太阳城集团

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一种稳定的复合辅酶制剂、其制备方法及应用.pdf

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一种 稳定 复合 辅酶 制剂 制备 方法 应用
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201310298764.9

申请日:

20130717

公开号:

太阳城集团CN103341155B

公开日:

20150311

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:
IPC分类号: A61K38/06,A61K47/26,A61K47/18,A61K9/19,A61P9/00,A61P1/00,A61K31/7076,A61K31/7084 主分类号: A61K38/06,A61K47/26,A61K47/18,A61K9/19,A61P9/00,A61P1/00,A61K31/7076,A61K31/7084
申请人: 北京双鹭药业股份有限公司,北京双鹭立生医药科技有限公司,北京双鹭生物技术有限公司
发明人: 吴彦卓,杨仲璠,贾东晨,牛罡,刘成东,倪娜,许可,刘晓航,徐明波
地址: 100049 北京市海淀区阜石路69号碧桐园1号楼
优先权: CN201310298764A
专利代理机构: 代理人:
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法律状态
申请(专利)号:

CN201310298764.9

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明首次提供了一种稳定复合辅酶制剂及其制备方法,主要成分及配比为:辅酶A(CoA)90-120U、辅酶I(NAD)0.1-0.3mg/ml、谷胱甘肽(GSH)1-5mg/ml、三磷酸腺苷(ATP)1-2.5mg/ml、黄素单核苷酸(FMN)1.8-12μg/ml、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)3-13μg/ml、二磷酸腺苷(ADP)0.1-0.4mg/ml、一磷酸腺苷(AMP)0.2-0.4mg/ml、腺苷蛋氨酸(SAM)1.2-15μg/ml、葡萄糖酸钙1-5mg/ml、盐酸半胱氨酸0.5-1.5mg/ml、甘露醇0.6-5mg/ml。同时,制备方法克服现有方法中采用高速离心、冻干条件不明确及产品稳定性差的缺点,在制备用于治疗心脑血管病和消化系统疾病药品的实践中有广泛应用。

权利要求书

1.一种稳定的复合辅酶冻干制剂,其主要组成成分为:辅酶A 114单位/ml,辅酶I0.3mg/ml、谷胱甘肽4.8mg/ml、三磷酸腺苷2.4mg/ml、黄素单核苷酸9.0μg/ml、黄素腺嘌呤二核苷酸8.0μg/ml、二磷酸腺苷0.3mg/ml、一磷酸腺苷0.3mg/ml、腺苷蛋氨酸10.0μg/ml、葡萄糖酸钙3mg/ml、盐酸半胱氨酸1.0mg/ml、和甘露醇3mg/ml。2.如权利要求1所述复合辅酶冻干制剂的制备方法,包括以下步骤:1)将冰冻新鲜酵母菌取出,加入纯水搅拌混匀;将悬液加热至90~97℃,立即冷却至20℃至菌体破壁;充分破壁后4390G,4~10℃,离心20分钟收取粗提上清液;2)取对应粗提液上清体积的活性炭装柱,用纯水冲洗平衡柱体;粗提液上清液调pH值至5~5.5上柱,用氨乙醇洗脱液洗脱;3)将洗脱液蒸发浓缩,进行离子交换层析:调节浓缩液pH值7.0,用2~5倍纯水稀释后上阴离子交换柱,用20mM pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱样品;4)将洗脱样品用分子量5000道尔顿超滤器超滤,以洁净容器接取滤过液,此过滤液为复合辅酶原液;以步骤4)获得的复合辅酶为基础,每毫升溶液加入葡萄糖酸钙3mg/ml,加入稳定剂盐酸半胱氨酸1.0mg、3mg/ml甘露醇配制成中间品;中间品用分子量5000道尔顿的超滤器超滤,除菌、灌装,冻干,冻干后获得成品。3.如权利要求1所述复合辅酶冻干制剂在制备用于治疗心脑血管病药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域,发明的核心在于提供了一种稳定的复合辅酶药物制剂、其制备方法及应用。

