太阳城集团

  • / 58
  • 下载费用:30 金币  

控制水稻穗大小基因、其突变体及应用.pdf

摘要
申请专利号:

CN201210030466.7

申请日:

2012.02.10

公开号:

CN103243107B

公开日:

2015.01.21

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/29申请日:20120210|||公开
IPC分类号: C12N15/29; C12N15/63; C12N5/10; C07K14/415; A01H5/00 主分类号: C12N15/29
申请人: 中国科学院遗传与发育生物学研究所
发明人: 傅向东; 刘正斌; 刘学英; 吴昆
地址: 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院2号
优先权:
专利代理机构: 中科专利商标代理有限责任公司 11021 代理人: 王旭
PDF完整版下载: PDF下载
法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201210030466.7

授权太阳城集团号:

太阳城集团103243107B||||||

法律状态太阳城集团日:

2015.01.21|||2013.09.11|||2013.08.14

法律状态类型:

授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及控制水稻穗大小基因SSP1(Small and Sheathed Panicle 1)及其突变基因ssp1,以及它们在调控植物株高、叶夹角和穗大小等方面的作用机理,其中来源于控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因的序列SEQ IDNO:3。本发明还涉及控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因在大麦、小麦、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或拟南芥等植物中的同源基因,它们统称为控制穗大小基因。本发明还涉及SSP1基因和突变体ssp1基因在控制植物株高、提高耐倒伏能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制穗发芽等育种方面的应用。

权利要求书

权利要求书
1.   控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因,其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

2.   根据权利要求1所述的控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

3.   一种重组载体,其包含权利要求2所述的控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因。

4.   一种转基因植物细胞,其转化了权利要求3所述的重组载体。

5.   根据权利要求4所述的转基因植物细胞,其为下列植物的细胞:水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或拟南芥。

6.   根据权利要求5所述的转基因植物细胞,其为水稻细胞。

7.   控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因的应用,其用于培育具有植株半矮化提高抗倒伏能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制种子穗发芽的优点的农作物。

8.   一种培育植株矮化耐倒伏、改良农作物穗型和提高叶片光合效率的农作物的方法,其包括通过转基因技术在所述农作物中组织特异性启动子过量表达控制水稻穗大小基因SSP1基因或其突变体ssp1基因的步骤。

9.   根据权利要求8所述的方法,其中所述农作物包括水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或拟南芥。

10.   控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因在小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或拟南芥等植物中的同源基因,它们统称为控制穗大小基因,其cDNA序列为:
小麦TaSSP1‑like1(Rht‑A1a):SEQ ID NO:5;
大麦HvSSP1‑like:SEQ ID NO:7;
玉米ZmSSP1‑like:SEQ ID NO:9;
高粱SbSSP1‑like:SEQ ID NO:11;
大豆GmSSP1‑like:SEQ ID NO:13;
棉花GhSSP1‑like1:SEQ ID NO:15;
棉花GhSSP1‑like2:SEQ ID NO:17;
油菜BnSSP1‑like1:SEQ ID NO:19;
油菜BrSSP1‑like2:SEQ ID NO:21;
拟南芥AtSSP1‑like1:SEQ ID NO:23;
拟南芥AtSSP1‑like2:SEQ ID NO:25。

