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一种用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物.pdf

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一种 用于 梗死 心肌 修复 血管 重建 细胞 移植 组合
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摘要
申请专利号:

CN200710078299.2

申请日:

20070316

公开号:

CN101020081A

公开日:

20070822

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61L27/38,A61L27/54 主分类号: A61L27/38,A61L27/54
申请人: 重庆大学
发明人: 杨应斌,蔡绍皙,杨力,蔡绍晖,于淑惠,李军华
地址: 400044重庆市沙坪坝区沙正街174号
优先权: CN200710078299A
专利代理机构: 重庆市恒信知识产权代理有限公司 代理人: 刘小红
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN200710078299.2

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法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明的目的是提供一种用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,该组合物包括移植辅助细胞,以及体外制备心肌前体细胞的基因工程载体。移植辅助细胞具有植入到心梗区瘢痕组织后,可以促进心梗区血管的生成,同时提高心肌前体细胞移植成活率的作用;基因工程载体用于体外从病人(或动物)骨髓干细胞中制备出心肌修复的高纯度心肌前体细胞。本发明组合物还包括与上述基因工程载体上的自杀基因相对应的药物,用于在移植辅助细胞与心肌前体细胞植入心梗区内并形成自己的血管系统后,将移植辅助细胞及发生瘤变的心肌组织前体细胞从宿主体内清除。由于心肌前体细胞可以来源于病人的骨髓,所以不需要免疫抑制剂来维持心肌前体细胞的存活。

权利要求书

1、一种用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,该组合物包括移植辅助细胞、以及体外制备的心肌前体细胞的基因工程载体;所述移植辅助细胞是经过表达自杀基因的病毒载体转染后筛选得到的,能够稳定表达自杀基因产物的人或动物的肝窦内皮细胞株或其他肿瘤细胞株;所述基因工程载体包括心肌细胞特异性启动子及内部核糖体进入位点序列调控新酶素抗性基因和端粒酶催化亚基同时表达的双顺反子腺病毒载体,以及肿瘤细胞特异性启动子调控自杀基因表达的慢病毒载体。2.如权利要求1所述用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,其特征是:组合物中还包括与自杀基因相对应的药物。3.如权利要求1或2所述用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,其特征是:所述肿瘤细胞特异性启动子选自端粒酶催化亚基启动子、甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子、前列腺特异性启动子、视黄酸效应生长/分化因子启动子、肾细胞因子启动子、络氨酸激酶启动子、人工合成肿瘤细胞特异性表达启动子中的一种。4.如权利要求1或2所述用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,其特征是:所述心肌细胞特性启动子选自MHC启动子、MLC2v启动子中的一种。5.如权利要求1或2所述用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,其特征是:所述自杀基因选自胞嘧啶脱胺酶基因、单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因、水痘疱疹病毒胸苷激酶基因、细胞色素P450 2B1基因、核苷磷酸化酶基因中的一种。6.如权利要求3所述用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,其特征是:所述人工合成的肿瘤细胞特异性表达启动子为人工合成核苷酸的序列,其核苷酸组成为SEQ ID No.3。7.如权利要求1或2所述用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,其特征是:所述肿瘤细胞特异性启动子调控自杀基因表达的慢病毒载体的核苷酸组成为SEQ ID No.4。8.如权利要求2所述用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,其特征是:所述与自杀基因相对应的药物选自5-氟胞嘧啶、丙氧鸟苷、无环鸟苷、6-甲氧嘌呤阿拉伯糖苷、环磷酰胺、6-甲基嘌呤脱氧核苷中的一种。

说明书

一种用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物

技术领域

本发明属于生物技术领域。涉及一种用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组 合物。

背景技术

现有技术中细胞移植的意义及其存在问题:

目前对心肌损伤而引起的充血性心力衰竭(CHF)还缺乏有效的治疗药物和治疗 手段,由于成年哺乳类动物的心肌细胞不能再生,心肌细胞丢失而导致的CHF是一个 不可逆转的病理过程,所以细胞移植是未来治疗CHF的根本方法。

细胞移植的关键是解决细胞来源的问题。由于干细胞具有分化成各种组织细胞的 潜力,特别是骨髓干细胞(Born marrow stem cells,BMSC),具有取材方便,还可 以实现自体移植,不需要免疫抑制剂进行维持移植物存活等优点,而被认为是一种理 想的用于组织修复的种子细胞。据目前的研究表明,利用BMSC中的骨髓间充质干细 胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在体外的诱导分化培养可以得到心肌组织前体 细胞,如利用特定的化学诱导剂5-AZA和bFGF诱导MSCs在体外分化成心肌样细胞(裴 雪涛、牛丽丽等,成年人骨髓间充质干细胞体外扩增和定向诱导分化为心肌样细胞的 方法,中国专利公开号:CN1536076A)等。

