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树木源异紫葳新甙II在防治神经退行性疾病上的应用.pdf

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树木 源异紫葳新甙 II 防治 神经 退行 性疾病 应用
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201310021757.4

申请日:

20130122

公开号:

太阳城集团CN103006677A

公开日:

20130403

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K31/7032,A61P25/28 主分类号: A61K31/7032,A61P25/28
申请人: 天津科技大学
发明人: 司传领,于国敬,任晓丹,徐光辉
地址: 300457 天津市滨海新区塘沽经济技术开发区13大街29号
优先权: CN201310021757A
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201310021757.4

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

树木天然活性成分异紫葳新甙II在防治神经退行性疾病上的应用。异紫葳新甙II是泡桐属树木的主要活性成分之一,其分子式为C29H36O16。实验证明,异紫葳新甙II对过氧化氢诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12的氧化应激损伤具有保护作用。因此,异紫葳新甙II可作为防治神经退行性疾病的药物,并可与可药用载体制成各种剂型。

权利要求书

1.异紫葳新甙II在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用,其特征在于:所述的异紫葳新甙II用于制备防治神经退行性疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域中树木天然活性成分异紫葳新甙II在防治神经退行性疾病上的应用。

背景技术

神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是指人体大脑和脊髓的细胞神经元发生退行性变化乃至丧失的疾病状态。大脑和脊髓由神经元组成,神经元有不同的功能,如控制运动,处理感觉太阳城集团,并作出决策。大脑和脊髓的细胞一般是不会再生的,所以过度的损害可能是毁灭性的、不可逆转的。神经退行性疾病是由神经元或其髓鞘的退行及丧失所致,随着太阳城集团的推移而恶化,导致功能障碍。该类疾病主要包括帕金森病(又称震颤麻痹,Parkinson’s disease)、阿尔茨海默氏病(又称老年性痴呆症,Alzheimer’s disease)、肌萎缩侧索硬化症肌(又称肉萎缩性脊髓侧索硬化症,Amyotrophic lateral sclerosis)、Huntington舞蹈病(Huntington disease)、脊髓肌萎缩症(Spinal muscular atrophy)、不同类型脊髓小脑共济失调(Spinal cerebellar ataxias)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy)等(张蕊等.细胞骨架与神经退行性疾病.《中国药理学通报》.2011,第27卷(第8期).1041-1044;石玥,梁晓春.槲皮素防治神经退行性疾病的机制研究进展.《中国中西医结合杂志》.2012,第32卷(第10期).1432-1435)。

太阳城集团全世界范围内,随着人口老龄化,神经退行性疾病,特别是阿尔茨海默氏病等疾病的发病率日益增高,已经成为全球医药卫生界的重大难题之一。长久以来,因为神经功能的复杂性,神经退行性疾病的预防和治疗一直是个难题。近年来,随着医学、药学等学科日新月异的迅猛发展,科学界对神经退行性疾病发病机理的研究有了新的突破,而且各种防治疗法和药物也层出不穷。然而,迄今为止,尚未有任何疗法和药物对神经退行性疾病的防治取得满意效果。因此,探寻行之有效的药物来减缓、抑制甚至是逆转神经细胞的退行病变,以防治神经退行性疾病已成为当务之急(Zuccato,et al.,From Target Identification to Drug Screening Assays for Neurodegenerative Diseases.《Pharmacological Research》.2005,第52卷(第3期),245-251)。

太阳城集团植物的天然产物中含有多种活性成分,这些活性成分疗效突出、毒副作用小或没有毒副作用,其中的很多活性成分已被开发成药物,在临床上广泛应用。因此,从植物的天然产物中筛选天然、安全、高效、低毒的预防和治疗神经退行性疾病的活性成分已经成为近年来国内外药物学界、生物学界、化学界等研究的重点课题(Essa,et al.,Neuroprotective Effect of Natural Products Against Alzheimer′s Disease.《Neurochemical Research》.2012,第37卷(第9期),1829-1842;Tavares,et al.,The Neuroprotective Potential of Phenolic-Enriched Fractions from Four Juniperus Species Found in Portugal.《Food Chemistry》.2012,第135卷(第2期),562-570)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种异紫葳新甙II作为预防和治疗各种神经退行性疾病的药物的应用。

异紫葳新甙II(Isocampneoside II),黄色粉末,分子式为C29H36O16,系统命名为R,S-α-(3,4-dihydroxyphenyl)-ethyl-O-α-L-rhamnopyranosyl(1”→3’)-β-D-(6’-O-caffeoyl)-glucopyr anoside。其熔点为153-154℃,旋光度(c,0.0025,甲醇),溶于甲醇、乙醇。异紫葳新甙II是一个差向异构体化合物,其化学结构式如图1所示。