说明书

说明书控制水稻穗大小基因、其突变体及应用
技术领域
本发明涉及控制水稻穗大小基因SSP1(Small and Sheathed Panicle 1)和突变体ssp1基因,以及它们在调控植物株高、叶夹角和穗型等方面的作用机理。本发明还涉及控制水稻穗大小基因SSP1和突变体ssp1基因在降低株高提高抗倒能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制种子穗发芽等育种方面的应用。
背景技术
“农以种为先”,提高产量一直是作物遗传育种研究的主要目标。水稻株型由株高、分蘖数目、分蘖角度叶片夹角以及穗型等构成,也是影响水稻产量的重要因素之一。上世纪60年代以株型改良为特征的矮化育种使得小麦和水稻的产量大幅度提高,而水稻“绿色革命”就是利用了半矮秆sd1基因。SD1编码赤霉素(Gibberellin,GA)合成基因,其突变使得水稻体内有活性的赤霉素含量下降,导致株高降低,提高植株抗倒伏能力,进而提高产量。目前研究表明,赤霉素促进植物生长发育是通过降解DELLA蛋白而实现的。在植物体内,GA首先与赤霉素受体GID1蛋白结合,活化的GA‑GID1能与DELLA蛋白相结合,促进GID1‑GA‑DELLA复合体与GID2(F‑Box)蛋白结合,被泛素化后的DELLA蛋白经由26S蛋白酶解途径降解,解除了DELLA蛋白的阻遏作用来促进植物生长的(Jiang and Fu,2007)。
小麦的“绿色革命”基因是赤霉素信号途径的关键元件‑‑DELLA蛋白。目前在黄淮海平原大部分小麦新品种单产可达500公斤/亩,部分品种具有超过600公斤/亩产量的潜力。但在全国范围的大面积生产中,小麦的平均单产远低于350公斤/亩。据统计近30年来,小麦产量提高速度缓慢,平均年增长仅为0.7%左右。而根据预测,到2020年,我国小麦单产平均年增加2%以上才能基本满足需求。因此,要实现小麦自给,必须进一步提高小麦产量潜力,培育出高产、稳产的小麦新品种。同样,水稻的产量自上世纪60年代水稻“绿色革命”即矮化育种使得中国水稻单产比原有高秆品种提高20‑30%。70年代成功采用以杂种优势利用为手段的杂交稻育种,使水稻单产在矮秆品种的基础上再增产20%左右,实现水稻产量上的飞跃,为解决我国13亿人口的吃饭问题做出了巨大贡献。
然而,目前水稻生产中所应用的矮杆基因都是sd1,来源相当狭窄。矮秆基因利用单一化以及矮秆基因遗传隐性化,导致了水稻品种遗传背景单一和狭窄,影响了水稻品种特别是杂交水稻组合的产量潜力进一步挖掘和提高。所以发掘和利用新型矮秆基因十分重要。
发明内容
本发明涉及控制水稻穗大小基因SSP1基因和突变体ssp1基因,以及它们在调控植物株高、叶夹角和穗型等方面的作用及其作用机制。本发明还涉及控制水稻穗大小基因SSP1和突变体ssp1在植株半矮化提高抗倒能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制种子穗发芽等育种方面的应用。
本发明人在中国水稻所收集的水稻资源材料中发现其中一个材料具有植株矮化、包穗等表型,通过遗传杂交,确定这个性状是受一个显性基因控制的。进一步遗传回交,构建了近等基因系,对近等基因系的比较分析发现,该基因除了控制株高外(降低株高对农作物抗倒伏,利于农作物密植增产),还控制水稻的剑叶和叶夹角的大小,剑叶变短、叶夹角也变小的性状对提高作物光合效率很重要,控制水稻的穗部性状(包穗且穗也变小)。根据穗部的突出表型,本发明人将这个突变体命名为水稻穗型突变体ssp1(Small and Sheathed Panicle 1)。
ssp1穗部性状不是农业直接应用的优良性状,但是它的株型和叶型性状对农业生产非常有利:1),降低株高,可提高农作物的抗倒伏能力;2),株型紧凑,可密植;3),叶片深绿色,本身光合效率较高;4),叶夹角变小,可提高群体光合效率;5),改变赤霉素应答反应,可用于抑制种子穗发芽遗传改良。本发明人的研究工作正是针对上述五个优良性状开展的。
产量是由复杂数量性状位点QTL(Quantitative Trait Loci)和环境互作所控制,并最终通过调节单位面积的穗粒数和粒重来影响产量。穗型(包括穗长、枝梗数、穗粒数、籽粒大小和结实率等)是影响水稻产量的重要因素之一,而株高和叶片夹角对提高水稻种植密度、提高光能转换效率和耐肥抗倒性以及提高产量非常重要。水稻穗型突变体ssp1表现为植株半矮化和叶片直立等特征,属典型的nl类矮化类型。
为了弄清该突变体矮化株型的遗传控制基础,我们利用图位克隆的方法,克隆了SSP1基因(Small and Sheathed Panicle 1)。该基因编码一个GRAS蛋白,它与水稻SLR1蛋白(水稻中的DELLA蛋白)C端氨基酸序列有较高的相似性。突变的ssp1是由2个氨基酸置换突变造成的(参见SEQ ID NO:4)。
