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靶向下调LIN28基因表达在提高小细胞肺癌化疗敏感性方面的应用.pdf

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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201710084971.2

申请日:

20170217

公开号:

CN106806903B

公开日:

20181116

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A61K48/00,A61K45/00,A61K31/192,A61P35/00 主分类号: A61K48/00,A61K45/00,A61K31/192,A61P35/00
申请人: 江苏天芳健康科技有限公司
发明人: 郭守河
地址: 221000 江苏省徐州市邳州高新技术产业开发区(三先大道与邳新路交叉口北150米)
优先权: CN201710084971A
专利代理机构: 南京聚匠知识产权代理有限公司 代理人: 刘囝
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法律状态
申请(专利)号:

CN201710084971.2

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

本发明公开了靶向下调LIN28基因表达在提高小细胞肺癌化疗敏感性方面的应用,所述化疗药物为顺铂。本发明提供的技术方案通过下调小细胞肺癌中基因LIN28的表达可以显著提高小细胞肺癌对顺铂的化疗敏感性;本发明技术方案提供的上述基因的表达抑制剂可以有效提高顺铂的化疗敏感性,从而可以降低顺铂的给药剂量,降低顺铂对机体带来的不良反应。本发明与现有技术相比,具有突出的实质性特点和显著的进步,临床应用价值高。

权利要求书

1.一种LIN28表达抑制剂在制备促进小细胞肺癌对顺铂化疗敏感性的药物中的应用,其特征在于,所述LIN28表达抑制剂为(Z)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸或(Z)-3-(3-羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域,涉及肺癌化疗敏感性相关基因的发现,具体涉及靶向下调LIN28基因表达在提高小细胞肺癌化疗敏感性方面的应用。

背景技术

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤,死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势,年平均增长近2%。肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型,肺癌组织类型不同,其治疗措施也不同。根据2004版WHO分类,常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。不同肺癌临床治疗方案不同,预后效果也不同。因此,为了提高治疗效果,肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、精准的多学科治疗模式。个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。

腺癌(AC)作为最常见的肺癌组织学类型,在全球及我国发病率均呈上升趋势。流行病学研究结果显示,非小细胞肺癌的发病有明显的性别差异,尤其是腺癌。腺癌占原发肺癌的50%,是非吸烟患者的主要组织学类型。鳞状细胞癌(SCC)又称肺鳞癌,占原发肺癌的30%,是非吸烟患者的另一种主要组织学类型。小细胞肺癌是肺癌常见的类型之一,约占肺癌总数的14%,与吸烟明显相关。作为一种高侵袭性肿瘤,SCLC疾病进展快,易早期发生转移,由于易复发和产生耐药,中位总生存期仅8个月-11个月,5年生存率不足5%。

临床上,不同组织学类型肺癌的给药和治疗方案也不同。但是,顺铂为基础的化疗方案仍为肺腺癌、肺鳞癌及小细胞肺癌的一线治疗方案,顺铂为基础的化疗方案比非顺铂为基础的化疗方案具有更好的生存期。

太阳城集团但是,顺铂抵抗出现以及顺铂的毒副反应严重降低了患者的生存质量,一定程度上限制着顺铂的临床应用。针对此种情况,众多医药工作者试图逆转不同肺癌细胞对顺铂抵抗的出现,以及通过提高肺癌对顺铂的化疗敏感性降低顺铂的临床剂量从而降低对患者的毒副作用。

STAT3(信号传导蛋白和转录激活物)可通过介导炎症介质的细胞外信号调控肿瘤细胞、免疫细胞等的生物学行为,是慢性炎症促进肿瘤发生及肿瘤相关性炎症形成过程中不可或缺的关键性分子。一般情况下,细胞因子、生长因子等可结合至细胞表面的相应受体,从而启动细胞内酪氨酸激酶磷酸化级联反应。在JAK2、MAPK或mTOR等激酶的作用下,胞浆中的STAT3可因自身Y705及S727位点磷酸化而发生二聚化、活化,此外STAT3亦可通过可逆性乙酰化而活化。活化的STAT3可转位至细胞核内并结合于基因组DNA,发挥转录调控作用。STAT3的这一信号转导及转录激活作用维持和调控着正常机体的一系列生物学行为,包括胚胎发育、程序性细胞死亡、器官发生、先天性免疫、适应性免疫、细胞生长等,而STAT3的异常活化可导致多种疾病的发生。临床研究发现,肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌等肿瘤中的STAT3活性均发生高频率的异常活化,且其活化程度与肿瘤患者的预后呈显著反相关,与肿瘤关系密切。

