太阳城集团

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一种同源四倍体诱导及其快繁体系及其构建方法和应用.pdf

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一种 同源 四倍体 诱导 及其 繁体 构建 方法 应用
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摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201810935994.4

申请日:

20180816

公开号:

太阳城集团CN108849525A

公开日:

20181123

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A01H4/00 主分类号: A01H4/00
申请人: 贵州师范学院
发明人: 黄燕芬,王自布,谢奇
地址: 550018 贵州省贵阳市乌当区高新路115号
优先权: CN201810935994A
专利代理机构: 北京国坤专利代理事务所(普通合伙) 代理人: 黄耀钧
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法律状态
申请(专利)号:

CN201810935994.4

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法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术领域,公开了一种同源四倍体诱导及其快繁体系及其构建方法和应用,所述同源四倍体诱导及其快繁体系采用抽滤灭菌的秋水仙素溶液浓度为0.15%,诱导太阳城集团16小时;同源四倍体芽苗在MS+6‑BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.6mg/L培养基培养20d。本发明一方面能够提高百蕊草种植的经济效益,为百蕊草人工培育提供较优质的种质资源,改变品种杂乱现状、质量低下和防止病虫害的影响;另一方面能够使百蕊草种植的环境成本降低,有效避免对自然植被的毁坏;此外,在药材生产应用上也具有很大的潜力。

权利要求书

1.一种同源四倍体诱导及其快繁体系,其特征在于,所述同源四倍体诱导及其快繁体系采用抽滤灭菌的秋水仙素溶液浓度为0.15%,诱导太阳城集团16小时;同源四倍体芽苗在MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L+IBA0.6mg/L培养基培养20d。2.一种如权利要求1所述同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法,其特征在于,所述同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法包括以下步骤:步骤一,百蕊草同源多倍体诱导及生根培养;步骤二,百蕊草同源四倍体形态解剖学观察鉴定;步骤三,百蕊草同源四倍体细胞学鉴定;步骤四,百蕊草同源四倍体植株扩繁及生根。3.如权利要求2所述的同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法,其特征在于,所述步骤一具体包括:(1)多倍体诱导单因素实验,选择对百蕊草诱导苗的长势及生根情况有影响的因素:秋水仙素灭菌方式、秋水仙素浓度、诱导处理太阳城集团,分别进行单因素试验,从芽苗成活率、芽苗变异率、四倍体诱导率三方面对百蕊草多倍体苗诱导的影响;(2)多倍体诱导正交实验,在单因素试验基础上,高压蒸汽灭菌温度为104℃,太阳城集团15min或抽滤灭菌方式条件下,对秋水仙素浓度X1、诱导处理太阳城集团X2进行考察,每个因素取三个水平,以芽苗存活率、芽苗变异率、四倍体诱导率为试验指标;(3)芽苗生根培养,选择经秋水仙素处理表现茎比较粗,叶片较厚且深绿的芽苗与二倍体芽苗一同转接于1/2MS+0.5mg/LNAA的生根培养基诱导生根,培养完整植株并获得染色体倍数鉴定材料。4.如权利要求2所述的同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法,其特征在于,所述步骤二具体包括:将百蕊草二倍体和经诱导处理的多倍体无菌试管苗的叶片分别置于卡诺氏固定溶液中乙醇~冰醋酸3:1固定2~3h后清洗干净,撕下叶片同一部位的下表皮于载玻片上展平,滴1d1%I-KI溶液,制成临时装片;每张片子随机取5个视野观察气孔的大小及分布,统计叶片保卫细胞叶绿体数目,用显微测微尺随机测量10个气孔横径、纵径;以平均数比较,初步筛选同源四倍体试管苗。5.如权利要求2所述的同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法,其特征在于,所述步骤三具体包括:待二倍体苗和通过形态解剖鉴定筛选出的诱导苗根长至1~2cm长时,参照向增旭等和聂杨眉等的方法,分别将根尖切下,放入浓度为0.002mol/L的8-羟基喹啉溶液中进行预处理,温度为10~20℃;处理4h后,洗干净放入卡诺氏固定液中固定24h;之后用蒸馏水洗净放入0.075mol/LKCL溶液中前低渗处理20~30min,再放入0.2mol/LHCl溶液中水浴解离5~10min,温度60℃,然后浸泡在蒸馏水中,低渗处理30min,之后将根尖制成临时装片用显微镜观察,统计染色体数量。6.如权利要求2所述的同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法,其特征在于,所述步骤四具体包括:通过形态解剖观察鉴定和细胞染色体数量鉴定,初步筛选出同源四倍体试管苗;在无菌条件下切成单芽,接种于MS基本培养基附加6-BA0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L,NAA0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L,IBA0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L的增殖培养正交实验设计培养基中培养,观察记录增殖倍数、增殖周期、芽苗生长情况。7.如权利要求2所述的同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法,其特征在于,所述同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法的培养条件培养温度:24±1℃;相对湿度:75%~85%;光照太阳城集团:16h/d;光照度:1500~2000lx。8.一种采用权利要求1~7任意一项所述同源四倍体诱导及其快繁体系繁殖的百蕊草。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术领域,尤其涉及一种同源四倍体诱导及其快繁体系及其构建方法和应用。