SSP1基因几乎在水稻不同发育阶段的各个器官和太阳城集团位都有表达,尤其在穗部和穗下节的居间分生组织中表达量最高。转基因水稻植株中SSP1‑GFP融合蛋白定位于细胞核中。赤霉素诱导糊粉层细胞α‑淀粉酶活性实验表明突变的ssp1蛋白能抑制赤霉素应答反应,表明ssp1参与GA信号传导过程,是赤霉素信号传导中的一个关键元件。
进一步的酵母双杂交实验结果显示,突变的ssp1和野生的SSP1蛋白均不能与赤霉素受体GID1蛋白相互作用,这说明ssp1/SSP1是一个参与赤霉素信号途径但不依赖于GID1功能的新的负调控因子。ssp1和SSP1蛋白也不能与参与DELLA蛋白降解的F‑Box蛋白(GID2)和U‑Box蛋白互作,说明ssp1/SSP1蛋白稳定性的调控机制与DELLA蛋白SLR1的降解途径不同。另外,比较氨基酸序列发现,SSP1蛋白与另外一个参与油菜素内酯(BR)的调控因子DLT相似性较高。当利用外源油菜素内酯BR处理ssp1突变体时,ssp1突变体的第二叶鞘长度和叶夹角能够恢复到野生型对照植株接近的水平。在ssp1突变体背景下,DLT表达量被明显上调,而另外一个油菜素内酯信号途径的关键基因BU1表达量略有下调。这表明SSP1基因也参与调控油菜素内酯的应答反应。以上实验结果说明,SSP1可能既参与赤霉素信号传导,又参与油菜素内酯信号传导,是两激素互作的一个关键调控元件。
具体地,本发明包括下述方面:
1.鉴定了水稻穗型突变体ssp1的表型。水稻ssp1突变体表现为包穗(抽穗不完全)、叶片直立,是一个赤霉素不敏感的半矮秆突变体。遗传分析表明,植株矮化(抽穗不完全)是受一对显性基因控制的。树脂切片实验结果表明,ssp1突变体倒一节茎秆的细胞数目和细胞伸长都受到明显抑制,表明ssp1抑制茎秆的细胞分裂和细胞伸长;同时,ssp1突变体叶夹角明显变小,外源施加油菜素内酯能使叶夹角表型恢复到野生型水平,这说明,SSP1基因参与油菜素内酯的应答反应。
2.克隆了SSP1基因。ssp1突变体分别与南京6号(NJ6,一种籼稻)和中花11号(ZH11,一种粳稻)杂交,构建了SSP1基因的粗(精细)定位群体。通过图位克隆方法,获得了SSP1候选基因。SSP1基因编码一个GRAS蛋白,其C端与水稻DELLA蛋白SLR1具有较高的序列保守性。获得候选基因后,通过以下实验对该候选基因进行了互补验证:a.遗传互补实验:构建自身启动子+ssp1 cDNA+3’UTR的载体(pSSP1:ssp1‑3’UTR)并通过农杆菌介导转化到日本晴(一种粳稻)中,转基因植株表现为ssp1突变体的表型,具体为:株高变矮、倒一节明显缩短、叶夹角变小和对外源赤霉素处理不敏感;b.过量表达实验:构建过表达载体p35S:ssp1,并通过农杆菌介导转化到日本晴中。表型分析发现,过量表达ssp1的转基因水稻表现更为明显的矮化,且矮化程度与该基因表达水平呈正相关。通过以上实验确定了该候选基因是目的基因。
3.获得了近等基因系NIL‑ssp1和NIL‑SSP1。构建粳稻(日本晴)和籼稻(南京6号)两个不同遗传背景的近等基因系:NIL‑ssp1和NIL‑SSP1。遗传分析表明,ssp1基因在籼稻和粳稻中均表现为显性遗传。
4.SSP1/ssp1基因表达分析。利用RT‑PCR方法分析了SSP1基因在各个发育阶段和不同组织器官中的表达情况,包括:花、叶、鞘、叶枕、根、穗下茎节(从下到上0‑3cm(居间分生组织区),3‑8cm(伸长区),8cm以上(成熟区))等组织。结果表明,SSP1基因几乎在水稻不同发育阶段的各个器官太阳城集团位都有表达,尤其在穗部和穗下节的居间分生组织中表达量最高。同SSP1野生型相比,ssp1基因表达模式和表达量均没有明显的变化。
5.SSP1‑GFP融合蛋白的亚细胞定位分析。构建了p35S:HA‑SSP1‑GFP载体,转化日本晴,利用共聚焦显微镜观察转基因植株根部的荧光信号。实验结果表明,SSP1‑GFP融合蛋白定位于细胞核中。另外,GA处理并没有观察到细胞核中SSP1‑GFP或ssp1‑GFP融合蛋白量的变化,表明SSP1‑GFP融合蛋白稳定性不受GA影响。
6.SSP1参与赤霉素信号途经,但不依赖于赤霉素信号传导途径中GID1和DELLA蛋白的功能。在ssp1突变体种子糊粉层细胞中,GA不能诱导淀粉酶活性;其第二叶鞘的生长也不受GA影响。这些结果表明,SSP1参与GA信号传导过程,是赤霉素信号途径中的一个关键负调控因子。虽然,从氨基酸序列比较来看,SSP1蛋白与SLR1蛋白具有较高的同源性,但酵母双杂交结果显示,SSP1和ssp1蛋白都不能与赤霉素受体GID1蛋白互作。这些研究表明SSP1在GA信号传导途径中起作用,却是一个不依赖于GID1功能的调控因子。同时,SSP1/ssp1蛋白也不能与参与SLR1蛋白降解的U‑BOX和F‑BOX(GID2)蛋白互作,表明SSP1/ssp1蛋白稳定性(蛋白降解途径)的调控机制与SLR1不同。ssp1突变体中SLR1蛋白水平没有明显改变,而且GA处理也能导致SLR1蛋白的降解,但ssp1突变体矮化表型并没有改变。这些实验也表明,ssp1基因并不依赖于(或影响)DELLA蛋白的功能。