但是,这并不意味着我们就可以得到大量的可以用于移植修复的组织前体细胞。 由于BMSC在体外诱导分化成各种组织前体细胞的过程中,并非所有的BMSC都可以分 化为我们所需要的目的细胞。所以,在一个BMSC的诱导分化培养体系中,往往含有 未分化的BMSC以及多种多样的组织前体细胞,我们所需要的心肌组织前体细胞只占 其中的一部分。如果将没有经过筛选纯化的组织前体细胞移植入体内后,就可能导致 植入细胞在体内发生瘤变,从而给病人带来潜在的危险。所以,如何从BMSC的诱导 分化培养产生的混合细胞体系中,将心肌前体细胞分离纯化出来,才是解决细胞来源 问题的关键。太阳城集团细胞的分离纯化方法,目前最常采用的方法是基于细胞表面特异性 蛋白标志的流式细胞技术。然而不幸的是:心肌前体细胞表面上,到底存在何种特异 性的特异性蛋白标志,至今还存在学术上的争论。

太阳城集团为了能够从干细胞分化后的培养体系中得到纯化了的心肌前体细胞,Klug和 Field等用含α-心肌肌凝蛋白重链(MHC)启动子驱动氨基糖苷磷酸基转移酶neor的 表达载体,转入胚胎干细胞的诱导分化培养体系中,然后再用G418进行筛选,从而成 功地分离纯化出心肌前体细胞(J.Clin.Invest.98:216,1996)。也许Klug和Field 的方法,是从干细胞体外诱导分化体系分离纯化出符合细胞移植要求的心肌组织前体 细胞的一种理想方法。

但是该方法只适用于从胚胎干细胞分化培养体系中分离纯化心肌前体细胞,却很 难适用于从BMSC分化培养体系中分离纯化出心肌所需要修复的细胞。这是因为胚胎干 细胞具有强大的体外扩增能力,而BMSC的体外扩增能力非常有限,一般在体外进行有 限的10~20次传代,满足不了基因工程操作所需要的要求。特别是BMSC分化后,细胞 很快就凋亡了,根本就不可能进行转基因后的阳性细胞克隆筛选培养。

端粒酶与细胞扩增

太阳城集团端粒酶(Telomerase)在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的 继续增殖能力等方面有重要作用。哺乳动物体内绝大多数组织细胞,在动物出生以后 就丧失了端粒酶活性,因而组织细胞在体外只能进行有限传代的培养,这就制约了基 因工程技术在动物组织细胞上的应用。一般认为,端粒酶活性的再活化,可以维持端 粒的长度,而延缓细胞进入克隆性的老化,是维持细胞不老的关键步骤。很多研究表 明,在端粒酶活性丧失的组织细胞中重建端粒酶的活性以后,可导致细胞的体外扩增 能力增加,同时保持原有细胞的功能不变。

端粒酶活性再活化后,细胞就会继续地进行分裂克隆,但是与此同时,细胞发生瘤 变致癌的风险也相对提高了,这是因为细胞不受控制地分裂对个体而言极具侵略和破 坏性。然而,适度一过性地提高组织细胞中的端粒酶活性,可以在提高细胞体外扩增 能力,便于基因工程操作的同时,还能增加细胞在移植后与机体组织的整合能力。

细胞移植初始无功能

细胞移植与器官移植最大的不同之处在于,植入器官具有完整的解剖结构,手术 完成后,植入的器官可以通过自身的血管系统获取成活所需要的营养物质。而植入细 胞进入机体后,只能依靠植入环境中的组织液提供养料和氧份。所不幸的是,大多数 情况下细胞需要植入的环境,都是一些组织损伤后形成的瘢痕组织,如:梗死心肌的 瘢痕组织等,在这些组织内往往血管分布稀少,除了肿瘤细胞外,正常细胞在植入的 初期很难在这些组织内成活下来。因此,心肌损伤后瘢痕组织内的血管系统重建,是 心肌前体细胞移植成活的关键。