TRPM7是TRPM(瞬时受体电位)亚族的一员是具有离子通道和激酶活性双功能的膜蛋白它对阳离子有通透性,使细胞去极化,可使自身和底物磷酸化。TRPM7可以介导感觉信号的传递,调节细胞钙镁平衡和影响发育,其表达及活性异常与多种疾病特别是肿瘤的发生具有相关性。TRPM7通道激酶在细胞的增殖、存活、分化、生长和迁移等一系列细胞活动中起重要作用。TRPM7在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌等患者中异常高表达,并且与肿瘤的转移、临床分期等相关,是肿瘤预后的独立预测因子。

LIN28是一种高度保守的RNA结合蛋白,在let-7的转录调节过程中起重要的负性调控作用,可以抑制let-7的加工合成。LIN28促进胚胎干细胞的快速增长,参与干细胞的增殖,在肿瘤干细胞的形成中发挥重要作用。LIN28在多种肿瘤组织或肿瘤细胞系中高表达,可以促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤的进展,与患者预后不良有关。另外LIN28能够促进组织修复。有研究显示LIN28属于一种致癌基因,它在肿瘤细胞中过表达,促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤的进展。LIN28在多种肿瘤组织或细胞系中高表达,而且多出现在低分化以及预后差的肿瘤中。同时LIN28的表达与恶性肿瘤患者的生存密切相关,它的高表达可能预示患者预后不良。另外,作为一种参与诱导多能干细胞的多能因子,LIN28可能成为肿瘤的潜在治疗靶点。

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的靶mRNA高效特异性降解的现象,是研究基因功能的重要技术手段。RNA干扰中常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。与其他载体相比,慢病毒载体具有以下优点:(1)既可以感染分裂期细胞又能感染非分裂期细胞。逆转录病毒载体不能感染非分裂期细胞,而慢病毒载体已被证实能有效感染大脑,眼睛,肝脏,造血系统等器官的非分裂期细胞。腺病毒和腺相关病毒载体虽然具有感染非分裂期细胞的能力,但容易引起炎症和毒性反应。另外,慢病毒基因组可以与宿主基因组整合,因此更适合长期诱导转移基因的表达。(2)病毒突变和产生有复制能力的病毒机率小。(3)可以兼容多个转录启动子,转录多个目的序列片段。(4)能够容纳相对大的转移基因序列。慢病毒经过改建后可以容纳10Kb左右的外源基因片段,因此应用范围更加广泛。

太阳城集团申请人在研究过程中发现,上述三个基因的表达与不同类型肺癌对顺铂的化疗敏感性存在相关性,然后以该基因为靶标筛选得到了可以增强顺铂化疗敏感性的化合物,化疗时配合该化合物可以降低化疗所需的顺铂剂量,降低顺铂对机体带来的不良反应。

发明内容

太阳城集团本发明的目的是提高顺铂对肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌的化疗敏感性,从而可以降低顺铂的给药剂量,降低顺铂对机体带来的不良反应。

上述目的是通过如下技术方案实现的:

太阳城集团肺腺癌化疗敏感性技术方案:

基因STAT3作为靶标在制备促进肺腺癌对化疗药物敏感性的药物中的应用。

太阳城集团具体实施例中,所述化疗药物为顺铂。

抑制基因STAT3表达的抑制剂在制备促进肺腺癌对化疗药物敏感性的药物中的应用。

其中,所述抑制剂可以为干扰基因STAT3表达的RNA片段,如靶向干扰基因STAT3表达的siRNA或shRNA,或为下调基因STAT3表达的小分子化合物。

进一步地,所述小分子化合物具有如下结构的通式:

R3选自-H,-OCH3,-OH,-CH3。

太阳城集团优选地,所述小分子化合物为(Z)-3-苯基-2-(4-甲基苯甲酰基)丙烯酸。

优选地,小分子化合物为(Z)-3-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基苯甲酰基)丙烯酸。

太阳城集团优选地,所述小分子化合物为(Z)-3-(4-羟基苯基)-2-(4-甲基苯甲酰基)丙烯酸。

优选地,所述小分子化合物为(Z)-3-(4-甲基苯基)-2-(4-甲基苯甲酰基)丙烯酸。

肺鳞癌化疗敏感性技术方案:

基因TRPM7作为靶标在制备促进肺鳞癌对化疗药物敏感性的药物中的应用。

具体实施例中,所述化疗药物为顺铂。

太阳城集团抑制基因TRPM7表达的抑制剂在制备促进肺鳞癌对化疗药物敏感性的药物中的应用。

其中,所述抑制剂可以为干扰基因TRPM7表达的RNA片段,如靶向干扰基因TRPM7表达的siRNA或shRNA,或为下调基因TRPM7表达的小分子化合物。

太阳城集团进一步地,所述小分子化合物具有如下结构的通式:

R1选自-CH3或-OCH3,R3选自-H或-OH。

优选地,所述小分子化合物为(Z)-3-(3-羟基苯基)-2-(4-甲基苯甲酰基)丙烯酸。

太阳城集团优选地,小分子化合物为(Z)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(4-甲基苯甲酰基)丙烯酸。

太阳城集团优选地,小分子化合物为(Z)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸。

小细胞肺癌化疗敏感性技术方案:

太阳城集团基因LIN28作为靶标在制备促进小细胞肺癌对化疗药物敏感性的药物中的应用。

太阳城集团具体实施例中,所述化疗药物为顺铂。

抑制基因LIN28表达的抑制剂在制备促进小细胞肺癌对化疗药物敏感性的药物中的应用。

其中,所述抑制剂可以为干扰基因LIN28表达的RNA片段,如靶向干扰基因LIN28表达的siRNA或shRNA,或为下调基因LIN28表达的小分子化合物。

进一步地,所述小分子化合物具有如下结构的通式:

太阳城集团 R2和R3为-OH或-H,或R2和R3为-O-CH2-O-。

进一步地,小分子化合物为(Z)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸。

进一步地,小分子化合物为(Z)-3-(3-羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲酰基)丙烯酸。

本发明的有益效果:

太阳城集团本发明提供的技术方案通过下调肺腺癌中基因STAT3的表达可以显著提高肺腺癌对顺铂的化疗敏感性,通过下调肺鳞癌中基因TRPM7的表达可以显著提高肺鳞癌对顺铂的化疗敏感性,通过下调小细胞肺癌中基因LIN28的表达可以显著提高小细胞肺癌对顺铂的化疗敏感性;本发明技术方案提供的上述基因的表达抑制剂可以有效提高顺铂的化疗敏感性,从而可以降低顺铂的给药剂量,降低顺铂对机体带来的不良反应。

附图说明

图1为转染含STAT3-shRNA序列的慢病毒重组载体的293FT细胞在倒置荧光显微镜下的100×显微放大图,图中灰色板块代表绿色荧光;

太阳城集团图2A为shRNA干扰后SPCA-1细胞中STAT3 mRNA的表达变化;图2B为shRNA干扰后SK-MES-1细胞中TRPM7 mRNA的表达变化;图2C为shRNA干扰后NCI-H1688细胞中LIN28 mRNA的表达变化;

图3为shRNA干扰后细胞中靶基因蛋白的表达变化;其中,A为shRNA干扰后SPCA-1细胞中STAT3蛋白的表达变化;B为shRNA干扰后SK-MES-1细胞中TRPM7蛋白的表达变化;C为shRNA干扰后NCI-H1688细胞中LIN28蛋白的表达变化。

具体实施方式

太阳城集团下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。

实施例1:基因表达与肺癌化疗敏感性的相关性

一、实验材料

1、实验细胞

包括肺腺癌细胞株SPCA-1、A549;肺鳞癌细胞株SK-MES-1、NCI-H520;小细胞肺癌细胞株NCI-H1688、NCI-H446。各细胞株均为本公司冻存,复苏后按如下方法培养:

SPCA-1:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

A549:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

太阳城集团SK-MES-1:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

NCI-H520:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

NCI-H1688:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

太阳城集团NCI-H446:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

2、实验动物

SPF级BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司,7周龄,体重19.5~22.5g。所有小鼠置于温度(22±2)℃、湿度(60±5)℃、12h明暗交替环境中饲养。

太阳城集团其他材料包括常规试剂、常规仪器等均为本领域技术人员熟知并易于获取的材料。

二、实验方法

太阳城集团1、慢病毒载体的构建及慢病毒的包装

太阳城集团shRNA设计:根据GenBank中基因cDNA序列,利用Invitrogen公司软件BLOCK-iTTMRNAi Designer设计出目的基因的shRNA片段,每个基因选出1条最优的片段,同时设置阴性对照(negative control,NC)。

shRNA片段序列如下表所示:

太阳城集团慢病毒载体的构建:按照慢病毒包装试剂盒(Invitrogen)说明书中操作步骤构建pcDNATM6.2-GW/EMGFP-miR表达载体,转化感受态细胞TOP10,提取质粒,通过BP/LR反应构建目的基因表达重组载体pLenti6/V5-DEST,转化感受态细胞Stb13,提取质粒用于病毒包转。

慢病毒的包装:将提取好的高纯度的pLenti6/V5-DEST、包转试剂VirapowerTMpackaging mix(Invitrogen)和LipofectamimeTM 2000(Invitrogen)共转染293FT细胞,第2天用新的完全培养基替代旧的培养基,48~72h后收集细胞液,3000r/min 4℃离心5min,吸出上清分装后置于-80℃保存。

