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HEMOKININ1在制备疫苗佐剂中应用.pdf

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HEMOKININ1 制备 疫苗 佐剂 应用
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201210098052.8

申请日:

20120405

公开号:

CN103357009A

公开日:

20131023

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:
IPC分类号: A61K39/39,A61K38/08,A61K38/22,A61K48/00,A61P37/04,A61P31/20 主分类号: A61K39/39,A61K38/08,A61K38/22,A61K48/00,A61P37/04,A61P31/20
申请人: 中国农业大学,北京大学
发明人: 王宾,张毓,陈璇,张望
地址: 100193 北京市海淀区圆明园西路2号
优先权: CN201210098052A
专利代理机构: 北京纪凯知识产权代理有限公司 代理人: 关畅
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法律状态
申请(专利)号:

CN201210098052.8

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了Hemokinin-1在制备疫苗佐剂中的应用。本发明提供了特异多肽在如下(A)或(B)或(C)中的应用:(A)制备疫苗佐剂;(B)制备疫苗;(C)制备促进机体对抗原的免疫应答的产品;所述特异多肽为如下(a)或(b)或(c):(a)序列表的序列3所示多肽;(b)序列表的序列1所示多肽;(c)含有两个以上单拷贝的多肽;所述单拷贝如序列表的序列1所示。HK-1无论是作为DNA疫苗分子佐剂使用,还是以合成多肽的形式与抗原联合使用,均可以达到增强抗原特异性抗体水平的作用,这为新型预防性疫苗佐剂的开发,提供了新的思路。本发明的新型疫苗,可以有效激发基于抗体的体液免疫反应技术成熟,使用方面,成本低,无副作用,易于推广。

权利要求书

1.特异多肽在如下(A)或(B)或(C)中的应用:(A)制备疫苗佐剂;(B)制备疫苗;(C)制备促进机体对抗原的免疫应答的产品;所述特异多肽为如下(a)或(b)或(c):(a)序列表的序列3所示多肽;(b)序列表的序列1所示多肽;(c)含有两个以上单拷贝的多肽;所述单拷贝如序列表的序列1所示。2.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述促进机体对抗原的免疫应答体现为如下(1)中(25)中的至少一种:(1)促进机体内IgG产生;(2)促进机体内IgM产生;(3)促进机体内针对所述抗原的特异性抗体的产生;(4)促进B细胞激活;(5)增加机体中CD80阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(6)增加机体中CD86阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(7)促进B细胞分化为浆细胞;(8)增加机体中B220阴性且CD138阳性细胞的数量;(9)促进转录因子Blimp-1和转录因子Xbp-1的表达;(10)抑制转录因子Bcl-6和转录因子Pax-5的表达;(11)促进B细胞分化为记忆性细胞;(12)增加机体中B220阳性且CD27阳性细胞的数量;(13)促进T淋巴细胞增殖;(14)增加机体中IL-2阳性细胞占CD4阳性T细胞的比例;(15)促进CD4阳性T细胞分化为Tfh细胞;(16)促进淋巴结细胞分化为Tfh细胞;(17)促进CD4阳性T细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(18)促进淋巴结细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(19)促进CD4阳性T细胞分化为分泌IL-21的细胞;(20)促进淋巴结细胞分化为分泌IL-21的细胞;(21)促进Tfh细胞分泌IL-21;(22)增强生发中心反应;(23)增加机体中PNA阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(24)促进BCL-6的表达;(25)促进CD4阳性T细胞表达BCL-6。3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述(A)和/或所述(B)中,所述疫苗为乙型肝炎疫苗;所述(C)中,所述抗原为乙型肝炎病毒表面抗原S2。4.特异多肽的编码基因或含有所述编码基因的重组质粒在如下(A)或(B)或(C)中的应用:(A)制备疫苗佐剂;(B)制备疫苗;(C)制备促进机体对抗原的免疫应答的产品;所述特异多肽为如下(a)或(b)或(c):(a)序列表的序列3所示多肽;(b)序列表的序列1所示多肽;(c)含有两个以上单拷贝的多肽;所述单拷贝如序列表的序列1所示。5.如权利要求4所述的应用,其特征在于:所述特异多肽的编码基因为序列表的序列4或序列表的序列2所示的DNA分子。6.如权利要求5所述的应用,其特征在于:所述促进机体对抗原的免疫应答体现为如下(1)中(25)中的至少一种:(1)促进机体内IgG产生;(2)促进机体内IgM产生;(3)促进机体内针对所述抗原的特异性抗体的产生;(4)促进B细胞激活;(5)增加机体中CD80阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(6)增加机体中CD86阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(7)促进B细胞分化为浆细胞;(8)增加机体中B220阴性且CD138阳性细胞的数量;(9)促进转录因子Blimp-1和转录因子Xbp-1的表达;(10)抑制转录因子Bcl-6和转录因子Pax-5的表达;(11)促进B细胞分化为记忆性细胞;(12)增加机体中B220阳性且CD27阳性细胞的数量;(13)促进T淋巴细胞增殖;(14)增加机体中IL-2阳性细胞占CD4阳性T细胞的比例;(15)促进CD4阳性T细胞分化为Tfh细胞;(16)促进淋巴结细胞分化为Tfh细胞;(17)促进CD4阳性T细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(18)促进淋巴结细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(19)促进CD4阳性T细胞分化为分泌IL-21的细胞;(20)促进淋巴结细胞分化为分泌IL-21的细胞;(21)促进Tfh细胞分泌IL-21;(22)增强生发中心反应;(23)增加机体中PNA阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(24)促进BCL-6的表达;(25)促进CD4阳性T细胞表达BCL-6。7.如权利要求4或5或6所述的应用,其特征在于:所述(A)和/或所述(B)中,所述疫苗为乙型肝炎疫苗;所述(C)中,所述抗原为乙型肝炎病毒表面抗原S2。8.活性成分为特异多肽、所述特异多肽的编码基因或含有所述编码基因的重组质粒的产品;所述产品的功能为如下(D)或(E)或(F):(D)疫苗佐剂;(E)疫苗;(C)促进机体对抗原的免疫应答的产品;所述特异多肽为如下(a)或(b)或(c):(a)序列表的序列4所示多肽;(b)序列表的序列3所示多肽;(c)含有两个以上单拷贝的多肽;所述单拷贝如序列表的序列3所示。9.如权利要求8所述的产品,其特征在于:所述特异多肽的编码基因为序列表的序列4或序列表的序列2所示的DNA分子;所述促进机体对抗原的免疫应答体现为如下(1)中(25)中的至少一种:(1)促进机体内IgG产生;(2)促进机体内IgM产生;(3)促进机体内针对所述抗原的特异性抗体的产生;(4)促进B细胞激活;(5)增加机体中CD80阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(6)增加机体中CD86阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(7)促进B细胞分化为浆细胞;(8)增加机体中B220阴性且CD138阳性细胞的数量;(9)促进转录因子Blimp-1和转录因子Xbp-1的表达;(10)抑制转录因子Bcl-6和转录因子Pax-5的表达;(11)促进B细胞分化为记忆性细胞;(12)增加机体中B220阳性且CD27阳性细胞的数量;(13)促进T淋巴细胞增殖;(14)增加机体中IL-2阳性细胞占CD4阳性T细胞的比例;(15)促进CD4阳性T细胞分化为Tfh细胞;(16)促进淋巴结细胞分化为Tfh细胞;(17)促进CD4阳性T细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(18)促进淋巴结细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(19)促进CD4阳性T细胞分化为分泌IL-21的细胞;(20)促进淋巴结细胞分化为分泌IL-21的细胞;(21)促进Tfh细胞分泌IL-21;(22)增强生发中心反应;(23)增加机体中PNA阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(24)促进BCL-6的表达;(25)促进CD4阳性T细胞表达BCL-6。10.如权利要求8或9所述的产品,其特征在于:所述(D)和/或所述(E)中,所述疫苗为乙型肝炎疫苗;所述(F)中,所述抗原为乙型肝炎病毒表面抗原S2。

