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一种甘蔗无菌外植体的获取方法.pdf

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一种 甘蔗 无菌 外植体 获取 方法
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201610232287.X

申请日:

20160413

公开号:

CN105875409B

公开日:

20180529

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A01H4/00 主分类号: A01H4/00
申请人: 广东省农业科学院作物研究所
发明人: 王继华,曹干,吕冰
地址: 510640 广东省广州市天河区五山路金颖西二街18号
优先权: CN201610232287A
专利代理机构: 广州市越秀区哲力专利商标事务所(普通合伙) 代理人: 谭启斌
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610232287.X

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明提供了一种甘蔗无菌外植体的获取方法,包括以下步骤:1)选取甘蔗植株,自肥厚带向下35‑45cm处的地方砍断,取甘蔗尾稍段,记为第一甘蔗茎段;2)去除第一甘蔗茎段肥厚带以上的叶片后,自肥厚带起向下选取20‑35cm的甘蔗茎段,记为第二甘蔗茎段;3)剥掉第二甘蔗茎段的叶片,直至剩下肥厚带叶和肥厚带叶以下第一叶为止,得到第三甘蔗茎段;4)用70%‑75%的酒精擦拭第三甘蔗茎段的表面2‑5次,剥掉肥厚带叶以下第一叶,得到第四甘蔗茎段;5)用70%‑75%的酒精擦拭第四甘蔗茎段的表面2‑5次,剥掉肥厚带叶,得到甘蔗无菌外植体。该方法简便,效率高,能够有效简化甘蔗组培程序,满足生产需要。

权利要求书

1.一种甘蔗无菌外植体的获取方法,其特征在于,包括以下步骤:1)选取甘蔗植株,自肥厚带向下35-45cm处的地方砍断所选取的甘蔗植株,取甘蔗尾稍段,记为第一甘蔗茎段,所述第一甘蔗茎段的长度为40cm;2)去除第一甘蔗茎段肥厚带以上的叶片后,自肥厚带起向下选取20-35cm的甘蔗茎段,记为第二甘蔗茎段,所述第二甘蔗茎段的长度为30cm;3)剥掉第二甘蔗茎段的叶片,直至剩下肥厚带叶和肥厚带叶以下第一叶为止,得到第三甘蔗茎段;4)用完全浸润了70%的酒精棉球擦拭第三甘蔗茎段的表面2次后,剥掉肥厚带叶以下第一叶,得到第四甘蔗茎段;5)在超净工作台中,用完全浸润了70%的酒精棉球擦拭第四甘蔗茎段的表面2次后,用无菌镊子剥掉肥厚带叶后,切除第四甘蔗茎段的生长点,得到甘蔗无菌外植体。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域,具体涉及一种甘蔗无菌外植体的获取方法。

背景技术

随着生物技术的发展,植物组织培养技术日趋成熟,在农业上的应用也越来越广泛。目前众多的植物都已经通过组织培养进行快速繁殖。甘蔗(Saccharum)既是一种重要的糖料作物也是一种生物质能源作物。甘蔗糖占我国食糖总量的90%以上,甘蔗也是生产乙醇的最佳能源作物。自上世纪70年代,组织培养技术就开始应用于甘蔗培植上,它在甘蔗种苗快速繁殖和脱毒种苗的生产上起着重要的作用。甘蔗系无性繁殖,繁殖系数低,利用组织培养技术,甘蔗能够在短期内大量繁殖,满足种苗在生产上的需求。随着种植年限的延长,甘蔗受到多种病害的侵染,导致品种退化,利用组培技术能够提纯复壮品种。

太阳城集团外植体的消毒是植物组织培养的第一步,也是最为关键的一步,直接关系到试验的成败。现有技术中外植体消毒发一般包括氧化汞消毒法和酒精浸泡法。

氧化汞消毒法,氯化汞是目前植物组织培养中常用的消毒物质。甘蔗外植消毒一般采用氯化汞浸泡的方法,首先在0.1-0.3%的氯化汞溶液中浸泡8-10分钟,再用无菌水清洗3次以上。该方法步骤繁琐,耗时长,同时氯化汞是剧毒物质,对外植体伤害比较严重,容易导致外植体死亡,丢弃的废液也容易造成环境污染。

酒精浸泡法,该方法利用酒精浸泡甘蔗外植体,相比氧化汞消毒法,酒精浸泡法同样需要用无菌水冲洗材料,比较费时和繁琐。

发明内容

太阳城集团本发明为了避免现有技术的不足之处而提供了一种甘蔗无菌外植体的获取方法,该方法简便,效率高,能够有效简化甘蔗组培程序,满足生产需要。

根据本发明所提供的一种甘蔗无菌外植体的获取方法,包括以下步骤:

1)选取甘蔗植株,自肥厚带向下35-45cm处的地方砍断所选取的甘蔗植株,取甘蔗尾稍段,记为第一甘蔗茎段;

太阳城集团2)去除第一甘蔗茎段肥厚带以上的叶片后,自肥厚带起向下选取20-35cm的甘蔗茎段,记为第二甘蔗茎段;

3)剥掉第二甘蔗茎段的叶片,直至剩下肥厚带叶和肥厚带叶以下第一叶为止,得到第三甘蔗茎段;

4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗茎段的表面2-5次后,用无菌镊子剥掉肥厚带叶以下第一叶,得到第四甘蔗茎段;

5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗茎段的表面2-5次后,用无菌镊子剥掉肥厚带叶,得到甘蔗无菌外植体。

太阳城集团优选地,步骤1)中,所述第一甘蔗茎段的长度为40cm。

太阳城集团优选地,步骤2)中,所述第二甘蔗茎段的长度为30cm。

优选地,步骤4)中,用70%酒精擦拭第三甘蔗茎段的表面2次。

太阳城集团优选地,步骤4)中,用完全浸润了70%-75%的酒精棉球擦拭第三甘蔗茎段的表面。

太阳城集团优选地,步骤5)中,用70%酒精擦拭第四甘蔗茎段的表面2次。

优选地,步骤5)中,用完全浸润了70%-75%的酒精棉球擦拭第四甘蔗茎段的表面。

优选地,步骤5)在超净工作台中进行操作。

优选地,步骤5)中,还包括切除生长点;用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗茎段的表面2-5次,用无菌镊子剥掉肥厚带叶后,切除第四甘蔗茎段的生长点,得到甘蔗无菌外植体。

太阳城集团为了更好地展示本发明所提供的技术方案,下面对甘蔗叶片作简单的陈述。甘蔗的叶包括鞘基、叶梢、叶耳、叶舌、肥厚带(又称叶环)、叶中脉和叶片。肥厚带叶又称“+1叶”,肥厚带叶的上一叶为“-1叶”,肥厚带叶以下第1叶为“+2叶”,肥厚带叶以下第2叶为“+3叶”,依次类推。

本发明所提供的技术方案可以包括以下有益效果:

太阳城集团(1)本发明所提供的甘蔗无菌外植体的获取方法,选取甘蔗尾稍为外植体,经过70%酒精进行表面擦拭消毒,获得无菌外植体。甘蔗外植体消毒的方法效率高,整个过程能够在10分钟内完成,成功率可达到95%以上,完全满足后续开展甘蔗组织培养的要求。乙醇的使用不仅节约了成本,而且减少了重金属所带来的环境污染问题。该方法操作步骤简单,节约生产太阳城集团,对环境和操作者都无毒,本技术可以用于甘蔗健康种苗的无菌培养,甘蔗转基因愈伤组织的获得。

太阳城集团(2)本发明所提供的甘蔗无菌外植体的获取方法,使用酒精作为消毒液,酒精价格便宜且无毒,节约成本,无毒的酒精不会对甘蔗外植体带来伤害,也不会对生产者造成危害,不污染环境。

太阳城集团(3)本发明所提供的甘蔗无菌外植体的获取方法,还可以用于甘蔗转基因育种研究中外植体的获得,为今后的开展相关研究提供技术基础。

附图说明

太阳城集团图1为本发明实施例1所提供的新台糖22号无菌外植体的示意图;

图2为本发明实施例2所提供的新台糖20号无菌外植体的示意图;

图3为本发明实施例3所提供的黑皮果蔗无菌外植体培养后的愈伤组织示意图;

太阳城集团图4为本发明实施例1所提供的新台糖22号再生植株的示意图;

太阳城集团图5为本发明实施例2所提供的新台糖20号再生植株的蔗苗示意图;

太阳城集团图6为本发明实施例3所提供的黑皮果蔗无菌外植体培养后的蔗苗示意图。

具体实施方式

下面,结合附图及具体实施方式,对本发明做进一步描述:

太阳城集团一种甘蔗无菌外植体的获取方法,包括以下步骤:

太阳城集团1)选取甘蔗植株,自肥厚带向下35-45cm处的地方砍断所选取的甘蔗植株,取甘蔗尾稍段,记为第一甘蔗茎段;

太阳城集团2)去除第一甘蔗茎段肥厚带以上的叶片后,自肥厚带起向下选取20-35cm的甘蔗茎段,记为第二甘蔗茎段;

3)剥掉第二甘蔗茎段的叶片,直至剩下肥厚带叶和肥厚带叶以下第一叶为止,得到第三甘蔗茎段;

4)用70%-75%的酒精擦拭第三甘蔗茎段的表面2-5次后,用无菌镊子剥掉肥厚带叶以下第一叶,得到第四甘蔗茎段;

