太阳城集团

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一种中药组合物及其制剂和制备方法.pdf

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一种 中药 组合 及其 制剂 制备 方法
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摘要
申请专利号:

CN201310058428.7

申请日:

20130225

公开号:

CN103070949A

公开日:

20130501

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A61K36/744,A61K9/16,A61P1/12,A61P1/00,A61P31/14,A61P31/04,A61P37/04 主分类号: A61K36/744,A61K9/16,A61P1/12,A61P1/00,A61P31/14,A61P31/04,A61P37/04
申请人: 西南大学
发明人: 刘娟,朱兆荣,罗艺晨,刘俊玮,凌榕镔
地址: 400715 重庆市北碚区天生路1号
优先权: CN201310058428A
专利代理机构: 北京同恒源知识产权代理有限公司 代理人: 赵荣之
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201310058428.7

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明公开了一种中药组合物,按重量份计由白术50~100份、黄芩50~150份、苦参20~40份、广藿香60~150份、黄芪60~120份、白头翁60~100份、栀子25~60份和金银花60~140份组成,其配方合理,具有扶正祛邪,健脾燥湿清热止痢的功效;本发明还公开了含有上述中药组合物的制剂,该制剂使用方便,制备方法简单,能够用于治疗猪湿热泄痢、猪传染性胃肠炎和免疫功能低下等疾病,有良好的应用前景。

权利要求书

1.一种中药组合物,其特征在于:按重量份计由白术50~100份、黄芩50~150份、苦参20~40份、广藿香60~150份、黄芪60~120份、白头翁60~100份、栀子25~60份和金银花60~140份组成。2.根据权利要求1所述的中药组合物,其特征在于:按重量份计由白术80份、黄芩100份、苦参30份、广藿香70份、黄芪100份、白头翁80份、栀子40份、金银花100份组成。3.权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗猪湿热泄痢的药物中的应用。4.权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗猪传染性胃肠炎的药物中的应用。5.权利要求1或2所述的中药组合物在制备治疗免疫功能低下的药物中的应用。6.由权利要求1或2所述中药组合物制备的制剂。7.根据权利要求6所述的制剂,其特征在于:所述制剂为颗粒剂。8.权利要求7所述的制剂的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:a.按配方取白术、广藿香和金银花,提取其挥发油,然后用β-环糊精包合,得挥发油包合物;b.按配方取黄芩、苦参、白头翁、栀子、黄芪,先用乙醇回流提取,得提取液A,剩余药渣再加水煎煮提取,收集提取液记为提取液B,将提取液A和提取液B混合后并浓缩成清膏;同时将药渣干燥,然后粉碎,记为药渣A;c.将步骤a所得挥发油包合物和步骤b所得清膏和药渣A混合,然后加入辅料按照常规方法制成颗粒剂。9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于:所述辅料包括粘合剂、填充剂和矫味剂中的一种或多种。10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于:所述填充剂为磷酸氢二钙、玉米淀粉、糖粉和乳糖中一种或多种;所述的粘合剂为玉米淀粉、糊精和纤维素中的一种或多种;所述的矫味剂为蔗糖、糖精钠和青草香精的一种或多种。

说明书

 

技术领域

太阳城集团本发明属于医药领域,涉及一种中药组合物,还涉及由该中药组合物制备的制剂和制备方法。

背景技术

太阳城集团猪泄痢,中兽医认为主要是脾胃湿热之病,多因风、寒、暑、湿、热、毒侵于肠胃而形成,可分为以下热毒型、湿热型、寒湿型和虚寒型等四型。其中,湿热泄痢又称为急性肠炎, 是由细菌及病毒等微生物感染所引起的动物机体疾病,是常见病、多发病。本病多发于夏秋季节,主要由脾胃功能障碍和胃肠功能失调引起,临床表现为腹泄、呕吐、发热等,严重者可致脱水、电解质紊乱等。

猪传染性胃肠炎是由病毒引起的一种急性高度接触性猪肠道传染病。近几年来,在我地仔猪及成年猪中都有流行,特别是早春产仔季节流行本病的初发期,会造成大批仔猪死亡, 5周龄以上仔猪死亡率低,但经感染后耐过的猪生产性能下降,饲料报酬率下降,给养猪业造成了较大的经济损失。感染的猪以剧烈呕吐、水样腹泄和严重脱水为主要特征。

仔猪白痢是由大肠杆菌引起的,是10~30日龄仔猪常发的一种肠道传染病,气候突变,阴雨潮湿,栏舍污染,母猪饲料配合不当,乳汁中含脂率过高或泌乳量不足都是促发本病的重要因素。临诊症状:下痢,粪便呈灰色或淡黄绿色,内含有黏液而呈糊状,随后腹泄次数增多,粪便腥臭而稀薄。仔猪逐渐消瘦,被毛粗乱无光,尾和后肢被粪便污染。精神萎顿,恶寒,吃奶减少,脱水,终因昏迷虚脱而死。

由于上述疾病发病原因不同,现有无同时治疗治疗猪湿热泄痢、猪传染性胃肠炎和仔猪白痢,即使能够治疗,在治疗时并不能同时提高猪的免疫功能。因此,急需一种中药组合物,该组合物能够治疗猪湿热泄痢、猪传染性胃肠炎和仔猪白痢等疾病,同时还能提高猪的免疫功能。

发明内容

有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种中药组合物,配方独特,能够同时治疗猪湿热泄痢、猪传染性胃肠炎和仔猪白痢等疾病,还能提高猪的免疫功能。

为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:

太阳城集团一种中药组合物,按重量份计由白术50~100份、黄芩50~150份、苦参20~40份、广藿香60~150份、黄芪60~120份、白头翁60~100份、栀子25~60份和金银花60~140份组成。

优选的,按重量份计由白术80份、黄芩100份、苦参30份、广藿香70份、黄芪100份、白头翁80份、栀子40份、金银花100份组成。

本发明中药组合物的各原料具有如下性质和功效:

白术为菊科植物白术(Atractylodes macrocephala Koidz.)的干燥根茎;味苦、甘,性温;归脾、胃经;功能健脾益气,燥湿利水,止汗,安胎;主治脾虚食少,腹胀泄泄,痰饮眩悸,水肿,自汗,胎动不安。

太阳城集团黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根;味苦,性寒;归肺、胆、脾、大肠、小肠经;功能清热燥湿,泄火解毒,止血,安胎;主治湿温、暑温胸闷呕恶,湿热痞满,泄痢,黄疸,肺热咳嗽,高热烦渴,血热吐衄,痈肿疮毒,胎动不安。

苦参为豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait.)的干燥根;味苦,性寒;归心、肝、胃、大肠、膀胱经;功能清热燥湿,杀虫,利尿;主治热痢,便血,黄疸尿闭,赤白带下,阴肿阴痒,湿疹,湿疮,皮肤瘙痒,疥癣麻风。

广藿香为唇形科植物广藿香(Pogostemon cablin (Blanco) Benth.)的干燥地上部分;味辛,性微温;归脾、胃、肺经;功能芳香化浊,开胃止呕,发表解暑;主治湿浊中阻,脘痞呕吐,暑湿倦怠,胸闷不舒,寒湿闭暑,腹痛吐泄,鼻渊头痛。

太阳城集团黄芪多糖为豆科植物蒙古黄芪(Astragalus memeranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao)或膜荚黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.)的干燥根的多糖提取物;黄芪味甘,性微温;归肺、脾经;功能补气固表,利尿托毒,排脓,敛疮生肌。现代药理研究结果显示:黄芪多糖是黄芪的主要有效部位,具有增强免疫功能、诱导机体产生干扰素、保护心血管系统、调节血糖、降血压等多种药理活性,其中对免疫功能的促进和调节作用尤为明显。

太阳城集团白头翁为毛茛科植物白头翁(Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel)的干燥根。性味苦,寒;归胃经,具有清热解毒,凉血止痢。据研究表明,白头翁含有白头翁皂甙、白桦脂酸、胡萝卜甙、原白头翁素及白头翁素等多种有效活性成分,原白头翁素和白头翁素有抗多种细菌和病毒的功效,其中对白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、结核杆菌、魏氏梭菌等有明显的抑制作用;同时白头翁具有镇静、镇痛及抗痉挛,对由于细菌引起的肠道出血性痢疾和肠痉挛性痢疾有良好的治疗作用。

栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果实;味苦,性寒;归心、肺、三焦经;功能泄火除烦,清热利湿,凉血解毒;主治热病心烦,黄疸尿赤,血淋涩痛,血热吐衄,目赤肿痛,火毒疮疡。

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thund.)的干燥花蕾或带初开的花;味甘,性寒;归肺、心、胃经;功能清热解毒,凉散风热;主治痈肿疔疮,喉痹,丹毒,热毒血痢,风热感冒,温病发热。

本发明的目的之二在于提供中药组合物在制备治疗猪湿热泄痢的药物中的应用,技术方案为:

所述的中药组合物在制备治疗猪湿热泄痢的药物中的应用。

太阳城集团本发明的目的之三在于提供中药组合物在制备治疗猪传染性胃肠炎的药物中的应用,技术方案为:

所述的中药组合物在制备治疗猪传染性胃肠炎的药物中的应用。

本发明的目的之四在于提供中药组合物在制备治疗免疫功能低下的药物中的应用,技术方案为:

太阳城集团所述的中药组合物在制备治疗免疫功能低下的药物中的应用。

太阳城集团本发明的目的之五在于提供中药组合物的制剂,技术方案为:

由所述中药组合物制备的制剂。

太阳城集团优选的,所述制剂为颗粒剂。

本发明的目的之六在于提供上述制剂的制备方法,技术方案为:

太阳城集团所述的制剂的制备方法,具体步骤如下:

太阳城集团a.按配方取白术、广藿香和金银花,提取其挥发油,然后用β-环糊精包合,得挥发油包合物;

b.按配方取黄芩、苦参、白头翁、栀子、黄芪,先用乙醇回流提取,得提取液A,剩余药渣再加水煎煮提取,收集提取液记为提取液B,将提取液A和提取液B混合后并浓缩成清膏;同时将药渣干燥,然后粉碎,记为药渣A;

c.将步骤a所得挥发油包合物、步骤b所得清膏和药渣A混合,然后加入辅料按照常规方法制成颗粒剂。

太阳城集团优选的,所述辅料包括粘合剂、填充剂和矫味剂中的一种或多种。

更优选的,所述填充剂为磷酸氢二钙、玉米淀粉、糖粉和乳糖中一种或多种;所述的粘合剂为玉米淀粉、糊精和纤维素中的一种或两种;所述的矫味剂为蔗糖、糖精钠和青草香精的一种或多种。