说明书

技术领域

本发明涉及一种Hemokinin-1的新用途,即Hemokinin-1在制备疫苗佐剂中的应用。

背景技术

太阳城集团佐剂作为能同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性或改变免疫反应类型的物质,在新型、高效疫苗复合物的研发中受到研究者的广泛重视。佐剂又称非特异性免疫增生剂,本身不具抗原性,是一类先于抗原或与抗原同时作用,能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的一种物质,即同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性或改变免疫反应类型。

太阳城集团免疫佐剂的主要生物作用包括以下几个方面:抗原物质混合佐剂注入机体后,改变了抗原的物理性状,可使抗原物质缓慢地释放,延长了抗原的作用太阳城集团;佐剂吸附了抗原后,增加了抗原的表面积,使抗原易于被抗原呈递细胞吞噬;佐剂能刺激抗原呈递细胞对抗原的处理;佐剂可促进淋巴细胞之间的接触,增强辅助T细胞的作用;可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。

速激肽是由10-12个氨基酸组成的神经肽家族。Hemokinin-1(HK-1)是最新发现的速激肽家族成员,并且表达在神经外围组织。

发明内容

本发明的目的是提供Hemokinin-1在制备疫苗佐剂中的应用。

本发明提供了特异多肽在如下(A)或(B)或(C)中的应用:(A)制备疫苗佐剂;(B)制备疫苗;(C)制备促进机体对抗原的免疫应答的产品;所述特异多肽为如下(a)或(b)或(c):(a)序列表的序列3所示多肽(含有三个拷贝的Hemokinin-1,各个拷贝之间具有连接序列);(b)序列表的序列1所示多肽(单拷贝的Hemokinin-1);(c)含有两个以上单拷贝的多肽;所述单拷贝如序列表的序列1所示。

太阳城集团所述促进机体对抗原的免疫应答体现为如下(1)中(25)中的至少一种:(1)促进机体内IgG产生;(2)促进机体内IgM产生;(3)促进机体内针对所述抗原的特异性抗体的产生;(4)促进B细胞激活;(5)增加机体中CD80阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(6)增加机体中CD86阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(7)促进B细胞分化为浆细胞;(8)增加机体中B220阴性且CD138阳性细胞的数量;(9)促进转录因子Blimp-1和转录因子Xbp-1的表达;(10)抑制转录因子Bcl-6和转录因子Pax-5的表达;(11)促进B细胞分化为记忆性细胞;(12)增加机体中B220阳性且CD27阳性细胞的数量;(13)促进T淋巴细胞增殖;(14)增加机体中IL-2阳性细胞占CD4阳性T细胞的比例;(15)促进CD4阳性T细胞分化为Tfh细胞;(16)促进淋巴结细胞分化为Tfh细胞;(17)促进CD4阳性T细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(18)促进淋巴结细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(19)促进CD4阳性T细胞分化为分泌IL-21的细胞;(20)促进淋巴结细胞分化为分泌IL-21的细胞;(21)促进Tfh细胞分泌IL-21;(22)增强生发中心反应;(23)增加机体中PNA阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(24)促进BCL-6的表达;(25)促进CD4阳性T细胞表达BCL-6。

所述(A)和/或所述(B)中,所述疫苗可为乙型肝炎疫苗。

太阳城集团所述(C)中,所述抗原可为乙型肝炎病毒表面抗原S2。所述乙型肝炎病毒表面抗原S2具体可如序列表的序列9所示。

本发明还保护特异多肽的编码基因或含有所述编码基因的重组质粒在如下(A)或(B)或(C)中的应用:(A)制备疫苗佐剂;(B)制备疫苗;(C)制备促进机体对抗原的免疫应答的产品;所述特异多肽为如下(a)或(b)或(c):(a)序列表的序列3所示多肽;(b)序列表的序列1所示多肽;(c)含有两个以上单拷贝的多肽;所述单拷贝如序列表的序列1所示。