7.过量表达SSP1基因也能导致植株矮化、叶夹角变小和包穗等性状。构建过表达载体p35S:ssp1/SSP1,将其转化水稻日本晴。转基因水稻表型分析证实,过量表达SSP1也能导致类似ssp1突变体的表型,包括株高、叶夹角和包穗等性状。在基因表达水平相同时,过量表达ssp1有更强的矮化表型。
8.SSP1基因参与油菜素内酯(BR)的应答反应。在ssp1突变体背景下,参与油菜素内酯信号途径的调控因子,如:DLT、BU1等基因的表达量都发生了变化。DLT基因表达量得到较为明显的上调,而BU1的表达量略有下调。当外源油菜素内酯BR处理ssp1突变体后,ssp1突变体第二叶鞘长度和叶夹角表型等能恢复到野生型表型。这些实验表明,SSP1基因也参与了调控油菜素内酯应答反应。SSP1既参与了赤霉素信号传导,又参与了油菜素内酯信号传导,是两大激素互作的一个关键调控元件。
另外,本发明人在进一步的研究中发现,控制水稻穗大小基因SSP1基因在农作物中非常保守,通过Blast发现控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因在小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或拟南芥等植物中的同源基因,可以将它们统称为控制穗大小基因,这些基因的名称以及它们的cDNA序列编号可参见表1。根据本发明对控制水稻穗大小基因SSP1及其突变体ssp1基因的研究结果,可以推测这些同源基因也具有与控制水稻穗大小基因SSP1及其突变体ssp1基因相似的功能。
表1:控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因在其它植物中的同源基因
  名称  cDNA序列编号  小麦TaSSP1‑like1(Rht‑A1a)  SEQ ID NO:5  大麦HvSSP1‑like  SEQ ID NO:7  玉米ZmSSP1‑like  SEQ ID NO:9  高粱SbSSP1‑like  SEQ ID NO:11  大豆GmSSP1‑like  SEQ ID NO:13  棉花GhSSP1‑like1  SEQ ID NO:15  棉花GhSSP1‑like2  SEQ ID NO:17  油菜BnSSP1‑like1  SEQ ID NO:19  油菜BrSSP1‑like2  SEQ ID NO:21  拟南芥AtSSP1‑like1  SEQ ID NO:23  拟南芥AtSSP1‑like2  SEQ ID NO:25
因此,本发明提供下述:
1.控制水稻穗大小基因的突变体ssp1基因,其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
2.根据第1项所述的控制水稻穗大小基因的突变体ssp1基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
3.一种重组载体,其包含第2项所述的控制水稻穗大小基因的突变体ssp1基因。
4.一种转基因植物细胞,其转化了第3项所述的重组载体。
5.根据第4项所述的转基因植物细胞,其为下列植物的细胞:水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或拟南芥。
6.根据第5项所述的转基因植物细胞,其为水稻细胞。
7.控制水稻穗大小基因的突变体ssp1基因的应用,其用于培育具有植株半矮化提高抗倒伏能力、减小叶夹角提高光合效率、改变赤霉素响应抑制种子穗发芽的优点的农作物。
8.一种培育植株矮化耐倒伏、改良农作物穗型和提高叶片光合效率的农作物的方法,其包括通过转基因技术在所述农作物中组织特异性启动子过量表达控制水稻穗大小基因SSP1基因或其突变体ssp1基因的步骤。
9.根据第8项所述的方法,其中所述农作物包括水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或拟南芥。
10.控制水稻穗大小基因突变体ssp1基因在小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或拟南芥等植物中的同源基因,它们统称为控制穗大小基因,它们的名称和cDNA序列参见表1。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1ssp1是小穗突变体(图1A),ssp1穗子变小(图1,B、C)。统计发现,突变体的每穗粒数(图1D),一次枝梗数目(图1E),二次枝梗数目(图1F)都明显少于野生型对照(NP‑SSP1);
图2ssp1是nl类型半矮秆突变体。A:倒五节;B:倒四节;C:倒三节;D:倒二节;E:倒一节;F:每节占株高的百分比;