异紫葳新甙II是玄参科(Scrophulariaceae)泡桐属(Paulownia)落叶乔木毛泡桐(原变种)(Paulownia tomentosa var.tomentosa)、毛泡桐(Paulownia tomentosa)及Paulownia coreana的主要活性成分之一。研究表明,异紫葳新甙II具有显著的抗氧化、抗菌、抗醛糖还原酶(即防治糖尿病并发症)活性(司传领等.泡桐(原变种)果实中抑菌性苯丙素苷成分的研究.《林产化学与工业》.2007,第27卷增刊,37-40;Kim,et al.Inhibition of Aldose Reductase by Phenylethanoid Glycoside Isolated from the Seeds of Paulownia coreana.《Biological and Pharmaceutical Bulletin》.2011,第34卷160-163;Si,et al.,Activity-guided Screening of the Antioxidants from Paulownia tomentosa var.tomentosa Bark.《Bioresources》.2013,第8卷(第1期),628-637)。但迄今为止,尚未见异紫葳新甙II单体成分防治任何神经退行疾病活性的研究报道。

本发明提出的异紫葳新甙II作为防治各种神经退行疾病的药物组合,该药物组合物包括活性成分异紫葳新甙II及可药用的载体。

本发明还提出上述药物组合物的制备方法,该方法包括异紫葳新甙II和可药用的载体溶解或混合。

附图说明

图1为异紫葳新甙II的化学结构式。

图2为异紫葳新甙II对正常PC12细胞存活率的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

图3为异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞存活率的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

太阳城集团图4为异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞MDA水平的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

图5为异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞SOD活性的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

太阳城集团图6为异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞氧化氢酶活性的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

太阳城集团图7为异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞内活性氧积累的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

图8为异紫葳新甙II对H2O2诱导PC12细胞凋亡的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

图9为异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞内Bcl-2和Bax mRNA表达的影响。其中,数据皆以均数±标准差表示(n=3),同颜色图型标有相同上标表示差异不显著(P>0.05),ICD为异紫葳新甙II的英文Isocampneoside的缩写。

具体实施方式

太阳城集团参考下列实施例将更容易、更全面地理解本发明,给出实施例是为了阐明本发明,而不是以任何方式限制本发明。

实施例1:

太阳城集团异紫葳新甙II的制备

太阳城集团(1)以洗净、阴干、粉碎至粒度为60目的毛泡桐(原变种)的木质部为原料,按质量比为1∶4加入体积百分浓度为95%的乙醇水溶液,在40℃以索氏提取4次,每次12h,过滤,滤液减压浓缩至原体积的5%,得到毛泡桐(原变种)木质部粗提物的浓缩液;

太阳城集团(2)加入浓缩液质量2倍的水,搅拌,加入浓缩液质量2倍的正己烷重复萃取3次,分离得正己烷萃取剩余相,向正己烷萃取剩余相加入浓缩液质量2倍的二氯甲烷重复萃取3次,分离得二氯甲烷萃取剩余相,向二氯甲烷萃取剩余相加入浓缩液质量2倍的正丁醇重复萃取3次,分离得正丁醇萃取相,将正丁醇萃取相减压浓缩、冷冻干燥,得到毛泡桐(原变种)木质部的正丁醇萃取相粉末;

(3)取毛泡桐(原变种)木质部的正丁醇萃取相粉末进行常压硅胶柱层析,流动相采用体积比起始浓度为6∶1终止浓度为2∶1的二氯甲烷∶丙酮溶液梯度洗脱,得到A、B、C三个流分;对流分B进行常压Sephadex LH-20凝胶柱层析,以体积比为2∶1的甲醇∶水溶液为流动相,得到B1、B2、B3三个流分;分别以体积比为1∶1的乙醇∶正己烷溶液及体积比为1∶3的甲醇∶水溶液为洗脱液对B2流分连续进行常压Sephadex LH-20凝胶柱层析得到异紫葳新甙II。

实施例2:

太阳城集团异紫葳新甙II对过氧化氢H2O2诱导PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)氧化应激损伤的保护作用

太阳城集团(1)PC12细胞的培育

太阳城集团PC12细胞在含有5%FBS、10%HS、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI1640培养基中于37℃5%CO2孵箱中培养。

太阳城集团(2)异紫葳新甙II对正常PC12细胞存活率的影响

以MTT法测定以不同浓度(0、6.25、12.5、25、50及100μg/ml)异紫葳新甙II处理24h后的PC12细胞的存活率。其结果如图2所示,相比于未经异紫葳新甙II处理的对比组,各组PC12细胞的相对存活率几乎为100%,即异紫葳新甙II对H2O2未诱导的正常PC12细胞几乎没有毒性影响。

