太阳城集团

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用于含有脂解酶的烘焙产品的组合物及其用途.pdf

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用于 含有 脂解酶 烘焙 产品 组合 及其 用途
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摘要
申请专利号:

CN201780026290.9

申请日:

20170428

公开号:

太阳城集团CN109152372A

公开日:

20190104

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:
IPC分类号: A21D2/26,A21D8/04,A23L7/104 主分类号: A21D2/26,A21D8/04,A23L7/104
申请人: 焙乐道有限责任公司
发明人: 雅克·格奥里斯,瓦莱里·多尔格奥,奥克萨纳·舍盖,蒂埃里·多夫林,艾维利恩·阿加切,阿涅丝·杜特龙,菲利佩·阿尔诺特
地址: 比利时古鲁特-北臼阿登
优先权: BE201605307A,BE201605346A,EP2017060144W
专利代理机构: 北京康信知识产权代理有限责任公司 代理人: 沈敬亭;李海霞
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法律状态
申请(专利)号:

CN201780026290.9

授权太阳城集团号:

法律状态太阳城集团日:

法律状态类型:

摘要

太阳城集团本发明涉及改善烘焙产品性质的组合物和方法,所述烘焙产品结合了具有限定比例的磷脂酶A1活性与磷脂酶A2活性的脂解酶。

权利要求书

太阳城集团1.一种组合物,包含:-至少一种第一酶,具有在0.01至100的范围内、优选地0.01至80的范围内、更优选地0.01至50的范围内、更优选地1至50的范围内、甚至更优选地2至50的范围内、甚至更优选地0.01至25的范围内、甚至更优选地1至25的范围内、甚至更优选地2至25的范围内的磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比;和-至少一种第二酶,具有在5000至60000的范围内、优选地10000至50000的范围内、更优选地15000至50000的范围内的磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述第一酶选自具有来自嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)的磷脂酶活性的脂解酶、具有来自红色亚栖热菌(Meiothermusruber)的磷脂酶活性的脂解酶、具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermussilvanus)的磷脂酶活性的脂解酶、具有来自紫红链霉菌(Streptomycesviolaceoruber)的磷脂酶活性的脂解酶和/或具有来自黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)的磷脂酶活性的脂解酶。3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述第一酶与SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和/或SEQIDNO5中的任一个具有至少85%的序列同一性,优选地与SEQIDNO1、SEQIDNO2和/或SEQIDNO3中的任一个具有至少85%的序列同一性,更优选地与SEQIDNO2和/或SEQIDNO3中的任一个具有至少85%的序列同一性,甚至更优选地与SEQIDNO3具有至少85%的序列同一性。4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述第一酶的特征在于在等于或高于45℃的温度下具有最佳磷脂酶活性。5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述第二酶选自具有来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)的磷脂酶和脂肪酶活性的脂解酶或具有来自腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的磷脂酶和脂肪酶活性的脂解酶。6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述第二酶与SEQIDNO6和/或SEQIDNO7中的任一个具有至少85%的序列同一性或选自来自Novozymes的Max或者是来自ABenzymes的HyperbakeT。7.根据权利要求1至6所述的组合物在烘焙应用中的用途。8.根据权利要求7所述的用途,用于面包改良剂中。9.根据权利要求7或8所述的用途,用于面包或糕点产品,优选蛋糕、面包、法式长棍面包或面包卷中。10.面包改良剂,含有权利要求1至6中任一项所述的组合物。11.一种用于制备烘焙产品的方法,包括在烘焙之前将以下各项添加到面团或面糊中的步骤:-至少一种第一酶,具有在0.01至100的范围内、优选地0.01至80的范围内、更优选地0.01至50的范围内、甚至更优选地1至50的范围内、甚至更优选地2至50的范围内、甚至更优选地0.01至25的范围内、甚至更优选地1至25的范围内、甚至更优选地2至25的范围内的磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比;和-至少一种第二酶,具有在5000至60000的范围内、优选地10000至50000的范围内、更优选地15000至50000的范围内的磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。12.根据权利要求11所述的方法,其中所述面团或面糊包含5000至100000PmU/100kg面粉、优选7000至50000PmU/100kg面粉、更优选10000至30000PmU/100kg面粉的所述第一酶和10000至100000LmU/100kg面粉、优选20000至70000LmU/100kg面粉的所述第二酶。13.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述面团或面糊显示出改善的耐受性。14.根据权利要求11或12所述的方法,其中所述烘焙产品显示出改善的新鲜度。15.由包含权利要求1至6中任一项所述的组合物的面团或面糊制备的烘焙产品。

说明书

技术领域

太阳城集团本发明涉及用于改进包含一种或多种脂解酶(lipolytic enzyme)的烘焙产品的新型组合物和方法。

背景技术

在烘焙中,面粉脂质虽然占面粉质量的2%,但却起着重要的技术作用,因为它们与面团(dough)或面糊(batter)中的蛋白质和淀粉相互作用,影响面团或面糊的流变性质,以及烘焙产品的质量。脂质可分为游离脂质和结合脂质,两种部分均含有极性或非极性脂质。大约一半的脂质是极性的,且极性与非极性脂质的比例在面包制作中非常重要,因为它与面包体积密切相关。极性脂质部分主要由溶血磷脂、磷脂和半乳糖脂组成。

重要的是要注意脂质位于面团或面糊中的不同位置。大多数极性脂质在淀粉颗粒内部。一些游离脂质将自发地迁移到水气界面,一些在表面上或在淀粉颗粒内部或附着于面筋分子,而一些只在淀粉糊化后可用。

太阳城集团通常,脂质的主要功能是它们对气体细胞稳定性和面筋强化的影响。而且,特别地,极性脂质具有减少淀粉回生的能力。来自酵母发酵的气泡稳定化导致更大的烘焙产品体积。强化面筋网络导致面团的稳定性更好,并且增强面包屑柔软度和质地,因此延长贮存期。然而,由于面粉中少量的脂质,面粉的天然磷脂部分本身不足以对面团或面糊的性质和烘焙产品的质量产生显著影响。此外,存在的一些磷脂分子对面团性质没有积极影响或甚至有负面影响。因此,外源性磷脂和/或乳化剂用于确保烘焙产品的均一质量和贮存期稳定性。