图3近等基因系的树脂切片,A图:NIL‑SSP1茎秆横切面,B图:NIL‑ssp1茎秆横切面,C图:NIL‑SSP1茎秆纵切面,D图:NIL‑ssp1茎秆纵切面;
图4SSP1基因的图位克隆,箭头表示ssp1的突变位点;
图5SSP1与ssp1蛋白的氨基酸序列比对,箭头表示突变位点;
图6遗传互补实验,A:株高比较,B:剑叶夹角比较,C:穗子大小比较,D:每穗穗粒数比较,E:一级枝梗数目比较,F:二级枝梗数目比较,其中A、B和C图中由左至右依次为野生型对照和遗传互补转基因植株;
图7p35S:ssp1转基因植株表现出比ssp1突变体更强的表型,A:株高比较,B:剑叶夹角比较,C:穗子大小比较,D:每穗穗粒数比较,E:一级枝梗数目比较,F:二级枝梗数目比较,其中A、B和C图中由左至右依次为野生型对照和过量表达ssp1转基因植株;
图8过量表达ssp1抑制穗的形成,由左至右依次为4个独立的转基因植株;
图9过表达SSP1的转基因植株表现出与ssp1相似的表型。A:株高比较,B:剑叶夹角比较,C:穗子大小比较,D:每穗穗粒数比较,E:一级枝梗数目比较,F:二级枝梗数目比较,其中A、B和C图中由左至右依次为野生型对照和过量表达SSP1的转基因植株;
图10敲除SSP1的日本晴表型上没有变化。A:株高比较,B:每穗穗粒数比较,C:一级枝梗数目比较,D:二级枝梗数目比较;图中由左至右依次为野生型对照和下调SSP1基因表达的转基因植株;
图11SSP1基因在水稻中的表达谱;
图12SSP1‑GFP融合蛋白的亚细胞定位分析;
图13GA诱导α‑淀粉酶的活性依赖于SSP1;
图14酵母双杂交实验。A:SSP1蛋白与GID1蛋白相互作用分析,B:SSP1蛋白与GID2蛋白相互作用分析,C:SSP1蛋白与U‑Box蛋白相互作用分析;
图15叶片夹角比较分析,A:剑叶夹角比较,B:第二叶片夹角比较,C:剑叶夹角比较统计,D:第二叶片夹角比较统计,其中A和B图中由左至右依次为近等基因系NIL‑SSP1和NIL‑ssp1;
图16水稻SSP1系统进化树分析;
图17不同BRs浓度下第二叶鞘的长度变化的比较;
图18SSP1影响BRs调控因子DLT、BU1达量;
图19SSP1/ssp1基因在双子叶植物拟南芥中过量表达。
序列表描述:
SEQ ID NO:1控制水稻穗大小基因SSP1基因全长cDNA序列(野生型);
SEQ ID NO:2控制水稻穗大小基因SSP1蛋白序列(野生型);
SEQ ID NO:3控制水稻穗大小基因的突变体ssp1基因全长cDNA序列(突变型);
SEQ ID NO:4控制水稻穗大小基因的突变体ssp1蛋白序列(突变型);
SEQ ID NO:5‑6小麦TaSSP1‑like1(Rht‑A1a)cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:7‑8大麦HvSSP1‑like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:9‑10玉米ZmSSP1‑like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:11‑12高粱SbSSP1‑like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:13‑14大豆GmSSP1‑like cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:15‑16棉花GhSSP1‑like1cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:17‑18棉花GhSSP1‑like2cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:19‑20油菜BnSSP1‑like1cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:21‑22油菜BrSSP1‑like2(也称:BrRGA2)cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:23‑24拟南芥AtSSP1‑like1(GAI,AT1G14920)cDNA序列及氨基酸序列;
SEQ ID NO:25‑26拟南芥AtSSP1‑like2(RGA,AT2G01570)cDNA序列及氨基酸序列。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解,所述实施例只是举例说明的目的,并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1:突变体ssp1的表型分析