背景技术

目前,业内常用的现有技术是这样的:百蕊草科多年生草本,为我国特产药材之一,主产湖南、安徽等地。以根茎入药,近现代药理研究表明:百蕊草主要含内酯类化合物、多糖和挥发油。大量研究证明百蕊草具有调节免疫、调节胃肠功能、抗衰老、利尿、扩张血管、抗炎、抑菌、镇静、降血糖等重要作用。而目前我国百蕊草中药材的栽培存在产量低下,品种迅速退化,药材质量逐年降低,有效成分含量不稳定等问题,优质百蕊草药材在市场上供不应求。百蕊草适于在海拔高、阴凉的山地生长,不宜于连作,需不断采取开荒的方式种植,这对自然植被的损坏很大,也造成了种植地生态环境的破坏。目前我国百蕊草中药材的栽培存在产量低下,品种迅速退化,药材质量逐年降低,有效成分含量不稳定等问题,优质百蕊草药材在市场上供不应求。百蕊草适于在海拔高、阴凉的山地生长,不宜于连作,需不断采取开荒的方式种植,这对自然植被的损坏很大,也造成了种植地生态环境的破坏。

太阳城集团 综上所述,现有技术存在的问题是:

太阳城集团(1)目前我国百蕊草中药材的栽培存在产量低下,品种迅速退化,药材质量逐年降低,有效成分含量不稳定等问题,优质百蕊草药材在市场上供不应求。

太阳城集团(2)百蕊草适于在海拔高、阴凉的山地生长,不宜于连作,需不断采取开荒的方式种植,对自然植被的损坏很大,造成种植地生态环境的破坏。

太阳城集团 解决上述技术问题的难度和意义:

发明内容

太阳城集团针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种同源四倍体诱导及其快繁体系及其构建方法和应用。

太阳城集团本发明是这样实现的,一种同源四倍体诱导及其快繁体系,所述同源四倍体诱导及其快繁体系采用抽滤灭菌的秋水仙素溶液浓度为0.15%,诱导太阳城集团16小时;同源四倍体芽苗在MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.6mg/L培养基培养20d。

本发明的另一目的在于提供一种所述同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法,所述同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法包括以下步骤:

太阳城集团步骤一,百蕊草同源多倍体诱导及生根培养;

太阳城集团步骤二,百蕊草同源四倍体形态解剖学观察鉴定;

步骤三,百蕊草同源四倍体细胞学鉴定;

太阳城集团步骤四,百蕊草同源四倍体植株扩繁及生根。

进一步,所述步骤一具体包括:

(1)多倍体诱导单因素实验,选择对百蕊草诱导苗的长势及生根情况有影响的因素:秋水仙素灭菌方式、秋水仙素浓度、诱导处理太阳城集团,分别进行单因素试验,从芽苗成活率、芽苗变异率、四倍体诱导率三方面对百蕊草多倍体苗诱导的影响;

太阳城集团(2)多倍体诱导正交实验,在单因素试验基础上,高压蒸汽灭菌温度为104℃,太阳城集团15min或抽滤灭菌方式条件下,对秋水仙素浓度X1、诱导处理太阳城集团X2进行考察,每个因素取三个水平,以芽苗存活率、芽苗变异率、四倍体诱导率为试验指标;

太阳城集团(3)芽苗生根培养,选择经秋水仙素处理表现茎比较粗,叶片较厚且深绿的芽苗与二倍体芽苗一同转接于1/2MS+0.5mg/L NAA的生根培养基诱导生根,培养完整植株并获得染色体倍数鉴定材料。