解决该问题的另一种方法是使用脂解酶(lipolytic enzyme)(例如,磷脂酶(phospholipase)和脂肪酶(lipase))并对甘油三酯、磷脂和半乳糖脂进行原位修饰以释放相应的溶血脂类。与原始分子相比,溶血脂类具有更好的乳化性质,并且在面包和蛋糕制作过程中作为润湿剂更具功能性。

此外,具有优异乳化性质的更多溶血脂类的释放导致改善的面团或面糊流变性质。特别地,在蛋糕制作中,这种改进的释放增强了空气在乳沫类或海绵蛋糕中的水相中的掺入,并改善了烘焙脂肪在层状蛋糕(layer cake)面糊中的分散。

太阳城集团由于脂质不均匀地分布在面团和面糊体系中的事实,它们并不总是可被脂肪酶和磷脂酶水解。通过改变pH条件、在不同温度下的离子强度和/或糖浓度,将改变这些脂质的可用性。在这种情况下,需要在这些不同温度和条件下具有活性并具有所需特异性的酶。另一方面,过度水解底物会产生对烘焙产品质量特性有负面影响的分子。

虽然已经描述了一些脂肪酶和/或磷脂酶在烘焙产品的制备中的积极性质,但由于它们的不同特异性、它们的不同水解产物、它们的潜在协同作用或工艺条件或底物,它们的使用结果是高度不可预测的。因此,至今仍然需要组合物和方法来进一步改善烘焙产品的性质,例如面团或面糊耐受性、体积和/或新鲜度。

发明内容

发明人已经发现,在烘焙应用中,特别是在面包制作中,使用脂解酶和特定磷脂酶的组合对面团耐受性具有协同效应。

因此,在第一方面,本发明涉及一种组合物,其包含:

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为0.01至100的范围内,优选地为0.01至80的范围内,更优选地为0.01至50的范围内,甚至更优选地为1至50的范围内,甚至更优选地为2至50的范围内,甚至更优选地为0.01至25的范围内,甚至更优选地为1至25的范围内,且甚至更优选地为2至25的范围内的第一酶;和

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为5000至60000的范围内,优选地为10000至50000的范围内,更优选地为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶选自具有来自嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的磷脂酶活性的脂解酶,具有来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的磷脂酶活性的脂解酶,具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶,具有来自紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)的磷脂酶活性的脂解酶和/或具有来自黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)的磷脂酶活性的脂解酶,优选地为具有来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的磷脂酶活性的脂解酶和/或具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶,更优选地为具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和/或SEQ ID NO 5中的任一个具有至少85%的序列同一性,优选地与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3中的任一个具有至少85%的序列同一性,更优选地与SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3具有至少85%的序列同一性,且甚至更优选地与SEQ ID NO 3具有至少85%的序列同一性。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶特征在于在等于或高于45℃的温度下具有最佳的磷脂酶活性。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶在50℃下温育30分钟后保留其大于50%的磷脂酶活性。

太阳城集团在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第二酶选自具有来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的磷脂酶和脂肪酶活性的脂解酶或具有来自腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的磷脂酶和脂肪酶活性的脂解酶。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第二酶与SEQ ID NO 6和/或SEQ ID NO 7中的任一个具有至少85%的序列同一性或选自来自Novozymes(诺维信)的Max或来自AB enzymes的Hyperbake T。

此外,在另一方面,本发明涉及本文公开的组合物在烘焙应用中的用途。

在一个具体实施方式中,提供了本文公开的组合物在面包改良剂中的用途。

在一个具体实施方式中,提供了本文公开的组合物在面包或糕点(patisserie)产品,优选为蛋糕、面包、法式长棍面包(baguettes)或面包卷(rolls)中的用途。

太阳城集团此外,在另一方面,本发明涉及包含本文公开的组合物的面包改良剂。

此外,在另一方面,本发明涉及一种制备烘焙产品的方法,其包括在烘焙之前将以下酶添加到面团或面糊中的步骤:

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为0.01至100的范围内,优选地为0.01至80的范围内,更优选地为0.01至50的范围内,甚至更优选地为1至50的范围内,甚至更优选地为2至50的范围内,甚至更优选地为0.01至25的范围内,甚至更优选地为1至25的范围内,且甚至更优选地为2至25的范围内的第一酶;和

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为5000至60000的范围内,优选地为10000至50000的范围内,更优选地为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

在一个具体实施方式中,本文公开的方法提供:所述面团或面糊包含5000至100000PmU/100kg面粉,优选为7000至50000PmU/100kg面粉,更优选为10000至30000PmU/100kg面粉的所述第一酶和10000至100000LmU/100kg面粉,优选为20000至70000LmU/100kg面粉的所述第二酶。

在一个具体实施方式中,本文公开的方法提供:所述面团或面糊显示出改进的耐受性。

在一个具体实施方式中,本文公开的方法提供:所述烘焙产品显示出改进的新鲜度。

太阳城集团此外,在另一方面,本发明涉及由包含本文公开的组合物的面团或面糊制备的烘焙产品。

具体实施方式

太阳城集团在描述本发明的产品、组合物、用途和方法之前,应理解本发明不限于所述的特定产品、组合物、用途和方法或组合,因为这些产品、组合物、用途和方法以及组合当然可能会有所不同。还应该理解,本文使用的术语不意图是限制性的,因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限定。

太阳城集团如本文所用,单数形式“一个(a)”,“一种(an)”和“该(the)”包括单数和复数指示物,除非上下文另有明确规定。

太阳城集团如本文所用,术语“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised of)”与“包含(including)”、“包含(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”同义,并且是包含性的或开放式的,并且不排除附加的、未列举的成员、元素或方法步骤。应当理解,如本文所用,术语“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised of)”包括术语“由......组成(consisting of)”,“组成(consists)”和“由......组成(consists of)”。

由端点表述的数值范围包括包含在各自范围内的所有数字和分数,以及所列举的端点。

太阳城集团当提及诸如参数、量、时距等的可测量值时,如本文所用,术语“约”或“近似地”意味着包含与规定值相差+/-10%或更小,优选地为+/-5%或更小,更优选地为+/-1%或更小,且仍更优选地为+/-0.1%或更小的变化,只要这些变化适合于在所公开的发明中进行。应理解,修饰语“约”或“近似地”所指的值本身也被具体地且优选地公开。