通过遗传杂交,构建并获得了日本晴(粳稻)和南京6号(籼稻)背景的近等基因系:NP‑SSP1和NIL‑ssp1。如图1所示,南京6号遗传背景下的NIL‑ssp1植株表现为半矮化、叶夹角变小、叶片深绿色、穗型改变等表型。
NIL‑ssp1水稻穗变小(图1,B、C)、抽穗不完全(图1B)。统计发现,NIL‑ssp1的每穗粒数(图1D)、一次枝梗数(图1E)、二次枝梗数(图1F)都明显少于NIL‑SSP1。尤其,NIL‑ssp1水稻二次枝梗数目减少更为显著,说明穗粒数的减少主要是由二次枝梗数目减少引起的。另外,NIL‑ssp1水稻植株半矮化,叶夹角直立(图1A,图2)。对其各节间长度占整个株高的百分比进行统计分析发现,其矮化主要是由于倒一节显著缩短引起的,属于nl矮化类型(图2)。
实施例2:ssp1基因抑制细胞分裂和细胞伸长
选取近等基因系的倒一节茎秆相同部位的组织进行固定,观察横向和纵向组织切片发现,NIL‑ssp1的倒一节茎秆(图3A)中维管束数目明显少于NP‑SSP1(图3B),说明NIL‑ssp1的细胞分裂受到抑制;同时,NIL‑ssp1的倒一节茎秆中纵向细胞数目和大小(图3D)明显小于NP‑SSP1(图3C),说明NIL‑ssp1中细胞分裂和细胞伸长均明显受到抑制。
实施例3:图位克隆SSP1基因
利用ssp1与南京6号杂交所获得的F1和F2后代进行遗传分析,统计数据和卡方检验发现其性状分离比符合3:1,说明该性状由一个显性单基因控制。
利用ssp1与南京6号杂交所构建的定位群体F2代单株表型分离,将SSP1粗定位于1号染色体长臂上Marker 337和Marker481之间。然后,利用ssp1与中花11杂交所构建的的F2代单株表型分离,将其精细定位在BAC AP002910上109kb的区域内(图4)。该区域含15个ORF,其中11个有预测蛋白产物。进一步测序发现,其中一个基因存在两个点突变:C端1360bp处的G‑C,导致Gly‑Arg,1366bp处的A‑C,导致Asn‑His。该基因只有一个外显子,编码一个GARS蛋白(图5)。
实施例4:SSP1与水稻DELLA蛋白有较高的序列保守性
SSP1基因编码一个GRAS蛋白,与水稻SLR1蛋白序列比对缺少了N端的DELLA、TVHYNP、polyS/T/V区,但是C末端多了47个氨基酸,其他区域非常保守,故该基因又被命名为SLR1‑Like1(SLRL1)。突变发生在C端(图5,箭头所示)。NCBI blast所有物种的GRAS蛋白,发现玉米ZmSCL1存在与SSP1蛋白C端相类似的保守序列。说明该基因在禾本科作物中也非常保守。
实施例5:遗传互补验证
将含水稻SSP1基因自身启动子(2214bp)、突变ssp1的全长cDNA(SEQ ID NO:3)和3’‑UTR的2215bp的DNA片段克隆到pCAMBIA1300载体(购自CAMBIA,Canberra,Australia),获得pSSP1:ssp1‑3’UTR载体并将其转化日本晴。与野生型相比,转基因日本晴植株株高和穗部性状有明显变化,类似于突变体ssp1的表型:植株半矮化、叶片直立、包穗等性状。如图6所示。
实施例6:过表达ssp1植株表现出突变体ssp1的强化表型
构建过表达载体p35S:ssp1,将其转化水稻日本晴,结果发现转基因植株无论穗型还是株型都有着比ssp1突变体本身更强的表型(图7)。并且,转基因植株的株高和穗型表型与ssp1基因表达量正相关,随着ssp1基因表达量升高,转基因植株矮化越明显,叶夹角和穗越小(结果未显示);当ssp1基因表达非常高时,转基因植株严重矮化,穗发育受到严重抑制,甚至不能生长(图8)。
实施例7:过表达SSP1的转基因植株表现出类似于ssp1突变体的表型
构建过表达载体p35S:SSP1,将其转化水稻日本晴。过量表达SSP1基因的转基因植株也产生类似于ssp1突变体的表型:植株半矮化、叶夹角变小、叶片长度变短、叶色变深和包穗等(图9)。另外,过量表达SSP1转基因植株表型(包括株高、叶夹角和包穗等性状)与SSP1基因表达量呈正相关。但与过量表达ssp1基因的转基因植株表型相比,在相同表达水平下,过量表达ssp1有更强的表型变化。
实施例8:下调SSP1基因的表达水平并不明显改变日本晴表型
转p35S:SSP1‑RNAi载体的转基因日本晴株系与野生型在表型上无明显差别(图10A),统计结果也显示,株高、叶夹角变化不明显;每穗穗粒数(图10B)和一次枝梗数目(图10C)略大于野生型,但差别不显著;二次枝梗数目(图10D)与野生型接近。
实施例9:SSP1基因表达模式分析
以根、叶片、叶鞘、10cm长穗、茎秆倒一节的居间分生组织(0‑3cm)、伸长区(3‑8cm)和成熟区(8cm以上)等太阳城集团位为材料,用RT‑PCR分析SSP1的表达模式发现,SSP1基因几乎在水稻不同发育阶段的各个组织中都有表达,尤其在穗部和茎秆倒一节的居间分生组织中表达量最高(图11)。突变体ssp1与野生型SSP1基因表达模式和表达水平基本一致(图11)。
实施例10:SSP1是核定位蛋白