所述特异多肽的编码基因为序列表的序列4或序列表的序列2所示的DNA分子。

所述促进机体对抗原的免疫应答体现为如下(1)中(25)中的至少一种:(1)促进机体内IgG产生;(2)促进机体内IgM产生;(3)促进机体内针对所述抗原的特异性抗体的产生;(4)促进B细胞激活;(5)增加机体中CD80阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(6)增加机体中CD86阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(7)促进B细胞分化为浆细胞;(8)增加机体中B220阴性且CD138阳性细胞的数量;(9)促进转录因子Blimp-1和转录因子Xbp-1的表达;(10)抑制转录因子Bcl-6和转录因子Pax-5的表达;(11)促进B细胞分化为记忆性细胞;(12)增加机体中B220阳性且CD27阳性细胞的数量;(13)促进T淋巴细胞增殖;(14)增加机体中IL-2阳性细胞占CD4阳性T细胞的比例;(15)促进CD4阳性T细胞分化为Tfh细胞;(16)促进淋巴结细胞分化为Tfh细胞;(17)促进CD4阳性T细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(18)促进淋巴结细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(19)促进CD4阳性T细胞分化为分泌IL-21的细胞;(20)促进淋巴结细胞分化为分泌IL-21的细胞;(21)促进Tfh细胞分泌IL-21;(22)增强生发中心反应;(23)增加机体中PNA阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(24)促进BCL-6的表达;(25)促进CD4阳性T细胞表达BCL-6。

所述(A)和/或所述(B)中,所述疫苗可为乙型肝炎疫苗。

太阳城集团所述(C)中,所述抗原可为乙型肝炎病毒表面抗原S2。所述乙型肝炎病毒表面抗原S2具体可如序列表的序列9所示。

本发明还保护活性成分为特异多肽、所述特异多肽的编码基因或含有所述编码基因的重组质粒的产品;所述产品的功能为如下(D)或(E)或(F):(D)疫苗佐剂;(E)疫苗;(F)促进机体对抗原的免疫应答的产品;所述特异多肽为如下(a)或(b)或(c):(a)序列表的序列4所示多肽;(b)序列表的序列3所示多肽;(c)含有两个以上单拷贝的多肽;所述单拷贝如序列表的序列3所示。

所述特异多肽的编码基因为序列表的序列4或序列表的序列2所示的DNA分子。

所述促进机体对抗原的免疫应答体现为如下(1)中(25)中的至少一种:(1)促进机体内IgG产生;(2)促进机体内IgM产生;(3)促进机体内针对所述抗原的特异性抗体的产生;(4)促进B细胞激活;(5)增加机体中CD80阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(6)增加机体中CD86阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(7)促进B细胞分化为浆细胞;(8)增加机体中B220阴性且CD138阳性细胞的数量;(9)促进转录因子Blimp-1和转录因子Xbp-1的表达;(10)抑制转录因子Bcl-6和转录因子Pax-5的表达;(11)促进B细胞分化为记忆性细胞;(12)增加机体中B220阳性且CD27阳性细胞的数量;(13)促进T淋巴细胞增殖;(14)增加机体中IL-2阳性细胞占CD4阳性T细胞的比例;(15)促进CD4阳性T细胞分化为Tfh细胞;(16)促进淋巴结细胞分化为Tfh细胞;(17)促进CD4阳性T细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(18)促进淋巴结细胞分化为CXCR5阳性且ICOS阳性的细胞;(19)促进CD4阳性T细胞分化为分泌IL-21的细胞;(20)促进淋巴结细胞分化为分泌IL-21的细胞;(21)促进Tfh细胞分泌IL-21;(22)增强生发中心反应;(23)增加机体中PNA阳性细胞占B220阳性细胞的比例;(24)促进BCL-6的表达;(25)促进CD4阳性T细胞表达BCL-6。

所述(D)和/或所述(E)中,所述疫苗可为乙型肝炎疫苗。

所述(E)中,所述疫苗可为抗原表位与所述特异多肽的融合蛋白、所述融合蛋白的编码基因或含有所述融合蛋白的编码基因的重组质粒。所述(E)中,所述疫苗具体可为治疗和/或预防乙型肝炎的疫苗。所述(E)中,所述抗原表位可为乙型肝炎病毒表面抗原S2。所述乙型肝炎病毒表面抗原S2具体可如序列表的序列9所示。所述(E)中,所述重组质粒具体可为在重组质粒proVAX/S2的BamHI和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列7自5’末端第19至153位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。所述重组质粒proVAX/S2是在proVAX载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列5自5’末端第10至855位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。所述重组质粒具体还可为在proVAX载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列6自5’末端第10至903位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。

太阳城集团所述(F)中,所述抗原可为乙型肝炎病毒表面抗原S2。所述乙型肝炎病毒表面抗原S2具体可如序列表的序列9所示。

太阳城集团本发明的发明人在长期的研究工作中,发现HK-1无论是作为DNA疫苗分子佐剂,还是以多肽的形式与抗原一同使用,均可以增强抗原特异性的IgG水平。将一个拷贝或三个拷贝的HK-1基因序列分别连接到乙型肝炎病毒表面抗原S2基因下游,并分别将这两条基因序列插入proVAX真核表达载体,形成两种新的DNA疫苗。与没有携带HK-1基因序列的proVAX/S2 DNA疫苗相比,proVAX/S2-HK-1和proVAX/S2-3HK-1在注射动物后,机体产生的抗原特异性的IgG水平更高,特别是携带有三拷贝的HK-1基因序列的proVAX/S2-3HK-1,激发的抗体水平最高。随后的研究发现,HK-1多肽与抗原混合后注射动物,同样可以增强抗原特异性的抗体的产生。将一个拷贝的HK-1多肽或三个拷贝的HK-1多肽分别与NP15-KLH抗原混合后注射动物。与单纯免疫NP15-KLH抗原的实验组相比,混合了HK-1多肽的NP15-KLH抗原所激发的抗体水平更高,特别是混合了三个拷贝HK-1多肽的实验组,所激发的抗体水平最高。这些结果与HK-1以分子佐剂的形式增强DNA疫苗的体液免疫水平的实验结果相一致。进一步的研究发现,HK-1分别通过两种同途径增强抗原特异性的抗体的产生。其一,通过增强浆细胞的分化,直接促进抗体的产生;其二,通过促进T细胞分化为Tfh T细胞,间接作用于B细胞,促进抗体的产生。另外,有实验结果表明,HK-1可以促进免疫记忆。