终上所述,如何有效解决干细胞分化后,如何筛选纯化心肌组织前体细胞、如何 在坏死太阳城集团位重建心血管、以及如何有效控制细胞在植入体内后发生瘤变,是细胞 移植治疗充血性心率衰竭的关键。故本发明提供一种用于梗死心肌修复与血管重建的 细胞移植组合物,无疑对充血性心力衰竭患者带来了希望。

发明内容

太阳城集团本发明的目的是提供一种用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物,该组 合物包括移植辅助细胞,以及体外制备心肌前体细胞的基因工程载体。移植辅助细胞 具有植入到心梗区瘢痕组织后,可以促进心梗区血管的生成,同时提高心肌前体细胞 移植成活率的作用;基因工程载体用于体外从病人(或动物)骨髓干细胞中制备出心 肌修复的高纯度心肌前体细胞。

太阳城集团本发明组合物还包括与上述基因工程载体上的自杀基因相对应的药物,用于在移 植辅助细胞与心肌前体细胞植入心梗区内并形成自己的血管系统后,将移植辅助细胞 及发生瘤变的心肌组织前体细胞从宿主体内清除。由于心肌前体细胞可以来源于病人 的骨髓,所以不需要免疫抑制剂来维持心肌前体细胞的存活。

太阳城集团为实现上述目的而采用的技术方案是这样的:即提供一种用于梗死心肌修复与血 管重建的细胞移植组合物,该组合物包括移植辅助细胞、以及体外制备的心肌前体细 胞的基因工程载体;所述移植辅助细胞为人或动物的肝窦内皮细胞株或其他肿瘤细胞 株、经过表达自杀基因的病毒载体转染后经筛选得到的,能够稳定表达自杀基因产物 的细胞;所述基因工程载体包括转心肌细胞特异性启动子及内部核糖体进入位点序列 (IRES)调控新酶素抗性基因和端粒酶催化亚基表达的双顺反子腺病毒载体,以及肿 瘤细胞特异性启动子调控自杀基因表达的慢病毒载体。

太阳城集团组合物中还包括与所述自杀基因相对应的药物。

太阳城集团上述组合物中:所述肿瘤细胞特异性启动子选自端粒酶催化亚基启动子、甲胎蛋 白启动子、癌胚抗原启动子、前列腺特异性启动子、视黄酸效应生长/分化因子启动子、 肾细胞因子启动子、络氨酸激酶启动子、以及人工合成上述肿瘤细胞特异性启动子突 变序列中的一种。

所述心肌细胞特性启动子选自心肌肌凝蛋白重链(MHC)启动子、心肌肌凝蛋白轻 链2(MLC2v)启动子中的一种。

所述自杀基因选自胞嘧啶脱胺酶基因、单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因、水痘疱疹 病毒胸苷激酶基因、细胞色素P450 2B1基因、核苷磷酸化酶基因中的一种。

所述与自杀基因相对应的药物选自5-氟胞嘧啶、丙氧鸟苷、6-甲氧嘌呤阿拉伯糖 苷、环磷酰胺、6-甲基嘌呤脱氧核苷中的一种。

上述组合物可以通过目前成熟的基因工程及组织培养技术制备,其中:

1.所述移植辅助细胞的制备过程包括:(1)人肝窦内皮细胞株(或其他肿瘤细 胞)的体外培养;(2)用表达自杀基因的病毒载体转染步骤(1)所述的细胞;(3) 用步骤(2)所述病毒载体上真核抗性基因所对应的抗生素培养基进行筛选培养;(4) 将步骤(3)得到的细胞进行自杀基因表型鉴定;(4)将能够稳定表达自杀基因产物 的细胞克隆按常规方法进行扩大培养;(5)移植前用PBS冲洗(4)所得到的细胞;

2.所述双顺反子的腺病毒穿梭质粒载体构建:

(1)根据NCBI中所查到的MHC或MLC2v启动子序列为依据进行PCR引物设计, 并从人(或动物)组织细胞基因组DNA中扩增出不同长度的MHC或MLC2v启动子片段; 将MHC或MLC2v启动子片段插入无启子腺病毒穿梭质粒载体中;在MHC或MLC2v启动 子的3′端插入报告基因;将新构建好的腺病毒穿梭质粒载体与腺病毒基因组质粒在体 外包装成腺病毒颗粒;将包装得到的腺病毒颗粒与含有心肌细胞或心肌前体细胞的培 养体系共同培养;培养24~48小时后,检测报告基因的表达,选择具有较强心肌细 胞特异性表达报告基因的最短的MHC或MLC2v启动子片段用于下一步的操作。(2)在 普通无启动子腺病毒穿梭质粒载体(如:pdc312等可以从市场购得)上的多克隆位点 5’端插入MHC或MLC2v启动子片段;(3)将IRES片段插入到MHC或MLC2v启动子片 段与PolyA片段的中间;(4)在MHC或MLC2v启动子片段与IRES片段之间插入hTERT 编码序列;(5)在IRES与PolyA片段之间插入neor编码序列;(6)最后用PCR对上 一步操作所得到的质粒载体进行鉴定。