太阳城集团进一步,所述步骤二具体包括:将百蕊草二倍体和经诱导处理的多倍体无菌试管苗的叶片分别置于卡诺氏固定溶液中乙醇~冰醋酸3:1固定2~3h后清洗干净,撕下叶片同一部位的下表皮于载玻片上展平,滴1d 1%I-KI溶液,制成临时装片;每张片子随机取5个视野观察气孔的大小及分布,统计叶片保卫细胞叶绿体数目,用显微测微尺随机测量10个气孔横径、纵径。以平均数比较,初步筛选同源四倍体试管苗。

进一步,所述步骤三具体包括:待二倍体苗和通过形态解剖鉴定筛选出的诱导苗根长至1~2cm长时,参照向增旭等和聂杨眉等的方法,分别将根尖切下,放入浓度为0.002mol/L的8-羟基喹啉溶液中进行预处理,温度为10~20℃;处理4h后,洗干净放入卡诺氏固定液中固定24h;之后用蒸馏水洗净放入0.075mol/L KCL溶液中前低渗处理20~30min,再放入0.2mol/L HCl溶液中水浴解离5~10min,温度60℃,然后浸泡在蒸馏水中,低渗处理30min,之后将根尖制成临时装片用显微镜观察,统计染色体数量。

太阳城集团进一步,所述步骤四具体包括:通过形态解剖观察鉴定和细胞染色体数量鉴定,初步筛选出同源四倍体试管苗;在无菌条件下切成单芽,接种于MS基本培养基附加6-BA 0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L,NAA 0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L,IBA0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L的增殖培养正交实验设计培养基中培养,观察记录增殖倍数、增殖周期、芽苗生长情况。

太阳城集团进一步,所述同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法的培养条件培养温度:24±1℃;相对湿度:75%~85%;光照太阳城集团:16h/d;光照度:1500~2000lx。

本发明的另一目的在于提供一种采用所述同源四倍体诱导及其快繁体系繁殖的百蕊草。

太阳城集团综上所述,本发明的优点及积极效果为:本发明为获得百蕊草同源四倍体及构建其快繁体系,以百蕊草无菌播种快繁芽苗为实验材料,用高压灭菌和抽滤灭菌的不同浓度的秋水仙素溶液,以不同太阳城集团处理诱导百蕊草同源四倍体;最终利用人工诱导多倍体技术诱导培育多倍体百蕊草种苗,一方面能够提高百蕊草种植的经济效益,为百蕊草人工培育提供较优质的种质资源,改变品种杂乱现状、质量低下和防止病虫害的影响;另一方面能够使百蕊草种植的环境成本降低,有效避免对自然植被的毁坏;此外,在药材生产应用上也具有很大的潜力。

附图说明

太阳城集团图1是本发明实施例提供的同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法流程图。

太阳城集团图2是本发明实施例提供的百蕊草二倍体与同源四倍体试管植株叶片气孔a、b、c、d示意图。

图3是本发明实施例提供的百蕊草二倍体试管植株染色体与同源四倍体试管植株染色体a、b示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。

太阳城集团本发明实施例提供的同源四倍体诱导及其快繁体系采用抽滤灭菌的秋水仙素溶液浓度为0.15%,诱导太阳城集团16小时,芽苗成活率为38.17%,同源四倍体诱导率最高,11.72%。同源四倍体芽苗在MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA0.6mg/L培养基培养20d可以6.6倍的速率增殖。

如图1所示,本发明实施例提供的同源四倍体诱导及其快繁体系的构建方法包括以下步骤:

太阳城集团S101:百蕊草同源多倍体诱导及生根培养;

S102:百蕊草同源四倍体形态解剖学观察鉴定;

S103:百蕊草同源四倍体细胞学鉴定;

太阳城集团S104:百蕊草同源四倍体植株扩繁及生根;

太阳城集团下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试材料

百蕊草试管播种快繁芽苗,保存于贵州省生物资源开发利用特色重点实验室,百蕊草种子采自贵阳金实农业科技开发有限公司中药材种植基地。

1.2实验方法

太阳城集团1.2.1百蕊草同源多倍体诱导及生根培养

(1)多倍体诱导单因素实验

选择对百蕊草诱导苗的长势及生根情况有影响的因素:秋水仙素灭菌方式、秋水仙素浓度、诱导处理太阳城集团等,分别进行单因素试验,从芽苗成活率、芽苗变异率、四倍体诱导率三方面考察其对百蕊草多倍体苗诱导的影响。