2、细胞分组及转染

取对数生长期的肺腺癌细胞株SPCA-1、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、小细胞肺癌细胞株NCI-H1688,分别分为空白对照组、RNA干扰组和阴性对照组。空白对照组不进行转染处理,RNA干扰组转染含shRNA序列的慢病毒重组载体,阴性对照组转染含shRNA-NC序列的慢病毒重组载体。具体如下:

SPCA-1 RNA干扰组:转染含STAT3-shRNA的慢病毒重组载体;

SPCA-1 阴性对照组:转染含STAT3-shRNA-NC的慢病毒重组载体;

SK-MES-1 RNA干扰组:转染含TRPM7-shRNA的慢病毒重组载体;

SK-MES-1阴性对照组:转染含TRPM7-shRNA-NC的慢病毒重组载体;

太阳城集团NCI-H1688 RNA干扰组:转染含LIN28-shRNA的慢病毒重组载体;

太阳城集团NCI-H1688阴性对照组:转染含LIN28-shRNA-NC的慢病毒重组载体。

靶细胞转染方法:

取对数生长期的细胞,以1×105/孔的密度接种于24孔板,每孔加0.5mL含10%胎牛血清和抗生素的培养基,37℃、5%CO2培养24h后换液。取100μL病毒原液加入到400μL含10%胎牛血清的培养基中稀释,同时加入聚凝胺至终浓度为8μg/mL,37℃、5%CO2培养24h。换用0.5mL不含聚凝胺的培养基,培养48-72h,于荧光显微镜下观察转染细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况,GFP阳性细胞率>80%,则进行后续实验。

3、Real-time RT-PCR方法测定细胞中靶基因的mRNA表达水平

将空白对照及转染处理的肺腺癌细胞株SPCA-1、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、小细胞肺癌细胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2条件下常规培养,至细胞生长达到85%左右,用0.25%胰酶消化、收集细胞,按RNeasy Mini Kit说明书提取总RNA,凝胶电泳鉴定其完整性,分光光度法测定其纯度和量。根据Real time PCR试剂盒说明书中的方法配置好各个样品的反应体系,在PCR仪上设置好反应程序进行PCR反应。以GAPDH为内参基因,用实时定量PCR相对定量法对SPCA-1细胞中的STAT3 mRNA、SK-MES-1细胞中的TRPM7 mRNA、NCI-H1688细胞中的LIN28 mRNA结果进行分析。

各基因的RT-PCR引物序列设计如下:

4、Western blot法测定细胞中靶基因对应蛋白的表达水平

将空白对照及转染处理的肺腺癌细胞株SPCA-1、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、小细胞肺癌细胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2条件下常规培养,至细胞生长达到85%左右,用细胞裂解试剂盒对细胞进行裂解,裂解细胞时加入2×loading蛋白上样缓冲液,95℃加热5min,用10%SDS-PAGE蛋白电泳分离样品,湿转法转至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h,加入一抗4℃孵育过夜,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1h,ECL化学发光检测显影,在凝胶成像系统上拍照并分析。以β-actin为内参,用Quantity One 4.6.2软件分析条带灰度值,用相对灰度值对SPCA-1细胞中的STAT3蛋白、SK-MES-1细胞中的TRPM7蛋白、NCI-H1688细胞中的LIN28蛋白结果进行分析。

太阳城集团5、MTT法检测不同细胞对顺铂的化疗敏感性

太阳城集团取对数生长期的细胞(SPCA-1的空白对照组、RNA干扰组和阴性对照组;SK-MES-1的空白对照组、RNA干扰组和阴性对照组;NCI-H1688的空白对照组、RNA干扰组和阴性对照组),用2.5g/L的胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基制成单细胞悬液,按1×105/mL接种于96孔板中,置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,24h后加入终浓度为0、0.5、1、2、4、8μM的顺铂(SPCA-1细胞)或终浓度为0、5、10、20、40、80μM的顺铂(SK-MES-1和NCI-H1688细胞),每浓度设3个复孔,药物作用48h后每孔加入5g/L MTT 20μL,37℃继续孵育4h后小心吸去孔内培养基,每孔加入DMSO 150μL,置摇床上低速振荡10min,酶标仪测量490nm波长处的吸光度值(A)。抑制率=(对照组A值-各浓度组A值)/对照组A值×100%,并绘制药物-剂量反应曲线,Bliss法计算IC50。

三、实验结果

1、慢病毒重组载体的包装

太阳城集团将包装质粒和包装试剂一起通过LipofectamimeTM 2000转入293FT细胞后,其包装成功的确认和效率可通过绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达判断,转染48h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,证明转染成功。图1为转染含STAT3-shRNA序列的慢病毒重组载体的293FT细胞在倒置荧光显微镜下的100×显微放大图,未转染的293FT细胞未见绿色荧光。转染其他序列的293FT细胞的绿色荧光蛋白基因的表达情况与STAT3-shRNA基本一致。

