat 60

太阳城集团ggttgaaggt caaagagtca gaaccatctc caaggacgct aagaacaac             109

太阳城集团<210>84

<211>101

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

<400>84

太阳城集团gtcttgacgt gaaccttgac gatagcgtcg tacaaagtct taccttcaac gtatgggaag 60

ataatggttc tagtgttgtt cttagcgtcc ttggagatgg t                     101

<210>85

太阳城集团<211>106

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>85

cgctatcgtc aaggttcacg tcaagactat tgactacgac ggtcaatacc acgttagaat 60

tgttgacaag gaagctttca ccaaggctaa caccgacaag tccaac                106

太阳城集团<210>86

<211>96

太阳城集团<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>86

tggggttggc ttagatgggg tagctggggt agcttccttc ttagcagagt tgtcttgttg 60

ttccttcttg ttggacttgt cggtgttagc cttggt                           96

太阳城集团<210>87

太阳城集团<211>85

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>87

cagctacccc atctaagcca accccatctc cagttgaaaa ggaatctcaa aagcaagact 60

太阳城集团cccaaaagga cgacaacaag caatt                                       85

太阳城集团<210>88

太阳城集团<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>88

gttggcttgg tagctggagt cttgtcctta ccggattcag aagacgcgtc gttttccttt 60

太阳城集团tcgacggatg gcaattgctt gttgtcgtcc ttttgggagt                       100

<210>89

<211>101

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

太阳城集团<400>89

太阳城集团ggacaagact ccagctacca agccaactaa gggtgaagtt gaatcttcct ctactactcc 60

太阳城集团aaccaaggtt gtctccacta cccaaaacgt cgctaagcca a                     101

太阳城集团<210>90

<211>101

<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>90

agcagagtcc ttagcttcag aggaaccagc agaagtttgg acaacgtcct tggtagtctt 60

太阳城集团ggaagaagcg gtagttggct tagcgacgtt ttgggtagtg g                     101

<210>91

<211>91

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>ORF0657n寡聚体

<400>91

太阳城集团ggttcctctg aagctaagga ctctgctcca ttgcaaaagg ctaacatcaa gaacaccaac 60

gacggtcaca cccaatccca aaacaacaag a                                91

太阳城集团<210>92

太阳城集团<211>98

<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>92

太阳城集团gtgaagaatc caacaaggac atgaccttgc cattgatggc tttgttggct ttgtcttcca 60

tcgttgcttt cgtcttgcca agaaagagaa agaactaa                         98

<210>93

<211>98

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>ORF0657n寡聚体

<400>93

gtgaagaatc caacaaggac atgaccttgc cattgatggc tttgttggct ttgtcttcca 60

tcgttgcttt cgtcttgcca agaaagagaa agaactaa                         98

<210>94

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>引物

<400>94

太阳城集团cttaaagctt atgtcacttt ctcttgtatc g                                31

<210>95

太阳城集团<211>30

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>95

tgataagctt gctcaatggt tctcttcctc                                  30

太阳城集团<210>96

<211>53

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>引物

<400>96

太阳城集团aaccggtttg gatcccacaa aacaaaatgg gtaacaagca acaaaaggaa ttc   53

<210>97

太阳城集团<211>42

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>引物

太阳城集团<400>97

aaccggtttg gatccttagt tctttctctt tcttggcaag ac               42

<210>98

太阳城集团<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220><223>引物

太阳城集团<400>98

太阳城集团gctgaagaaa ctggtggtac caac                                   24

<210>99

<211>42

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>引物

太阳城集团<400>99

gtcacggatc cttaagactt agccttgttt tcttgagtgt tc               42

<210>100

太阳城集团<211>41

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>引物

太阳城集团<400>100

太阳城集团ggggggatcc cacaaaacaa aatggctgaa gaaactggtg g   41

太阳城集团<210>101

<211>39

<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

<220>

<223>引物

太阳城集团<400>101

ggggggggat ccttaagact tagccttgtt ttcttgagt      39

<210>102

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>引物

太阳城集团<400>102

太阳城集团ggggggatcc cacaaaacaa aatggctgaa gaaactggtg g   41

<210>103

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

太阳城集团<223>引物

<400>103

gggggggatc cttagttctt tctctttctt gg             32

太阳城集团<210>104

太阳城集团<211>39

太阳城集团<212>DNA

太阳城集团<213>人工序列

太阳城集团<220>

太阳城集团<223>引物

<400>104

ctccggatcc cacaaaacaa aatggctgaa gaaactggt    39

<210>105

太阳城集团<211>38

太阳城集团<212>DNA

<213>人工序列

太阳城集团<220>

<223>引物

太阳城集团<400>105

gctgccggga tccttatggg gttggcttag atggggta     38

<210>106

<211>644

<212>PRT

太阳城集团<213>金黄色葡萄球菌(S.aureus)

