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一种荆半夏种茎快速繁殖方法.pdf

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一种 半夏 快速 繁殖 方法
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201610203382.7

申请日:

20160401

公开号:

CN105850728B

公开日:

20180223

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A01H4/00 主分类号: A01H4/00
申请人: 荆楚理工学院
发明人: 李先良,李居宁
地址: 448000 湖北省荆门市象山大道33号
优先权:
专利代理机构: 武汉宇晨专利事务所 代理人: 王敏锋
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201610203382.7

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了一种荆半夏种茎快速繁殖方法,步骤是:A﹑外植体的选择和诱导:选用叶柄作外植体,以叶片展开后的叶柄作外植体,经自来水冲洗后,加入酒精,浸泡,倒掉酒精,用无菌水清洗,用新洁儿灭浸泡,倒掉新洁尔灭,用无菌水清洗,加入升汞溶液和吐温,浸泡,用无菌水清洗后接种到诱导培养基,培养形成带芽的球状体;B﹑球状体芽的增殖:经过诱导将获得带有芽点的球状体,在超净工作台内将芽切开,切开的球状体含芽点,增殖培养;C、种茎的形成:带芽的球状体经过增殖培养后,取下单个芽点,在超净工作台接种到种茎培养基,促使种茎增大。方法易行,操作简便。能有效的降低了内生菌对半夏无菌培养的影响,提高了组培快繁效率。增殖效率高。

权利要求书

太阳城集团1.一种荆半夏种茎快速繁殖方法,其步骤是:A﹑外植体的选择和诱导:选用叶片未展开的叶柄作外植体,外植体的诱导过程如下:取下选取的叶柄外植体,经自来水冲洗10-30min后,在超净工作台中将上述叶柄外植体移到一个经灭菌的烧杯中,加入75%v/v酒精,浸泡28-32s,倒掉酒精,用无菌水清洗2-4次,然后加入0.1%m/v新洁尔灭浸泡2-4min,倒掉新洁尔灭,用无菌水清洗4-6次,然后加入0.2%m/v升汞溶液和1-2滴吐温,浸泡8-12min,期间应旋转烧杯,使药剂和外植体表面接触,然后用无菌水冲洗4-6次,接种时将叶柄在滤纸上晾干,以平躺的方式接种到培养基上,诱导培养基为:MS+TDZ0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L,pH5.4-pH6.2,接种完毕后将培养瓶放入培养室培养,培养室温度24-26℃,光照1500~2500lx,光照太阳城集团为:10-12h/d,培养25-30d形成带芽的球状体;B﹑球状体芽的增殖:经过步骤(A)的诱导将获得带有芽点的球状体,在超净工作台内将芽切开,切开的球状体含2-3个芽点,增殖培养密度控制在0.2个/cm,芽增殖培养基为:MS+6-BA0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/LpH5.8,培养条件为:温度24-26℃,光照1500~2500lx,光照太阳城集团:10h/d,24-26d达到充分增殖;C、种茎的形成:带芽的球状体经过增殖培养后,取下单个芽点,在超净工作台接种到种茎培养基,种茎培养基配方为:1/2MS,蔗糖60g/L,pH5.8,培养条件为:温度24-26℃,光照1500~2500lx,光照太阳城集团:10h/d,培养18-22d后形成完整植株,此时,见叶片和根系从切下的芽点上长出,该芽点已具备半夏块茎的特性,然后,将培养瓶放在室温下有自然光照的地方,有利于营养物质在种茎中进一步积累,促使种茎增大。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术领域,更具体涉及一种利用植物组织培养技术生产荆半夏种茎的方法。该方法主要用于荆半夏种茎的快速生产。

背景技术

半夏(Pinellia ternata)为天南星科半夏属多年生草本植物,株高15-30厘米;块茎近球形,直径1-2厘米;叶出自块茎顶端,叶柄长6-23厘米,一年生的叶为单叶,卵状心形;2-3年后,叶为三出复叶。半夏是一种常用的中药材,在588种中药处方中,半夏使用频率居第22位。具有降逆止呕、燥湿化痰、消痞散节的功效。近年来,研究发现半夏还有抗早孕、抗肿瘤、降血脂、护肝等功能。由于市场需求量大,野生半夏资源无法满足,现已有大规模的人工种植。但半夏人工种植所需种茎量大,成本高。目前,人工种植半夏每亩地需种茎300-400kg,购买这些种茎的成本约为6000-8000元,因此,人工种植半夏种茎的成本为6000-8000元/亩。这也是影响半夏人工种植效益的主要因素之一。因此,开发种茎高效繁殖方法是提高半夏人工种植效益的途径之一。

