太阳城集团

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一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒及其测试方法.pdf

摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201310547097.3

申请日:

2013.11.07

公开号:

太阳城集团CN103630657A

公开日:

2014.03.12

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情: 专利权的转移IPC(主分类):G01N 33/02登记生效日:20170511变更事项:专利权人变更前权利人:洛阳莱普生太阳城集团科技有限公司变更后权利人:洛阳莱普生太阳城集团科技有限公司变更事项:地址变更前权利人:471000 河南省洛龙科技园区牡丹大道西N3号变更后权利人:471000 河南省洛阳市洛龙科技园区牡丹大道西N3号变更事项:共同专利权人变更后权利人:河北英茂生物科技有限公司|||专利权保全的解除IPC(主分类):G01N 33/02申请日:20131107授权太阳城集团日:20151028解除日:20170116|||专利权的保全IPC(主分类):G01N 33/02申请日:20131107授权太阳城集团日:20151028登记生效日:20160822|||授权|||著录事项变更IPC(主分类):G01N 33/02变更事项:发明人变更前:王善普 王兴普 刘欢 闫玉良 王宇东变更后:王善普 李秀梅 张和平 秦百众 陈高良 沈前程 马超峰 刘玉宝 赵昀祺|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/02申请日:20131107|||公开
IPC分类号: G01N33/02 主分类号: G01N33/02
申请人: 洛阳莱普生太阳城集团科技有限公司
发明人: 王善普; 王兴普; 刘欢; 闫玉良; 王宇东
地址: 471000 河南省洛龙科技园区牡丹大道西N3号
优先权:
专利代理机构: 洛阳公信知识产权事务所(普通合伙) 41120 代理人: 时国珍
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201310547097.3

授权太阳城集团号:

太阳城集团||||||||||||||||||

法律状态太阳城集团日:

2017.05.31|||2017.02.15|||2016.09.14|||2015.10.28|||2015.10.07|||2014.04.09|||2014.03.12

法律状态类型:

专利申请权、专利权的转移|||专利权的保全及其解除|||专利权的保全及其解除|||授权|||著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及一种检测喹诺酮类化学发光检测试剂盒及其测试方法,所述的试剂盒内设有发光板、经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体、经过辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液和发光液,所述发光板上有包被抗原,该包被抗原由喹诺酮类药物半抗原与OVA采用混合酸酐法进行偶联得到,所述经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体是以诺氟沙星、氧氟沙星衍生物与OVA偶联后制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔所得;本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒最低检测限可达0.1ng/ml,线性检测范围0.1-8.1ng/ml,板内变异系数在20%以内,水样品中回收率在78%-118%之间。

权利要求书

权利要求书
1.  一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒内设有发光板、经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体、经过辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液和发光液,所述发光板上有包被抗原,该包被抗原由喹诺酮类药物半抗原与OVA采用混合酸酐法进行偶联得到,所述经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体是以诺氟沙星、氧氟沙星衍生物与OVA偶联后制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔所得。

2.  如权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述发光板为乳白色不透明的96孔聚苯乙烯化学发光板。

3.  如权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述喹诺酮类系列标准溶液包括浓度分别为0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL的喹诺酮类校准液。

4.  如权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述喹诺酮类多克隆抗体在使用时按照1:10000的比例稀释。

5.  如权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述经过辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体在使用时按照1:5000的比例稀释。

6.  如权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述浓缩磷酸盐缓冲液由80g NaCl、2.0g  KH2P04、229.0g  Na2HP04·12H20和2.0g  KCl溶于1000mL蒸馏水中制得。

7.  如权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述浓缩洗涤液由浓縮磷酸盐缓冲液与吐温-20混合配制而成,其中吐温-20的浓度为0.05mol/L。

8.  如权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,其特征在于:所述发光液由底物A和底物B两部分组成,底物A 为0.01M鲁米诺溶解到0.01M pH为8.8的Tris缓冲液中得到的混合物,底物B 为0.001M对碘苯酚溶解到0.01M pH为8.8的Tris缓冲液后再加入其体积3/10000的过氧化氢得到的混合物,所述鲁米诺作为发光物,对碘苯酚为发光增强剂,使用时将底物A和底物B按照1:1的比例混合。