尽管术语“一个或多个”或“至少一个”,例如一组成员中的一个或多个或至少一个成员,本身是清楚的,但通过进一步的例证,该术语尤其包括对任何一个所述成员,或任何两个或更多个所述成员的引用,例如,所述成员中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等,并且直至所有成员。

本说明书中引用的所有参考文献都通过引用其全部内容并入本文。特别地,本文具体提及的所有参考文献的教导通过引用并入。

太阳城集团除非另外定义,否则用于公开本发明的所有术语,包括技术和科学术语,具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导,包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

在下面的段落中,更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的各个方面可以与任何其它方面或多个方面组合,除非明确地规定相反的情况。特别地,可将被指示为优选的或有利的任何特征与被指示为优选的或有利的任何其它特征或多个特征组合。

太阳城集团在整个说明书中,对“一个实施方式(one embodiment)”或“一种实施方式(an embodiment)”的任何引用意味着结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此,在整个说明书中不同地方出现的短语“在一个实施方式中(in one embodiment)”或“在一个实施方式中(in an embodiment)”不一定都指代相同的实施方式,但是可以这样。此外,在一个或多个实施方式中,特定特征、结构或特性可以任何合适的方式组合,如本领域技术人员从本公开中显而易见的。此外,虽然本文描述的一些实施方式包括一些但不包括在其他实施方式中的其他特征,但不同实施方式的特征的组合意图在本发明的范围内,并且形成不同的实施方式,如本领域技术人员将理解的。例如,在所附权利要求中,任何要求保护的实施方式可以任何组合形式使用。

本文公开了包含具有低磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第一酶结合具有高磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第二酶的组合物,其特别适用于烘焙应用,且特别地用作或用于面包改良剂。

本发明人惊奇地发现,使用包含两种或更多种具有本文公开的特定性质的脂肪酶和/或磷脂酶的组合物可以获得具有改进的特性的烘焙产品。特别地,面糊和/或面团的性质(例如,耐受性(tolerance))得到显著改进。还发现烘焙产品显示出改进的体积和/或新鲜度。

如本文所用,术语“脂肪酶”通常是指由酶条目EC 3.1.1.3定义的三酰甘油脂肪酶或三酰甘油酰基水解酶。脂肪酶在本文中定义为催化三酰甘油水解以产生游离脂肪酸、二酰甘油、单酰甘油和甘油的酶。用于本文定义的组合物中的脂肪酶可包含酶副活性(enzymatic side-activities),例如磷脂酶活性。

在本发明的上下文中,使用对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)作为底物并根据本文所述的方法测量脂肪酶活性。酶活性还可用本领域技术人员已知的脂肪酶活性的其他测定法来测量(对于综述,参见例如Stoytcheva M.&al,2012,Current Analytical Chemistry,第8卷,第400页)。

特别地,使用对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)作为底物测量脂肪酶活性。由脂肪酶水解对硝基苯基棕榈酸酯引起的黄色对硝基苯酚的释放通过分光光度法在414nm下测量。一个脂肪酶毫单位(LmU)定义为在40℃和pH 7.5下从对硝基苯基棕榈酸酯中每分钟释放一个纳摩尔(nmole)的对硝基苯酚所需的酶的量。太阳城集团脂肪酶活性测量的更多细节在实施例中给出。

如本文所用,术语“磷脂酶”通常是指将磷脂水解成脂肪酸和其他亲脂性物质的酶,例如溶血磷脂、二酰甘油、磷酸胆碱和磷脂酸(phosphatidate),这取决于水解位点。根据磷脂分子中靶向的特异性键,磷脂酶分为不同类型,例如A、B、C和D。

太阳城集团在本发明的上下文中,使用对硝基苯基磷酰胆碱作为底物测量磷脂酶活性,其中磷脂酶活性以毫单位(PmU)表示,其定义为在50℃和pH 7.5下从对硝基苯基磷酰胆碱中每分钟释放一个纳摩尔(nmole)的对硝基苯酚所需的酶的量。磷脂酶活性也可以用本领域技术人员已知的磷脂酶活性的其他测定法来测量,例如磷脂酰胆碱的水解。

太阳城集团特别地,使用对硝基苯基磷酰胆碱(pNPPC)作为底物测量磷脂酶活性。由磷脂酶水解对硝基苯磷酰胆碱引起的黄色对硝基苯酚的释放通过分光光度法在414nm下测量。一个磷脂酶毫单位(PmU)定义为在50℃和pH 7.5下每分钟释放1nmol的对硝基苯酚所需的酶的量。太阳城集团磷脂酶活性测量的更多细节在实施例中给出。

太阳城集团如本文所用,术语“磷脂酶A”是指催化磷脂中一个或多个键水解的脂解酶。可以区分两种不同类型的磷脂酶A活性,其水解将脂肪酰基部分连接至甘油骨架的(一个或多个)酯键。由酶条目EC 3.1.1.32定义的磷脂酶A1和由酶条目EC 3.1.1.4定义的磷脂酶A2分别催化来自二酰基甘油磷脂的sn-1和sn-2位的一个脂肪酰基的脱酰化,产生溶血磷脂。

在本发明的上下文中,分别使用二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油和染料标记的N-((6-(2,4-DNP)氨基)己酰基)-1-(FL C5)-2-己基-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(对于磷脂酶A1)的脂质混合物或二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油和染料标记的1-O-(6-558/568-氨基己基)-2-FL C5-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(对于磷脂酶A2)的脂质混合物作为底物并根据本文所述的方法测量磷脂酶活性。磷脂酶活性也可以用本领域技术人员已知的脂肪酶活性的其他测定法来测量,例如使用外消旋-1,2-S,O-二癸酰基-3-磷酸胆碱-1-巯基-2,3-丙二醇底物用于测定磷脂酶A1活性和2-十六碳酰基硫代-1-乙基-磷酸胆碱底物用于测定磷脂酶A2活性。

特别地,使用二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油和染料标记的N-((6-(2,4-DNP)氨基)己酰基)-1-(FL C5)-2-己基-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(PED-A1)的脂质混合物作为底物测量磷脂酶A1(PLA1)活性(例如,其可以在EnzChek磷脂酶A1测定试剂盒-ThermoFisher Scientific中找到)。PED-A1对PLA1具有特异性,是一种染料标记的甘油磷酸乙醇胺,具有在sn-1位的FL染料标记的酰基链和二硝基苯基猝灭剂修饰的头基。一个磷脂酶A1毫单位(PA1mU)定义为在40℃和pH 7.4下每分钟释放一纳摩尔(nmole)的在PED-A1的sn-1位取代的荧光脂肪酸所需的酶的量。在实施例中给出了太阳城集团磷脂酶A1活性测量的更多细节。