3.所述肿瘤特异性表达CD慢病毒载体构建:(1)根据NCBI中所记载的端粒酶催 化亚基启动子、甲胎蛋白启动子、癌胚抗原启动子、前列腺特异性启动子、视黄酸效 应生长/分化因子启动子、肾细胞因子启动子、络氨酸激酶启动子、人工合成肿瘤细胞 特异性启动子序列的其中一种进行引物设计,从人或动物的基因组DNA中扩增启动子 片段,或采用人工合成肿瘤细胞特异性启动子片段;(2)用此片段取代慢病毒载体的 启动子片段;(3)在上一步操作所得到载体的肿瘤细胞特异性启动子的3′端,接入 报告基因;(4)将上一步操作所得到的载体与相应的包装质粒有体外进行病颗粒包装, 并将得到的病毒颗粒去感染肿瘤细胞与正常组织原代培养的细胞;(5)病毒颗粒感染 细胞24~48小时后,检测各个培养细胞的报告基因表达情况,并选择肿瘤细胞特异表 达报告基因的载体用于下一步的操作。(6)根据NCBI所记载的胞嘧啶脱胺酶基因、 单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因、水痘疱疹病毒胸苷激酶基因、细胞色素P450 2B1基因、 核苷磷酸化酶编码序列中的一种进行引物设计,并用PCR扩增相应的自杀基因片段; (7)将自杀基因片段插入并取代步骤(3)所得载体中的报告基因片段,从而得到新 序列肿瘤特异性表达自杀基因的慢病毒载体;

太阳城集团4、所述与自杀基因相对应的药物:可以通过任何药物品市场获取。

太阳城集团上述组合物在梗死心肌修复与血管重建中的使用过程:

太阳城集团(1)用组合物提供的双顺反子穿梭质粒载体和肿瘤细胞特异性表达自杀基因慢病 毒载体按常规方法分别包装成腺病毒颗粒与慢病毒颗粒,并分离浓缩腺病毒颗粒和慢 病毒颗粒;

(2)BMSC的分离培养;

太阳城集团(3)用5-Az诱导体外培养的BMSC分化;

(4)用腺病毒颗粒和慢病毒颗粒转染分化后的BMSC;

太阳城集团(5)转染病毒后,将BMSC转入含G418和与慢病毒载体上真核抗性基因(如: blasticidin等)相应抗生素的培养基中进行筛选培养,得到的心肌前体细胞用PBS 清洗掉真核抗生素后,即可用于移植手术。

(6)将发明组合物中的移植辅助细胞手术多点植入患者心梗区内,并每天肌肉注 射环孢素A 1mg/公斤体重;

太阳城集团(7)用超声波检测仪或CT等监测移植辅助细胞的生长,当移植部位形成直径为3~ 5毫米大小的肿瘤灶时,将操作步骤(5)所得到的细胞植入肿瘤灶内;

太阳城集团(8)心肌细胞植入1~2周后,静注或肌注适量与自杀基因相对应的药物如:5- 氟胞嘧啶等,连续用药至移植辅助细胞被完全清除。

本发明的有益效果如下:

该组合物包括移植辅助细胞,以及体外制备心肌前体细胞的基因工程载体,其中 移植辅助细胞具有植入到心梗区瘢痕组织后,可以促进心梗区血管的生成,同时提高 心肌前体细胞移植成活率的作用;基因工程载体,可以从病人(或动物)骨髓干细胞 中制备出心肌修复的高纯度心肌前体细胞。利用本发明方法获取的心肌前体细胞在心 梗区内移植成活并形成移植辅助细胞与心肌前体细胞自己的血管系统后,可以用特定 的药物将移植辅助细胞及发生瘤变的心肌组织前体细胞从宿主体内清除。因而,采用 本发明组合物进行梗死心肌修复及血管重建,不但具有心肌前体细胞移植成活率高, 而且还避免了骨髓干细胞由于分化末尽等因素,而造成在植入体内后发生瘤变的潜在 危险,因而具有使用安全的特点。