HK-1无论是作为DNA疫苗分子佐剂使用,还是以合成多肽的形式与抗原联合使用,均可以达到增强抗原特异性抗体水平的作用,这为新型预防性疫苗佐剂的开发,提供了新的思路。本发明首次将HK-1作为佐剂,通过直接或间接作用与B细胞,特异性的增强疫苗基于抗体的体液免疫反应,在国际上尚属首次,为新型疫苗佐剂的研发提供新的方向和可能性。本发明的新型疫苗,可以有效激发基于抗体的体液免疫反应技术成熟,使用方面,成本低,无副作用,易于推广。

附图说明

太阳城集团图1为S2基因、S2-HK-1融合基因和S2-3HK-1融合基因在NIH/3T3细胞中的表达;泳道M为分子量marker,泳道1为转染重组质粒proVAX/S2的细胞,泳道2为转染重组质粒proVAX/S2-HK-1的细胞,泳道3为转染重组质粒proVAX/S2-3HK-1的细胞,泳道4为转染proVAX载体的细胞,泳道5为未转染质粒的细胞。

图2为ELISA检测HBsAg特异性抗体的产生水平的结果。

太阳城集团图3为HK-1基因和3HK-1基因促进B细胞的激活。

太阳城集团图4为HK-1基因和3HK-1基因作为DNA疫苗分子佐剂影响浆细胞的分化;1至6依次代表第一组、第二组、第三组、第四组、第五组和第六组。

图5为HK-1基因和3HK-1基因作为分子佐剂通过修饰多种转录因子的表达,进而影响浆细胞的分化。

图6为HK-1基因和3HK-1基因作为分子佐剂促进B220+CD27+细胞亚群的分化;1至6依次代表第一组、第二组、第三组、第四组、第五组和第六组。

太阳城集团图7为HK-1基因和3HK-1基因作为分子佐剂可以影响记忆性B细胞的分化因而影响机体再次受到抗原刺激后抗体的产生;1至6依次代表第一组、第二组、第三组、第四组、第五组和第六组。

太阳城集团图8为HK-1基因和3HK-1基因作为分子佐剂可以增强抗原特异性的T细胞反应;1至6依次代表第一组、第二组、第三组、第四组、第五组和第六组,7代表阳性对照组,8代表阴性对照组。

图9为HK-1基因和3HK-1基因作为分子佐剂对细胞因子表达的影响;1至6依次代表第一组、第二组、第三组、第四组、第五组和第六组。

图10为HK-1多肽和3HK-1多肽在体外促进Tfh细胞的分化(培养3天)。

太阳城集团图11为HK-1多肽和3HK-1多肽在体外促进Tfh细胞的分化(培养4天)。

图12为HK-1多肽和3HK-1多肽HK-1多肽在体外促进Tfh细胞的功能。

太阳城集团图13为HK-1多肽和3HK-1多肽HK-1多肽在体内促进Tfh细胞的分化。

图14为HK-1多肽促进生发中心反应。

太阳城集团图15为HK-1多肽促进特异性抗体的产生。

图16为HK-1多肽促进BCL-6的表达(体外)。

图17为HK-1多肽促进BCL-6的表达(体内)。

具体实施方式

太阳城集团以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。以下实施例中的%,如果特殊说明均为质量百分数。

太阳城集团proVAX载体:公众可以从中国农业大学获得;参考文献:The adjuvant effects ofco-stimulatory molecules on cellular and memory responses to HBsAg DNAvaccination。

NIH/3T3细胞:ATCC CRL-1658。BALB/c小鼠:购自北京华阜康生物科技股份有限公司。C57BL/6小鼠:维通利华。anti-B220:eBioscience 17-0452-81。anti-CD80:eBioscience 12-0801。anti-CD86:eBioscience 12-0862。anti-CD138:BD Pharmingen553714。anti-CD27:eBioscience 12-0271-81。anti-CD4:eBioscience 17-0041。anti-IL-4:eBioscience 12-7041。anti-IL-21:eBioscience 12-7211。anti-IFN-γ:eBioscience 12-7311。anti-CD8:eBioscience 17-0081。anti-CD3:BD 553057。anti-CD28:BD 553294。anti-TGF-β:R&D MAB1835。IL-21:R&D 594-ML-010。anti-CXCR5:BD 560577。anti-ICOS:BD 552146。NP15-KLH:Biosearch TecnologiesN-5065。anti-PD-1:BD 551892。PNA:SIGMA L7381。

太阳城集团实施例1、重组质粒和多肽片段的制备

一、重组质粒的构建

1、重组质粒proVAX/S2的构建

(1)人工合成序列表的序列5所示的双链DNA片段。序列5中,自5’末端第10至852位核苷酸为乙型肝炎病毒表面抗原S2基因(简称S2基因),第853至855位核苷酸为终止密码子。

(2)用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切步骤(1)的双链DNA片段,回收酶切产物。

太阳城集团(3)用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切proVAX载体,回收载体骨架(约3600bp)。