背景技术

辅酶是人体物质代谢中重要而不可缺少的辅助因子。辅酶复合物因富含多种活性成分(辅酶A、辅酶I、GSH、ATP等)及其相互间的协同增效功能,而对机体的新陈代谢、蛋白质合成、组织及生理功能的动态平衡等具有重要的促进作用,是临床上治疗急慢性肝炎、原发性血小板减少性紫癜、冠状动脉硬化、肾功能不全等疾病的重要辅助药物(秦榜勇余志豪等,2009;沈忠明朱俊毅等,200710037422.6;Rebecca A.Faulkner,Andrew D.Nguyen etc.,2013)。

太阳城集团酵母是单细胞真核生物,其细胞中含有糖、脂肪、蛋白质、核酸等生物物质代谢必需的各种酶(Paul N.Black,Nils J.etc.,2000;Jasmina Mar janovic,Dominika Chalupska,etc.,2010;任雷,任乔,200810063121.5),国外70年代研制出的注射用复合辅酶针剂就是以酵母为基础(Qin Liu,Rodrigo M.P.Siloto,etc.,2011;郑学昌,200410058086.x)。

太阳城集团目前,国内外文献中未见太阳城集团稳定的复合辅酶药物制剂组合物的相关专利报道。中国专利检索到两篇相关专利文献。其中“一种复合辅酶的制备方法及其复合辅酶药和临床的用途”,申请号:2004158086.X,描述了一种制造复合辅酶的方法,并对该方法及制造出来的产物进行了保护(郑学昌,200410058086.x)。其独立权利要求是“一种制造方法”,其它权利要求均为从属权利要求。“一种复合辅酶药的制备方法”,申请号:201010503237.3,描述了复合辅酶的另一种制造方法,并对该方法作为独立权项进行了保护(廖元秋,201010503237.3)。该两项专利均未提及制造产物作为药品所要求的稳定性数据,无从考察其稳定性能;同时,上述文献未涉及制剂学数据,未从制剂研究角度考虑处方组成。

然而,目前小分子多肽类及酶类药物的稳定性是现今制药业制剂科学家的主要挑战。环境中存在多种引起酶类及小分子多肽类可逆和不可逆变化的应力。这些困难提出了对稳定这些灵敏小分子多肽及酶类的实际的要求。在复合辅酶组成成分中,CoA、SAM、ADP、AMP、ATP、GSH等多种物质均存在结构上的不稳定性,在不同的温度、酸碱度、氧化还原因素或组合因素下具有不同的稳定性能。制剂开发的关键步骤,需要选择并加入一定的稳定剂、赋形剂等,并对这些组分及配比进行研究摸索,获得稳定的临床药用制剂(王崧,2010;威廉·埃尔德奇,尼尔·库利等,200680012072.1)。所以,制剂组成是制剂的关键,而制剂的稳定性是一个不可或缺的检测指标,是临床用药质量的根本保证。与此同时,冻干工艺也是不容忽视的一项关键技术,目前尚未见到太阳城集团复合辅酶制备中冻干工艺条件的相关报道。然而,针对复合辅酶这种对热比较敏感、又具有一定表面活性的小分子多肽类药物而言,找到冻干过程中合适的温度和太阳城集团并不是一件容易的事,冻干条件掌控不好,不但会导致药品外观不好,更重要的是会导致冻干后产品萎缩,即导致商业化生产中废品率很高,且批件质量不稳定,难以制备及长期保存。

太阳城集团除此之外,就上述已获授权的两项专利本身涉及的方法而言,在生产应用过程中存在一定弊端:首先,两种方法中使用高速离心(20000-35000CPM和10000-15000G),离心太阳城集团较长(30-60分钟),这样的条件对仪器设备质量要求非常高,且耗能极大,在生产中很难实现,对环境造成严重污染;其次,“一种复合辅酶药的制备方法”专利中直接对离心液进行超滤,在实际生产过程中易造成超滤柱的堵塞,大大降低过滤速度,甚至使过滤停止,对填料造成极大浪费;再次,按此方法小规模生产出的复合辅酶原料,其稳定性也较难控制,批间重现性差;最后,两个专利中冻干工艺条件不明确,按照常规方法又很难重复得到稳定的冻干产品。