(2)多倍体诱导正交实验设计

太阳城集团在单因素试验基础上,高压蒸汽灭菌(温度为104℃,太阳城集团15min)或抽滤灭菌方式条件下,对秋水仙素浓度X1、诱导处理太阳城集团X2进行考察,每个因素取三个水平,以芽苗存活率(%)、芽苗变异率(%)、四倍体诱导率(%)为试验指标,试验设计见表1。

(3)芽苗生根培养

选择经秋水仙素处理表现茎比较粗,叶片较厚且深绿的芽苗与二倍体芽苗一同转接于1/2MS+0.5mg/L NAA的生根培养基诱导生根,培养完整植株并获得染色体倍数鉴定材料。

1.2.2百蕊草同源四倍体形态解剖学观察鉴定

参照汪卫星和姚焱等的方法(稍有调整)进行鉴定:将百蕊草二倍体和经诱导处理的多倍体无菌试管苗的叶片分别置于卡诺氏固定溶液中(乙醇~冰醋酸3:1)固定2~3h后清洗干净,撕下叶片同一部位的下表皮于载玻片上展平,滴1d 1%I-KI溶液,制成临时装片。每张片子随机取5个视野观察气孔的大小及分布,统计叶片保卫细胞叶绿体数目,用显微测微尺随机测量10个气孔横径、纵径。以平均数比较,初步筛选同源四倍体试管苗。观察百蕊草生根试管苗叶片的大小,茎的粗细,叶片厚度和颜色,并与百蕊草二倍体试管苗做对比。

太阳城集团1.2.3百蕊草同源四倍体细胞学鉴定

待二倍体苗和通过形态解剖鉴定筛选出的诱导苗根长至1~2cm长时,参照向增旭等和聂杨眉等的方法,分别将其根尖切下,放入浓度为0.002mol/L的8-羟基喹啉溶液中进行预处理,温度为10~20℃。处理4h后,洗干净放入卡诺氏固定液中固定24h。之后用蒸馏水洗净放入0.075mol/L KCL溶液中前低渗处理20~30min,再放入0.2mol/L HCl溶液中水浴解离5~10min,温度60℃,然后浸泡在蒸馏水中,低渗处理30min,之后将根尖制成临时装片用显微镜观察,统计染色体数量。

1.2.4百蕊草同源四倍体植株扩繁及生根

太阳城集团通过形态解剖观察鉴定和细胞染色体数量鉴定,初步筛选出同源四倍体试管苗。将其在无菌条件下切成单芽,接种于MS基本培养基附加6-BA 0.5mg/L、1mg/L、1.5mg/L,NAA 0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L,IBA0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L的增殖培养正交实验设计培养基中培养,观察记录增殖倍数、增殖周期、芽苗生长情况。待增殖培养结束,从中选择壮苗接种于上述生根培养基中诱导长根,获得完整再生植株。

1.3培养条件

太阳城集团培养温度:(24±1)℃;相对湿度:75%~85%;光照太阳城集团:16h/d;光照度:1500~2000lx。

2结果与分析

2.1百蕊草多倍体诱导

2.1.1秋水仙素不同灭菌方式、浓度、处理太阳城集团对百蕊草幼芽四倍体诱导率的影响

太阳城集团从表2可以看出,高压和抽滤灭菌的秋水仙素溶液处理的百蕊草幼芽的存活率均存在随着秋水仙素溶液浓度的升高而降低的趋势。当秋水仙素处理浓度为0.15%时,两种灭菌方式的四倍体诱导率均达最高,且抽滤灭菌秋水仙素溶液处理的四倍体诱导率高于高压灭菌秋水仙素溶液处理2.9%;两种灭菌方式的秋水仙素溶液处理幼芽,随着处理太阳城集团加长,毒害加重存活率逐渐降低,而诱导率则出现先逐渐升高随后逐渐降低的趋势。当处理太阳城集团为16h时,两种灭菌方式的诱导率均达最高,分别为7.83%和10.23%,抽滤灭菌明显高于高压灭菌。综合考虑确定以抽滤灭菌为诱导百蕊草四倍体的秋水仙素最佳灭菌方式,正交实验秋水仙素溶液诱导浓度选择0.1%,0.15%,0.2%,处理太阳城集团选择12h,16h,20h。