2、病毒转导靶细胞

在荧光显微镜下可观察到经过转染处理的靶细胞内有绿色荧光蛋白的表达,说明质粒成功转染靶细胞。各转染处理的靶细胞中绿色荧光蛋白阳性细胞率均大于80%。

上述结果证明重组载体已成功转染至靶细胞,并在靶细胞中稳定表达。

太阳城集团3、shRNA干扰后各细胞中靶基因的mRNA水平的变化

慢病毒转染肺腺癌细胞株SPCA-1后,Real-time PCR检测STAT3 mRNA结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,SPCA-1 RNA干扰组STAT3 mRNA水平显著降低(P<0.01);慢病毒转染肺鳞癌细胞株SK-MES-1后,Real-time PCR检测TRPM7 mRNA结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,SK-MES-1 RNA干扰组TRPM7 mRNA水平显著降低(P<0.01);慢病毒转染小细胞肺癌细胞株NCI-H1688后,Real-time PCR检测LIN28 mRNA结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,NCI-H1688 RNA干扰组LIN28 mRNA水平显著降低(P<0.01)。结果见下表和图2A-2C。

4、shRNA干扰后各细胞中靶基因的蛋白质水平的变化

太阳城集团慢病毒转染肺腺癌细胞株SPCA-1后,Western blot检测STAT3蛋白结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,SPCA-1 RNA干扰组STAT3蛋白水平显著降低(P<0.01);慢病毒转染肺鳞癌细胞株SK-MES-1后,Western blot检测TRPM7蛋白结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,SK-MES-1 RNA干扰组TRPM7蛋白水平显著降低(P<0.01);慢病毒转染小细胞肺癌细胞株NCI-H1688后,Western blot检测LIN28蛋白结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,NCI-H1688 RNA干扰组LIN28蛋白水平显著降低(P<0.01)。

结果见图3。

上述结果证明,含有上述shRNA片段的慢病毒重组载体可以有效下调靶基因的表达。

5、不同细胞对顺铂的化疗敏感性

慢病毒转染肺腺癌细胞株SPCA-1后,MTT实验结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,SPCA-1 RNA干扰组对顺铂的化疗敏感性明显增加,IC50值显著降低(P<0.01);慢病毒转染肺腺癌细胞株SK-MES-1后,MTT实验结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,SK-MES-1 RNA干扰组对顺铂的化疗敏感性明显增加,IC50值显著降低(P<0.01);慢病毒转染小细胞肺癌细胞株NCI-H1688后,MTT实验结果显示,与空白对照组及阴性对照组比较,NCI-H1688 RNA干扰组对顺铂的化疗敏感性明显增加,IC50值显著降低(P<0.01)。

不同细胞对顺铂的药物敏感性见下表:

上述结果表明,STAT3低表达,肺腺癌SPCA-1细胞对顺铂的敏感性显著增加;TRPM7低表达后,肺鳞癌SK-MES-1细胞对顺铂的敏感性显著增加;LIN28低表达后,小细胞肺癌NCI-H1688对顺铂的敏感性显著增加。

太阳城集团实施例2:以靶基因为靶标筛选提高肺癌化疗敏感性的化合物

一、实验材料

1、实验细胞

包括肺腺癌细胞株SPCA-1、A549;肺鳞癌细胞株SK-MES-1、NCI-H520;小细胞肺癌细胞株NCI-H1688、NCI-H446。各细胞株均为本公司冻存,复苏后按如下方法培养:

SPCA-1:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

太阳城集团A549:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

SK-MES-1:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

NCI-H520:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

太阳城集团NCI-H1688:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

太阳城集团NCI-H446:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

2、实验动物

太阳城集团SPF级BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司,7周龄,体重19.5~22.5g。所有小鼠置于温度(22±2)℃、湿度(60±5)℃、12h明暗交替环境中饲养。

其他材料包括常规试剂、常规仪器等均为本领域技术人员熟知并易于获取的材料。

二、实验方法

1、化合物干扰处理肺癌细胞

太阳城集团取对数生长期的细胞,以1×105/孔的密度接种于孔板中,每孔加含10%胎牛血清和抗生素的培养基,37℃、5%CO2培养24h后换含有待测试化合物的完全培养基,继续培养48h。

各化合物名称、结构、编号及给药浓度如下:

太阳城集团2、Real-time RT-PCR方法测定细胞中靶基因的mRNA表达水平

将空白对照及化合物干扰处理的肺腺癌细胞株SPCA-1、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、小细胞肺癌细胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2条件下常规培养,至细胞生长达到85%左右,用0.25%胰酶消化、收集细胞,按RNeasy Mini Kit说明书提取总RNA,凝胶电泳鉴定其完整性,分光光度法测定其纯度和量。根据Real time PCR试剂盒说明书中的方法配置好各个样品的反应体系,在PCR仪上设置好反应程序进行PCR反应。以GAPDH为内参基因,用实时定量PCR相对定量法对SPCA-1细胞中的STAT3 mRNA、SK-MES-1细胞中的TRPM7 mRNA、NCI-H1688细胞中的LIN28 mRNA结果进行分析。

各基因的RT-PCR引物序列设计如下:

3、Western blot法测定细胞中靶基因对应蛋白的表达水平

将空白对照及化合物干扰处理的肺腺癌细胞株SPCA-1、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、小细胞肺癌细胞株NCI-H1688在37℃、5%CO2条件下常规培养,至细胞生长达到85%左右,用细胞裂解试剂盒对细胞进行裂解,裂解细胞时加入2×loading蛋白上样缓冲液,95℃加热5min,用10%SDS-PAGE蛋白电泳分离样品,湿转法转至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h,加入一抗4℃孵育过夜,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1h,ECL化学发光检测显影,在凝胶成像系统上拍照并分析。以β-actin为内参,用Quantity One 4.6.2软件分析条带灰度值,用相对灰度值对SPCA-1细胞中的STAT3蛋白、SK-MES-1细胞中的TRPM7蛋白、NCI-H1688细胞中的LIN28蛋白结果进行分析。

4、MTT法检测不同细胞对顺铂的化疗敏感性

取对数生长期的细胞(SPCA-1的空白对照组、化合物干扰组;SK-MES-1的空白对照组、化合物干扰组;NCI-H1688的空白对照组、化合物干扰组),用2.5g/L的胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基制成单细胞悬液,按1×105/mL接种于96孔板中,置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,24h后加入终浓度为0、0.5、1、2、4、8μM的顺铂(SPCA-1细胞)或终浓度为0、5、10、20、40、80μM的顺铂(SK-MES-1和NCI-H1688细胞),每浓度设3个复孔,药物作用48h后每孔加入5g/L MTT 20μL,37℃继续孵育4h后小心吸去孔内培养基,每孔加入DMSO 150μL,置摇床上低速振荡10min,酶标仪测量490nm波长处的吸光度值(A)。抑制率=(对照组A值-各浓度组A值)/对照组A值×100%,并绘制药物-剂量反应曲线,Bliss法计算IC50。

三、实验结果

1、化合物干扰后各细胞中靶基因的mRNA水平的变化

太阳城集团化合物处理肺腺癌细胞株SPCA-1后,Real-time PCR检测STAT3 mRNA结果显示,与空白对照组比较,化合物干扰组STAT3 mRNA水平显著降低(P<0.01);化合物处理肺鳞癌细胞株SK-MES-1后,Real-time PCR检测TRPM7 mRNA结果显示,与空白对照组比较,化合物干扰组TRPM7 mRNA水平显著降低(P<0.01);化合物处理小细胞肺癌细胞株NCI-H1688后,Real-time PCR检测LIN28 mRNA结果显示,与空白对照组比较,化合物干扰组LIN28mRNA水平显著降低(P<0.01)。

结果见下表。

2、化合物干扰后各细胞中靶基因的蛋白水平的变化

太阳城集团化合物处理肺腺癌细胞株SPCA-1后,Western blot检测STAT3蛋白结果显示,与空白对照组比较,化合物干扰组STAT3蛋白水平显著降低(P<0.01);化合物处理肺鳞癌细胞株SK-MES-1后,Western blot检测TRPM7蛋白结果显示,与空白对照组比较,化合物干扰组TRPM7蛋白水平显著降低(P<0.01);化合物处理小细胞肺癌细胞株NCI-H1688后,Western blot检测LIN28蛋白结果显示,与空白对照组比较,化合物干扰组LIN28蛋白水平显著降低(P<0.01)。结果见下表。

3、化合物处理后各细胞对顺铂的化疗敏感性

化合物处理肺腺癌细胞株SPCA-1后,MTT实验结果显示,与空白对照组比较,化合物处理组对顺铂的化疗敏感性明显增加,IC50值显著降低(P<0.01);化合物处理肺腺癌细胞株SK-MES-1后,MTT实验结果显示,与空白对照组比较,化合物处理组对顺铂的化疗敏感性明显增加,IC50值显著降低(P<0.01);化合物处理小细胞肺癌细胞株NCI-H1688后,MTT实验结果显示,与空白对照组比较,化合物处理组对顺铂的化疗敏感性明显增加,IC50值显著降低(P<0.01)。不同细胞对顺铂的药物敏感性见下表:

太阳城集团化合物1-4对鳞癌SK-MES-1和小细胞癌NCI-H1688无明显增敏作用(80μM干扰48h后顺铂IC50值无明显降低,下同);化合物5、6对腺癌SPCA-1和小细胞癌NCI-H1688无明显增敏作用;化合物8、9对腺癌SPCA-1和鳞癌SK-MES-1无明显增敏作用;化合物7对鳞癌SK-MES-1和小细胞癌NCI-H1688都具有明显的增敏作用。

化合物1-4具有如下共同的结构:

其中,R3为-H,-OCH3,-OH,-CH3。

化合物5-7具有如下共同的结构:

太阳城集团其中,R1为-CH3或-OCH3,R3为-H或-OH。

化合物7-9具有如下共同的结构:

太阳城集团其中,R2和R3为-OH或-H,或R2和R3为-O-CH2-O-。

化合物1-9对人正常胚肺MRC-5细胞的毒性:

取对数生长期的MRC-5细胞,用DMEM高糖培养液调整至5×104/ml,以90μl/孔加入96孔培养板中。实验分空白对照组、给药组(10、20、40、80、160μM),置37℃、5%CO2培养箱培养,24h后分别以10μl/孔加入药物或溶媒,继续培养24小时。于实验终止前4h加入MTT(10μl/孔),实验终止时加入10%SDS(100μl/孔),置培养箱中过夜,次日于波长570nm处测定吸光值。按下式计算抑制率。抑制率=(空白对照组A值-给药组A值)/空白对照组A值×100%。结果证明,化合物1-9对正常胚肺细胞均无明显的细胞毒性,最大给药浓度160μM时对人正常胚肺MRC-5细胞的抑制率最大不超过15%。

实施例3:从动物水平对筛选出的化合物进行活性确证

一、实验材料

1、实验细胞

太阳城集团包括肺腺癌细胞株SPCA-1、A549;肺鳞癌细胞株SK-MES-1、NCI-H520;小细胞肺癌细胞株NCI-H1688、NCI-H446。各细胞株均为本公司冻存,复苏后按如下方法培养:

太阳城集团SPCA-1:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

A549:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

太阳城集团SK-MES-1:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

太阳城集团NCI-H520:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

NCI-H1688:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

NCI-H446:37℃、5%CO2条件下常规培养于含10%胎牛血清(GIBICO公司)的RPMI-1640培养液(GIBICO公司)中,当细胞密度达75%~85%时进行传代培养。

2、实验动物

SPF级BALB/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司,7周龄,体重19.5~22.5g。所有小鼠置于温度(22±2)℃、湿度(60±5)℃、12h明暗交替环境中饲养。

太阳城集团其他材料包括常规试剂、常规仪器等均为本领域技术人员熟知并易于获取的材料。

二、实验方法

1、动物模型的建立及分组

肺腺癌裸鼠:取对数生长期肺腺癌A549细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,台盼蓝拒染法记数活细胞数占95%以上,将细胞密度调至1×107/ml,每只裸鼠取0.2ml细胞悬液接种于右大腿背侧皮下,术前测量体重。接种后每日观察,待出现肉眼可见移植瘤后,用游标卡尺测量移植瘤,待移植瘤体积达100mm3左右将裸鼠按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则随机分为空白对照组、低剂量组、高剂量组、单顺铂组,空白对照组给予等体积生理盐水,经皮下注射给药,隔天一次,连续十次。药物处理结束后一天,颈椎脱臼法处死裸鼠,照相,观察记录各组裸鼠包块形态大小,将肿块剥出、称重,冷藏于-80℃备用。

肺鳞癌裸鼠:取对数生长期肺鳞癌NCI-H520细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,台盼蓝拒染法记数活细胞数占95%以上,将细胞密度调至1×107/ml,每只裸鼠取0.2ml细胞悬液接种于右大腿背侧皮下,术前测量体重。接种后每日观察,待出现肉眼可见移植瘤后,用游标卡尺测量移植瘤,待移植瘤体积达100mm3左右将裸鼠按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则随机分为空白对照组、低剂量组、高剂量组、单顺铂组,空白对照组给予等体积生理盐水,经皮下注射给药,隔天一次,连续十次。药物处理结束后一天,颈椎脱臼法处死裸鼠,照相,观察记录裸鼠包块形态大小,将肿块剥出、称重,立即冷藏于-80℃备用。