太阳城集团由此可知,发明一种简便易行的方法替代复杂步骤具有重要的创新价值及现实应用前景。

发明内容

我公司在复合辅酶研制方面进行了大量的文献检索分析及实验工作,首次提供了一种稳定的复合辅酶制剂及其制备方法,该方法有别于现有的制备方法,更简单易行,可重复性强。同时对该制剂中的所有成分的配比及优选的含量范围进行了研究,提供了一种优化的配比方案。特别地,在研究中惊喜地发现在原料药中按一定比例加入一定比例的葡萄糖酸钙、盐酸半胱氨酸及甘露醇三种成分可起到极好的稳定效果。

在整个研制过程中,我们对比了不同的缓冲体系,如弱酸及其盐缓冲体系(HAc-NaAc)、弱碱及其盐缓冲体系(NH3·H2O-NH4Cl)、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐缓冲体系(NaH2PO4-Na2HPO4)。其中醋酸作为缓冲剂,易使原液pH不稳定,冻干前后差异较大;NH3.H2O--NH4Cl缓冲剂,有一定刺激性;磷酸盐缓冲剂在溶液中含有磷,且调节范围广,不易控制。我们也对比了不同的抗氧化剂在制剂中的应用效果,如谷胱甘肽及维生素C等,结果表明用谷胱甘肽及维生素C效果不理想;我们还对比了常用的赋形剂,如蔗糖、磷酸钙二水化合物等,用蔗糖充当赋形剂,在注射时会引起血糖一过性升高,我们认为这对糖尿病人非常不利;而用磷酸钙作为赋形剂,在检测过程中发现溶液中磷酸根离子有少量增加,pH值有波动。最后,我们惊喜地发现,在复合辅酶制剂中加入葡萄糖酸钙、盐酸半胱氨酸及甘露醇三种成分,这三种成分按一定比例混合可起到极好的稳定效果,此效果通过大量实验已得到证实。以葡萄糖酸钙作为药学缓冲剂作用显著,溶液pH稳定,无有害离子加入,更意想不到的是,加入葡萄糖酸钙后,起到了一种营养增补的作用,动物实验表明,注射加入葡萄糖酸钙的复合辅酶溶液后,小鼠的毛细管通透性降低,心肌收缩加强,血液离子平衡得到一定程度的调节;我们以盐酸半胱氨酸作为抗氧化剂,发现其抗氧化作用极强,且易被快速吸收,同时也可以起到一定的营养补充剂的作用;我们选择甘露醇作为赋形剂,之前对比过它与其他赋形剂的理化特性,发现甘露醇突出表现为无吸湿性,干燥快,化学稳定性好,所以,我们赋形后得出的产品外观特性良好,三种成分按一定比例混合,大大增强了复合辅酶的稳定性,延长保质期,临床效果突出。

太阳城集团在生产过程中本发明首次采用低转速离心(4390G,远低于现有专利中介绍的20000-35000CPM和10000-15000G),效果明显,节约能源;同时本发明首次公布了复合辅酶冻干粉针的冻干工艺,该工艺通过长期、多次摸索,反复实验得出,冻干效果良好,可控性强,参考价值大,大大减少了在产品冻干过程中存在的赋形不好,水分超标,稳定性差等问题。

1.本发明中提供的制剂通过以下方案实现:

1)将冰冻新鲜酵母菌取出,加入纯水搅拌混匀;将悬液加热至90~97℃,立即冷却至20℃使菌体破壁。充分破壁后2810G-5120G,4~10℃,离心20分钟收取粗提上清液。本步骤中采用温差破壁,低转速离心,克服了当前已有方法中采用高转速(20000-35000CPM和10000-15000G)离心的不足之处,降低了对机器的要求,从而节约了成本,更适合大规模生产,增加了批间重现性。

太阳城集团2)取对应粗提液上清体积的活性炭装柱,用纯水冲洗平衡柱体。粗提液上清液调pH值至5~5.5上柱,用氨乙醇洗脱液洗脱,收集洗脱液;