太阳城集团(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接,得到重组质粒proVAX/S2。根据测序结果,对重组质粒proVAX/S2进行结构描述如下:在proVAX载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列5自5’末端第10至855位核苷酸所示的DNA片段。

2、重组质粒proVAX/S2-HK-1的构建

太阳城集团(1)人工合成序列表的序列6所示的双链DNA片段。序列6中,自5’末端第10至852位核苷酸为S2基因,第868-900位核苷酸为单拷贝的HK-1基因,第901至903位核苷酸为终止密码子。

太阳城集团(2)用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切步骤(1)的双链DNA片段,回收酶切产物。

(3)用限制性内切酶EcoR I和BamH I酶切proVAX载体,回收载体骨架(约3600bp)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接,得到重组质粒proVAX/S2-HK-1。根据测序结果,对重组质粒proVAX/S2-HK-1进行结构描述如下:在proVAX载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列6自5’末端第10至903位核苷酸所示的DNA片段。

太阳城集团3、重组质粒proVAX/S2-3HK-1的构建

(1)人工合成序列表的序列7所示的双链DNA片段。序列7中,自5’末端第19至21位核苷酸为起始密码子,第22至54位核苷酸为的一个单拷贝的HK-1基因,第70至102位核苷酸为第二个单拷贝的HK-1基因,第118至150位核苷酸为第三个单拷贝的HK-1基因,第151至第153位核苷酸为终止密码子。

(2)用限制性内切酶BamH I和Not I酶切步骤(1)的双链DNA片段,回收酶切产物。

(3)用限制性内切酶BamH I和Not I酶切重组质粒proVAX/S2,回收载体骨架(约4446bp)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接,得到重组质粒proVAX/S2-3HK-1。根据测序结果,对重组质粒proVAX/S2-3HK-1进行结构描述如下:在重组质粒proVAX/S2的BamH I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列7自5’末端第19至153位核苷酸所示的DNA片段(3HK-1基因,又称多拷贝HK-1基因)。重组质粒proVAX/S2-3HK-1中,S2基因与3HK-1基因形成序列表的序列8所示的S2-3HK-1融合基因。

二、重组质粒的鉴定

分别将proVAX载体、重组质粒proVAX/S2、重组质粒proVAX/S2-HK-1、重组质粒proVAX/S2-3HK-1转染NIH/3T3细胞。采用invitrogen公司LipofectamineTM2000试剂按照说明书进行转染,转染剂量为每105个细胞转染1微克重组质粒。

太阳城集团转染48小时后,提取细胞的总RNA,通过RT-PCR鉴定目的基因。采用F1和R1组成的引物对鉴定重组质粒proVAX/S2(靶序列约846bp),采用F2和R2组成的引物对鉴定重组质粒proVAX/S2-HK-1(靶序列约894bp),采用F3和R3组成的引物对鉴定重组质粒proVAX/S2-3HK-1(靶序列约996bp)。

太阳城集团F1:5’-ATGCAGTGGAACTCCACA-3’;

太阳城集团R1:5’-TCAAATGTATACCCAAGG-3’。

F2:5’-ATGCAGTGGAACTCCACA-3’;

R2:5’-TCACATCAGACCATAGAA-3’。

F3:5’-ATGCAGTGGAACTCCACA-3’;

R3:5’-TCACATCAGACCATAGAA-3’。

RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1。转染重组质粒proVAX/S2的细胞显示目的条带(S2基因)。转染重组质粒proVAX/S2-HK-1的细胞显示目的条带(S2-HK-1融合基因)。转染重组质粒proVAX/S2-3HK-1的细胞在显示目的条带(S2-3HK-1融合基因)。而转染载体proVAX的细胞和未转染质粒的细胞均没有相应的基因条带产生,说明步骤一构建的3个重组质粒都可以在真核细胞中表达。

太阳城集团三、多肽片段的制备

分别人工合成如下多肽:序列表的序列1所示的HK-1多肽和序列表的序列3所示的3HK-1多肽。

太阳城集团实施例2、HK-1基因和3HK-1基因对免疫的促进作用

一、动物的免疫

太阳城集团将6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分成6组,每组30只,第一组至第五组分别进行如下处理(第六组为不进行任何处理的平行对照):

第一组:用PBS缓冲液免疫小鼠,每只小鼠的单次免疫剂量为100微升;

太阳城集团第二组:用proVAX载体免疫小鼠,每只小鼠的单次免疫剂量为100微克(用PBS缓冲液调整质粒的体积至100微升);

第三组:用重组质粒proVAX/S2免疫小鼠,每只小鼠的单次免疫剂量为100微克(用PBS缓冲液调整质粒的体积至100微升);

第四组:用重组质粒proVAX/S2-HK-1免疫小鼠,每只小鼠的单次免疫剂量为100微克(用PBS缓冲液调整质粒的体积至100微升);

第五组:用重组质粒proVAX/S2-3HK-1免疫小鼠,每只小鼠的单次免疫剂量为100微克(用PBS缓冲液调整质粒的体积至100微升)。

免疫方式为肌肉注射。免疫三次,分别于实验第0天,第14天和第28天各免疫一次。

太阳城集团二、HK-1基因和3HK-1基因促进抗体的产生

分别在实验第14天、第28天和第42天免疫前收集血清(每组随机选取三只小鼠),采用乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒(购自北京金豪制药有限公司,批号S20053020,其中包括HBsAg;按说明书进行操作)定量检测IgG。

采用抗乙肝的参比抗体(8IU/ml;IU,国际单位)(北京金豪制药有限公司,批号20060701)按2倍稀释5个梯度,按说明书操作并显色,置于450nm/620nm测定每孔光密度值,制作标准曲线。

结果见图2(平均值)。与重组质粒proVAX/S2注射组相比,重组质粒proVAX/S2-HK-1注射组和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组产生的IgG水平显著增加。特别是重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组,产生了最高水平的IgG。结果表明,HK-1基因(单拷贝HK-1基因或多拷贝HK-1基因)均可作为疫苗佐剂有效增强HBV DNA疫苗的体液免疫反应。