(3)异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞存活率的影响

以不同浓度(0、6.25、12.5、25、50及100μg/ml)的异紫葳新甙II处理PC12细胞30min,然后用0.5mM H2O2诱导6h。以MTT法判断异紫葳新甙II对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护活性,其存活率如图3所示。结果表明,相比于对比组(未经异紫葳新甙II和H2O2处理的PC12细胞组),用0.5mM H2O2诱导6h后,PC12细胞存活率下降到41.03±1.71%,而在6.25,12.5,25及50μg/ml的异紫葳新甙II保护下,PC12细胞存活率分别升高到58.73±0.90%,78.80±1.14%,89.42±3.25%和91.97±6.41%,即异紫葳新甙II预处理可以拮抗H2O2诱导的PC12细胞的损伤,提高细胞的存活率。

(4)异紫葳新甙II对H2O2诱导PC12细胞内MDA水平、SOD活性及氧化氢酶活性的影响

太阳城集团将PC12细胞按每孔6×105个细胞接种到6孔培养板上以4ml培养基孵育16h,再以不同浓度(0、6.25、12.5、25及50μg/ml)的异紫葳新甙II处理后继续培养30min,再以0.5mM H2O2诱导6h。然后以分光光度法确定PC12细胞的MDA水平、SOD活性和过氧化氢酶活性,试验结果如图4、图5及图6所示。结果表明,异紫葳新甙II能显著降低H2O2诱导的PC12细胞的MDA水平,可以显著增加SOD及过氧化氢酶活性,即异紫葳新甙II预处理可以明显的抑制过氧化氢诱导PC12细胞损伤。

(5)异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞内活性氧积累的影响

将PC12细胞按每孔1×105个细胞接种到6孔培养板上以2ml培养基孵育16h,再以不同浓度(0、12.5及25μg/ml)的异紫葳新甙II处理后继续培养30min,再以0.5mM H2O2诱导6h,将细胞破碎后以PBS洗3遍,加入20μM DCFH-DA在37℃下避光孵育处理30min。用流式细胞仪进行细胞内活性氧的测定,激发光波长为498nm,检测波长为522nm。结果显示,0.5mM H2O2诱导6h使细胞内ROS水平增加到276.00±1.20%,而异紫葳新甙II预处理则可以明显降低H2O2诱导PC12细胞内的ROS的产生,进一步说明异紫葳新甙II预处理对PC12细胞损伤起到了较好的防治作用。

太阳城集团(6)异紫葳新甙II对H2O2诱导PC12细胞凋亡的影响

用PI单染流式细胞仪分析可直接观察DNA含量,凋亡细胞DNA荧光强度降低,在正常细胞的G0/G1峰前出现一个小于DNA二倍体含量的亚二倍体峰,称为凋亡峰,根据凋亡峰计算细胞凋亡率。将PC12细胞按每孔1×105个细胞接种到6孔培养板上以2ml培养基孵育16h,再以不同浓度(0、12.5及25μg/ml)的异紫葳新甙II处理后继续培养30min,再以0.5mM H2O2诱导6h。结果显示,PC12细胞经H2O2诱导6h后,凋亡细胞百分率达10.03±2.58%,而正常对照组凋亡细胞百分率为0.67±0.12%,12.5和25μg/ml异紫葳新甙II预处理30min后再用H2O2诱导6h,则PC12细胞的凋亡百分率分别下降到5.75±1.32%和3.60±0.65%。这表明异紫葳新甙II能显著抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡,可对神经退行性疾病起到防治作用。

(7)异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞内Bcl-2和Bax mRNA表达的影响

太阳城集团将PC12细胞按每孔3×106个细胞接种到60mm培养皿中以4ml培养基孵育16h,再以不同浓度(0、12.5及25μg/ml)的异紫葳新甙II处理后继续培养30min,再以0.5mM H2O2诱导6h。然后以逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测Bcl-2及Bax mRNA表达水平。研究结果显示,在正常PC12细胞Bcl-2、Bax mRNA呈一定水平表达,用0.5mM H2O2处理后Bcl-2表达量明显降低,Bax表达量明显升高,而异紫葳新甙II预处理PC12细胞的Bcl-2表达量增加,Bax mRNA表达量降低,因而Bcl-2/Bax二者比值增高,表明异紫葳新甙II对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的保护作用是通过在转录及翻译水平调节Bcl-2和Bax mRNA的表达实现。

实施例3:

异紫葳新甙II注射液的制备

称取10g异紫葳新甙II,顺次加入乙醇和丙二醇各1000ml,混合均匀至溶解,加入氯化钠500g后再加入注射用水至50000ml,调节pH值,搅拌均匀,过滤除菌后分装,每瓶50ml,灌封,紫外灭菌,得到防治神经退行性疾病的异紫葳新甙II注射液。

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