太阳城集团3)将洗脱液蒸发浓缩,将浓缩液调至pH值7.0,用2~5倍纯水稀释后上阴离子交换柱,用20mM pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱,收集洗脱液样品。本步骤克服了现有方法中直接超滤的缺点,由于上一步中获得的洗脱液分子量为5000-8000道尔顿,所以在实际操作中,易造成超滤住的堵塞,大大降低过滤速度,甚至使过滤停止;

4)将洗脱样品用截留分子量为5000道尔顿的超滤器超滤,以洁净容器接取滤过液;

5)在步骤4)所的滤过液中,加水稀释,稀释后每毫升含有辅酶A(CoA)90-120U、辅酶I(NAD)0.1-0.3mg/ml、谷胱甘肽(GSH)1-5mg/ml、三磷酸腺苷(ATP)1-2.5mg/ml、黄素单核苷酸(FMN)1.8-12μg/ml、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)3-13μg/ml、二磷酸腺苷(ADP)0.1-0.4mg/ml、一磷酸腺苷(AMP)0.2-0.4mg/ml、腺苷蛋氨酸(SAM)1.2-15μg/ml;

6)在步骤5)的稀释液中加入下列物质,并使其终浓度为:葡萄糖酸钙1.5-4mg/ml、盐酸半胱氨酸0.8-1.2mg/ml、甘露醇0.6-5mg/ml配制成中间品;中间品用分子量5000道尔顿的超滤器超滤,收集滤出液;

太阳城集团7)将步骤6)收集的滤出液经除菌、灌装;

太阳城集团8)灌装结束后,对产品进行常规预冻,达到要求后进行一次干燥、二次干燥,压塞。特别地,冻干工艺如下:

预冻时,导液温度设定为-46--50℃,导液达到-46℃以下保持2-4小时后开始降冷阱;冷阱温度低于-45℃时开始抽真空,一次干燥,导液温度设定为-20℃,然后导液温度以4-7℃/小时升温,真空度设定为0.17±0.01mbar,真空度控制范围为≤0.20mbar或≤5.10V;二次干燥,导液温度设定为39-41℃到温后保持5-8小时,真空度设定为0.09±0.02mbar,真空度控制范围为≤0.14mbar或≤4.80V;冻干后压盖,送检获得药学性质稳定的复合辅酶冻干制剂产品。

2.为观察上述复合辅酶制剂的稳定性,进行如下实验:

各条件下的稳定性考察指标包括:外观性状、pH值、各组分含量等。

1)影响因素试验:

(1)高温

供试品置于稳定性考察培养箱内,在37℃(由于酶类药物通常贮存温度为20℃以下,所以37℃对于该类药物已算高温)条件下放置10天,于第5天和第10天取样,检测上述有关指标。

(2)高湿

太阳城集团供试品置于稳定性考察培养箱内,于25℃、RH75%±5%条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测吸湿增重等上述相关指标。

(3)强光照射

太阳城集团供试品置光照箱或其它适宜的光照容器内,于照度4500Lx±500Lx条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测上述相关指标。

2)加速试验:

取样品,于25℃,相对湿度75±5%干燥箱内放置六个月。在试验期间于第1、2、3、和6个月各取样检测上述相关指标。

3)长期稳定性:

太阳城集团取样品,20℃以下避光存放,在试验期间于第3、6、9、12、18、24和36个月取样检测上述相关指标。

太阳城集团3.实施例1-3提供了在菌体破壁离心转速分别为2400G、4390G及6320G条件下(现有方法的转速20000-35000CPM和10000-15000G),制备的复合辅酶原料药各主要成分的含量,其中转速为2400G(实施例1)条件下,杂质含量较多,溶液澄清度差;转速为4390G(实施例2)条件下的得到的复合辅酶原料各成分含量最优,该工艺为优选工艺;转速为6320G(实施例3)的条件下,主要成分含量与实施例2相比,会略有减少,分析原因可能是转速加大,导致分子量稍大的有效成分也会损失一部分;