附图说明

图1:本发明用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植实施应用方案流程图。

图2:在体外培养的BMSC中加入5-氮杂胞苷进行诱导分化培养72小时后细胞图 (10×20)

太阳城集团图中所示,用文献记载方法分离培养BMSC传二代细胞,在加入5-Az诱导分化培 养48小时后,大多数的细胞形体变宽,已经开始出现衰老迹象,细胞很难再继续增殖。

图3:加入5-氮杂胞苷同时转染腺病毒Ad-MHCp-hTERT-IRES-neor后,细胞培养 72小时图(10×20)

图中所示,用本发明提供方法分离培养BMSC传二代细胞,在加入5-Az诱导分化培 养48小时后,绝大多数细胞体形呈长梭状,细胞的数量明显增多,显示出较强的扩增 能力。

图4:转染腺病毒Ad-MHCp-hTERT-IRESneo后,心肌前体细胞端粒酶活性测定TRAP 图。图中所示,和转染前对照组相比较,含MHC启动子驱动hTERT表达的腺病毒颗粒, 转染心肌前体细胞24小时后,细胞端粒酶的活性就得到显著的提高。72小时后细胞 端粒酶活性达到最高。

太阳城集团图5:G418及blasticidin双抗筛选48小时后细胞图(10×20)。图中所示,加入 5-氮杂胞苷同时转染重组腺病毒及慢病毒颗粒后的BMSC,在加入G418及blasticidin 双抗筛选培养48小时后,大部分的细胞被杀死而呈悬浮状态。

太阳城集团图6:G418及blasticidin双抗筛选72小时后细胞图(10×20)。图中所示,加入 5-氮杂胞苷同时转染重组腺病毒及慢病毒颗粒后的BMSC,在加入G418及blasticidin 双抗筛选培养72小时后,有部分细胞聚集在一起,且出现高频蠕动。

太阳城集团图7:加入G418及blasticidin进行双抗筛选96小时后心肌前体细胞图(10×20)。 图中所示,加入5-氮杂胞苷同时转染重组腺病毒及慢病毒颗粒后的BMSC,在加入G418 及blasticidin双抗筛选培养96小时后,细胞开始出现明显的心肌细胞外形特征,在 细胞与细胞之间,甚至出现类似润盘的结构。

太阳城集团图8:pdc315-MHCp-EGFP腺病毒颗粒感染BMSC分化72小时后细胞共聚焦显微镜 图(10×63)。图中所示,加入5-氮杂胞苷同时转染重组腺病毒及慢病毒颗粒后的BMSC, 经过pdc315-MHCp腺病毒颗粒感染后,部分细胞有EGFP的表达,且表达EGFP的细胞 具有心肌细胞的形状。

图9:重组hTERT启动子功能鉴定的激光共聚焦显微镜图(10×63)。其中的图A 所示,荷载有hTERT启动子驱动EGFP表达的慢病毒颗粒,在感染端粒酶阳性的肿瘤细 胞后,能表达出肉眼可见的EGFP;图B所示,荷载有hTERT启动子驱动EGFP表达的 慢病毒颗粒,在感染端粒酶阴性的正常组织原代培养细胞后,不能表达可见的EGFP; 说明了人工合成的hTERT启动子在端粒酶阳性肿瘤细胞中有很强的特异性表达活性。

具体实施方式

本发明的上述内容可以通过下面非限定性的实施例进一步说明。实施所需要组合 物之外的材料均属可购取的商品。

应用实施举例1:利用所述组合物修复大鼠梗死心肌及血管重建

1.心肌梗死大鼠模型建立:取体重200克左右的SD大鼠,用乙醚麻醉后,固定于台 面上,接上大鼠专用呼吸机。用毛剪将胸部毛剪干净并消毒后,外科手术打开胸腔,暴 露心脏。用丝线结扎冠状动脉的左前降支后,用手挤压胸腔排出空气,然后缝合胸腔。 两个月后,即可用于下一步操作。