<400>106

Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys

太阳城集团 1               5                  10                  15

Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu

            20                  25                  30

太阳城集团Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn

太阳城集团        35                  40                  45

太阳城集团Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Leu Ala Ser Pro Thr Thr Thr

太阳城集团    50                  55                  60

太阳城集团Thr Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val

太阳城集团65                  70                  75                  80

Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys

太阳城集团                85                  90                  95

Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro

太阳城集团            100                 105                 110

Ala Ala Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu

        115                 120                 125

Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala

太阳城集团    130                 135                 140

Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly Glu

太阳城集团145                 150                 155                 160

太阳城集团Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile

太阳城集团                165                 170                 175

太阳城集团Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln

            180                 185                 190

Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile

        195                 200                 205

Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe

    210                 215                 220

Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His

太阳城集团225                 230                 235                 240

太阳城集团Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala

                245                 250                 255

Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr

太阳城集团            260                 265                 270

Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu

太阳城集团        275                 280                 285

太阳城集团Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys

太阳城集团    290                 295                 300

Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu

305                 310                 315                 320

太阳城集团Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro

太阳城集团                325                 330                 335

太阳城集团Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr

            340                 345                 350

Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His

        355                 360                 365

Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu

    370                 375                 380

Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg

385                 390                 395                 400

Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Ile Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile

                405                 410                 415

太阳城集团Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val

太阳城集团            420                 425                 430

His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val

        435                 440                 445

Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys

    450                 455                 460

太阳城集团Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro

465                 470                 475                 480

太阳城集团Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp

                485                 490                 495

太阳城集团Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn

太阳城集团            500                 505                 510

太阳城集团Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro

        515                 520                 525

Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val

    530                 535                 540

Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr

太阳城集团545                 550                 555                 560

太阳城集团Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp

                565                 570                 575

太阳城集团Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His

            580                 585                 590

Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

        595                 600                 605

Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro Leu

    610                 615                 620

太阳城集团Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro Arg

太阳城集团625                 630                 635                 640

Lys Arg Lys Asn

<210>107

太阳城集团<211>644

<212>PRT

太阳城集团<213>金黄色葡萄球菌(S.aureus)

<400>107

Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys

 1               5                  10                  15

Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu

            20                  25                  30

太阳城集团Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr Asn

        35                  40                  45

太阳城集团Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr Thr

    50                  55                  60

Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser Val

65                  70                  75                  80

Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala Lys

太阳城集团                85                  90                  95

Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys Pro

            100                 105                 110

Ala Thr Lys Ala Asp Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu Leu

        115                 120                 125

太阳城集团Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser Ala

太阳城集团    130                 135                 140

太阳城集团Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly Glu

太阳城集团145                 150                 155                 160

Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val Ile

                165                 170                 175

太阳城集团Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly Gln

            180                 185                 190

太阳城集团Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro Ile

        195                 200                 205

Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg Phe

太阳城集团    210                 215                 220

太阳城集团Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr His

225                 230                 235                 240

Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe Ala

                245                 250                 255

Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp Tyr

            260                 265                 270

太阳城集团Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu Glu

        275                 280                 285

太阳城集团Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu Lys

    290                 295                 300

Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala Leu

305                 310                 315                 320

Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln Pro

                325                 330                 335

Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val Tyr

            340                 345                 350

太阳城集团Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys His

太阳城集团        355                 360                 365

Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met Glu

    370                 375                 380

太阳城集团Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln Arg

385                 390                 395                 400

Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile Ile

                405                 410                 415

太阳城集团Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys Val

            420                 425                 430

太阳城集团His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile Val

太阳城集团        435                 440                 445

Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys Lys

    450                 455                 460

Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr Pro

465                 470                 475                 480

Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln Asp

                485                 490                 495

Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu Asn

太阳城集团            500                 505                 510

Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys Pro

        515                 520                 525

太阳城集团Ala Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val Val

    530                 535                 540

Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys Thr

太阳城集团545                 550                 555                 560

Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys Asp

                565                 570                 575

太阳城集团Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly His

            580                 585                 590

Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys Ser

        595                 600                 605

Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro Leu

太阳城集团    610                 615                 620

Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro Arg

625                 630                 635                 640

Lys Arg Lys Asn

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