构建载体p35S:HA‑SSP1‑GFP转化日本晴,激光共聚焦荧光显微镜下观察转基因植株中的荧光信号,发现SSP1‑GFP融合蛋白定位于细胞核内(图12)。这与预测SSP1的氨基酸序列(图8)中含有核定位信号相符。另外,GFP蛋白能增强SSP1功能,所得到的二十多个独立的转基因株系都表现为极端矮化,类似于高表达ssp1的表型。由于N端融合GFP往往能够增加融合蛋白的稳定性,这也暗示ssp1突变可能增强了SSP1蛋白的稳定性。
实施例11:SSP1是GA信号传导途径的负调控因子
ssp1突变体表现为赤霉素不敏感的矮化表型。在野生型水稻种子的糊粉层细胞中,GA能诱导α‑淀粉酶的活性,表现为GA依赖型。而ssp1突变体糊粉层细胞中,其α‑淀粉酶活性不能被GA诱导(图13)。这些实验说明SSP1是GA信号传递途径中的负调控因子,ssp1基因可以用于改变赤霉素反应。这个结果可用于主要农作物(例如,小麦、水稻和大麦等)抑制种子穗发芽遗传改良。
实施例12:SSP1蛋白参与赤霉素信号传递但其功能并不依赖GID1‑GA‑SLR1调控模块
构建pGADT7:SSP1、pGADT7:NSLR1‑SSP1(N端融合SLR1蛋白的DELLA结构域、THVYNP以及polyS/T/V结构域)载体,分别与构建的pGBKT7‑GID1、pGBKT7‑UBOX、pGBKT7‑GID2(购自CLONTECHLaboratories,Inc.)进行酵母双杂交实验,酵母菌株使用AH109(购自CLONTECH Laboratories,Inc.)。研究结果表明,SSP1蛋白以及在其N端融合SLR1蛋白的N端(含DELLA结构域、THVYNP以及polyS/T/V结构域)后均不与GID1互作(图14A);同时它也不与F‑BOX蛋白(GID2)(图14B)和U‑BOX蛋白(图14C)互作,说明SSP1虽然同SLR1一样是GA途径的负调控因子,但与SLR1不同,SSP1的功能不依赖于GID1,也不是通过SCFGID2介导的26S蛋白酶途径降解的。
结合实施例11和12,说明SSP1是一个新的不依赖于GID1和DELLA蛋白功能的GA信号途径负调控因子。
实施例13:SSP1基因参与油菜素内酯(BR)信号传递途径
首先,ssp1突变体具有油菜素内酯(BR)典型的表型,如:叶色明显加深,叶夹角无论是剑叶(图15A、15C)还是第二叶(图15B、15D)均明显变小。ssp1突变体的叶夹角约为10度,而野生型叶夹角约为45度(图15C、15D)。
其次,水稻种子去壳、灭菌,37℃催芽24小时,挑选萌发基本一致的种子播到含不同浓度(10‑9、10‑8、10‑7、10‑6M)BR的1%GM培养基上。然后置于30℃持续光照,两周后测量第二叶鞘的长度。结果如图17所示,随着BR浓度的增加,突变体第二叶鞘的长度变长,在BR浓度达到10‑6M时,其长度已接近野生型水平。这非常类似于BR缺失突变体对BR的反应。
再次,在ssp1背景下,BR信号途径中的调控因子DLT、BU1基因的表达水平也发生了变化,DLT(图18)的表达量明显上调,而BU1(图18)的表达量略有下调。这说明,SSP1与上述基因位于同一通路,参与BR的信号传导与调控。
实施例14:ssp1和SSP1基因在单、双子叶植物(拟南芥)中功能保守
我们将水稻SSP1基因的过表达载体p35S:SSP1和p35S:ssp1异源转入双子叶植物拟南芥野生型(Columbia)。转基因株系株高显著降低,开花太阳城集团推迟,而且ssp1过表达植株叶片卷曲(图19)。这些实验说明,水稻SSP1基因在拟南芥中也能抑制植物生长发育,其功能在单、双子叶植物间是保守的。这种功能的保守性,意味着SSP1基因或ssp1基因可以用于在大豆、油菜、棉花等双子叶植物上进行株型改良。
水稻ssp1基因和SSP1基因转化水稻和拟南芥都能导致植物半矮化表型和提高植株的耐倒伏性。过量表达ssp1基因和SSP1基因的转基因水稻和拟南芥植株的叶片变为深绿色。利用光合仪L1‑6400(LI‑COR Inc.,Lincolin,NE.USA),在的光强1500μmol photous m‑2sec‑1下,测定CO2的净吸收量(μmol m‑2sec‑1),结果表明,转基因的水稻叶片的光和效率比对照提高18.5%。同时,本发明人发现,转基因水稻叶片夹角变小。根据本发明人的实验结果,ssp1基因和SSP1基因的转基因水稻叶角变小、半矮化表型和高光效的特性说明,ssp1基因和SSP1基因可以用来降低水稻、小麦等农作物的株高并增强抗倒伏性,改良农作物穗型和提高叶片光合效率,提高农作物的种植密度和增加群体光合效率,进而提高产量。例如,可以通过转基因组织特异性过量表达ssp1基因或SSP1基因,实现提高作物光合效率、半矮化育种等目标。