太阳城集团2.大鼠心肌细胞特异性表达hTERT和neor的腺病毒双顺反子的腺病毒穿梭质粒载 体制备:(1)用大鼠基因组DNA作模板,根据NCBI中所载序列X04267进行引物设计, 其中上游引物为:5’-CGGTCTAGATGGGAGGAAGAGGC 3’,下游引物为:5’-TTGAATTCGTT GGCTGCAAAACA-3’,用PCR方法扩增大鼠心肌肌凝蛋白重链(MHC)启动子序列。见序 列表SEQ ID NO:1。(2)然后将步骤(1)启动子片段取带腺病毒穿梭质粒pdc315 的mCMV启动子,并在其多克隆位点上插入报告基因EGFP片段,得到的新载体命名为: pdc315-pMHC-EGFP。将其进行病毒颗粒包装后,转染BMSC诱导分化后的细胞培养体系, 并用共聚焦荧光显微镜鉴定EGFP的表达,结果见图8。(3)用限制性内切酶EcoRI, Not I消化质粒pGRN145(可以从市场购得)和质粒pIRESneor3,电泳并凝胶回收hTERT 片段和线性pIRESneor3片段,用T4连接酶将hTERT片段和线性pIRESneor3片段连接 起来,得到的腺病毒穿梭质粒命名为:phTERT-IRES-neor;(4)用限制性内切酶EcoR I,XbaI消化质粒phTERT-IRES-neor,用EcoR I,NheI消化质粒消化腺病毒穿梭质粒 pdc315-pMHC,分别回收hTERT-IRES-neor片段,和线性腺病毒穿梭质粒pdc315-pMHC 片段,并用T4DNA连接酶将回收的两片段进行连接,得到的重组质粒命名为:pdc315- pMHC-hTERT-IRES-neor,即是本发明所述心肌细胞特异性表达hTERT和neor的腺病毒 双顺反子的腺病毒穿梭质粒载体,其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.2。

太阳城集团3.肿瘤特异性表达CD及EGFP慢病毒载体构建:(1)以NCBI中序列AB016767 的第2930~3762之间的碱基序列为基础进行启动子序列设计,为了提高启动子在肿瘤 细胞中的转录活性,同时降低在端粒酶阴性细胞中的表达活性,在序列的内部插入了 一些顺式作用元件序列(见序列表SEQ ID NO:3.);为了下一步能够方便地取代慢病 毒载体上的启动子,在序列的5’端引入了ClaI限制性内切酶位点识别序列,在序列 的3’端引入了BamHI限制性内切酶位点识别序列,最后采用人工化学合成法合成,并 将其亚克隆入PUC57中,命名为PUC57-phTERT;(2)根据NCBI注册的序列S56903, 进行引物设计,为了方便与载体进行连接,我们在上游引物的5端引入B amHI限制性 内切酶识别位点序列,在下游引物的5端引入AgeI限制性内切酶识别位点序列,因而, 上游引物为:5’-ATAGGATCCGACAGCAGCAATGAC-3’,下游引物为:5’-TATACCGGTGCGTTGG AGGAAT-3’。然后进行PCR扩增;(3)用PCR方法用扩增EGFP片段,其上游引物 为:5’-CACCATGGTGAGCAAGGGC-3’,下游引物为:5’-ACAACACTCAACCCTATCTCGGTCT-3’, PCR产物与试剂盒pLenti6/V5 Directional TOPOCloning Kit(可从Invitrogen公 司购买)中的线性慢病毒载体进行TOP连接,得到的载体命名为pLenti-EGFP;(4) 用限制性内切酶BamH I、Age I消化步骤(2)的PC R产物,以及慢病毒载体 plenti-EGFP,最后用琼脂糖凝胶电泳方法分别回收CD片段和线性载体片段;用T4 DNA连接酶将CD片段和线性载体片段进行连接,得到的表达CD的慢病毒载体质粒命 名为:pLenti-CMVp-CD;(5)用限制性内切酶Cla I、BamH I消化步骤(1)所得质 粒PUC57-phTERT,以及慢病毒载体pLenti-CMVp-CD,分别用凝胶电泳回收phTERT 启动子片段及无启动子慢病毒载体pLenti-CD片段,并用连接酶将所回收的两条片段 进行连接,得到的质粒载体即是肿瘤特异性表达CD的慢病毒载体,并命名为: pLenti-phTERT-CD,其核苷酸组成见序列表SEQ ID NO.4;(6)用hTERT启动子取代 步骤(3)所得到慢病毒载体pLenti-EGFP上的CMV启动子片段后,得到的质粒命名为: pLenti-phTERT-EGFP。