太阳城集团2.1.2抽滤灭菌秋水仙素溶液处理芽苗正交试验结果

由表3结果可知,抽滤灭菌方式处理秋水仙素溶液后,秋水仙素的浓度为主要影响百蕊草幼芽的存活率和四倍体诱导率的因素,处理太阳城集团次之;处理太阳城集团为影响百蕊草幼芽变异率的主要因素。综合分析存活率、变异率和四倍体诱导率结果,得到秋水仙素的浓度和处理太阳城集团的组合是X12X22,即秋水仙素处理浓度为0.15%,最佳处理太阳城集团16h。

2.2形态学鉴定

2.2.1百蕊草二倍体与同源四倍体植株的形态特征比较

观察得出百蕊草二倍体植株与同源四倍体植株在形态上表现出明显的差异,百蕊草二倍体植株苗小,叶片薄且小,叶色较浅,叶片锯齿少;百蕊草四倍体植株茎粗,叶片大且厚,叶片褶皱,锯齿多,呈深绿色,初步显示出了四倍体植株巨型性的特征。

太阳城集团2.2.2二倍体和四倍体的气孔大小和叶绿体数量

太阳城集团由表4可以看出,百蕊草四倍体植株气孔的纵径、横径、面积分别为百蕊草二倍体植株的1.4倍、1.6倍、2.2倍。二倍体植株的气孔明显比四倍体植株的小,但其气孔分布多,百蕊草二倍体植株叶片平均每视野气孔个数是四倍体植株的2.3倍;百蕊草四倍体植株叶片保卫细胞叶绿体数目是二倍体的1.9倍。二者显现出很明显的差异,见图2。

2.3细胞学鉴定

在显微镜下观察根尖制成的临时装片结果如图3:百蕊草二倍体植株的染色体条数为2n=2x=24,经初步形态鉴定为四倍体的植株染色体条数为2n=4x=48。与程心旻等的研究结果一致。

太阳城集团2.4同源四倍体快繁体系的建立

预实验中接种在不同激素的MS培养基上的芽苗培养20d后,发现其增殖率不同,6-BA浓度低于0.5mg/L或者NAA浓度低于0.1mg/L时增殖效果差,且增殖苗比较弱小,而6-BA浓度高于2mg/L时增殖率反而会降低,由此可见6-BA和NAA的浓度过高或者过低都会使百蕊草的增殖率都有影响。由正交实验表5结果看出,百蕊草试管苗的增殖培养,6-BA的影响最大,其次是NAA,IBA的作用较弱。综合分析增殖芽数和增殖系数的实验结果,可以得到最佳增殖培养基激素组合是6-BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.6mg/L。百蕊草试管苗在此培养基上增殖倍数最大,芽苗长势良好,增殖效果最佳,可以此指标建立同源四倍体快繁体系。

3结果

3.1本实验中获得的同源四倍体百蕊草试管植株也有类似特征,百蕊草同源四倍体试管植株的形态特征与二倍体植株存在明显的差异;百蕊草同源四倍体试管植株叶片的气孔密度、保卫细胞的叶绿体数量和面积与二倍体相比存在显著的差别;染色体鉴定结果百蕊草二倍体植株的染色体数为2n=2x=24,四倍体植株染色体为2n=4x=48。

太阳城集团3.2对诱变的多倍体进行倍性鉴定是获得四倍体的重要环节。形态特征鉴定只能是作为初步确定,必须结合染色体计数才能作为真实倍性的确定依据。目前较为流行的流式细胞仪倍性鉴定技术操作简单、快速,可减少细胞学鉴定的工作量,但存在一定的假阳性,且费用较高。本实验结合试管植株的形态、气孔特征、染色体数量三个方面对百蕊草四倍体进行了鉴定,染色体倍数鉴定仍采用传统的压片法。

3.3秋水仙素是一种被广泛应用的动植物多倍体诱导剂,对于植物微管蛋白的亲合性要低于对动物微管蛋白的亲合性。本发明虽较成功地获得了秋水仙素诱导百蕊草同源四倍体的实验结果。

表1百蕊草同源多倍体诱导正交实验表

表2秋水仙素不同灭菌方式及浓度、处理太阳城集团对诱导百蕊草多倍体的影响

太阳城集团表3抽滤灭菌秋水仙素溶液处理芽苗正交试验结果

表4百蕊草二倍体和四倍体的气孔大小和叶片气孔保卫细胞叶绿体数量

表5不同植物激素配比对百蕊草增殖的影响正交实验结果

太阳城集团以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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