太阳城集团实施例4-8提供了以实施例2的优选工艺获得的复合辅酶原液为基础,条件分别为不加任何辅料(实施例4)、只加入缓冲剂葡萄糖酸钙(实施例5)、加入葡萄糖酸钙和盐酸半胱氨酸(实施例6)、加入葡萄糖酸钙、盐酸半胱氨酸和甘露醇(实施例7)、加入盐酸半胱氨酸和甘露醇(实施例8)配制成中间品。中间品用截留分子量为5000道尔顿的超滤器超滤,除菌、灌装、冻干后获得成品,对其稳定性进行考察,其中加入葡萄糖酸钙、盐酸半胱氨酸和甘露醇(实施例7)条件下,各组分含量稳定,效果理想;

太阳城集团实施例9总结了研发过程中对不同缓冲液、抗氧化剂及赋形剂不同组合的筛选对比试验,共27组,实验结果再次表明,葡萄糖酸钙、盐酸半胱氨酸及甘露醇组合对高温(37±2℃)、高湿(RH75%±5%)及强光照射(光照度4500Lx±500Lx)影响不敏感,pH值稳定;加速实验条件(25℃,相对湿度75+5%)下,六个月各成分含量稳定;长期稳定性实验条件(18±2℃,相对湿度60±5%)下,36个月内各成分含量稳定;

太阳城集团实施例10提供了复合辅酶冻干粉针剂溶解后的动物药效学实验,结果表明复合辅酶提高了CPR大鼠SOD、Na+-K+-ATPase活力,改善组织细胞能量代谢对抗氧自由基的损伤,使凋亡相关基因Fas表达降低,凋亡细胞明显减少,对CPR后的大鼠有保护作用,对心跳暂停和CPR预后有明显改善作用。

太阳城集团4.复合辅酶药物制剂的质量参数及标准如下:

太阳城集团本发明意外地发现并通过大量实验证实了按一定比例在复合辅酶中加入葡萄糖酸钙、盐酸半胱氨酸及甘露醇三种成分(其优选含量范围为:盐酸半胱氨酸0.5-1.5mg/ml、葡萄糖酸钙1-5mg/ml、甘露醇0.6-5mg/ml),可起到极好的稳定效果,优于其他组合方式,大大延长了保质期,降低了对保存条件的要求,是未见文献报道的制剂组合物,体现了发明的创造性和新颖性;本发明在生产过程中采用低转速离心,提高了大规模生产的可操作性,减少了对能量的损耗和环境的污染,降低了对设备的要求;本发明提供了详细的冻干条件,简单实用可操作,批件重复性好,具有很强的实用价值,这些特征在现有文献中未曾述及;本发明还涉及到具体的冻干工艺,特定的冻干工艺参数是成功制备冻干符合服酶制剂的必备条件之一。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。

实施例1:

1)将冰冻新鲜酵母菌取出,加入纯水搅拌混匀;将悬液加热至90~97℃,立即冷却至20℃至菌体破壁。充分破壁后2400G,4~10℃,离心20分钟收取粗提上清液;

2)取对应粗提液上清体积的活性炭装柱,用纯水冲洗平衡柱体。粗提液上清液调pH值至5~5.5上柱,用乙醇氨洗脱液沈脱;

3)将洗脱液蒸发浓缩,进行离子交换层析:调节浓缩液pH值7.0,用2~5倍纯水稀释后上阴离子交换柱,用20mM pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱样品;

4)将洗脱样品用分子量5000道尔顿超滤器超滤,以洁净容器接取滤过液,此过滤液为复合辅酶原液。

各组分含量检测结果如下:

结果分析:溶液杂质含量高,澄清度低,仅有复合辅酶A达到参考标准,其他成分含量均未达标。

实施例2:

1)将冰冻新鲜酵母菌取出,加入纯水搅拌混匀;将悬液加热至90~97℃,立即冷却至20℃至菌体破壁。充分破壁后4390G,4~10℃,离心20分钟收取粗提上清液;

2)取对应粗提液上清体积的活性炭装柱,用纯水冲洗平衡柱体。粗提液上清液调pH值至5~5.5上柱,用氨乙醇洗脱液洗脱;

3)将洗脱液蒸发浓缩,进行离子交换层析:调节浓缩液pH值7.0,用2~5倍纯水稀释后上阴离子交换柱,用20mM pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱样品;