自然状态下,半夏可通过有性和无性两种方式进行繁殖。半夏雌雄花序在同一个佛焰苞中,属同株异花传粉,一般而言,只有较大块茎才能抽出佛焰苞,形成的种子在常规条件下萌发率相当低。因此,有性繁殖不是其主要繁殖方式。自然群体内大部分个体是源自无性繁殖产生的珠芽。珠芽繁殖是半夏无性繁殖的主要方式,珠芽着生在叶柄下部内侧面,有的会在三叶交汇处着生一珠芽。珠芽落于土中形成新植株,珠芽变成了块茎。半夏块茎偶尔也产生子块茎,子块茎能形成新个体。块茎繁殖是另一种无性繁殖方式。综上所述可见,自然状态下半夏繁殖效率低。

太阳城集团组织培养是一种植物快速繁殖的方法,是指从植物体中取出组织、器官,然后模拟机体的生理条件,在体外进行培养,使之生存,形成组织或长成植株的技术过程。任家惠(1983)最早用半夏叶片和叶柄作外植体进行研究,通过愈伤组织获得大量完整植株。通过组培方法快繁半夏种苗的方法主要集中于外植体、培养条件和培养基、再生途径方面。半夏组织培养中常用的半夏材料有叶片、叶柄、块茎和珠芽。夏海武(1994)在半夏不同生长时期分别取叶片、叶柄和块茎进行培养,发现早期取材诱导效果较好。万美亮等(1995)的研究表明叶柄诱导效果最好,叶片次之,二者皆启动快,诱导率可达 90%;而块茎、珠芽较差。武宗信等(2005)报道了采用珠芽成功建立半夏无性繁殖系,并获得了大量再生植株。邱萍等(2008)采用半夏茎尖作外植体,得到较高的成活率和成苗率。培养条件和培养基方面研究比较一致,MS培养基是比较适合培养基,培养光照强度1500~2500lx,每日10~12h左右。培养温度为(25±1)℃。半夏植株再生途径有两种:器官途径和胚状体途径。朱忠荣(1991)等用叶柄和块茎切块进行培养,过程中不出现明显的愈伤组织,而是直接从外植体表面产生多个球状体,然后由球状体上方长绿芽,下方长出根。何奕昆(1994)等将叶柄接在分化培养基上,可直接产生小块茎或小鳞茎,进而分化出完整植株。在某些情况下也可经过愈伤阶段形成再生苗。以上研究为半夏组培快繁奠定了基础,可利用半夏叶柄、叶片、珠芽和块茎作为外植体进行培养,最终均可获得完整植株。

在半夏人工栽培中,还主要是用半夏块茎作为种茎,播种量为300-400kg/亩,种茎成本为6000-8000元/亩,一般5年内不用再购买种茎。因此,如果通过组培方法来商业化生产种茎,需要在种茎质量、成本等方面优于天然块茎。为此,一些半夏改良的组培快繁方法被建立起来,主要目标在于降低半夏种植的成本,提高半夏种植的效益。为了减少组培中的操作环节,降低成本,罗成科等(2007)引入一步成苗技术,该技术的优点是将组培技术中的诱导、增殖和分化等环节合并一个环节,将外植体叶片接入到培养基中,经过90天培养后,获得再生苗,再生苗移栽容易存活。应该说,一步成苗技术有助于半夏组培快繁技术的商业化应用。对于培养方式也有些有益探索。贾明良等(2012)将间歇浸没培养的方法引入半夏组培快繁,减少培养时的人力投入,且提高增殖率,为低成本生产大量高质量的种苗提供保障。该方法的具体操作是:将无菌外植体接入到生物反应器中,间歇性地加入无菌液体培养基,使外植体能从培养基中吸收养分,接受培养基中激素的诱导,另一方面,又可避免像悬浮培养那样导致外植体和分化苗等中间体玻璃化。该方法展现出一些工业化生产的特点,为半夏利用组培方法进行商业化生产提供了技术支持。

发明内容

本发明目的是在于提供了一种荆半夏种茎快速繁殖方法,方法易行,操作简便。能有效的降低了内生菌对半夏无菌培养的影响,提高了组培快繁效率。能高效的诱导带芽球状体的形成,并能使带芽球状体高效的增殖,增殖效率高。所形成种茎相对组培苗使用更方便。

为了实现上述的目的,本发明采用以下技术措施:

本发明构思是:一种荆半夏种茎快速繁殖方法包括三个步骤:A﹑外植体的选择和诱导;B﹑球状体芽的增殖;C﹑种茎形成。

一种荆半夏种茎快速繁殖方法,其步骤是:

太阳城集团A﹑外植体的选择和诱导:当选用叶柄作外植体时,应该选用叶片还未展开时叶柄作为外植体,叶柄展开后的叶柄作外植体时,其内生菌的污染率明显增高。外植体的诱导过程如下:取下按上述要求选取的叶柄外植体,经自来水冲洗10-30min后,在超净工作台中将上述叶柄外植体移到一个经灭菌的烧杯中,加入75%(V/V,体积比)酒精,浸泡28-32S,倒掉酒精,用无菌水清洗2-4次,然后加入0.1%(M/V,体积质量比)新洁尔灭浸泡2-4min,倒掉新洁尔灭,用无菌水清洗4-6次,然后加入0.2%(M/V,体积质量比)升汞溶液和1-2滴吐温,浸泡8-12min,期间应旋转烧杯,使药剂和外植体表面充分接触,然后用无菌水冲洗4-6次。接种时尽量将叶柄在滤纸上晾干,以平躺的方式接种到培养基上。诱导培养基为:MS+TDZ 0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L,pH5.4-pH6.2。也可以用叶片作为外植体,操作过程与上述操作相同。用无菌苗的叶柄和叶片作外植体无需进行外植体消毒过程。接种完毕后接好后将培养瓶放入培养室培养,培养室温度24-26℃左右,光照1500~2500lx,光照太阳城集团为:10-12h/d。培养25-30d可形成带芽的球状体。

另外,为了降低组培过程中劳动量和成本,可用PC方盒代替培养瓶,用滤纸取代琼脂。具体操作如下:以长宽高分别为20×13×9cm的带盖PC方盒为例。制作一个长宽比此方盒长宽略小的PC板,保证能卡在方盒中间。将滤纸铺在PC板上,然后卡在方盒内,将方盒盖盖后放入高压灭菌灭菌,同时将配制好的上述不加琼脂培养基也放入高压灭菌锅灭菌,完毕后,在超净工作台内将液体培养基加入PC方盒,盖上盖子,等培养基冷却后,将上述外植体接种滤纸上,接种密度与接种到培养基上相同。此改进能大幅度降低培养基分装的劳动量。同时也可更有效利用组培架空间。

太阳城集团所述的叶柄(petiole)是叶片与块茎的联系部分,其上端与叶片相连,下端着生在茎上,通常叶柄位于叶片的基部。少数植物的叶柄着生于叶片中央或略偏下方,称为盾状着生,如莲、千金藤。叶柄通常呈细圆柱形。

B﹑球状体芽的增殖:经过步骤A的诱导将获得带有芽点的球状体,在超净工作台内将芽切开,尽可能保证切开的球状体含2-3个芽点,增值培养密度控制在0.2个/cm2左右。芽增值培养基为:MS+6-BA 0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L pH5.8。培养条件为:温度24-26℃左右,光照1500~2500lx,光照太阳城集团:10h/d。一般24-26d左右可达到充分增殖。

本步骤同样可利用PC方盒改进方法,节省劳动量。

C、种茎的形成:带芽的球状体经过增殖培养后,尽量取下单个芽点,在超净工作台接种到种茎培养基,种茎培养基配方为:1/2MS,蔗糖45-60g/L,pH5.8。培养条件为:温度24-26℃左右,光照1500~2500lx,光照太阳城集团:10h/d。一般18-22d左右可形成完整植株,可见叶片、叶片和根系从切下的芽点上长出,此时,该芽点已具备半夏块茎的特性。此时,可将培养瓶放在室温(室温在15-30℃之间)下有自然光照的地方,有利于营养物质在种茎中进一步积累,促使种茎增大。

太阳城集团所述的诱导培养基:MS+TDZ 0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L,pH5.4-pH6.2;

所述的增殖培养基:MS+6-BA 0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L,pH5.8;

所述的种茎形成培养基:1/2MS,蔗糖45-60g/L,pH5.8。

太阳城集团本发明与现有技术相比,具有以下优点与效果:

(1)与半夏自然繁殖和一次成苗技术相比,本发明主要特征是半夏种茎繁殖效率高。自然状态下,一棵生长2年半夏苗可产生1-2个珠芽(种茎),通过本发明一个培养过程(75-90d),无污染情况下一棵苗可产生约468个种茎[21(诱导芽点数)×3(叶柄通常可切成三段)×6(增殖率)+5(诱导芽点数)×3(三片叶)×6(增殖率)计算方法]。繁殖效率相较自然繁殖效率提高约20万倍。