三、HK-1基因和3HK-1基因促进B细胞的激活

B细胞激活通常会伴随共刺激分子CD80和CD86的表达。

实验第7天,每组随机选取三只小鼠,取脾细胞和淋巴结细胞,分别使用anti-B220和anti-CD80(或anti-CD86)进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团结果见图3(A为脾细胞,B为淋巴结细胞)。免疫了重组质粒proVAX/S2-HK-1或重组质粒proVAX/S2-3HK-1的小鼠,其表达共刺激分子CD80和CD86的B220+细胞在数量上要明显多于免疫了重组质粒proVAX/S2的小鼠和免疫了proVAX载体的小鼠。结果表明,HK-1基因(单拷贝HK-1基因或多拷贝HK-1基因)作为疫苗佐剂可以促进B细胞的激活。

四、HK-1基因和3HK-1基因促进浆细胞的分化

实验第15天,每组随机选取三只小鼠,取脾细胞,使用anti-B220和anti-CD138进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团结果见图4。重组质粒proVAX/S2注射组产生了少量的B220-CD138+细胞。重组质粒proVAX/S2-HK-1注射组和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组产生了大量的B220-CD138+细胞。特别是重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组,与重组质粒proVAX/S2注射组相比,B220-CD138+细胞的数量有3倍的提升。结果表明,HK-1基因(单拷贝HK-1基因或多拷贝HK-1基因)作为DNA疫苗佐剂,可以影响浆细胞的分化。

浆细胞的分化受到多种转录因子调控。起正向调控的转录因子有Blimp-1和Xbp-1,起负向调控的有Bcl-6和Pax-5。使用RT-PCR的方法分析细胞中这些转录因子的表达。

太阳城集团用于检测Blimp-1的引物对如下:5’-GGAGGATCTGACCCGAAT 3’;5’-TCCTCAAGACGGTCTGCA 3’;靶序列约为175bp。

太阳城集团用于检测Xbp-1的引物对如下:5’-ACACGCTTGGGAATGGACAC 3’;5’-CCATGGGAAGATGTTCTGGG 3’;靶序列约为133bp。

用于检测Bcl-6的引物对如下:5’-TCAGAGTATTCGGATTCTAGCTGTGA 3’;5’-TGCAGCGTGTGCCTCTTG 3’;靶序列约为156bp。

太阳城集团用于检测Pax-5的引物对如下:5’-CAACAAACGCAAGAGGG 3’;5’-GGGCTCGTCAAGTTGG 3’;靶序列约为127bp。

用于检测HPRT的引物对如下:5’-CTGGTGAAAAGGACCTCTCG 3’;5’-TGAAGTACTCATTATAGTCAAGGGCA 3’;靶序列约为165bp。

太阳城集团结果见图5(以HPRT的表达量为1)。与proVAX/S2注射组相比,重组质粒proVAX/S2-HK-1注射组和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组中Blimp-1和Xbp-1的表达显著上调,而Bcl-6和Pax-5的表达水平相对较低。结果表明,HK-1基因(单拷贝HK-1基因或多拷贝HK-1基因)作为疫苗佐剂通过修饰多种转录因子的表达,进而影响浆细胞的分化。

太阳城集团五、HK-1基因和3HK-1基因影响免疫记忆

从预防的角度,好的疫苗应该可以诱导高效长时的免疫记忆细胞。CD27是一个能够协助B细胞向记忆性细胞分化的信号分子。实验第58天,每组随机选取三只小鼠,取脾细胞,使用anti-B220和anti-CD27进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团结果见图6。重组质粒proVAX/S2注射组产生了一定数量的B220+CD27+细胞。重组质粒proVAX/S2-HK-1注射组和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组产生了更多的B220+CD27+细胞。特别是重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组,产生的该亚群细胞数量最多。

太阳城集团如果再次受到抗原的刺激,记忆性B细胞具有迅速增殖并产生大量抗体的能力。,每组随机选取三只小鼠进行如下实验:实验第88天采集血清;然后用HBsAg肌肉注射小鼠(每只小鼠的注射剂量为3微克),实验第95天再次采集血清。ELISA检测HBsAg特异性抗体的产生水平(同步骤二)。结果见图7(平均值)。与重组质粒proVAX/S2注射组相比,重组质粒proVAX/S2-HK-1注射组和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组产生了更高水平的抗体。特别是重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组,血清中的抗体水平最高。

结果表明,HK-1基因(单拷贝HK-1基因或多拷贝HK-1基因)作为疫苗佐剂可能可以影响记忆性B细胞的分化因而影响机体再次受到抗原刺激后抗体的产生。

太阳城集团六、HK-1基因和3HK-1基因作为疫苗佐剂增强T淋巴细胞增殖

太阳城集团实验第35天,每组随机选取三只小鼠,将小鼠处死。于无菌条件下取出小鼠整个脾脏,小心分离脾脏细胞。将脾脏细胞悬液通过尼龙柱除去B细胞,细胞计数后将细胞浓度调整为2×106个/毫升。将细胞悬液加入96孔细胞培养板,每孔100μl。每孔加入20μl刺激物[阳性对照为0.1μg/ml佛波醇酯(PMA)加1μg/ml离子霉素(Ion),阴性对照为5μg/ml小牛血清白蛋白(BSA),实验组为5μg/ml重组HBsAg抗原]。每组各设3个复孔,另外设3个只加培养基的空白对照。将处理后的细胞在无菌培养箱中,于37℃5%CO2的条件下培养48小时(48-72小时均可)。每孔加入20μl5μg/ml噻唑蓝(MTT),37℃5%CO2的条件下继续培养4小时。室温1500×g离心10分钟,将上清小心吸出。每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO),充分震荡混匀,于OD490nm测定出每孔的光密度值。T淋巴细胞增殖水平通过以下公式计算:刺激指数(SI)=(OD实验组-OD空白对照组)/(OD阴性对照组-OD空白对照组)。