4.慢病毒颗粒的体外包装与纯化:(1)将上述操作所得到的慢病毒质粒载体 plenti-hTERT-CD和plenti-hTERT-EGFP,转化DH5α感受态大肠杆菌中进行扩增,并 制备大量的超纯质粒;将此两种超纯质粒分别与Invitrogen公司的慢病毒包装质粒 plp1、plp2、plpVSV-G按一定比例与阳离子脂质体混合后,转入293FT细胞中进行包 装并分离纯化病毒颗粒,(具体操作按pLenti6/V5 Directional TOPOCloning Kit 指导说明书进行);(2)将由质粒plenti-hTERT-EGFP及plenti-CMV-EGFP包装而来 的慢病毒颗粒分别与端粒酶阳性的:hLSEC细胞、结肠癌细胞(SW480)、人胚肾上 皮肿瘤细胞(293FT)、肝癌细胞(HepGII)、胃癌细胞(SGC7901)、黑色素瘤细胞 (B16)等,以及端粒酶表达阴性的人骨肉瘤细胞(U20S)、W38细胞、正常组织细胞 进行共同培养,48小时后,用激光共聚焦显微镜观察EGFP的表达。其结果见图9。

太阳城集团5.腺病毒颗粒的包装鉴定:(1)将负载心肌细胞特异性表达hTERT和neor的穿 梭质粒pdc315-MHCp-hTERT-IRES-neor与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaEl,3Cre共转 染人胚肾293细胞(HEK293);(2)当60%~80%的包装细胞出现变圆,并有部分细胞 开始出现脱壁的细胞病理现象(CPE)时,利用超声波将细胞破碎并离心分离,收集含 有病毒颗粒的上清液,包装得到的病毒颗粒命名为:Ad-MHCp-hTERT-IRES-neor,纯化 后进行病病毒颗粒测定、及双引物PCR鉴定。具体操作按元阳公司提供方法进行。此 方法得到的病毒滴度可达5×109VP/ml以上(注:如果OD260小于0.1则用氯化铯梯 度超高速离心浓缩病毒回收液后再测)。PCR鉴定MHC片段的引物为上游引物为 5’-CTAGGTCCTAACAGAC-3,下游引物为5’-TGTCTCTCCTAGATTC-3’(产物大小为247bp); 鉴定hTERT片段的引物为5’-TCTGGGATGCGAACGG-3’,下游引物为5’-ACGGATGGGTGGGA GTG-3’(产物大小为309bp).

6.心肌前体细胞的制备:从体重为150~200克健康2月龄SD大鼠,乙醚吸入麻 醉后,无菌条件下取下股骨和胫骨,用PBS冲洗干净后,除去骨端,暴露骨腔;用含 10%胎年血清的DMEM/F12(比例为1∶1)5毫升冲洗骨腔;用5毫升移液枪反复吹打 冲洗液,直到看不到凝块后,接种于50毫升细胞培养瓶中;继续培养24小时后,换 液去除不贴壁的细胞;继续37℃二氧化碳培养箱中培养至80%细胞呈融合状态;吸净 培养液,用0.25%胰蛋白酶室温消化细胞3~4分钟;加入15毫升含10%胎年血清的 DMEM/F12终止消化,用5毫升移液枪反复吹打细胞致悬浮状态后,接种于3个50毫 升细胞培养瓶中;37℃二氧化碳培养箱中培养20分钟后,轻轻地将末贴壁细胞悬液转 入另外的培养瓶中;重复此操作2遍后,于37℃二氧化碳培养箱中培养至细胞呈40%~ 60%融合状态;吸掉培养基,加入含终浓度为10uM的5-氮杂胞苷(5-Az),106~ 109pfu/ml腺病毒Ad-MHCp-hTERT颗粒,105~109VP/ml慢病毒pLenti-hTERTp-CD颗粒 的培养基,37℃二氧化碳培养箱中培养;72小时后,更换无5-Az的含终浓度为50ug/ml 的G418和2ug/ml的blasticidin的培养基进行双抗性筛选培养;以后,每换一次液, G418和杀稻瘟菌素的浓度增大50ug/ml,blasticidin浓度增大2ug/ml。最后,G418 最后将终浓度维持在400ug/ml,blasticidin终浓度维持在10ug/ml;当细胞传到10 代时,即可收集到用于梗死心肌修复治疗所需要的细胞,见附图7。并于手术移植前 用PBS溶液清洗掉抗生素。