9.  利用权利要求1所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒测试喹诺酮类药物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)加样:按照50μL/孔的加入量向发光板的孔中分别加入喹诺酮类系列标准浓度溶液和样品溶液,然后按照50μL/孔的加入量向孔中加入喹诺酮类多克隆抗体工作液,25℃条件下恒温孵育2.5h;
2)洗涤:倾出孔中液体,按照280μL/孔的加入量向发光板的孔中加入洗涤液,静置5min后倾出洗涤液、拍干,重复三次;
3)加辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体:在发光板的每个孔中加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体工作液100μL,25℃条件下恒温孵育1.5h;
4)洗涤:倾出孔中液体,按照280μL/孔的加入量向发光板的孔中加入洗涤液,静置5min后倾出洗涤液、拍干,重复三次;
5)加发光液:在发光板的每个孔中加入发光液100μL;
6)检测:用化学发光免疫分析仪测定发光板每个孔的发光强度;
7)结果判断:取标准品浓度对数做横坐标,标准品检测发光值对数做纵坐标,做标准曲线,根据每一个样品的发光强度,由标准曲线得出每一个样品的浓度。

说明书

说明书一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒及其测试方法
技术领域
    本发明涉及一种直接化学发光检测试剂盒及其测试方法,具体地说是一种动物组织、鸡蛋、蜂蜜等样本中喹诺酮类药物残留量的快速化学发光检测试剂盒及其测试方法。
背景技术
    喹诺酮类药物类药物可用于治疗呼吸道感染、泌尿生殖系统感染、消化系统感染及其它类的各种感染,还可用于抗肿瘤和抗病毒作用。除了被应用于人体的疾病治疗,还被应用到水产业上。该类药物易诱发细菌耐药性,故对生产食品动物使用的管理方式越来越严格,欧盟和北美等国家只批准恩诺沙星作为动物专用的抗菌药,诺氟沙星和环丙沙星已禁止在水产养殖业中使用。同时我国及世界卫生组织、日本等国家和组织都将喹诺酮类药物类药物列入限制使用的兽药名单,并制订出相应的最高残留限量:根据不同动物品种、组织和药物种类,最高残留限量在10-6000μg/kg之间。日本2006年5月开始实施“肯定列表制度”后,对喹诺酮类药物类药物残留的检测要求进一步提高。目前,喹诺酮类药物类药物的检测主要有微生物法(MIA)、高效液相色谱法 (HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS)、酶联免疫法(ELISA)等。
1、微生物法(MIA)是利用抗菌药物具有的抗微生物活性,在特定的培养基上接种已知微生物,再加入被测样品或提取液,经过一定太阳城集团的培养,根据对特异微生物的抑制作用观察所含药物的抑菌效果,利用抑菌差异筛选出残留物质的种类。微生物法是日本食肉卫生检查所和各个食品检查机构检测肉食品中抗生素残留的常规筛选方法。MIA方法的灵敏度与分析者所期望的水平和规定的最高残留限量(MRL)显示出满意的结果,尽管如此,在所期望的检测水平下,阴性样品的可靠性不被保证。
2、高效液相色谱法(HPLC)具有检测精度高、假阳性率低的特点。HPLC法的主要缺点是仪器价格昂贵,操作比较繁琐,耗时长,检测费用昂贵,对检测人员专业要求较高,样本前处理较复杂。
3、液相色谱-质谱法(LC-MQ),样品不需要衍生化处理,可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样品进行检测。该方法对喹诺酮类药物的最低检测限达到1.0ng/kg,LC-MS/MS 联用,可进一步提高信噪比,所以可用于对阳性结果的确认手段。但是,无论LC-MS还是 LC-MS/MS,仪器检测法未能解决仪器造价昂贵,操作步骤繁琐,样本前处理复杂,对操作人员专业素养要求高等问题。
4、酶联免疫法(ELISA)是20世纪70年代出现,用于微量物质的检测,最早应用于传染病、肿瘤标志物、激素水平等临床检测,90年代开始在我国食品安全检测领域推广应用,目前依托ELISA技术的试剂盒、试纸条已经成为食品安全快速检测领域的主导产品,同时也是我公司研发和销售的主要产品类型。酶联免疫检测法基于抗原-抗体的特异性反应,检测灵敏度较高、特异性较好,技术操作简易,容易掌握,确实解决了大量的以前难以解决的许多微量小分子物质如抗生素、激素、农药残留等的定性、定量分析工作,对食品安全快速检测技术的发展起到了积极的促进作用。但是,ELISA方法存在许多自身无法克服的缺陷,主要表现在:
1)非均相反应:检测过程中为分离游离物与结合物,需要多步洗板过程,耗时费力,难以提高操作的自动化程度;
2)酶催化反应:借助酶催化底物显色,测定反应液吸光度值,反应的太阳城集团与温度对酶活力存在较大影响,试剂稳定性差。
发明内容
针对上述现有技术中喹诺酮类药物的检测存在的缺陷,本发明提供一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒及其测试方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,所述的试剂盒内设有发光板、经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体、经过辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液和发光液,所述发光板上有包被抗原,该包被抗原由喹诺酮类药物半抗原与OVA采用混合酸酐法进行偶联得到,所述经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体是以诺氟沙星、氧氟沙星衍生物与OVA偶联后制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔所得;
所述发光板为乳白色不透明的96孔聚苯乙烯化学发光板;
所述喹诺酮类系列标准溶液包括浓度分别为0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL的喹诺酮类校准液;
所述喹诺酮类多克隆抗体在使用时按照1:10000的比例稀释;
所述经过辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体在使用时按照1:5000的比例稀释;
所述浓缩磷酸盐缓冲液由80g NaCl、2.0g  KH2P04、229.0g  Na2HP04·12H20和2.0g  KCl溶于1000mL蒸馏水中制得;
所述浓缩洗涤液由浓縮磷酸盐缓冲液与吐温-20混合配制而成,其中吐温-20的浓度为0.05mol/L;
所述发光液由底物A和底物B两部分组成,底物A 为0.01M鲁米诺溶解到0.01M pH为8.8的Tris缓冲液中得到的混合物,底物B 为0.001M对碘苯酚溶解到0.01M pH为8.8的Tris缓冲液后再加入其体积3/10000的过氧化氢得到的混合物,所述鲁米诺作为发光物,对碘苯酚为发光增强剂,使用时将底物A和底物B按照1:1的比例混合。
利用如上所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒测试喹诺酮类药物的方法,包括以下步骤:
1)加样:按照50μL/孔的加入量向发光板的孔中分别加入喹诺酮类系列标准浓度溶液和样品溶液,然后按照50μL/孔的加入量向孔中加入喹诺酮类多克隆抗体工作液,25℃条件下恒温孵育2.5h;
2)洗涤:倾出孔中液体,按照280μL/孔的加入量向发光板的孔中加入洗涤液,静置5min后倾出洗涤液、拍干,重复三次;
3)加辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体:在发光板的每个孔中加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体工作液100μL,25℃条件下恒温孵育1.5h;
4)洗涤:倾出孔中液体,按照280μL/孔的加入量向发光板的孔中加入洗涤液,静置5min后倾出洗涤液、拍干,重复三次;
5)加发光液:在发光板的每个孔中加入发光液100μL;
6)检测:用化学发光免疫分析仪测定发光板每个孔的发光强度;
7)结果判断:取标准品浓度对数做横坐标,标准品检测发光值对数做纵坐标,做标准曲线,根据每一个样品的发光强度,由标准曲线得出每一个样品的浓度。
本发明的有益效果:
(1)灵敏度高:灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性,其灵敏度可达0.1ng/ml,化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的物质,对临床上的早期诊断具有十分重要的意义;