本发明的有益效果在于:本发明公开了中药组合物,其配方独特,原料易得,成本低,具有扶正祛邪、健脾燥湿、清热止痢的功效;本发明还公开了中药组合物制备的制剂,其制备方法简单,将中药组合物按常规方法提取后与填充剂、粘合剂和矫味剂等辅料混合制成颗粒剂,添加辅料后使固体分散载体处于高度分散状态,增加中药组合物的生物利用率;制备的颗粒剂对猪传染性胃肠炎(TGEV)病毒具有吸附抑制、抑制复制和灭活的功效,其中直接灭活作用效果最好,能够提高因猪传染性胃肠炎病毒所损伤的细胞的保护能力;体外抑菌实验显示中药组合物制备的制剂能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪源魏氏梭菌、沙门氏菌和白色念珠菌等细菌的生长,因此能够用于治疗仔猪白痢;对猪湿热泄痢临床试验结果显示,中药组合物颗粒剂对猪湿热泄痢的治愈率达85%;同时本发明公开的中药组合物颗粒剂还具有提高免疫功能的效果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。

实施例1

太阳城集团一种中药组合物,配方如下:

太阳城集团配方1:白术60g、黄芩50g、苦参20g、广藿香60g、黄芪60g、白头翁60g、栀子25g、金银花60g。

配方2:白术50g、黄芩60g、苦参25g、广藿香60g、黄芪60g、白头翁70g、栀子30g、金银花60g。

配方3:白术80g、黄芩100g、苦参30g、广藿香70g、黄芪100g、白头翁80g、栀子40g、金银花100g。

太阳城集团配方4:白术90g、黄芩120g、苦参35g、广藿香150g、黄芪120g、白头翁90g、栀子45g、金银花120g。

配方5:白术100g、黄芩150g、苦参40g、广藿香80g、黄芪100g、白头翁100g、栀子60g、金银花140g。

实施例2

为了提高治疗效果,将中草药组合物可以用水或醇等溶剂提取有效成分制得提取物,其制备方法为:

a.提取挥发油及包被:

太阳城集团按上述配方取白术、广藿香和金银花,加入提取罐中,再加入相当于原料总重量5-8倍的水,加热回收,回收蒸馏液,对蒸馏液进行二次蒸发回流,待蒸馏液相当于原料重量1/10-2/10时停止蒸馏,回收蒸馏液,得挥发油。

太阳城集团称取相当于挥发油重量1/5的β-环糊精,然后加入相当于β-糊精重量15倍的蒸馏水,加热溶解后加入所得挥发油,在40℃条件下用搅拌机以600rpm速度搅拌1小时,再在4℃条件下冷藏24小时,过滤,收集沉淀,将沉淀于50℃条件下烘干,得挥发油包合物;

b. 黄芩、苦参、白头翁、栀子、黄芪的提取: 

按上述配比取黄芩、苦参、白头翁、栀子、黄芪,加入提取罐中,然后加入相当于原料总重量5-8倍的体积分数为50%的乙醇,蒸发回流2-3小时,收集提取滤液,滤液用乙醇回收塔回收乙醇,剩余液体记为提取液A;

太阳城集团继续往提取罐中加入相当于原料总重量3-5倍的水,煎煮提取2-3小时,收集提取滤液,得提取B,药渣烘干,粉碎后备用,记为药渣A;

太阳城集团c.将步骤b所得提取液A和提取液B混合,然后浓缩成清膏状,冷却后加入步骤a所得挥发油包合物,混合均匀,记为混合物C。

本实施例所得混合物C为中药组合物的有效成分。

实施例3

为了便于贮存和携带,服用方便,将中药组合物或其提取物制成各种适用于临床治疗需要的制剂,在制剂中可加入药剂学上可接受的载体,制剂的方法为常规方法。例如,可以将中草药组合物中的各种中药材直接粉碎成细粉,制成散剂,或者加入粘合剂制成丸剂;可以将中草药组合物的提取物与药剂学上可接受的载体制成胶囊、片剂、颗粒剂等等。这些提取物和制剂与中草药组合物具有相同的治疗作用。

以下以实施例2制得的混合物C和药渣A为原料,制备颗粒剂,具体配方为:

太阳城集团配方1:混合物C150g,药渣A150g,磷酸氢二钙100g,玉米淀粉200g,糖精钠1.5g。

配方2:混合物C80g,药渣A100g,磷酸氢二钙80g,玉米淀粉150g,糖精钠1g。

配方3:混合物C140g,药渣A140g,磷酸氢二钙120g,玉米淀粉250g,糖精钠2g。

配方4:混合物C200g,药渣A180g,磷酸氢二钙140g,玉米淀粉300g,糖精钠2.5g。

具体制备方法为:

(1)将配方量2/5的玉米淀粉在夹层锅内制成淀粉浆,备用;

(2)将配方量的糖精钠溶于混合物C中,然后加入配方量的药渣A、磷酸氢二钙与余下的玉米淀粉,混合均匀,得混合物D;

(3)将步骤(2)所述的混合物中加入(1)所述淀粉浆中,搅拌均匀后,转到制粒机上制粒,制粒后在60℃条件下烘10-12小时,然后置于整粒机内整粒,即得中药组合物颗粒剂。

本实施例中,磷酸氢二钙为填充剂,可以用相同重量的玉米淀粉、糖粉或乳糖替换,也可以用相同重量的磷酸氢二钙、玉米淀粉、糖粉和乳糖的混合物替换;玉米淀粉为粘合剂,可以用相同重量的糊精或纤维素替换,也可以用相同重量的玉米淀粉、糊精和纤维素的混合物替换;糖精钠为矫味剂,可以用相同重量的蔗糖或青草香精替换,也可以用相同重量的蔗糖、糖精钠和青草香精混合物替换。