太阳城集团特别地,使用二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰甘油和染料标记的1-O-(6-558/568-氨基己基)-2-FL C5-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(Red/GreenPC-A2)的脂质混合物作为底物测量磷脂酶A2(PLA2)活性(例如,其可以在EnzChek磷脂酶A2测定试剂盒-ThermoFisher Scientific中找到)。Red/GreenPC-A2底物对PLA2具有选择性,并且可对PLA2酶活性提供灵敏和连续的快速实时监测。一个磷脂酶A2毫单位(PA2mU)定义为在40℃和pH 8.9下每分钟释放一纳摩尔(nmole)的在Red/GreenPC-A2的sn-2位取代的荧光脂肪酸所需的酶的量。太阳城集团磷脂酶活性A2测量的更多细节在实施例中给出。

太阳城集团因此,在第一方面,本发明涉及一种组合物,其包含:

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为0.01至100的范围内,优选地为0.01至80的范围内,更优选地为0.01至50的范围内,甚至更优选地为1至50的范围内,甚至更优选地为2至50的范围内,甚至更优选地为0.01至25的范围内,甚至更优选地为1至25的范围内,且甚至更优选地为2至25的范围内的第一酶;和

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为5000至60000的范围内,优选地为10000至50000的范围内,更优选地为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

特别地,脂肪酶活性以毫单位(LmU)表示,其定义为在40℃和pH 7.5下从对硝基苯基棕榈酸酯每分钟释放一个纳摩尔(nmole)的对硝基苯酚所需的酶的量,磷脂酶A1活性以毫单位(PA1mU)表示,其定义为在40℃和pH 7.5下每分钟水解一个纳摩尔(nmole)的N-((6-(2,4-DNP)氨基)己酰基)-1-(FL C5)-2-己基-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺的sn-1位置取代的荧光脂肪酸的酶的量,且磷脂酶A2活性以毫单位(PA2mU)表示,其定义为在40℃和pH 8.9下每分钟水解一个纳摩尔(nmole)的1-O-(6-558/568-氨基己基)-2-FL C5-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱的sn-2位置取代的荧光脂肪酸的酶的量。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物包含:

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为0.01至50的范围内的第一酶;和;

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

太阳城集团在一个具体实施方式中,本文公开的组合物包含:

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为1至50的范围内的第一酶;和;

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物包含:

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为2至50的范围内的第一酶;和;

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物包含:

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为0.01至25的范围内的第一酶;和

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

太阳城集团在一个具体实施方式中,本文公开的组合物包含:

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为1至25的范围内的第一酶;和;

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物包含:

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为2至25的范围内的第一酶;和

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

太阳城集团本发明人发现,本文公开的组合物的酶在改进烘焙产品性质方面起协同作用。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶特征在于在等于或高于45℃的温度下具有最佳的磷脂酶活性。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶选自具有来自嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的磷脂酶活性的脂解酶,具有来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的磷脂酶活性的脂解酶,具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶,具有来自紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)的磷脂酶活性的脂解酶和/或具有来自黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)的磷脂酶活性的脂解酶,优选地为具有来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的磷脂酶活性的脂解酶和/或具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶,更优选地为具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和/或SEQ ID NO 5中的任一个具有至少85%的序列同一性(参见表A),且优选地与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3中的任一个具有至少85%的序列同一性,更优选地与SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3具有至少85%的序列同一性,且甚至更优选地与SEQ ID NO 3具有至少85%的序列同一性。

更具体地,所述第一酶是具有与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和/或SEQ ID NO 5具有至少85%,优选为至少90%,更优选为至少95%的序列同一性,且优选地与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3中的任一个具有至少85%,优选为至少90%,更优选为至少95%的序列同一性,更优选地与SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3具有至少85%,优选为至少90%,更优选为至少95%的序列同一性,且甚至更优选地与SEQ ID NO 3具有至少85%,优选为至少90%,更优选为至少95%的序列同一性的脂解酶(参见表A)。

表A

更具体地,所述第一酶是与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4和/或SEQ ID NO 5具有100%的序列同一性,且优选地与SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3中的任一个具有100%的序列同一性,更优选地与SEQ ID NO 2和/或SEQ ID NO 3具有100%的序列同一性,且甚至更优选地与SEQ ID NO 3具有100%的序列同一性的脂解酶。

在一个具体的实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶是具有来自嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的磷脂酶活性的脂解酶,其有利地是具有SEQ ID NO 1的酶,或其紧密变体。在一个具体的实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶是具有来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的磷脂酶活性的脂解酶,其有利地是具有SEQ ID NO 2的酶,或其紧密变体。在一个具体的实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶是具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶,其有利地是具有SEQ ID NO 3的酶,或其紧密变体。在一个具体的实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶是具有来自紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)的磷脂酶活性的脂解酶,其有利地是具有SEQ ID NO 4的酶,或其紧密变体,更优选地为来自Nagase的Nagase 10P。在一个具体的实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶是具有来自黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)的磷脂酶活性的脂解酶,其有利地是具有SEQ ID NO 5的酶,或其紧密变体,更优选地为来自DSM的金色。

在本发明的上下文中,如本文所提及的“紧密变体”是如上所述改进烘焙产品(的质量)并且与SEQ ID NO 1至5共享显著同一性的酶。在本发明的上下文中,“显著同一性”是指与SEQ ID NO 1至5的至少85%的同一性,优选为至少90%的同一性,优选为至少91%,更优选为至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至至少99%的同一性。

太阳城集团两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。出于本发明的目的,两个氨基酸序列之间的同一性程度如WO 2010/0142 697中使用Needleman-Wunsch算法测定,如在EMBOSS包的Needle程序中实施的,优选为3.0.0或更高版本。使用的任选参数是空位开放罚分为10,空位延伸罚分为0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性,并计算如下:(相同残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

在一个具体实施方式中,第一酶特征在于:在等于或高于45℃的温度下具有最佳的磷脂酶活性。

太阳城集团在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶在50℃下温育30分钟后保留其大于50%的磷脂酶活性。

