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一种百合种球脱毒方法.pdf

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一种 百合 脱毒 方法
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摘要
申请专利号:

CN201610268132.1

申请日:

20160427

公开号:

太阳城集团CN105941143B

公开日:

20180529

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A01H4/00 主分类号: A01H4/00
申请人: 江西绿百合生态农业开发有限公司,井冈山大学
发明人: 邹声达,邹先佼,邹先佑,吴政元,吴杨,李晓红,胡雪华,贺根和,张美凤
地址: 331509 江西省吉安市永丰县藤田镇中西山村
优先权: CN201610268132A
专利代理机构: 北京得信知识产权代理有限公司 代理人: 袁伟东
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201610268132.1

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种百合种球脱毒方法,包括以下步骤:(1)将百合种球在3‑8℃放置40‑50天;(2)选取芽长为4‑8cm的百合种球,剥去外层鳞片,留3‑5个内层鳞片的鳞茎盘,将鳞茎盘放入培养箱中进行预处理,预处理条件为:光照强度1500‑2000Lux,温度35‑40℃,处理太阳城集团2‑5天;(3)选择生长正常的鳞茎盘,剥取0.4‑0.7cm的茎尖移入分化培养基中,先在23‑25℃下暗培养1‑2天,然后移入光照培养箱中,光照强度为1500‑2000Lux,光照太阳城集团为12‑16小时/天,并以1‑5℃/d的速度升温,温度升至35‑45℃后,保持该温度培养35‑45天。本发明将热处理和化学处理结合脱除百合种球病毒,不仅缩短了诱导培养周期,还具有脱毒率高,增值系数高等特点,为培育百合无病毒植株,推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。

权利要求书

1.一种百合种球脱毒方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将百合种球在3-8℃放置40-50天;(2)选取芽长为4-8cm的百合种球,剥去外层鳞片,留3-5个内层鳞片的鳞茎盘,将鳞茎盘放入培养箱中进行预处理,预处理条件为:光照强度1500-2000Lux,温度35-40℃,处理太阳城集团2-5天;(3)选择预处理后生长正常的鳞茎盘,剥取0.4-0.7cm的茎尖移入分化培养基中,先在23-25℃下暗培养1-2天,然后移入光照培养箱中,光照强度为1500-2000Lux,光照太阳城集团为12-16小时/天,并以1-5℃/天的速度升温,温度升至35-45℃后,保持该温度培养35-45天;所述的分化培养基的配方为:MS培养基+6-BA1.2-1.8mg/L+NAA0.35-0.65mg/L+抗病毒剂5-15mg/L;所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍混合而成,所述二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍的质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组培快繁技术和生物技术领域,具体涉及一种百合种球脱毒方法。

背景技术

太阳城集团百合是单子叶植物纲百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)的总称,为多年生宿根草本花卉。百合属在世界上有90余种,原产我国的约有47种,占世界总数的51%。百合栽培品种繁多,其花朵硕大,色彩丰富,花姿优美,既能作切花、盆花,又能在园林绿地中应用,且大多数百合可以食用,是上等的滋补佳品。百合素有“百年好合”之意,深受人们的喜爱。百合主要分布在中国、日本、北美和欧洲等温带地区,我国近年来的百合切花生产发展较快,在昆明、上海、深圳已形成三大生产基地。但其繁殖主要还是采用常规分球、分珠芽鳞片扦插,鳞片包埋等繁殖的方式。长期的无性繁殖使百合体内逐渐积累大量病毒致使百合患病毒病,影响百合的产量和质量。

在已报道的十余种侵染百合的病毒中,发生最为普遍,危害最为严重的病毒有3种:黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV),它们常表现为复合侵染,造成植株的茎、叶或花出现斑驳或畸形,严重的导致植株矮小、退化甚至死亡,而且随着病毒的传播,常导致百合大面积感病,严重影响了百合鲜切花的产量和品质。