实施例4、中药组合物颗粒剂对TGEV病毒直接灭活试验

1. 培养PK-15猪肾细胞系和制备TGEV病毒液

按照现有技术培养PK-15猪肾细胞系,然后培养猪传染性胃肠炎(TGEV)病毒,制备病毒液,备用。

2.TGEV半数组织细胞感染量(TCID50)和药物最大无毒浓度测定

参照文献(姜成刚.中草药抗猪传染性胃肠炎病毒活性及作用机理研究[D].东北农业大学,2003:14-15)的方法测定TCID50,采用Reed-Muench法计算TCID50。

太阳城集团参照文献(姜成刚,张秀英,龙忠臣.中药复方制剂抗猪传染性胃肠炎病毒活性的研究[J].畜牧兽医学报,2004,(5):587-589;卫文强.抗猪传染性胃肠炎病毒中草药的筛选及作用机制初步研究[D].甘肃农业大学,2009:24-25.)方法测定药物最大无毒浓度,各试验组结果与空白对照组结果进行T检验,差异不显著的最大药物浓度为最大无毒浓度。

    3.细胞存活率测定

采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)测定细胞存活率,具体为:取出96孔板,弃细胞培养液,然后加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液,置37℃、5% CO2培养箱中培养4小时后取出,将孔内液体吸弃,再加入100 μL DMSO,置微量振荡器上振荡10 min,取下于酶标仪490 nm波长下测光密度值(OD),结果用细胞保护率表示。

太阳城集团细胞保护率=(试验组OD值-模型组OD值)/(空白组OD值-模型组OD值)×100%。

太阳城集团按照上述方法用配方1-5的中药组合物颗粒剂测定TGEV病毒直接灭活试验,具体方法为:将长满的单层PK-15猪肾细胞的96孔培养板分为空白组(不作任何处理)、模型组(PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒,不给药处理),黄芪多糖对照组(PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后用含10-5 g/mL黄芪多糖处理),配方1~5(PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后分别用配方1-5的浓度为10-5g/mL的中药组合物颗粒剂水溶液处理),每组重复6个孔,处理结果如表1所示。

太阳城集团表1、不同配方的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒直接灭活试验

注:同列中,不含相同字母肩注表示差异显著,同列中含相同字母肩注表示差异不显著(小写字母表示P>0.05,大写字母表示P>0.01)。

由表1可知,配方1-5的中药组合物均能直接抑制TGEV病毒,但是配方3的中药组合物制备的颗粒剂效果最好。

将长满的单层PK-15猪肾细胞的96孔培养板分为空白组(不作任何处理)、模型组(PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒,不给药处理),黄芪多糖对照组(PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后用含10-5 g/mL黄芪多糖处理),试验组1~5(PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后分别用配方3的浓度为10-4g/mL、10-5g/mL、10-6g/mL、10-7g/mL和10-8 g/mL的中药组合物颗粒剂水溶液处理),每组重复6个孔,然后测定配方3制备的中药组合物颗粒剂直接灭活效果,结果如表2所示。

表2、中药组合物颗粒剂对TGEV病毒直接灭活试验

注:同列中,不含相同字母肩注表示差异显著,同列中含相同字母肩注表示差异不显著(小写字母表示P>0.05,大写字母表示P>0.01)。

由表2可知,中药组合物颗粒剂能直接灭活病毒,减少病毒对细胞的损伤,从而保护PK-15细胞。实验组1~4对细胞保护作用明显,与模型组相比差异极显著(P<0.01),且在实验组2~4之间存在明显的量效关系,实验组2的作用最强,保护率达到29.62%。配方3效果做好。

太阳城集团然后根据Reed-Muench法计算得结果显示,TGEV感染半数细胞感染量是1TCID50为0.2 mL 10-3.654稀释度的病毒液。

太阳城集团药物最大无毒浓度测定显示,中药组合物颗粒剂在浓度c≥10-3 g/mL时细胞存活率降低,与空白组比较有极显著性差异(P<0.01);在浓度c≤10-4 g/mL时细胞存活率与空白组比较差异不显著(P>0.05),确定最大无毒浓度为10-4 g/mL。

实施例5、中药组合物颗粒剂对TGEV病毒吸附抑制试验

太阳城集团1.不同配方的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒吸附抑制试验

在长满单层PK-15猪肾细胞的96孔培养板内,每孔加入200 μL由配方1-5制备的浓度分别为10-5g/mL的中药组合物颗粒剂水溶液(依次为配方1~5),在37℃孵育2小时,弃药液;再接入200 μL 100TCID50病毒液,37℃孵育2小时后弃病毒液,然后加200 μL细胞维持液(含2% FBS的DMEM培养),置37℃、5%CO2培养箱中继续培养72小时。同时以不作任何处理的PK-15猪肾细胞作为空白组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后处理,不给药为模型组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后用含10-5 g/mL黄芪多糖处理作为黄芪多糖组,以上每组重复6个孔。然后测定不同配方的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒吸附抑制效果,结果如表3所示。