通过测定本文所示的磷脂酶活性(使用对硝基苯基磷酰胆碱作为底物)测量活性。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第二酶选自具有来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的磷脂酶和脂肪酶活性的脂解酶或具有来自腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的磷脂酶和脂肪酶活性的脂解酶。

在一个具体实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第二酶与SEQ ID NO 6和/或SEQ ID NO 7中的任一个具有至少85%的序列同一性(参见表A)或选自来自Novozymes的Max或来自AB enzymes的Hyperbake T。

太阳城集团更具体地,所述第二酶是脂解酶,其与SEQ ID NO 6和/或SEQ ID NO 7具有至少85%,优选为至少90%,更优选为至少95%的序列同一性(参见表A)。

更具体地,所述第二酶是脂解酶,其与SEQ ID NO 6和/或SEQ ID NO 7具有100%的序列同一性。

在一个具体的实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第二酶是具有来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的磷脂酶活性的脂解酶,其有利地是具有SEQ ID NO 6的酶,或其紧密变体(close variant)。在一个具体的实施方式中,本文公开的组合物提供:所述第一酶是具有来自腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的磷脂酶活性的脂解酶,其有利地是具有SEQ ID NO 7的酶,或其紧密变体。

甚至更优选地,第二酶是来自Novozymes的Max或来自AB enzymes的Hyperbake T。

太阳城集团在更优选的实施方式中,本文提供的组合物包含具有SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3,优选SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3,甚至更优选地SEQ ID NO 3,或其紧密变体的氨基酸序列的第一酶和磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性的比在5000至60000,优选在10000至50000,更优选在15000至50000;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性的比等于或大于500的第二酶。

太阳城集团在仍然优选的实施方式中,本文提供的组合物包含具有SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3,优选为SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3,甚至更优选地为SEQ ID NO 3,或其紧密变体的氨基酸序列的第一酶和具有SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7或其紧密变体的氨基酸序列的第二酶,优选具有SEQ ID NO 6或其紧密变体的序列的第二酶。

在甚至更优选的实施方式中,本文公开的组合物包含具有SEQ ID NO 1或其紧密变体的氨基酸序列的第一酶和具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性的比在5000至60000,优选为在10000至50000,更优选为在15000至50000且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性的比等于或大于500的第二酶;优选地具有SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7或其紧密变体的氨基酸序列的第二酶,更优选地具有SEQ ID NO 6或其紧密变体的序列的第二酶。

在甚至更优选的实施方式中,本文公开的组合物包含具有SEQ ID NO 2或其紧密变体的氨基酸序列的第一酶和具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性的比在5000至60000,优选为在10000至50000,更优选为在15000至50000且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性的比等于或大于500的第二酶;优选地具有SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7或其紧密变体的氨基酸序列的第二酶,更优选地具有SEQ ID NO 6或其紧密变体的序列的第二酶。

在甚至更优选的实施方式中,本文公开的组合物包含具有SEQ ID NO 3或其紧密变体的氨基酸序列的第一酶和具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性的比在5000至60000,优选为在10000至50000,更优选为在15000至50000且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性的比等于或大于500的第二酶;优选地具有SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7或其紧密变体的氨基酸序列的第二酶,更优选地具有SEQ ID NO 6或其紧密变体的序列的第二酶。

此外,在另一方面,本发明涉及包含本文公开的组合物的面包改良剂。

太阳城集团本发明的组合物可有利地是面包改良剂或糕点混合物或预混物的一部分。通常将“面包改良剂”(也称为“面团调理剂”或“面团改良剂”或“改良剂”或“面粉处理剂”)添加到面团中以改善烘焙产品的质地、体积、风味和新鲜度以及提高面团的可加工性和稳定性。通常,面包改良剂包含以下各项或由以下各项组成:一种或多种酶(例如,淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、原淀粉降解淀粉酶)、木聚糖酶(半纤维素酶)、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、果胶裂解酶、氧化酶(过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、己糖氧化酶、L-氨基酸氧化酶、碳水化合物氧化酶、巯基氧化酶)、脂氧合酶、脱氢酶、漆酶、转谷氨酰胺酶、酰基转移酶、蛋白质二硫键异构酶)、一种或多种氧化剂或还原剂(例如抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸)、一种或多种乳化剂(例如,甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、单硬脂酸甘油酯(GMS)、鼠李糖脂、卵磷脂、蔗糖酯、胆汁盐)、一种或多种脂类物质(例如,人造奶油、黄油、油、起酥油)、一种或多种维生素(例如,泛酸和维生素E)、一种或多种树胶和/或一种或多种纤维来源(例如,燕麦纤维)。蛋糕(法式糕点)混合物通常包含蛋糕配方的所有成分,除了水、脂肪(油、黄油、人造奶油)和蛋之外。蛋糕预混物通常是蛋糕混合物,其中全部或部分面粉和糖已被除去。

太阳城集团在具体的实施方式中,组合物包含具有低磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第一酶和具有如上所述的高磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第二酶;和至少一种,优选为两种选自(一种或多种)酶、(一种或多种)氧化剂、(一种或多种)还原剂、(一种或多种)乳化剂、(一种或多种)脂质、(一种或多种)维生素、(一种或多种)纤维的列表的附加成分。本发明人发现,在组合物中包含一种或多种选自淀粉酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、原淀粉降解淀粉酶)、木聚糖酶(半纤维素酶)、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、果胶裂解酶、氧化酶(过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、己糖氧化酶、L-氨基酸氧化酶、碳水化合物氧化酶、巯基氧化酶)、脂氧合酶、脱氢酶、漆酶、转谷氨酰胺酶、酰基转移酶、蛋白质二硫键异构酶的酶是特别有利的。

太阳城集团此外,在另一方面,本发明涉及本文公开的组合物在烘焙应用中的用途。在本发明的上下文中,烘焙应用是指与面包和糕点产品相关的应用。

已经发现,使用本文提供的组合物允许减少或甚至抑制不期望的面团或面糊成分如乳化剂的使用。

在一个具体实施方式中,提供了本文公开的组合物在面包改良剂中的用途。

太阳城集团在一个具体实施方式中,提供了本文公开的组合物在面包或糕点产品,优选为蛋糕、面包、法式长棍面包(baguette)或面包卷(roll)中的用途。

太阳城集团本发明还公开了用于制备烘焙产品的方法,其中在制备方法中使用具有低磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第一酶和具有高磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第二酶。