(2)宽的线性动力学范围:发光强度在4-6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系,这与显色的酶免疫分析吸光度(OD值)为2.0的范围相比,优势明显,虽然RIA也有较宽的线性动力学范围,但放射性限制了其应用;
(3)结果稳定、误差小;
(4)安全性好及使用期长:免除了使用放射性物质,到目前为止,还未发现其危害性,试剂稳定,保存期可达六个月至一年以上;
(5)本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒最低检测限可达0.1ng/ml,线性检测范围0.1-8.1ng/ml,板内变异系数在20%以内,水样品中回收率在78%-118%之间;
(6)本发明选用多克隆抗体,可降低假阳性率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的阐述。
一种喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒,所述的试剂盒内设有发光板、经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体、经过辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液和发光液,所述发光板上有包被抗原,该包被抗原由喹诺酮类药物半抗原与OVA采用混合酸酐法进行偶联得到,所述经过化学底物处理的喹诺酮类多克隆抗体是以诺氟沙星、氧氟沙星衍生物与OVA偶联后制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔所得;
所述发光板为乳白色不透明的96孔聚苯乙烯化学发光板;
所述喹诺酮类系列标准溶液包括浓度分别为0.lng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL的喹诺酮类校准液;
所述喹诺酮类多克隆抗体在使用时按照1:10000的比例稀释;
所述经过辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体在使用时按照1:5000的比例稀释;
所述浓缩磷酸盐缓冲液由80g NaCl、2.0g  KH2P04、229.0g  Na2HP04·12H20和2.0g  KCl溶于1000mL蒸馏水中制得;
所述浓缩洗涤液由浓縮磷酸盐缓冲液与吐温-20混合配制而成,其中吐温-20的浓度为0.05mol/L;
所述发光液由底物A和底物B两部分组成,底物A 为0.01M鲁米诺溶解到0.01M pH为8.8的Tris缓冲液中得到的混合物,底物B 为0.001M对碘苯酚溶解到0.01M pH为8.8的Tris缓冲液后再加入其体积3/10000的过氧化氢得到的混合物,所述鲁米诺作为发光物,对碘苯酚为发光增强剂,使用时将底物A和底物B按照1:1的比例混合。
利用如上所述的喹诺酮类药物快速化学发光检测试剂盒测试喹诺酮类药物的方法,包括以下步骤:
1)加样:按照50μL/孔的加入量向发光板的孔中分别加入喹诺酮类系列标准浓度溶液和样品溶液,然后按照50μL/孔的加入量向孔中加入喹诺酮类多克隆抗体工作液,25℃条件下恒温孵育2.5h;
2)洗涤:倾出孔中液体,按照280μL/孔的加入量向发光板的孔中加入洗涤液,静置5min后倾出洗涤液、拍干,重复三次;
3)加辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体:在发光板的每个孔中加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体工作液100μL,25℃条件下恒温孵育1.5h;
4)洗涤:倾出孔中液体,按照280μL/孔的加入量向发光板的孔中加入洗涤液,静置5min后倾出洗涤液、拍干,重复三次;
5)加发光液:在发光板的每个孔中加入发光液100μL;
6)检测:用化学发光免疫分析仪测定发光板每个孔的发光强度;
7)结果判断:取标准品浓度对数做横坐标,标准品检测发光值对数做纵坐标,做标准曲线,根据每一个样品的发光强度,由标准曲线得出每一个样品的浓度。
抗体灵敏度的测定:
1、样品处理
(1)鸡肉样本