太阳城集团4)将洗脱样品用分子量5000道尔顿超滤器超滤,以洁净容器接取滤过液,此过滤液为复合复酶原液。

产品分析结果如下:

太阳城集团结果分析:溶液澄清度高,无可见异物,各组分含量均达到并超过参考标准。

实施例3:

1)将冰冻新鲜酵母菌取出,加入纯水搅拌混匀;将悬液加热至90~97℃,立即冷却的至20℃至菌体破壁。充分破壁后6320G,4~10℃,离心20分钟收取粗提上清液;

太阳城集团2)取对应粗提液上清体积的活性炭装柱,用纯水冲洗平衡柱体。粗提液上清液调pH值至5~5.5上柱,用氨乙醇洗脱液洗脱;

3)将洗脱液蒸发浓缩,进行离子交换层析:调节浓缩液pH值7.0,用2~5倍纯水稀释后上阴离子交换柱,用20mM pH8.0磷酸盐缓冲液洗脱样品;

太阳城集团4)将洗脱样品用分子量5000道尔顿超滤器超滤,以洁净容器接取滤过液,此过滤液为复合辅酶原液。

产品组分分析结果如下:

结果分析:虽然主要成分含量均已达到参考标准,但是与实施例二所得结果相比,并无明显优越性,且使分子量较大的辅酶A、辅酶I、三磷酸腺苷、黄素单核苷酸及腺苷蛋氨酸的含量减少。

太阳城集团综上所述,制备方法中离心转速为2810-5120G(4000-6000rpm)即可满足需求,提升转速对于原液中有效成分含量并不能起到明显提升的作用。根据实施例2所得的最优原液,对冻干工艺进行摸索,进一步对其辅料配比做了深入研究:

实施例4:

太阳城集团以实施例二的工艺获得的复合辅酶为基础,不加任何辅料配制成中间品。中间品用分子量5000道尔顿的超滤器超滤,除菌、灌装,多次尝试用不同冻干条件,对温度(预冻温度尝试过-70--76℃、-60--64℃、-50--58℃、-46--50℃、-40--47℃;导液第二次干燥温度尝试过37-40℃、39-41℃、41-44℃、45-48℃;)、保持太阳城集团(预冻保持太阳城集团1-3小时、2-4、4-6小时、第二次干燥保持太阳城集团2-5小时、5-8小时)、升温梯度及真空控制范围等条件进行详细摸索,最终得出以下冻干工艺效果较好:-46--50℃导液温度预冻,达到-46℃以下保持2-4小时后开始降冷阱,冷阱后抽真空,-20℃导液一次干燥,导液温度以4-7℃/小时升温,真空度设定为0.17±0.01mbar,真空度控制范围为≤0.20mbar或≤5.10V。39-41℃导液二次干燥保持5-8小时,真空度设定为0.09±0.02mbar,真空度控制范围为≤0.14mbar或≤4.80V。冻干后获得成品。

对产品进行稳定性考察,分析结果如下:

1)影响因素试验:

(1)高温

太阳城集团供试品置密封洁净容器中,在37±2℃条件下放置10天,于第5天和第10天取样,检测有关指标。检测结果见下表:

(2)高湿

太阳城集团供试品置恒湿密闭容器中,于25±2℃、RH75%±5%条件下放置10天,在第5天和第10天取样,检测有关指标。检测结果见下表:

(3)强光照射

供试品置光照箱或其它适宜的光照容器内,于照度4500Lx±500Lx条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测。检测结果如下表:

2)加速试验:

太阳城集团取样品,于37±2℃,相对湿度75±5%干燥箱内放置六个月。在试验期间于第1、2、3、和6个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

3)长期稳定性:

太阳城集团取样品低于18±2℃放置,相对湿度60±5%的条件下放置,在试验期间于第3、6、9、12、18、24和36个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

实施例5:

太阳城集团以实施例二的工艺获得的复合辅酶为基础,每毫升溶液加入葡萄糖酸钙3mg/ml,配制成中间品。中间品用分子量5000道尔顿的超滤器超滤,除菌、灌装,按实施例4方法进行冻干,冻干后获得成品。

太阳城集团对产品进行稳定性试验,分析结果如下:

1)影响因素试验:

(1)高温

太阳城集团供试品置密封洁净容器中,在37±2℃条件下放置10天,于第5天和第10天取样,检测有关指标。检测结果见下表:

(2)高湿

太阳城集团供试品置恒湿密闭容器中,于25±2℃、RH75%±5%条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测吸湿增重等有关指标。检测结果见下表:

(3)强光照射

太阳城集团供试品置光照箱或其它适宜的光照容器内,于照度4500Lx±500Lx条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测。检测结果如下表:

2)加速试验:

取样品,于37±2℃,相对湿度75±5%干燥箱内放置六个月。在试验期间于第1、2、3和6个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

3)长期稳定性:

取样品于18±2℃,相对湿度60±5%的条件下放置,在试验期间于第3、6、9、12、18、24和36个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

实施例6:

太阳城集团以实施例二的工艺获得的复合辅酶为基础,每毫升溶液加入葡萄糖酸钙3mg/ml,加入稳定剂盐酸半胱氨酸2.0mg配制成中间品。中间品用分子量5000道尔顿的超滤器超滤,除菌、灌装、按实施例4方法进行冻干,冻干后获得成品。

太阳城集团对产品进行稳定性试验,分析结果如下:

1)影响因素试验:

(1)高温

太阳城集团供试品置密封洁净容器中,在37±2℃条件下放置10天,于第5天和第10天取样,检测有关指标。检测结果见下表:

(2)高湿

供试品置恒湿密闭容器中,于25±2℃、RH75%±5%条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测吸湿增重等有关指标。检测结果见下表:

(3)强光照射

太阳城集团供试品置光照箱或其它适宜的光照容器内,于照度4500Lx±500Lx条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测。检测结果如下表:

2)加速试验:

取样品于37±2℃,相对湿度75±5%干燥箱内放置六个月。在试验期间于第1、2、3、和6个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

3)长期稳定性:

太阳城集团取样品在18±2℃,相对湿度60±5%的条件下放置,在试验期间于第3、6、9、12、18、24和36个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,

测定结果见下表:

实施例7:

以实施例二的工艺获得的复合辅酶为基础,每毫升溶液加入葡萄糖酸钙3mg/ml,加入稳定剂盐酸半胱氨酸1.0mg、3mg/ml甘露醇配制成中间品。中间品用分子量5000道尔顿的超滤器超滤,除菌、灌装,按实施例4方法进行冻干,冻干后获得成品。

对产品进行稳定性试验,分析结果如下:

1)影响因素试验:

(1)高温

太阳城集团供试品置密封洁净容器中,在37±2℃条件下放置10天,于第5天和第10天取样,检测有关指标。检测结果见下表:

(2)高湿

太阳城集团供试品置恒湿密闭容器中,于25±2℃、RH75%±5%条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测吸湿增重等有关指标。检测结果见下表:

(3)强光照射

供试品置光照箱或其它适宜的光照容器内,于照度4500Lx±500Lx条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测。检测结果如下表:

2)加速试验:

取样品于37±2℃,相对湿度75±5%干燥箱内放置六个月。在试验期间于第1、2、3、和6个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

3)长期稳定性:

取样样品于18±2℃,相对湿度60±5%的条件下放置,在试验期间于第3、6、9、12、18、24和36个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

实施例8:

以实施例二的工艺获得的复合辅酶为基础,每毫升溶液加入稳定剂盐酸半胱氨酸1.0mg、3%甘露醇配制成中间品。中间品用分子量5000道尔顿的超滤器超滤,除菌、灌装,按实施例4的方法进行冻干,冻干后获得成品。

对产品进行稳定性试验,分析结果如下:

1)影响因素试验:

(1)高温

供试品置密封洁净容器中,在37±2℃条件下放置10天,于第5天和第10天取样,检测有关指标。检测结果见下表:

(2)高湿

太阳城集团供试品置恒湿密闭容器中,于25±2℃、RH75±5%条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测吸湿增重等有关指标。检测结果见下表:

(3)强光照射

供试品置光照箱或其它适宜的光照容器内,于光照度4500Lx±500Lx条件下放置10天,在第5天和第10天取样检测。检测结果如下表:

2)加速试验:

太阳城集团取样品于37±2℃,相对湿度75±5%干燥箱内放置六个月。在试验期间于第1、2、3、和6个月各取样一次,对其对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

3)长期稳定性:

太阳城集团取样品于18±2℃,相对湿度60±5%的条件下放置,在试验期间于第3、6、9、12、18、24和36个月各取样一次,对其性状、pH值、颜色及有关物质含量进行严格检测,测定结果见下表:

实施例9:

针对不同的缓冲体系、抗氧化剂和赋形剂组合,我们做了27组稳定性对比试验,组合方式如下:

实验结果表明:在27种组合中,葡-盐-甘(葡萄糖酸钙、盐酸半胱氨酸及甘露醇)组合对高温(37±2℃)、高湿(RH75%±5%)及强光照射(光照度4500Lx±500Lx)影响不敏感,pH值稳定;加速实验条件(25±2℃,相对湿度75±5%)下,六个月各成分含量稳定;长期稳定性实验条件(18±2℃,相对湿度60±5%)下,36个月内各成分含量稳定。在此,稳定性数据不一一赘述。

实施例10:

用实施例7的方案制备的复合辅酶,对心脏复苏(CPR)后大鼠甲状腺的保护作用,实验如下:

使用窒息(琥珀酰胆碱)合并0.5M冰氯化钾停跳液至大鼠心跳骤停,5分钟后开始心脏复苏。实验分三组:1)对照组大鼠不经窒息、心脏骤停和心脏复苏;2)常规复苏组大鼠(心脏复苏后24小时);3)复合辅酶实验组:常规药物复苏同时给予复合辅酶(每一支/10Kg)生理盐水稀释后腹腔注入,复苏后12小时再给同等剂量。每组八只大鼠。

(1)实验大鼠血清甲状腺素T3、T4促甲状腺激素的变化如下表:

分组 T3(ng/ml) T4(Hg/dl) TSH(μlU/ml) 对照组 0.62±0.04 5.39±0.42 1.73±0.5 常规复苏组 0.22±0.05 1.47±0.35 1.45±0.35 复合辅酶组 0.31±0.4 2.51±0.54 1.60±0.26

统计学分析结果表明,复合辅酶组与对照组及常规组间存在显著性差异(P<0.05)结果显示:CPR会造成血清T3、T4、TSH浓度明显下降,但常规复苏组明显低于复合辅酶组,两组T3、T4有显著差别。

(2)甲状腺组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、Na+-K+-ATPase活力如下表:

复合辅酶组分别与对照组及常规组比P均小于0.05。

太阳城集团结果显示:复合辅酶组甲状腺组织中MDA含量明显高于对照组,低于常规复苏组;SOD活力和Na+-K+-ATPase活力都低于对照组,显著高于常规复苏组。

太阳城集团(3)实验鼠原位末端转移酶标记(Tunel标记)变化如下表所示:

太阳城集团 分组 n 阳性细胞数(个) 平均灰度值(%) 对照组 8 4.99±1.36 72.03±6.71 常规复苏组 8 36.72±3.66 38.88±3.46 复合辅酶组 8 27.23±4.00 56.24±4.03

复合辅酶组分别与对照组及常规组比P均小于0.05。

太阳城集团结果显示:复合辅酶组阳性细胞数和平均灰度值均介于对照组和常规复苏组之间,常规复苏组及复合辅酶组间的差异有统计学意义。

(4)实验大鼠Fas表达差异的研究如下表所示:

太阳城集团结果分析:复合辅酶组Fas基因表达阳性细胞数和平均灰度与常规复苏组比较有显著差异。

综上所述,该实施例表明:

1)复合辅酶提高了CPR大鼠SOD、Na+-K+-ATPase活力,改善组织细胞能量代谢对抗氧自由基的损伤,并表现为组织中脂质过氧化降解产物MDA的含量低于常规复苏组;

太阳城集团2)复合辅酶使凋亡相关基因Fas表达降低,凋亡细胞明显减少,对CPR后的大鼠有保护作用;

3)复合辅酶对心跳暂停和CPR预后有明显改善作用。

太阳城集团本文
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