太阳城集团(2)与传统采用自然生长半夏块茎做种茎的方法相比,本发明主要特征是工厂化大规模生产优势明显,种茎成本可降低。按100平米培养室的组培规模,每斤半夏种茎成本为5-6元,与传统采用自然生长半夏块茎做种茎的方法(每斤10-20元)相比成本相对较低。

(3)本发明操作简单,成本低,具备推广前景。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步的详细描述,但并非是对本发明的限制,凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换,均属于本发明的保护范围。

实施例1:

一种荆半夏种茎快速繁殖方法,其步骤是:

A﹑外植体的选择和诱导:当选用叶柄作外植体时,应该选用叶片还未展开时叶柄作为外植体,叶柄展开后的叶柄作外植体时,其内生菌的污染率明显增高。外植体的诱导过程如下:取下按上述要求选取的叶柄外植体,经自来水冲洗10-30min后,在超净工作 台中将上述叶柄外植体移到一个经灭菌的烧杯中,加入75%(V/V,体积比)酒精,浸泡28或29或30或31或32S,倒掉酒精,用无菌水清洗2或3或4次,然后加入0.1%(M/V,体积质量比)新洁尔灭浸泡2或3或4min,倒掉新洁尔灭,用无菌水清洗4或5或6次,然后加入0.2%(M/V,体积质量比)升汞溶液和1-2滴吐温,浸泡8或9或10或11或12min,期间应旋转烧杯,使药剂和外植体表面充分接触,然后用无菌水冲洗4或5或6次。接种时尽量将叶柄在滤纸上晾干,以平躺的方式接种到培养基上。诱导培养基为:MS+TDZ0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L,pH5.4或5.6或5.8或6或6.2。也可以用叶片作为外植体,操作过程与上述操作相同。用无菌苗的叶柄和叶片作外植体无需进行外植体消毒过程。接种完毕后接好后将培养瓶放入培养室培养,培养室温度24或25或26℃,光照1500或2000或2500lx,光照太阳城集团为:10或11或12h/d。培养25或27或28或29或30d可形成带芽的球状体。

另外,为了降低组培过程中劳动量和成本,可用PC方盒代替培养瓶,用滤纸取代琼脂。具体操作如下:以长宽高分别为20×13×9的带盖PC方盒为例。制作一个长宽比此方盒长宽略小的PC板,保证能卡在方盒中间。将滤纸铺在PC板上,然后卡在方盒内,将方盒盖盖后放入高压灭菌灭菌,同时将配制好的上述不加琼脂培养基也放入高压灭菌锅灭菌,完毕后,在超净工作台内将液体培养基加入PC方盒,盖上盖子,等培养基冷却后,将上述外植体接种滤纸上,接种密度与接种到培养基上相同。此改进能大幅度降低培养基分装的劳动量。同时也可更有效利用组培架空间。

B﹑球状体芽的增殖:经过步骤A的诱导将获得带有芽点的球状体,在超净工作台内将芽切开,尽可能保证切开的球状体含2或3个芽点,增值培养密度控制在0.2个/cm2左右。芽增值培养基为:MS+6-BA 0.5-1.0mg/L,蔗糖30g/L,pH5.8。培养条件为:温度24或25或26℃,光照1500或1800或2200或~2500lx,光照太阳城集团:10h/d。一般24或25或26d左右可达到充分增殖。

太阳城集团C、种茎的形成:带芽的球状体经过增殖培养后,尽量取下单个芽点,在超净工作台接种到种茎培养基,种茎培养基配方为:1/2MS,蔗糖45-60g/L,pH5.8。培养条件为:温度24或25或26℃,光照1500或1900或2300或2500lx,光照太阳城集团:10h/d。一般18或19或20或21或22d可形成完整植株,可见叶片、叶片和根系从切下的芽点上长出,此时,该芽点已具备半夏块茎的特性。此时,可将培养瓶放在室温(室温在15或18或20或23或23或28或30℃之间)下有自然光照的地方,有利于营养物质在种茎中进一步积累,促使种茎增大。

实施例2:

一种荆半夏种茎快速繁殖方法,其步骤是:

太阳城集团A、外植体的选择和诱导:

a、外植体的选择,为了确定合适的外植体,选用半夏块茎、珠芽、不同发育时期的叶柄和叶片作为外植体,测试其污染率和诱导效率。外植体消毒方法如下:先用自来水冲洗15min。在超净工作台内,将冲洗干净的叶柄和叶片转到经过灭菌的瓶中,加75%酒精浸泡30s,用无菌水冲洗3次,然后加0.01%新洁尔灭溶液浸泡5min,用无菌水冲洗5次,然后用0.1%升汞浸泡10min,用无菌水冲洗5次。测试培养基为:MS+TDZ0.5mg/L+NAA0.01mg/L pH5.8。叶柄切取长度为1cm左右,块茎切成约0.5×0.5×0.5cm大小,珠芽对半切开,叶片切成1×1cm大小。每种外植体取15个,分别接种5个经灭菌的培养基中。7或9或12或15或18或20d后统计结果。见表1

表1不同外植体培养效果

太阳城集团注:叶柄1和叶片1表示半夏叶片长出,但叶片未展开这一时期;叶柄2和叶片2表示叶片展开,但珠芽并未形成时期;叶柄3和叶片3表示珠芽已形成时期。诱导效果“差”表示外植体褐化或未有芽点形成。“较好”表示有芽点形成,但芽点数量不多。“好”表示形成芽在10个以上。

太阳城集团从以上结果可看出,叶片形成初期的叶柄和叶片不仅污染率低,诱导效果较好,适合做外植体。

b、适合外植体诱导的培养基筛选:设计不同浓度细胞分裂素培养基,培养基基本成分为MS,蔗糖浓度为30g/L,pH为5.8。然后将发育初期的叶柄和叶片接种到培养基上。接种时将叶柄切成1cm左右,叶片大小在1×1cm左右。每种培养基接种5瓶,每瓶接种3个外植体。外植体消毒方法与“a、外植体的选择”部分相同。培养条件为:培养室温度25℃左右,光照1500或2100或2500lx,光照太阳城集团为:12h/d。25d后统计结果。

结果见表2。

太阳城集团由此可见,随着细胞分裂素浓度增高,诱导形成芽的数量也在增加,但同时,芽点之间接触紧密,不易分离。但作为一种高效的快繁体系,诱导形成芽点越多意味着最终的效率越高。因此,细胞分离素选择TDZ,浓度在0.5-1.0mg/L比较合理。

表2细胞分裂素种类和浓度对外植体诱导效果

太阳城集团注:芽点诱导率=芽点数/外植体数*100%;芽点大小和密度分三个等级,“a”代表芽点较大,芽点之间易于分离,“b”代表芽点中等,芽点比较容易分离,“c”代表芽点较小,芽点之间距离较小,相对不易分离。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例3:

一种荆半夏种茎快速繁殖方法,其步骤是:

太阳城集团A、球状体芽的增殖:为使球状体芽增殖,同时,使芽分散且易于分离,设计一系列分裂素种类和浓度不同培养基,培养基基本成分为MS,蔗糖添加量为30g/L,pH值为5.8。将上述诱导形成球状体上芽点切下,约2-3个芽点为一个单位,接种到增殖培养基上。每瓶培养基接种3个带2-3个芽的球状体,每种培养基接种5瓶。

B、培养条件与实施例1和实施例2相同。培养25d后观察芽点增殖和分散效果,见表3。从中可以看出,随着6-BA和TDZ浓度增加,芽增殖效率越高,但同时也导致芽点之间紧密相连,这对于下一步种茎形成不利。综合增值率和芽点分散效果两方面考虑,6-BA浓度控制在0.5-1.0mg/L合适。TDZ细胞分裂素效果太强,伴随着增殖还会引起芽点相连。

表3不同分裂素种类和浓度对球状体芽增殖的影响

太阳城集团注:增殖率=增值后芽点数/增殖前芽点数;芽点分散效果:“a”代表分散效果良好,“b”代表芽点分散效果比原球状体芽点分散度稍好,“c”代表分散度与原球状体相同。

其它实施步骤与实施例1相同。

实例4:

一种荆半夏种茎快速繁殖方法,其步骤是:

A、种茎的形成:此步培养是使芽点转变成块茎,如果自然状态下珠芽落到土壤转变块茎一样。

太阳城集团B、鉴于步骤A的结果和自然状态下珠芽向块茎的转变过程,在培养基不适合添加细胞分裂素。为使形成种茎具有更大体积(更大体积块茎做种茎可以降低收获块茎的年限),在培养基基本成分和蔗糖浓度方面进行对比实验。结果见表4。由此可见,降低基本培养基至1/2水平对半夏种茎形成无影响,降低至1/4水平则有影响。蔗糖浓度增加有利于半夏种茎的增大。故种茎培养基以1/2MS为基本成分添加60g/L蔗糖为宜。

表4MS培养基浓度及蔗糖添加量对种茎影响

其它实施步骤与实施例1相同。

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