5)用70%-75%的酒精擦拭第四甘蔗茎段的表面2-5次后,用无菌镊子剥掉肥厚带叶,得到甘蔗无菌外植体。

实施例1

一种甘蔗无菌外植体的获取方法,所采用的甘蔗茎段选自田间种植的健康生长甘蔗,其品种为新台糖22号。依次包括如下步骤:

太阳城集团1、在天气晴朗时,选取田间种植的甘蔗植株,在距离肥厚带约40cm处砍断,取甘蔗尾稍段,记为第一甘蔗茎段;

2、将第一甘蔗茎段肥厚带以上的叶片剪断,以肥厚带为顶端,截取30cm的甘蔗茎段,记为第二甘蔗茎段;

3、逐层剥掉第二甘蔗茎段的叶片,直至剩下肥厚带叶(+1叶)和肥厚带叶以下第一叶(+2叶)为止,得到第三甘蔗茎段;

4、用浸润了浓度为70%的酒精的棉球对第三甘蔗茎段进行表面擦拭消毒,用灭菌后的镊子剥离肥厚带叶以下第一叶(+2叶),得到第四甘蔗茎段;

太阳城集团5、在超净工作台中,继续用浸润了浓度为70%的酒精的棉球对第四甘蔗茎段进行表面擦拭消毒,用灭菌后的镊子剥离肥厚带叶(+1叶),用灭菌后的手术刀切掉第四甘蔗茎段的生长点,即获得了新台糖22号无菌外植体,切碎后接种到培养基上。

如图1所示,为实施1获取的新台糖22号的无菌外植体,经过培养后,其存活率为96%,存活率高,且长势良好(见图4)。

实施例2

太阳城集团一种甘蔗无菌外植体的获取方法,所采用的甘蔗茎段选自田间种植的健康生长甘蔗,其品种为新台糖20号。依序包括如下步骤:

1、在天气晴朗时,选取田间种植的甘蔗植株,在距离肥厚带约40cm处砍断,取甘蔗尾稍段,记为第一甘蔗茎段;

2、将第一甘蔗茎段肥厚带以上的叶片剪断,以肥厚带为顶端,截取30cm的茎段,记为第二甘蔗茎段;

3、逐层剥掉第二甘蔗茎段的叶片,直至剩下肥厚带叶(+1叶)和肥厚带叶以下第一叶(+2叶)为止,得到第三甘蔗茎段;

4、用浸润了浓度为70%的酒精的棉球对第三甘蔗茎段进行表面擦拭消毒,用灭菌后的镊子剥离肥厚带叶以下第一叶(+2叶),得到第四甘蔗茎段;

太阳城集团5、在超净工作台中,继续用浸润了浓度为70%的酒精的棉球对第四甘蔗茎段进行表面擦拭消毒,用灭菌后的镊子剥离肥厚带叶(+1叶),用灭菌后的手术刀切掉第四甘蔗茎段的生长点,即获得了新台糖20无菌外植体,切碎后接种到培养基上。

如图2所示,为实施2获取的新台糖20号的无菌外植体,经过培养后,其存活率为98%,存活率高,且长势良好(见图5)。

实施例3

一种甘蔗无菌外植体的获取方法,所采用的甘蔗茎段选自田间种植的健康生长甘蔗,其品种为黑皮果蔗。依序包括如下步骤:

太阳城集团1、在天气晴朗时,取田间种植的甘蔗植株,在距离肥厚带约40cm处砍断,取甘蔗尾稍段,记为第一甘蔗茎段;

2、将第一甘蔗茎段肥厚带以上的叶片剪断,以肥厚带为顶端,截取30cm的甘蔗茎段,记为第二甘蔗茎段;

3、逐层剥掉第二甘蔗茎段的叶片,直至剩下肥厚带叶(+1叶)和肥厚带叶以下第一叶(+2叶)为止,得到第三甘蔗茎段;

太阳城集团4、用浸润了浓度为70%的酒精的棉球对第三甘蔗茎段进行表面擦拭消毒,用灭菌后的镊子剥离肥厚带叶以下第一叶(+2叶),得到第四甘蔗茎段;

太阳城集团5、在超净工作台中,继续用浸润了浓度为70%的酒精的棉球对第四甘蔗茎段进行表面擦拭消毒,用灭菌后的镊子剥离肥厚带叶(+1叶),用灭菌后的手术刀切掉第四甘蔗茎段的生长点,即获得了黑皮果蔗无菌外植体,可以切碎后接种到培养基上。

如图3所示,为实施3获取的黑皮果蔗的无菌外植体,经过培养后,其存活率为98%,存活率高,且长势良好(见图6)。

对本领域的技术人员来说,可根据以上描述的技术方案以及构思,做出其它各种相应的改变以及形变,而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

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