太阳城集团结果见图8(平均值)。与重组质粒proVAX/S2注射组相比,重组质粒proVAX/S2-HK-1注射组和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组小鼠脾脏T细胞的增殖水平更强。结果表明,HK-1基因(单拷贝HK-1基因或多拷贝HK-1基因)作为疫苗佐剂可以增强抗原特异性的T细胞反应。

太阳城集团七、HK-1基因和3HK-1基因对细胞因子表达的影响

太阳城集团在免疫反应中,细胞因子起到非常重要的作用。实验第35天,每组随机选取三只小鼠,分离脾脏细胞,使用anti-CD4加anti-IL-4、anti-CD4加anti-IL-21、anti-CD4加anti-IFN-γ、anti-CD8加anti-IFN-γ对脾脏细胞进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团结果见图9。CD4+T细胞中的IL-4和IFN-γ,CD8+T细胞中的IFN-γ在重组质粒proVAX/S2、重组质粒proVAX/S2-HK-1和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组中的表达没有显著差异。与重组质粒proVAX/S2注射组相比,在重组质粒proVAX/S2-HK-1和重组质粒proVAX/S2-3HK-1注射组中CD4+T细胞中的IL-21+细胞亚群的数量显著上调。

实施例3、HK-1多肽和3HK-1多肽对免疫的促进作用

滤泡辅助性CD4+T细胞(Tfh细胞)是位于生发中心内的辅助性CD4+T细胞,广泛参与生发中心的产生和维持,特异性抗体的产生,亲和力成熟和同种型转换等过程,在特异性体液免疫过程中发挥至关重要的作用,其数量的增多或功能的增强可能促进特异性抗体产生,从而提高机体的体液免疫反应。

太阳城集团Tfh诱导培养液由RPMI 1640和如下浓度的溶质组成:anti-CD3 2μg/mL、anti-CD28 2μg/mL、anti-IL-4 10μg/mL、anti-IFN-γ 10μg/mL、anti-TGF-β20μg/mL和IL-21 30ng/mL。

太阳城集团一、HK-1多肽和3HK-1多肽体外促进Tfh细胞的分化

实施例2的步骤一中,实验第30天,每组随机选取三只小鼠,分离脾脏细胞和淋巴结细胞(LN),采用流式细胞仪从脾脏细胞中筛选CD4+ T细胞。

在Tfh诱导培养液中加入HK-1多肽,使其浓度为0.5mM(设置不加入多肽的空白对照);然后加入CD4+T细胞(或淋巴结细胞),使其浓度为1.0×106cell/mL。培养3天后(或4天后),使用anti-CXCR5和anti-ICOS对CD4+T细胞(或淋巴结细胞)进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团在Tfh诱导培养液中加入3HK-1多肽,使其浓度为0.024mM(设置不加入多肽的空白对照);然后加入CD4+T细胞(或淋巴结细胞),使其浓度为1.0×106cell/mL。培养3天后(或4天后),使用anti-CXCR5和anti-ICOS对CD4+T细胞(或淋巴结细胞)进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团培养3天后的结果见图10,CXCR5和ICOS双阳性细胞即Tfh细胞。加入HK-1多肽或3HK-1多肽后,Tfh细胞比例增高了,尤其是3HK-1多肽的作用更为明显。结果表明,HK-1多肽(单拷贝HK-1多肽或多拷贝HK-1多肽)在体外可以促进Tfh细胞的分化。

培养4天后的结果见图11。与培养3天后的结果一致。

二、HK-1多肽和3HK-1多肽体外促进Tfh细胞的功能

太阳城集团Tfh细胞在体内可以通过分泌细胞因子等方式促进体液免疫,其中最重要的细胞因子是IL-21,IL-21可以促进B细胞浆细胞化,同时也可以促进幼稚CD4+T细胞向Tfh细胞方向分化,是Tfh细胞的标志性细胞因子。

实施例2的步骤一中,实验第30天,每组随机选取三只小鼠,分离脾脏细胞和淋巴结细胞(LN),采用流式细胞仪从脾脏细胞中筛选CD4+T细胞。

太阳城集团在Tfh诱导培养液中加入HK-1多肽,使其浓度为0.5mM(设置不加入多肽的空白对照);然后加入CD4+T细胞(或淋巴结细胞),使其浓度为1.0×106cell/mL。培养4天后,使用anti-IL-21和anti-CD4对CD4+T细胞(或淋巴结细胞)进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团在Tfh诱导培养液中加入3HK-1多肽,使其浓度为0.024mM(设置不加入多肽的空白对照);然后加入CD4+T细胞(或淋巴结细胞),使其浓度为1.0×106cell/mL。培养4天后,使用anti-IL-21和anti-CD4对CD4+T细胞(或淋巴结细胞)进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团结果见图12。加入HK-1多肽或3HK-1多肽后,在分化的Tfh细胞群体中,分泌IL-21的Tfh细胞比例增多,尤其是3HK-1多肽的作用更为明显。结果表明,HK-1多肽(单拷贝HK-1多肽或多拷贝HK-1多肽)在体外可以促进Tfh细胞分泌IL-21。

三、HK-1多肽和3HK-1多肽在体内促进Tfh细胞的分化

太阳城集团实验第1天,用NP15-KLH对C57BL/6小鼠进行尾根部注射(50μg/只),然后将小鼠分为三组,每组3只,分别进行如下处理:

太阳城集团第一组:尾静脉注射100微升蒸馏水;

太阳城集团第二组:尾静脉注射HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.25微摩(用蒸馏水调整体积至100微升);

太阳城集团第三组:尾静脉注射3HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.072微摩(用蒸馏水调整体积至100微升)。