表3、不同配方的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒吸附抑制

太阳城集团注:同列中,不含相同字母肩注表示差异显著,同列中含相同字母肩注表示差异不显著(小写字母表示P>0.05,大写字母表示P>0.01)。

由表3可知,配方1-5的中药组合物颗粒制剂对TGEV病毒均有吸附抑制,但是配方3的中药组合物颗粒剂效果最好,细胞的保护率最高。

太阳城集团2. 不同浓度的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒吸附抑制试验

在长满单层PK-15猪肾细胞的96孔培养板内,每孔加入200μL浓度分别为10-4g/mL、10-5g/mL、10-6g/mL、10-7g/mL和10-8的中药组合物颗粒剂水溶液(依次为试验组1~5),在37℃孵育2小时,弃药液;再接入200 μL 100TCID50病毒液,37℃孵育2小时后弃病毒液,然后加200 μL细胞维持液(含2% FBS的DMEM培养),置37℃、5%CO2培养箱中继续培养72小时。同时以不作任何处理的PK-15猪肾细胞作为空白组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后处理,不给药为模型组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后用含10-5 g/mL黄芪多糖处理作为黄芪多糖组,以上每组重复6个孔。然后测定中药组合物颗粒剂对TGEV病毒吸附抑制效果,结果如表4所示。

表4、不同浓度的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒吸附抑制

太阳城集团注:同列中,不含相同字母肩注表示差异显著,同列中含相同字母肩注表示差异不显著(小写字母表示P>0.05,大写字母表示P>0.01)。

由表4可知,中药组合物颗粒剂能抑制病毒吸附,对体外培养PK-15细胞均有不同程度的保护作用。与模型组相比,试验组1~4对细胞保护作用明显(P<0.01),且在试验组2(10-5 g/mL)~试验组4(10-7 g/mL)之间存在较明显的量效关系。其中试验组2活性最高,保护率为24.79%。配方3效果做好。

实施例6、中药组合物颗粒剂对TGEV病毒复制抑制试验

1.不同配方的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒复制抑制试验

先将100TCID50病毒液接入长满单层PK-15猪肾细胞的96孔培养板内,然后每孔分别加入200 μL浓度为10-5g/mL的由配方1-5制备的中药组合物颗粒剂水溶液(依次为配方1~5),置37℃条件下孵育2小时后弃病毒液,加200 μL细胞维持液,置37℃、5%CO2培养箱中继续培养72小时。同时以不作任何处理的PK-15猪肾细胞作为空白组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后处理,不给药为模型组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后用含10-5 g/mL黄芪多糖处理作为黄芪多糖组,以上每组重复6个孔。然后检测TGEV病毒数量,计算细胞保护率,结果如表5所示。

太阳城集团表5、不同配方的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒复制抑制

注:同列中,不含相同字母肩注表示差异显著,同列中含相同字母肩注表示差异不显著(小写字母表示P>0.05,大写字母表示P>0.01)。

2.不同浓度的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒复制抑制

太阳城集团先将100TCID50病毒液接入长满单层PK-15猪肾细胞的96孔培养板内,每孔加入200 μL,在37℃条件下孵育2小时,弃病毒液,然后每孔分别加入200 μL浓度为10-4g/mL、10-5g/mL、10-6g/mL、10-7g/mL和10-8的中药组合物颗粒剂水溶液(依次为试验组1~5),置37℃条件下孵育2小时后弃病毒液,加200 μL细胞维持液,置37℃、5%CO2培养箱中继续培养72 h。同时以不作任何处理的PK-15猪肾细胞作为空白组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后处理,不给药为模型组,将PK-15猪肾细胞感染TGEV病毒后用含10-5 g/mL黄芪多糖处理作为黄芪多糖组,以上每组重复6个孔。然后检测TGEV病毒数量,计算细胞保护率,结果如表6所示。

表6、不同浓度的中药组合物颗粒剂对TGEV病毒复制抑制

注:同列中,不含相同字母肩注表示差异显著,同列中含相同字母肩注表示差异不显著(小写字母表示P>0.05,大写字母表示P>0.01)。

由表6所示,中药组合物颗粒剂能抑制病毒复制,对体外培养PK-15细胞均有不同程度的保护作用。与模型组相比,试验组1-3对培养的细胞有较明显的保护作用(P<0.01),试验组1(10-4 g/mL)~试验组3(10-6 g/mL)之间存在较明显的量效关系,试验组1保护率最高,为12.69%。

实施例7

中药组合物颗粒剂体外抗菌试验

1、二倍稀释法

太阳城集团将中药组合物颗粒剂溶于水中,制成浓度相当于生药0.24g/mL的水溶液,然后按照表7的方法稀释成不同浓度,再在各试管中接种0.1mL试验细菌,37℃的恒温箱中培养6~8小时。

表7、二倍稀释法的操作过程

太阳城集团 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 肉汤(ml) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 菌液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1   药稀释度 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512   1:2

按照上述方法检测配方3的中药组合物颗粒剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪源魏氏梭菌、沙门氏菌及白色念珠菌、藤黄微球菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果,找出对各种细菌生长的最低药物浓度,该浓度为中药组合物颗粒剂的最低抑菌浓度(MIC),结果见表8所示。

太阳城集团表8、不同浓度的中药组合物颗粒剂体外最低抑菌浓度(MIC)

太阳城集团 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 无药 无菌 药液稀释倍数 1 2 4 8 16 32 64 128 256 0 1 大肠杆菌 ― ― ― ― ― ― ― + + +++++ ― 金黄色葡萄球菌 - - - - - - - - + +++++ - 猪源魏氏梭菌 - - ― ― ― + + + ++ +++++ - 沙门氏菌 - ― ― ― ― ― + + + +++++ - 白色念珠菌 - ― ― ― ― ― + + + +++++ - 短小芽孢杆菌 + + + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ +++++ - 枯草芽孢杆菌 + + ++ ++ ++ ++ +++ +++ ++++ +++++ - 藤黄微球菌 + + + ++ ++ ++ +++ +++ ++++ +++++ ―