太阳城集团7.移植辅助细胞的基因工程改造及制备:将生长状况良好的HLSEC接种于培养培 养板上,当细胞长至40~60%融合状态时,更换培养液,加入含终浓度为106~109VP/ml的慢病毒Lenti-CMVp-CD颗粒的培养基,37℃二氧化碳培养箱中培养72小时后, 将培养基更换为含有终浓度为10ug/ml的blasticidin的培养基进行抗性筛选培养。 筛选后得到的细胞进行克隆培养,经过传5~10代的抗性筛选培养后,进行CD药物敏 感实验。挑选对CD敏感的细胞克隆进行扩增培养,并于手术移植前用PBS溶液清洗。

8.细胞移植重建血管及修复梗死心肌的操作:(1)外科手术打开大鼠心肌梗塞 模型胸腔,暴露心脏,在心肌梗的区域内植入104~106个对CD敏感的HLSEC细胞(辅 助细胞),然后缝合胸腔(具体操作与大鼠心肌梗塞模型建立方法相同);(2)每天 肌肉注射1毫克环孢素A(GsA)以抑制大鼠对移植辅助细胞的免疫排斥反应;(3) 用B超或CT等,检测移植辅助细胞的生长,当移植辅助细胞植入点形成3~5毫米大 小的肿瘤灶时,用步骤(3)的方法植入105~108个本发明方法制备的源于BMSC的心 肌前体细胞。

太阳城集团9.药物清除受体内辅助细胞及瘤变的心肌前体细胞:细胞移植2~5周后,开始 每日静脉注射5-Fc三次,每次给药剂量为50~200mg/kg.体重,连续用药3~5天即 可达到清除HLSEC,以及癌变的心肌前体细胞的目的。

应用实施案例2:利用本发明组合物修复人类梗死心肌及血管重建

1.人类心肌细胞特异性表达hTERT和neor的腺病毒双顺反子的腺病毒穿梭质粒载 体制备:将序列表SEQID NO.1和SEQ ID NO.2中的启动子序列更换为人类MHC或 者MLC2v启动子序列,即可得到人类心肌细胞特异性表达hTERT和neor的腺病毒双顺 反子的腺病毒穿梭质粒载体。

2.人类心肌前体细胞的制备:抽取需进行移植术心梗患者5~10毫升骨髓后,按 照与“应用实施案例1”相同的方法进行人类心肌前体细胞的制备。

3.以后步骤与方法与“应用实施案例1”相同。

序列表

<110>重庆大学

<120>一种用于梗死心肌修复与血管重建的细胞移植组合物

太阳城集团<160>4

<170>PatentIn Version2.1

<210>1

太阳城集团<211>492

<212>DNA

<213>大鼠(rat)

<220>

<221>promoter

太阳城集团<222>(10)...(499)

太阳城集团<220>

<221>promoter

太阳城集团<222>(1)...(492)

<400>1

tgggaggaag aggccatgtc aattaaaaag cagttcaaac tgcctctgcc attttctgct  60

太阳城集团cagcatcctc tctttgagga atgcctttac ttatttttat tatggtattt aacttgggat  120

太阳城集团gttctgttct ccatacctgt acttctcaga aaaggaagac aaagtgtcaa aagtggcatt  180

tcaaaggctc cttcaccaga ctgaaagaat caagagacac ttggattaaa cagattctaa  240

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gccggctgcc ggcccaggga gcagctgggc tgactggcag tttgttttgc agccaactgt  480

太阳城集团tttgcagcca ac                                                      492

太阳城集团<210>2

太阳城集团<211>9066

太阳城集团<212>DNA

太阳城集团<213>腺病毒穿梭质粒载体

太阳城集团<220>

<221>promoter

太阳城集团<222>(461)...(951)

<400>2

ttcatcaata atatacctta ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt  60

tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg  120

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gtgcagcgcg gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg  1140

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太阳城集团gtgggccgcc agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac  1920

acgccttgtc ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag  1980

gagcagctgc ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg  2040

太阳城集团aggctcgtgg agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg  2100

太阳城集团ttgccccgcc tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg  2160

太阳城集团aaccacgcgc agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg  2220

gtcaccccag cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc  2280

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ggctccaggc acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg  2460

太阳城集团aagcatgcca agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg ggactgcgct  2520

太阳城集团tggctgcgca ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag  2580

gagatcctgg ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg  2640

tctttctttt atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag  2700

agtgtctgga gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg  2760

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ttaaaaatg  aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt  7560

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