龙牙百合的产业化生产,种球繁殖是关键。在百合规模化种植中,我国百合种球繁殖尚处于探索阶段,繁殖方法可分为有性繁殖(种子繁殖)和无性繁殖两种。其中有性繁殖因为繁殖周期需要3-4年,因为多数百合杂种系不易结实,而且百合繁殖的后代容易发生变异,不能完全保持原品种的优良性状,所以在实际生产中,百合较少用有性繁殖,而以无性繁殖为主。其中无性繁殖主要采取的繁殖方式包括茎生小鳞茎繁殖、珠芽繁殖、鳞片扦插繁殖和组织培养等。茎生小鳞茎繁殖获得的种球质量好,但繁殖系数低;珠芽繁殖形成商品球的太阳城集团较长,一般要经过2-3年;鳞片扦插繁殖成本低、操作方便,且繁殖系数高,是快速繁殖百合的有效方法。小鳞茎、珠芽、鳞片扦插的无性繁殖方法,均导致后代容易积累病毒,品种退化现象十分严重。

植物组织培养技术在以无性繁殖为主的植物上应用广泛,技术也相对成熟。采用组织培养快繁龙牙百合,可在短太阳城集团内获得大量保持原有品种优良性状的优质种苗,如能推行组织培养工厂化育苗,还能产生显著的经济效益。目前,针对龙牙百合组织培养快繁的专利还未见报道,文献研究也主要集中在以获得种苗形式的组织培养上,对种球形式的组织培养产品研究较少,对于生长于地下的龙牙百合鳞茎,带菌多,外植体消毒十分困难,存在污染率较高的问题仍未得到较好的解决。

百合病毒进行检测的方法主要有指示植物法、电镜检测法、血清学方法等,1990年以来,国外逐渐开展了针对百合病毒的RT-PCR检测技术研究。RT-PCR技术用于百合病毒检测在便捷性、灵敏度、特异性等方面均优于上述几种方法。而在传统RT-PCR基础上发展起来的多重RT-PCR技术,因其快速、灵敏、特异性强、操作简单等优点(Bertolini et al.,2001;Nie and Singh,2001),近年来在百合病毒检测方面得到了一定的研究。多重RTPCR又称复RT-PCR,指将多对引物加入到一个反应体系中,同时扩增多个序列。应用该技术可以一次检测多种病毒。

太阳城集团目前国际上阻断病毒传播获得脱毒苗的基本方法有:茎尖培养、珠芽培养、化学处理、热处理。

太阳城集团因此建立简便易行、脱毒率高的脱毒体系是减少病毒对百合的危害、恢复种性的关键问题之一。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足,本发明所要解决的技术问题是提供一种百合种球脱毒方法。

太阳城集团本发明目的是通过如下技术方案实现的:

太阳城集团一种百合种球脱毒方法,包括以下步骤:

(1)将百合种球在3-8℃放置40-50天;

太阳城集团(2)选取芽长为4-8cm的百合种球,剥去外层鳞片,留3-5个内层鳞片的鳞茎盘,将鳞茎盘放入培养箱中进行预处理,预处理条件为:光照强度1500-2000Lux,温度35-40℃,处理太阳城集团2-5天;

(3)选择预处理后生长正常的鳞茎盘,剥取0.4-0.7cm的茎尖移入分化培养基中,先在23-25℃下暗培养1-2天,然后移入光照培养箱中,光照强度为1500-2000Lux,光照太阳城集团为12-16小时/天,并以1-5℃/天的速度升温,温度升至35-45℃后,保持该温度培养35-45天。

优选地,所述的分化培养基的配方为:MS培养基+6-BA1.2-1.8mg/L+NAA 0.35-0.65mg/L+抗病毒剂5-15mg/L。

优选地,所述的抗病毒剂为二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍中一种或多种的混合物。

更优选地,所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍混合而成,所述二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍的质量比为(1-3):(1-3):(1-3)。

具体的,在本发明中:

MS培养基的成份:

(1)大量元素:NH4NO3 1.65g/L、KNO3 1.90g/L、KH2PO4 0.17g/L、MgSO4·7H2O 0.37g/L、CaCl2(2H2O)0.44g/L;

(2)微量元素:MgSO4·4H2O 22.3mg/L、N3BO3 6.2mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.25g/L、CuSO4·5H2O 0.025mg/L、CoCl·6H2O 0.025mg/L、FeSO47H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA,37.3mg/L;

太阳城集团(3)有机成分:肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、L-甘氨酸2mg/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 0.1mg/L;

(4)蔗糖30g/L;