另外,本发明人还通过构建南京6背景下的近等基因系(NIL‑SSP1、NIL‑ssp1),分析了ssp1在南京6(籼稻)背景下的表型,结果发现ssp1在籼稻背景下具有与日本晴(粳稻)背景下同样的表型,而且株高降低更为明显。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
参考文献:
Jiang,C.,and Fu,X.(2007).GA action:turning on de‑DELLA repressing signaling.Curr Opin Plant Biol.10(5),461‑465.
H.Itoh,et al..(2005).Overexpression of a GRAS protein lacking the DELLA domain confers altered gibberellin responses in rice.The Plant Journal.44,669‑679.Gurdev S.Khush,.(2001).Green revolution:the way forward.Nature Reviews Genetics.2,815‑822.
Tomoaki Sakamoto,et al.,.(2003).Genetic manipulation of gibberellin metabolism in transgenic rice.Nature Biotechnology.21,909‑913.
Tong,H.,Jin,Y.,Liu,W.,Li,F.,Fang,J.,Yin,Y.,Qian,Q.,Zhu,L.,and Chu,C.(2009).DWARF AND LOW‑TILLERING,a new member of the GRAS family,plays positive roles in brassinosteroid signaling in rice.Plant J.58,803‑816.
Shimada,A.,Ueguchi‑Tanaka,M.,Sakamoto,T.,Fujioka,S.,Takatsuto,S.,Yoshida,S.,Sazuka,T.,Ashikari,M.,Matsuoka,M.(2006).The rice SPINDLY gene functions as a negative regulator of gibberellin signaling by controlling the suppressive function of the DELL A protein,SLR1,and modulating brassinosteroid synthesis.Plant J.48,390‑402.
Wang,L.,Xu,Y.,Zhang,C.,Ma,Q.,Joo,S.,Kim,S.,Xu,Z.,Chong,K.(2008).OsLIC,a Novel CCCH‑Type Zinc Finger Protein with Transcription Activation,Mediates Rice Architecture via Brassinosteroids Signaling.PLoS ONE.3(10):e3521..
Zhang,L.,Bai,M,Wu,J.,Zhu,J.,Wang,H.,Zhang,Z.,Wang,W.,Sun,Y.,Zhao,J.,Sun,X.,Yang,H.,Xu,Y.,Kim,S.,Fujioka,S.,Lin,W.,Chong,K.,Lu,T.,and Wang,Z.(2009).Antagonistic HLH/bHLH Transcription Factors Mediate Brassinosteroid Regulation of Cell Elongation and Plant Development in Rice and Arabidopsis.Plant Cell.21,3767‑3780.
太阳城集团Yongzhong Xing and Qifa Zhang.(2010).Molecular Basis of Plant Architecture.Annu.Rev.Plant Biol.59:253‑279.

关 键 词:
控制 水稻 大小 基因 突变体 应用
  专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
太阳城集团本文
本文标题:控制水稻穗大小基因、其突变体及应用.pdf
链接地址:http://zh228.com/p-6420565.html
太阳城集团我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服客服 - 联系我们

copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
 


收起
展开
葡京赌场|welcome document.write ('');