此外,在另一方面,本发明涉及一种制备烘焙产品的方法,其包括在烘焙之前将以下酶添加到面团或面糊中的步骤:

太阳城集团-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为0.01至100的范围内,优选地为0.01至80的范围内,更优选地为0.01至50的范围内,甚至更优选地为1至50的范围内,甚至更优选地为2至50的范围内,甚至更优选地为0.01至25的范围内,甚至更优选地为1至25的范围内,且甚至更优选地为2至25的范围内的第一酶;和;

-至少一种具有磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比为5000至60000的范围内,优选地为10000至50000的范围内,更优选地为15000至50000的范围内的第二酶;且磷脂酶A1活性/脂肪酶活性比为500或更高。

在所述方法中,脂肪酶活性以毫单位(LmU)表示,其定义为在40℃和pH 7.5下从对硝基苯基棕榈酸酯每分钟释放一个纳摩尔(nmole)的对硝基苯酚所需的酶的量,磷脂酶A1活性以毫单位(PA1mU)表示,其定义为在40℃和pH 7.4下每分钟水解一个纳摩尔(nmole)的N-((6-(2,4-DNP)氨基)己酰基)-1-(FL C5)-2-己基-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺的sn-1位置取代的荧光脂肪酸的酶的量,且磷脂酶A2活性以毫单位(PA2mU)每分钟表示,其定义为在40℃和pH 8.9下水解一个纳摩尔(nmole)的1-O-(6-558/568-氨基己基)-2-FL C5-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱的sn-2位置取代的荧光脂肪酸的酶的量,且磷脂酶活性以毫单位(PmU)表示,其定义为在50℃和pH 7.5下从对硝基苯基磷酰胆碱每分钟释放一个纳摩尔(nmol)的对硝基苯酚所需的酶的量。

在本发明的方法的一个具体实施方式中,第一酶特征在于在等于或高于45℃的温度下具有最佳的磷脂酶活性。

太阳城集团已经发现,本文公开的组合物特别适用于本文公开的方法。

太阳城集团在一个具体实施方式中,本文公开的方法提供:所述面团或面糊包含5000至100000PmU/100kg面粉,优选为7000至50000PmU/100kg面粉,更优选为10000至30000PmU/100kg面粉的所述第一酶和10000至100000LmU/100kg面粉,优选为20000至70000LmU/100kg面粉的所述第二酶。

太阳城集团本文公开的方法有利地允许改善面糊或面团耐受性和/或改善烘焙产品性质,例如体积或新鲜度。

太阳城集团在一个具体实施方式中,本文公开的方法提供:所述面团或面糊显示出改进的耐受性。

发明人已经发现,在烘焙应用中,特别是在面包产品的制作中,使用脂解酶和特定磷脂酶的组合对面团耐受性具有协同效应。

在本发明的上下文中,面团耐受性是指面团或面糊,优选为面包店面团(烘焙面团,bakery dough)在应力条件(如延长的醒发(发面)太阳城集团或者醒发期间或醒发之后机械冲击)下保持其形状,并且在烘焙后提供具有与用无应力面团或面糊获得的烘焙产品相当的性质(例如,体积)的烘焙产品的能力。

在一个具体实施方式中,本文公开的方法提供:所述烘焙产品显示出改进的新鲜度。

在本发明的上下文中,新鲜度是指纹理参数的组合,例如柔软度、湿度、粘结性、胶粘度和弹性。新鲜度损失通常与老化有关。更具体地,与参照物相比时,烘焙产品的改进的新鲜度对应于改进的柔软度和/或改进的湿度和/或改进的短咬合(short bite)。这些参数可以有利地通过物理方法测量,例如用质地测定仪(texturometer)或通过专家评审小组进行的感官分析。

太阳城集团本发明还公开了烘焙产品,其包含具有低磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第一酶和具有高磷脂酶A1活性/磷脂酶A2活性比的第二酶。

太阳城集团此外,在另一方面,本发明涉及由包含本文公开的组合物的面团或面糊制备的烘焙产品。

在本发明的上下文中,烘焙产品是本领域已知的烘焙或糕点产品,例如选自包括面包、软面包(soft roll)、百吉饼、甜甜圈、丹麦甜糕饼、汉堡卷、比萨饼、全麦中东包(pita bread)、夏巴塔(意大利式面包,ciabatta)、海绵蛋糕、奶油蛋糕、磅饼(pound cake)、松饼、纸杯蛋糕、蒸蛋糕、华夫饼、布朗尼蛋糕、蛋糕甜甜圈、酵母发酵甜甜圈、法式长棍面包、面包卷、咸饼干(cracker)、饼干、曲奇、大馅饼皮(pie crust)、面包干(rusk)和其他烘焙产品的组的那些。更优选地,本发明涉及面包、法式长棍面包和面包卷。

本发明的另一个目的涉及组合物、面包改良剂、糕点混合物和/或糕点预混物在制备烘焙产品中的用途。

实施例

实施例1:酶活性测定

脂肪酶:

使用对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)作为底物测量脂肪酶活性。由脂肪酶水解对硝基苯基棕榈酸酯引起的黄色对硝基苯酚的释放通过分光光度法在414nm下测量。一个脂肪酶毫单位(LmU)定义为在40℃和pH 7.5下从对硝基苯基棕榈酸酯中每分钟释放一个纳摩尔(nmole)的对硝基苯酚所需的酶的量。为了进行测试,将120μl的1mM的pNPP溶液(溶解在pH7.5的0.05M磷酸钠缓冲液中,含有0.69M的丙酮和0.0049M的Triton X-100)与60μl的酶样品混合,并在40℃下温育30分钟。在96孔微孔板中相对于底物空白在414nm下测量吸光度。

活性表示为:LmU/ml=(((Abs酶-Abs空白)/30)×0.18))/(13380×0.06))×样品稀释度×1000000

太阳城集团[30=以分钟计的反应太阳城集团;0.18=以ml计的反应体积;13380=414nm下的摩尔消光系数(M-1cm-1);0.06=以ml计的酶样品体积;1000000以转换为LmU/ml]

磷脂酶:

使用对硝基苯基磷酰胆碱(pNPPC)作为底物测量磷脂酶活性。由磷脂酶水解对硝基苯基磷酰胆碱引起的黄色对硝基苯酚的释放通过分光光度法在414nm下测量。一个磷脂酶毫单位(PmU)定义为在50℃和pH 7.5下每分钟释放1nmol的对硝基苯酚所需的酶的量。为了进行测试,将120μl的0.02M的pNPPC溶液(溶解在pH7.5的0.05M磷酸钠缓冲液中,含有0.69M的丙酮和0.0049M的Triton X-100)与60μl的酶样品混合,并在50℃下温育30分钟。然后,加入720μl的1M的Na2CO3以终止反应。在96孔微孔板中相对于底物空白在414nm下测量吸光度。

活性表示为:PmU/ml=(((Abs酶-Abs空白)/30)×0.9))/(13380×0.06))×样品稀释度×1000000

[30=以分钟计的反应太阳城集团;0.9=以ml计的反应体积;13380=414nm下的摩尔消光系数(M-1cm-1);0.06=以ml计的酶样品体积;1000000以转换为PmU/ml]

磷脂酶A1:

太阳城集团使用16.5μM的二油酰基磷脂酰胆碱、16.5μM的二油酰基磷脂酰甘油和3.3μM的染料标记的N-((6-(2,4-DNP)氨基)己酰基)-1-(FL C5)-2-己基-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(PED-A1)的脂质混合物作为底物(在EnzChek磷脂酶A1测定试剂盒中获得-ThermoFisher Scientific)测量磷脂酶A1(PLA1)活性。PED-A1对PLA1具有特异性,是一种染料标记的甘油磷酸乙醇胺,具有在sn-1位的FL染料标记的酰基链和二硝基苯基猝灭剂修饰的头基。一个磷脂酶A1毫单位(PA1mU)定义为在40℃和pH 7.4下每分钟释放一纳摩尔(nmole)的在PED-A1的sn-1位取代的荧光脂肪酸所需的酶的量。在96孔微孔板中进行测试,使用每孔为100μl的总体积。在pH 7.4下,在含有250mM的Tris-HCl、0.7M的NaCl和10mM的CaCl2的反应缓冲液中制备不同的脂质溶液。将样品和对照与脂质混合物以1:1的比例混合(50μl的样品/对照和50μl的脂质混合物)。酶促反应在40℃下进行30分钟。通过使用试剂盒(Lecitase ultra)中提供的不同浓度的磷脂酶A1建立校正曲线。通过在480nm下的激发和515nm下的发射进行荧光测量。

活性表示为:PA1mU/ml=(((荧光强度酶-荧光强度空白)-截距值)/校正曲线的斜率值)×样品稀释度×1000

太阳城集团[1000以转换为PA1mU/ml]

磷脂酶A2:

太阳城集团使用16.5μM的二油酰基磷脂酰胆碱、16.5μM的二油酰基磷脂酰甘油和1.7μM的染料标记的1-O-(6-558/568-氨基己基)-2-FL C5-Sn-甘油基-3-磷酸胆碱(Red/GreenPC-A2)的脂质混合物作为底物(在EnzChek磷脂酶A2测定试剂盒中获得-ThermoFisher Scientific)测量磷脂酶A2(PLA2)活性。Red/Green PC-A2底物对PLA2具有选择性,并且可对PLA2酶活性提供灵敏和连续的快速实时监测。一个磷脂酶A2毫单位(PA2mU)定义为在40℃和pH 8.9下每分钟释放一纳摩尔(nmole)的在Red/GreenPC-A2的sn-2位取代的荧光脂肪酸所需的酶的量。在96孔微孔板中进行测试,使用每孔为100μl的总体积。在pH 8.9下,在含有250mM的Tris-HCl、500mM的NaCl和5mM的CaCl2的反应缓冲液中制备不同的脂质溶液。将样品和对照与脂质混合物以1:1的比例混合(50μl的样品/对照和50μl的脂质混合物)。酶促反应在40℃下进行10分钟。通过使用来自试剂盒中提供的蜜蜂毒液(蜂毒,honey bee venom)的不同浓度的磷脂酶A2建立校正曲线。通过在480nm下的激发和515nm下的发射进行荧光测量。

活性表示为:PA2mU/ml=(((荧光强度酶-荧光强度空白)-截距值)/校正曲线的斜率值)×样品稀释度×1000

[1000=PA2mU/ml]

实施例2:酶

太阳城集团以下酶用于以下实施例中。

-具有来自嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的磷脂酶活性的脂解酶(PH2),具有SEQ NO 1氨基酸序列。

太阳城集团-具有来自红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的磷脂酶活性的脂解酶(PH3),具有SEQ NO 2氨基酸序列。

-具有来自西尔瓦诺斯亚栖热菌(Meiothermus silvanus)的磷脂酶活性的脂解酶(PH4),具有SEQ NO 3氨基酸序列。

-Max(来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶;Novozymes)(LIM)

-Nagase 10P(磷脂酶A2,来自紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber);Nagase)(NAG)

-Golden(来自黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)的脂肪酶;DSM)(PAN)

太阳城集团-Lecitase Ultra(来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的蛋白质工程羧酸酯水解酶;Novozymes)(LEC)

太阳城集团-PH 800BG(来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的脂肪酶;DSM)(BAK)

-Hyperbake-T(来自腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的脂肪酶;AB enzymes)(HYP)

太阳城集团通过克隆和表达如下所述的相应基因获得PH2、PH3和PH4酶。其他酶来自其各自的供应商。

PH2、PH3和PH4基因的克隆

太阳城集团基于推定的脂解酶基因的鉴定序列,合成了编码酶的DNA序列,以便通过使用peIB前导序列和遵循标准方案表达到pET22b质粒中。

太阳城集团对应于PH2、PH3和PH4的DNA序列示于表A中,且分别为SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10(参见表A)。

将完整合成的DNA片段亚克隆到pUC19衍生质粒中。这些质粒用于转化大肠杆菌(E.Coli)超级感受态细胞。通过用合适的限制酶消化用Pure Yield Midiprep System(Promega)制备的纯化质粒制剂以分离含有脂解酶编码序列的DNA片段。将那些片段亚克隆到pET 22b(+)克隆载体(Novagen)中,并将得到的重组质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)细胞(Agilent Technologies)中。通过用ABI3700DNA测序仪(Applied Biosystems)将用Pure Yield Midiprep System(Promega)制备的纯化质粒制剂测序。使用通用引物T7启动子和T7终止子以及对应于内部DNA序列的引物进行插入片段的测序。获得的序列与预期的序列相同。