注:“+”表示有细菌生长,“-”表示无细菌生长。用“+”,“++”,表示细菌的生长强度

太阳城集团由表8可知,中药组合物颗粒剂对各菌株的MIC分别为:大肠杆菌为3.75mg/mL、金黄色葡萄球菌1.875mg/mL、猪源魏氏梭菌15mg/mL、沙门氏菌及白色念珠菌7.5mg/mL,而对藤黄微球菌、短小芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌抑菌效果不佳,未测出其MIC。

按照与上述相同的方法,检测配方1-5的中药组合物颗粒剂在稀释16倍条件下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪源魏氏梭菌、沙门氏菌和白色念珠菌的抑菌情况,抑菌结果见表9所示。

表9、不同配方的中药组合物颗粒剂体外最低抑菌浓度(MIC)

管号 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5 无药 无菌 药液稀释倍数 16 16 16 16 16 0 16 大肠杆菌 ― ― ― ― ― +++++ ― 金黄色葡萄球菌 - - - - - +++++ - 猪源魏氏梭菌 - - ― + + +++++ - 沙门氏菌 - + ― ― + +++++ - 白色念珠菌 + ― ― ― + +++++ -

注:“+”表示有细菌生长,“-”表示无细菌生长。用“+”,“++”,表示细菌的生长强度

太阳城集团由表9可知,在稀释16倍的条件下,配方3可以同时抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪源魏氏梭菌、沙门氏菌和白色念珠菌;配方1不能抑制白色念珠菌,配方2不能抑制沙门氏菌,配方4不能抑制猪源魏氏梭菌,配方5只能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,因此配方3的抑菌效果最佳。

2、杯管法

首先将10mL经高压灭菌的琼脂培养基倒入培养皿中作为底层,待凝固后在上面铺一层约40~50℃含有0.1mL菌液的琼脂培养基5mL(菌液的制备方法为将细菌活化后,放到37℃的恒温箱中培养12~14小时,浊度约为4亿/mL),待上层凝固后每个培养皿中放置4个牛津杯(外径7.8mm,内径6.8mm),牛津杯中加入不同浓度的配方3的中药组合物颗粒剂水溶液,最后放入37℃恒温箱中过夜培养。次日测定不同浓度的药液产生的抑菌圈大小,观察其抑菌情况,结果如表10所示。

太阳城集团  表10、不同浓度的中药组合物颗粒剂对敏感菌抑菌圈大小(单位:mm)

由表10可知,中药组合物颗粒剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、白色念球菌、猪源魏氏梭菌5种菌株具有较好的抑菌效果,在浓度为5%时抑菌圈的浓度更大。因此,本发明公开的中药组合物颗粒剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、白色念球菌、猪源魏氏梭菌5种菌株具有较好的抑菌效果。

太阳城集团然后将配方1-5制备的中药组合物颗粒剂制成质量分数为5%的水溶液,用杯管法检测不同配方的中药组合物制备的颗粒剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、白色念球菌、猪源魏氏梭菌的抑菌效果,结果如表11所示。

太阳城集团表11、不同配方的中药组合物颗粒剂对敏感菌抑菌圈大小(单位:mm)

太阳城集团由表11可知,配方3的中药组合物颗粒剂的抑菌最好。

实施例8 

太阳城集团中药组合物颗粒剂对免疫功能低下的小鼠的影响

太阳城集团1.不同配方中药组合物颗粒剂对免疫功能低下的小鼠的影响

选取健康小鼠160只,随机分为8组,每组20只。取140只小鼠用于构建免疫低下小鼠模型,具体方法为:腹腔注射0.2mL环磷酰胺,1次/天,注射量按80mg/kg,共3天;余下20只小鼠腹腔注射相同量的蒸馏水,作为空白对照组。将构建的免疫低下小鼠模型随机分为模型组、阳性药物对照组(黄芪多糖注射液,0.15g/kg)、配方1-5组(每只给药量为:1.4g生药/kg),1次/天,连续给药3天;空白对照组,模型组给予等量蒸馏水。治疗后,各组一半小鼠眼框采血,血液用于碳粒廓清指数测定;取各组另一半小鼠脾脏、胸腺用于免疫指数测定(mg/g)及 T、B淋巴细胞转化试验。

太阳城集团(1)免疫器官指数的测定

方法:称体质量,取脾脏和胸腺,称湿质量,并按下列公式计算脾指数和胸腺指数。

脾指数=脾质量/体重(mg/g);胸腺指数=胸腺质量/体重(mg/g)。

脾指数和胸腺指数测定结果如表12所示:

表12、中药组合物颗粒剂对小鼠免疫指数的影响

组别 剂量(g/kg) 脾脏指数(mg/g) 胸腺指数(mg/g) 空白对照组 -- 4.706±0.24 1.156±0.01 模型组 -- 3.215±0.57△ 0.856±0.14△△ 阳性药物对照组 0.15 5.323±0.53** 1.880±0.05** 配方1 1.4 3.832±0.83** 1.380±0.32** 配方2 1.4 3.380±0.60 1.230±0.15* 配方3 1.4 4.832±0.83** 1.389±0.01** 配方4 1.4 4.832±0.83** 1.580±0.21** 配方5 1.4 5.250±0.82 1.839±0.18*