太阳城集团小细胞肺癌裸鼠:取处于对数生长期体外培养的小细胞肺癌NCI-H446细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,台盼蓝拒染法记数活细胞数占95%以上,将细胞密度调至1×107/ml,每只裸鼠取0.2ml细胞悬液接种于右大腿背侧皮下,术前测量体重。接种后每日观察,待出现肉眼可见移植瘤后,用游标卡尺测量移植瘤,待移植瘤体积达100mm3左右将裸鼠按瘤体积和荷瘤鼠体重均衡原则随机分为空白对照组、低剂量组、高剂量组、单顺铂组,空白对照组给予等体积生理盐水,经皮下注射给药,隔天一次,连续十次。药物处理结束后一天,颈椎脱臼法处死裸鼠,照相,观察记录各组裸鼠包块形态大小,将每个肿块剥出、称重,立即冷藏于-80℃冰箱备用。

太阳城集团2、给药方案及化疗敏感性评价

各组给药方案如下表:

通过肿瘤抑制率比较不同组别裸鼠对顺铂的化疗敏感性,抑瘤率=(1-给药组瘤重/空白对照组瘤重)×100%。

3、肿瘤组织中靶基因的mRNA表达水平

液氮磨组织提取RNA,取100mg组织加入1mL Trizol,提取总RNA。紫外分光光度计测定A260及A280,分析RNA纯度并调整浓度。根据Real time PCR试剂盒说明书中的方法配置好各个样品的反应体系,在PCR仪上设置好反应程序进行PCR反应。以GAPDH为内参基因,用实时定量PCR相对定量法对A549肺腺癌组织中的STAT3 mRNA、NCI-H520肺鳞癌组织中的TRPM7 mRNA、NCI-H446小细胞肺癌组织中的LIN28 mRNA结果进行分析。

各基因的RT-PCR引物序列设计如下:

太阳城集团4、肿瘤组织中靶基因蛋白的表达水平

液氮磨组织提取蛋白质,取100mg组织加入0.75mL细胞裂解液,提取总蛋白。运用BCA法测定蛋白量。每例取50μg,与4×上样缓冲液混合后煮沸5min,在15%SDS-PAGE电泳,然后电转移至0.22μm PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2h,加入一抗4℃孵育过夜,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育1h,ECL化学发光检测显影,在凝胶成像系统上拍照并分析。以β-actin为内参,用Quantity One 4.6.2软件分析条带灰度值,用相对灰度值对A549肺腺癌组织中的STAT3蛋白、NCI-H520肺鳞癌组织中的TRPM7蛋白、NCI-H446小细胞肺癌组织中的LIN28蛋白结果进行分析。

三、实验结果

1、不同裸鼠对顺铂的化疗敏感性

化合物1-4与顺铂联合给药可以显著提高肺腺癌裸鼠对顺铂的化疗敏感性;化合物5-7与顺铂联合给药可以显著提高肺鳞癌裸鼠对顺铂的化疗敏感性;化合物7-9与顺铂联合给药可以显著提高小细胞肺癌裸鼠对顺铂的化疗敏感性。

太阳城集团不同组别裸鼠对顺铂的化疗敏感性结果见下表:

2、肺癌组织中靶基因的mRNA表达水平的变化

太阳城集团化合物1-4可以显著降低裸鼠肺腺癌组织中STAT3 mRNA水平,且呈一定的浓度相关性;化合物5-7可以显著降低裸鼠肺鳞癌组织中TRPM7 mRNA水平,且呈一定的浓度相关性;化合物7-9可以显著降低裸鼠小细胞肺癌组织中LIN28 mRNA水平,且呈一定的浓度相关性。

mRNA表达水平见下表。

3、肺癌组织中靶基因的蛋白表达水平的变化

化合物1-4可以显著降低裸鼠肺腺癌组织中STAT3蛋白水平,且呈一定的浓度相关性;化合物5-7可以显著降低裸鼠肺鳞癌组织中TRPM7蛋白水平,且呈一定的浓度相关性;化合物7-9可以显著降低裸鼠小细胞肺癌组织中LIN28蛋白水平,且呈一定的浓度相关性。

太阳城集团蛋白表达水平见下表。

太阳城集团使用顺铂化疗时,辅以化合物1-7可以显著提高顺铂对裸鼠移植瘤的抑制率,裸鼠移植瘤组织学分析发现,相关靶基因的表达显著下调。

上述实施例证明:本发明提供的技术方案通过下调肺腺癌中基因STAT3的表达可以显著提高肺腺癌对顺铂的化疗敏感性,通过下调肺鳞癌中基因TRPM7的表达可以显著提高肺鳞癌对顺铂的化疗敏感性,通过下调小细胞肺癌中基因LIN28的表达可以显著提高小细胞肺癌对顺铂的化疗敏感性;本发明技术方案提供的上述基因的表达抑制剂可以有效提高顺铂的化疗敏感性,从而可以降低顺铂的给药剂量,降低顺铂对机体带来的不良反应。

太阳城集团本文
本文标题:靶向下调LIN28基因表达在提高小细胞肺癌化疗敏感性方面的应用.pdf
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