重组菌株的培养物和PH2、PH3和PH4的产生

将15ml的带有脂解酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的5小时预培养物(37℃)以10000g离心1分钟,在2L的摇瓶中将沉淀重悬于500ml的含有200μg/ml的氨苄青霉素的Terrific肉汤(12g/l的细菌用胰蛋白胨(Difco)、24g/l的酵母提取物(Difco)、4ml/l的甘油、12.54g/l的K2HPO4、2.31g/l的KH2PO4)中。将培养物在37℃和250rpm下温育直至550nm处的吸光度达到3和4之间,随后用1mM的异丙基-1-硫代-β-吡喃半乳糖苷诱导酶的表达。

太阳城集团 PH2、PH3和PH4的回收

在37℃下温育15小时后,通过在4℃下以18000g离心30分钟收获细胞,重悬于含有10mM的NaCl的50mM的BICINE中,在1500巴下在预冷的细胞破碎器(Panda 2K,Niro Soavi,GEA工艺工程部门)中破碎并以40,000g离心30分钟。通过用0.2%的硫酸鱼精蛋白(Calbiochem)处理并以40,000g离心30分钟从粗细胞裂解物中除去染色体DNA。然后,将25单位的广谱核酸酶(benzonase)(Merck,Darmstadt,Germany)加入到溶液中。在这样的处理之后,通过在截留范围为0.05至1μm的Millipore POD系统上的末端过滤(end filtration)澄清脂解酶制剂,然后通过在截留为5kDa的错流过滤系统(Satocon-Sartorius)上的超滤浓缩。在无菌过滤系统上过滤浓缩的酶溶液,包括0.8和0.22μm的末端过滤(绝对过滤器(absolute filter))。

太阳城集团已经使用实施例1的方案测定了酶的脂肪酶和磷脂酶活性。结果如表1所示。

表1

除了测试温度之外,使用实施例1的磷脂酶测定法测定酶的活性与温度的函数关系。结果列于表2中。

表2

在进行如实施例1的磷脂酶测定之前,通过在50℃下预温育酶样品30、60和240分钟,确定酶的稳定性。结果列于表3中。

表3

实施例3:硬皮卷

太阳城集团在硬皮卷制作中测试了脂解酶组合的效果。使用表4的面团组合物制备硬皮卷。

表4

太阳城集团*含有抗坏血酸和酶(α淀粉酶,木聚糖酶)

太阳城集团在Eberhardt N24混合器中在低速下2分钟以及在高速下5分钟混合成分。最终的面团温度以及静置和醒发温度为25℃。在25℃下静置15分钟后,手工重新加工面团并再静置10分钟。然后,制备2kg面团块并醒发10分钟。将2kg面团块分开并使用Rotamat制成。获得50g的圆形面团块。在另外5分钟的静置太阳城集团后,通过压制切割面团块,并且将50%的面团块在35℃下进行最终醒发阶段120分钟,并且对50%的面团块进行冲击测试(将含有面团的托盘从10cm的高度落到架子上,并在35℃下进行最终醒发阶段120分钟。将面团块在230℃下在具有蒸汽的MIWE Roll-In烘箱中烘焙(Michael Wenz-Arnstein-Germany)。使用常用的油菜籽法(rapeseed displacement method)测量6个卷的体积。

结果如表5所示。

表5

太阳城集团*计算为由单独的每种酶给出的体积增加(与对照相比)的总和

**计算为由冲击测试给出的体积损失百分比

太阳城集团结果显示,使用对应于根据本发明的组合物的第一酶的酶1和对应于根据本发明的组合物的第二酶的酶2(“1+2”),得到比参照物(“无”)或单独使用酶(“1”或“2”)时更好的体积改进和更好的面团耐受性。此外,这种效果是协同的,因为酶组合给出的结果高于用单独使用的酶(“1/2”)获得的结果的总和。

实施例4:硬皮卷

在硬皮卷制作中测试了脂解酶组合的效果。

太阳城集团如实施例3制备和评价硬皮卷。根据表6的方案将酶添加到面团中。酶剂量如下:PH3 315PmU/面团;LIM 690LmU/面团;HYP 1200LmU/面团;LEC 1400LmU/面团。

表6

结果显示,使用对应于根据本发明的组合物的第一酶的酶1(PH3)和对应于根据本发明的组合物的第二酶的酶2(LIM或HYP),得到比参照物或单独使用酶时更好的体积改进和更好的面团耐受性。

实施例5:猪胰脂肪酶

太阳城集团已经确定了来自猪胰腺的磷脂酶A2的实施例1的酶活性(PPL;获自Sigma,参考号P6534-10MG)。

表7

纯化酶的蛋白质含量为3.66mg/ml

如实施例3制备和评价硬皮卷。酶剂量分别为:LIM:690LmU/面团;PH4:703PmU/面团;PPLa:0.44mg/面团;PPLb:1.76mg/面团。

结果列于表8中。

表8

*:在测试中同时添加酶

**:通过将每种单独的酶给出的体积增加加和计算的体积

这些结果表明,猪胰磷脂酶A2对面团耐受性没有协同作用,并且增加酶的剂量没有效果。

实施例6:乳化剂替代

测试了脂解酶组合在piccolos制备中替代乳化剂的效果(过夜方法)。使用表9的面团组合物制备Piccolos。

表9

成分(克) 小麦粉(Crousti;比利时)) 1100 水 638 新鲜酵母(Bruggeman,比利时) 44 氯化钠 22 改良剂* 33 附加成分 根据表10

*含有抗坏血酸和酶(α淀粉酶,木聚糖酶)

在Eberhardt N24混合器中在低速下2分钟以及在高速下5分钟混合成分。最终的面团温度以及静置和醒发温度为25℃。在25℃下静置5分钟后,手工重新加工面团并再静置5分钟。然后,将面团分开并使用Rotamat制成。获得70g的面团块。将面团块在约2℃下在Koma醒发箱中储存过夜。将醒发箱的温度在6小时内逐渐升高至25℃。在25℃和95%湿度下进行30分钟的最终醒发后,用刀切割面团块一次并在230℃下在带有蒸汽的MIWE Roll-In烤箱中烘焙(Michael Wenz-Arnstein-Germany)18分钟。使用常用的油菜籽位移法测量6个piccolos的体积。

结果如表10所示。

表10

结果表明,根据本发明的酶的组合允许在面团配方中完全替代乳化剂。

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