由表12可知,配方1-5组的小鼠在给药后脾脏指数和胸腺指数增加。因此,配方1-5的中药组合物颗粒剂能够治疗免疫低下的小鼠,配方5效果最好。

(2)碳粒廓清指数测定

太阳城集团      各组小鼠于末次给药1小时后尾静脉注射体积分数为25%的印度墨汁10mL/kg,然后分别在2分钟和10分钟于每鼠眼球后静脉丛取血20μL,立刻吹入2mL质量分数为0.1%的Na2CO3溶液中,取血完毕后以于570nm测吸光度(OD),校零溶液为2mL质量分数为0.1%的Na2CO3。按下式计算廓清指数K及吞噬系数(校正吞噬指数)α,结果如表13所示。

碳粒廓清指数K=(logOD2-logOD10)/ (T10-T2)(OD2、OD10分别为2、10min时的吸光度)

太阳城集团K值经体质量及肝脾质量换算后,得吞噬指数α值:吞噬指数α=体质量/(肝质量+脾质量)×K1/3(T10 =10min,T2=2min)。

太阳城集团(3)T淋巴细胞、B淋巴细胞转化试验测定

太阳城集团  在无菌条件下取脾,然后用PBS缓冲液冲洗两遍。用无菌的研磨器研磨后取浆液,然后于1000 r/min条件下离心5 分钟,弃上清液;再加入5mL pH为7.2的Tris NH4Cl,轻轻吹打,使红细胞完全破裂,再在1000 r/min条件下离心5 min,弃上清液;沉淀用PBS缓冲液冲洗1次,再以1000r/min离心5 min,弃上清液;最后用含体积分数为10%的新生牛血清及质量分数为2%的庆大霉素的RPM II640全培养液重悬细胞,调整脾细胞浓度为3×106个/mL,备用。

T淋巴细胞转化试验:参照改进的MTT比色分析法,取96孔细胞培养板,每孔加制备成脾细胞悬液200μL,刀豆蛋白A 15μL(终浓度为6mg/L),8复孔,于37℃ 5%的CO2培养箱中培养72小时。在培养结束前4小时弃上清100μL,加人MTT液20μL继续培养4h,吸去上清液,每孔加入DMSO150 μL终止反应,将96孔板移入平板震荡器,水平震荡10min,使MTT还原产物完全溶解,用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸光度(OD值),结果如表13所示。

B淋巴细胞转化试验:其方法与T淋巴细胞转化试验相同,区别在于将15μL刀豆蛋白换成20μL脂多糖,加入后终浓度为50 mg/L。用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸光度(OD值),结果如表13所示。

表13、中药组合物颗粒剂对小鼠碳粒廓清及T、B淋巴细胞增殖的影响

组别 剂量(g/kg) T淋巴细胞OD630值 B淋巴细胞OD630值 碳清值α 空白对照组 --  0.421±0.05 0.391±0.04 5.125±0.08 模型组 -- 0.251±0.07△ 0.127±0.02△ 3.420±0.52△△ 阳性药物对照组 0.15  0.403±0.02* 0.364±0.04** 4.892±0.44* 配方1 1.4 0.320±0.16* 0.282±0.02** 4.520±0.20* 配方2 1.4 0.427±0.12* 0.235±0.02** 4.530±0.28* 配方3 1.4   0.520±0.02** 0.371±0.04** 4.571±0.03* 配方4 1.4 0.480±0.16* 0.332±0.03** 4.225±0.38* 配方5 1.4 0.467±0.15* 0.330±0.12** 4.420±0.28*

太阳城集团由表13可知,配方1-5的中药组合物颗粒剂均能增加T、B淋巴细胞的转化率和碳清值α,但是配方3效果最好。

太阳城集团2.不同浓度中药组合物颗粒剂对免疫功能低下的小鼠的影响

选取健康小鼠120只,随机分为6组,每组20只。取100只小鼠用于构建免疫低下小鼠模型,具体方法为:腹腔注射0.2mL环磷酰胺,1次/天,注射量按80mg/kg,共3天;余下20只小鼠腹腔注射相同量的蒸馏水,作为空白对照组。将构建的免疫低下小鼠模型随机分为模型组、阳性药物对照组(黄芪多糖注射液,0.15g/kg)、中药组合物颗粒剂高剂量组(配方3,1.4g生药/kg)、中药组合物颗粒剂中剂量组(配方3,1.0g生药/kg)、中药组合物颗粒剂低剂量组(配方3,0.6g生药/kg),1次/天,连续给药3天;空白对照组,模型组给予等量蒸馏水。治疗后,各组一半小鼠眼框采血,血液用于碳粒廓清指数测定;取各组另一半小鼠脾脏、胸腺用于免疫指数测定(mg/g)及 T、B淋巴细胞转化试验,测得的脾指数和胸腺指数如表14所示。

表14、中药组合物颗粒剂对小鼠免疫指数的影响

太阳城集团 组别 剂量(g/kg) 脾脏指数(mg/g) 胸腺指数(mg/g) 空白对照组 -- 4.706±0.24 1.156±0.01 模型组 -- 3.215±0.57△ 0.856±0.14△△ 阳性药物对照组 0.15 5.323±0.53** 1.880±0.05** 中药组合物颗粒剂高剂量组 1.4 4.832±0.83** 1.389±0.01** 中药组合物颗粒剂中剂量组 1.0 3.351±0.53 1.239±0.16* 中药组合物颗粒剂低剂量组 0.6 3.285±0.39 1.192±0.13

太阳城集团注:与模型对照组比较“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01;与空白对照组比较 “△△”表示P<0.01。