(5)琼脂12g/L。

太阳城集团6-BA,即6-苄氨基腺嘌呤,CAS号:1214-39-7。

NAA,即1-萘乙酸,CAS号:86-87-3。

太阳城集团二氢尿嘧啶,CAS号:504-07-4。

2-硫脲嘧啶,CAS号:141-90-2。

盐酸吗啉胍,CAS号:3160-91-6。

本发明百合种球脱毒方法,将热处理和化学处理结合脱除百合种球病毒,不仅缩短了诱导培养周期,还具有脱毒率高,增值系数高等特点,为培育百合无病毒植株,推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。

实施例1

百合种球脱毒方法,包括以下步骤:

太阳城集团(1)将百合种球(品种为西伯利亚,Siberia)在4℃放置45天;

(2)选取芽长为5cm的百合种球,剥去外层鳞片,留4个内层鳞片的鳞茎盘,将鳞茎盘放入培养箱中进行预处理,预处理条件为:光照强度1600Lux,温度38℃,处理太阳城集团3天;

(3)选择预处理后生长正常的鳞茎盘,剥取0.6cm的茎尖移入分化培养基中,先在24℃下暗培养1天(即在24℃黑暗无光的条件下放置1天),然后移入光照培养箱中,光照强度为1500Lux,光照太阳城集团为12小时/天,移入培养箱中第1天温度为24℃,并以2℃/天的速度升温,温度升至36℃后,以36℃培养35天。

太阳城集团所述的分化培养基的配方为:MS培养基+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+抗病毒剂9mg/L。

所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍按质量比为1:1:1混合而成。

实施例2

太阳城集团与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述的抗病毒剂由2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍按质量比为1:1混合而成。

实施例3

与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、盐酸吗啉胍按质量比为1:1混合而成。

实施例4

太阳城集团与实施例1基本相同,区别仅仅在于:所述的抗病毒剂由二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶按质量比为1:1混合而成。

实施例5

与实施例1基本相同,区别仅仅在于,所述步骤(3)为:选择生长正常的鳞茎盘,剥取0.6cm的茎尖移入分化培养基中,先在24℃下放置1天,然后移入光照培养箱中,光照强度为1500Lux,光照太阳城集团为12小时/天,并保持温度为24℃培养30天。

实施例6

与实施例1基本相同,区别仅仅在于,所述步骤(3)为:选择生长正常的鳞茎盘,剥取0.6cm的茎尖移入分化培养基中,先在24℃下放置1天,然后移入光照培养箱中,光照强度为1500Lux,光照太阳城集团为12小时/天,并保持温度为30℃培养30天。

实施例7

与实施例1基本相同,区别仅仅在于,所述步骤(3)为:选择生长正常的鳞茎盘,剥取0.6cm的茎尖移入分化培养基中,先在24℃下放置1天,然后移入光照培养箱中,光照强度为1500Lux,光照太阳城集团为12小时/天,并保持温度为36℃培养30天。

测试例1

太阳城集团将实施例1-7中步骤(3)的茎尖在分化培养基中成活率进行统计。具体测试结果见表1。

表1:成活率结果表

太阳城集团 成活率,% 实施例1 93 实施例2 86 实施例3 89 实施例4 87 实施例5 88 实施例6 91 实施例7 82

比较实施例1和实施例2-4,实施例1(二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍复配)成活率明显高于实施例2-4(二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍中任意二者复配)。比较实施例1与实施例5-7,实施例1(采用以2℃/天的速度升温)成活率明显高于于实施例2-4(保持恒定温度)。

测试例2

太阳城集团将实施例1-7中培养得到的茎尖脱毒率进行测试。

利用多重RT-PCR检测百合三种病毒(百合无症病毒、黄瓜花叶病毒、百合斑驳病毒)具体参照陈进等发表在《农业生物技术学报》上的文献《百合三种主要病毒的RT-PCR检测及脱毒技术研究》中的方法。脱毒率结果见表2。

表2:三种病毒脱毒率结果表

太阳城集团比较实施例1和实施例2-4,实施例1(二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍复配)三种病毒脱毒率明显高于实施例2-4(二氢尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、盐酸吗啉胍中任意二者复配)。比较实施例1与实施例5-7,实施例1(采用以2℃/天的速度升温)三种病毒脱毒率明显高于于实施例2-4(保持恒定温度)。

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