太阳城集团实验第7天,将小鼠处死,取脾脏,碾磨成单细胞悬液,使用anti-CXCR5和anti-PD-1进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

太阳城集团结果见图13。注射HK-1多肽或3HK-1多肽的小鼠,其脾脏内Tfh细胞(CXCR5和PD-1双阳性细胞)的比例增高,尤其是3HK-1多肽的作用更为明显。结果表明,HK-1多肽(单拷贝HK-1多肽或多拷贝HK-1多肽)在体内也可以促进Tfh细胞的分化。

四、HK-1多肽和3HK-1多肽促进生发中心反应

Tfh细胞在体内的重要作用之一是参与生发中心的产生和维持。

实验第1天,用NP15-KLH对C57BL/6小鼠进行尾根部注射(50μg/只),然后将小鼠分为三组,每组3只,分别进行如下处理:

第一组:尾静脉注射100微升蒸馏水;

第二组:尾静脉注射HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.25微摩(用蒸馏水调整体积至100微升);

第三组:尾静脉注射3HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.072微摩(用蒸馏水调整体积至100微升)。

太阳城集团实验第7天,将小鼠处死,取脾脏,碾磨成单细胞悬液,使用anti-B220和PNA进行流式细胞仪染色分析(结果取平均值)。

结果见图14。给予尾静脉注射HK-1的小鼠,其脾脏内生发中心B细胞(PNA阳性B细胞)比例增高,表明生发中心反应增强,尤其是三联体的3HK-1作用更明显。说明HK-1在体内可以增强生发中心反应。

太阳城集团五、HK-1促进特异性抗体的产生

B细胞在生发中心经过克隆选择,亲和力成熟,同种型转换等复杂的过程,特异性和亲和力逐渐提高并发生浆细胞化,从而产生能分泌特异性抗体的浆细胞,发挥体液免疫的功能。

实验第1天,用NP15-KLH对C57BL/6小鼠进行尾根部注射(50μg/只),然后将小鼠分为三组,每组3只,分别进行如下处理:

太阳城集团第一组:尾静脉注射100微升蒸馏水;

太阳城集团第二组:尾静脉注射HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.25微摩(用蒸馏水调整体积至100微升);

太阳城集团第三组:尾静脉注射3HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.072微摩(用蒸馏水调整体积至100微升)。

太阳城集团实验第7天,取血清,通过Elisa检测血清中的总IgM和总IgG水平,同时利用NP26-BSA检测NP特异性抗体的水平。

检测总IgG水平时,采用羊抗小鼠IgG(Millipore,AP503)作为包被抗原,包被浓度为1μg/ml,采用羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG抗体(Sigma)作为酶标二抗。

太阳城集团检测总IgM水平时,采用大鼠抗小鼠IgM(BD,553435)作为包被抗原,包被浓度为1μg/ml,采用羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgM抗体(Sigma)作为酶标二抗。

检测NP特异性IgG(NP-IgG)水平时,采用NP26-BSA(Biosearch Technologies,N-5050)作为包被抗原,包被浓度为50μg/ml,采用羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgG抗体(Sigma)作为酶标二抗。

检测NP特异性IgM(NP-IgM)水平时,采用NP26-BSA(Biosearch Technologies,N-5050)作为包被抗原,包被浓度为50μg/ml,采用羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记IgM抗体(Sigma)作为酶标二抗。

结果如图15所示,注射HK-1之后,小鼠体内的总抗体水平和特异性抗体水平都增高,尤其是三联体的3HK-1作用更明显。说明HK-1可以促进免疫反应特异性抗体的产生。

太阳城集团六、HK-1促进BCL-6的表达

太阳城集团BCL-6是具有锌指结构的抑制性转录因子,是目前已知的正向调控Tfh细胞分化的主要转录因子,BCL-6不仅在Tfh细胞中高表达,而且其表达水平的下调直接影响Tfh细胞的分化和维持。

太阳城集团用于RT-PCR  检测BCL-6的表达水平的引物对如下:F:5’-AGCCAACCTGAAGACCCACAC-3’;R:5’-CTGAGAAGGGGCTGGAGAGGA-3’。

1、体外诱导

实施例2的步骤一中,实验第30天,每组随机选取三只小鼠,分离脾脏细胞,采用流式细胞仪从脾脏细胞中筛选CD4+T细胞。

在Tfh诱导培养液中加入HK-1多肽,使其浓度为0.5mM(设置不加入多肽的空白对照);然后加入CD4+T细胞(或淋巴结细胞),使其浓度为1.0×106cell/mL。培养3天后(或4天后),通过RT-PCR检测BCL-6的表达水平。

在Tfh诱导培养液中加入3HK-1多肽,使其浓度为0.024mM(设置不加入多肽的空白对照);然后加入CD4+T细胞(或淋巴结细胞),使其浓度为1.0×106cell/mL。培养3天后(或4天后),通过RT-PCR检测BCL-6的表达水平。

结果见图16。

2、体内诱导

太阳城集团实验第1天,用NP15-KLH对C57BL/6小鼠进行尾根部注射(50μg/只),然后将小鼠分为三组,每组3只,分别进行如下处理:

第一组:尾静脉注射100微升蒸馏水;

第二组:尾静脉注射HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.25微摩(用蒸馏水调整体积至100微升);

第三组:尾静脉注射3HK-1多肽,每只小鼠的单次免疫剂量为0.072微摩(用蒸馏水调整体积至100微升)。

太阳城集团实验第7天,分离脾脏细胞,采用流式细胞仪从脾脏细胞中筛选CD4+T细胞,通过RT-PCR检测BCL-6的表达水平。

结果见图17。

步骤1和步骤2的结果均说明,HK-1可以促进BCL-6的表达,尤其是三联体的3HK-1作用更明显。提示HK-1可能通过促进BCL-6的表达促进Tfh细胞的分化。

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