太阳城集团由表14所示,模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数降低,与空白对照组比差异极显著(P<0.01),中药组合物颗粒剂治疗后,尤其是中药组合物颗粒剂高剂量组的小鼠脾脏指数、胸腺指数与空白对照组比差异不显著,趋向于正常;各剂量组有一定量效关系。

碳粒廓清指数测定

     各组小鼠于末次给药1小时后尾静脉注射体积分数为25%的印度墨汁10mL/kg,然后分别在2分钟和10分钟于每鼠眼球后静脉丛取血20μL,立刻吹入2mL质量分数为0.1%的Na2CO3溶液中,取血完毕后以于570nm测吸光度(OD),校零溶液为2mL质量分数为0.1%的Na2CO3。按下式计算廓清指数K及吞噬系数(校正吞噬指数)α,结果如表15所示。

碳粒廓清指数K=(logOD2-logOD10)/ (T10-T2)(OD2、OD10分别为2、10min时的吸光度)

太阳城集团K值经体质量及肝脾质量换算后,得吞噬指数α值:吞噬指数α=体质量/(肝质量+脾质量)×K1/3(T10 =10min,T2=2min)。

太阳城集团3.T淋巴细胞、B淋巴细胞转化试验测定

 在无菌条件下取脾,然后用PBS缓冲液冲洗两遍。用无菌的研磨器研磨后取浆液,然后于1000 r/min条件下离心5 分钟,弃上清液;再加入5mL pH为7.2的Tris NH4Cl,轻轻吹打,使红细胞完全破裂,再在1000 r/min条件下离心5 min,弃上清液;沉淀用PBS缓冲液冲洗1次,再以1000r/min离心5 min,弃上清液;最后用含体积分数为10%的新生牛血清及质量分数为2%的庆大霉素的RPM II640全培养液重悬细胞,调整脾细胞浓度为3×106个/mL,备用。

太阳城集团T淋巴细胞转化试验:参照改进的MTT比色分析法,取96孔细胞培养板,每孔加制备成脾细胞悬液200μL,刀豆蛋白A 15μL(终浓度为6mg/L),8复孔,于37℃ 5%的CO2培养箱中培养72小时。在培养结束前4小时弃上清100μL,加人MTT液20μL继续培养4h,吸去上清液,每孔加入DMSO150 μL终止反应,将96孔板移入平板震荡器,水平震荡10min,使MTT还原产物完全溶解,用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸光度(OD值),结果如表15所示。

太阳城集团B淋巴细胞转化试验:其方法与T淋巴细胞转化试验相同,区别在于将15μL刀豆蛋白换成20μL脂多糖,加入后终浓度为50 mg/L。用酶联免疫检测仪于630nm波长处测定每孔吸光度(OD值),结果如表15所示。

表15、中药组合物颗粒剂对小鼠碳粒廓清及T、B淋巴细胞增殖的影响

组别 剂量(g/kg) T淋巴细胞OD630值 B淋巴细胞OD630值 碳清值α 空白对照组 --  0.421±0.05 0.391±0.04 5.125±0.08 模型组 -- 0.251±0.07△ 0.127±0.02△ 3.420±0.52△△ 阳性药物对照组 0.15  0.403±0.02* 0.364±0.04** 4.892±0.44* 中药组合物颗粒剂高剂量组 1.4   0.520±0.02** 0.371±0.04** 4.571±0.03* 中药组合物颗粒剂中剂量组 1.0 0.427±0.12* 0.235±0.02** 4.529±0.18* 中药组合物颗粒剂低剂量组 0.6 0.313±0.03 0.218±0.01* 4.002±0.16*

太阳城集团与模型对照组比较“*”表示P<0.05,“**”表示P<0.01;与空白对照组比较 “△△”表示P<0.01。

太阳城集团由表15所示,模型组小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞转化率细胞转化率降低,与空白对照组比差异显著(P<0.05);模型组小鼠碳清值α降低,与空白对照组比差异极显著(P<0.01);因此,中药组合物颗粒剂明显增加T、B淋巴细胞的转化率和碳清值α,各剂量组有一定量效关系,表明中药组合物颗粒剂能提高小鼠的免疫功能。

实施例9

中药组合物颗粒剂对猪湿热泄痢临床试验

     2012年3月,重庆市荣昌县某猪场仔猪出现不食、呕吐、腹泻,有些严重脱水的临床症状,发病仔猪共120头。诊断,此病症属湿热泄痢,宜扶正祛邪,健脾燥湿,清热止痢。

太阳城集团治疗方案:将发病仔猪随机分成6组,每组20头,试验组采用中药组合物颗粒剂拌料饲喂,剂量为2g/kg体重,另一组采用白头翁散拌料饲喂,剂量为2g/kg体重。试验周期为一周,

治疗效果:在用药后的第2天部分仔猪的临床症状得到明显的好转,结果如表16所示。

表16、中药组合物颗粒剂对猪湿热泄痢临床试验

由表16可知,在用药后第3天、第4天、第5天、第6天,配方1-5组均有头仔猪得到治愈,白头翁散组分别有4头、8头、13头、15头仔猪得到治愈。到用药后第6天,实验组和白头翁散组分别有15头、15头、17头、16头、15头和15头仔猪被治愈,治愈率分别达到75.5、75.5%、85%、80%和75.5%。因此,中药组合物颗粒剂对猪湿热泄痢有治疗效果,并且配方3效果最好,治愈率达85%。

太阳城集团上述实施例中,以中药组合物的颗粒剂为例验证中药组合物的功能,由于中药组合物中含有颗粒剂的全部有效成分。因此,中药组合物具有与颗粒剂相同的功能。

最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

太阳城集团本文
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