用均质器均质组织样本,称取3.0士0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中,加入9ml乙腈-0.1mol/L氢氧化钠溶液,充分上下振荡混合10min,3000g以上,15℃条件下离心10min;移取上清液至50ml聚苯乙烯离心管中,加入0.02M磷酸盐缓冲液,再加入8ml 二氯甲烷,振荡器振荡10min,3000g以上,15℃条件下离心l0min,去上层,取下层有机相 6ml~10ml至干净玻璃试管中,于50-60℃水浴氮气流下吹干;用0.5ml复溶工作液,15℃条件下离心5min;轻吸掉上层正己烷及中间层杂质,取下层50μl用于分析,样本稀释倍数为1。
(2)血清样本前处理方法
将采集的鸡血样本室温放置,待析出血清;吸取0.5ml血清样本至10ml干净的聚苯乙烯离心管中,加入乙腈-二氯甲烷溶液,用振荡器剧烈振荡5min,3000g以上,室温(20-25℃)条件下离心8min ;吸取上层有机相2ml~10ml至干净的玻璃试管中,于50-60℃水浴氮气流下吹干;加入1ml正己烷,用涡旋仪涡动10S,再加入1ml复溶工作液,用涡旋仪涡动,3000g以上,室温25℃条件下离心5min;除去上层有机相,取下层水相50μl用于分析,样本稀释倍数为4。
(3)鸡蛋前处理方法
用均质器低速均质鸡蛋样本,使得蛋清和蛋黄充分混合;取2.0士0.05g鸡蛋样本至15ml聚苯乙烯离心管中,加入8ml乙腈,用振荡器充分振荡5min;取2ml上清液至10ml干净玻璃试管中,于50 ~60℃水浴氮气流下吹干;加入1ml正己烷,用涡旋仪涡动1min;加入1ml复溶工作液,用涡旋仪充分涡动,3000g以上,室温25℃条件下离心5min;去除上层有机相,取下层50μl用于分析,样本稀释倍数为2。
(4)饲料前处理方法
取1.0士0.05g饲料样本于50ml聚苯乙烯离心管中,加入9ml 0.1M氢氧化钠溶液,再加入1ml甲醇,充分振荡5min,3000g以上,室温(20-25℃)离心5min ;移取50μl上清液至2ml聚苯乙烯离心管中,加入450μl复溶工作液;取50μl用于分析,样本稀释倍数为100。
(5)水产前处理方法
取2.0士0.05g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中,加入1ml 0.1M氢氧化钠溶液,再加入7ml乙腈,用振荡器充分振荡5min;3000g以上离心10min;取2ml上清液于10ml玻璃试管中,于50-60℃水浴氮气流下吹干;加入1ml正已烷用涡旋仪涡动30S,再加入1ml复溶工作液,涡动30S,3000g以上,室温25℃条件下离心5min ;除去上层有机相,取下层50μl用于分析,样本稀释倍数为2。
(6)蜂蜜前处理方法
称取1.0士0.05g样本至50ml聚苯乙烯离心管中,加入1ml去离子水,涡动充分溶解,再加入7ml乙腈,振荡混匀5min;3000g以上,室温25℃条件下离心l0min,取1ml上层清液,至10ml干燥玻璃管中,于50-60℃水浴氮气流下吹干;加入1ml复溶工作液,涡动1min,取50μl 用于分析,样本稀释倍数为8。
2、检测过程
(1)包被过程:用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液,将喹诺酮类包被抗原配成4μg/ml的溶液,每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL,4℃条件下过夜,次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,280μL/孔,每次5分钟,拍干。(此步简称洗涤,下同)。
(2)封闭过程:用250μL/孔的封闭液封闭上述已包被的发光板,25℃条件下恒温孵育2.5小时,洗涤。
(3)竞争过程:加稀释抗体(1:10000) 50μL/孔与不同浓度的药物50μL/孔于上述已封闭的反应孔中,25℃条件下恒温孵育2-4小时,洗涤。
(4)酶标过程:于各反应孔中加入新鲜稀释辣根过氧化酶标记的羊抗兔的抗体(1:5000)100μL/孔,25℃条件下恒温孵育1.5小时,洗涤。
(5)发光过程:于各反应孔中加入100 μL/孔临时配制的发光液,立即用化学发光免疫分析仪检测。
(6) 结果判断:取标准品浓度对数做横坐标,标准品检测发光值对数做纵坐标,做标准曲线,每一个样品的浓度可以从标准曲线得出。
结果如表1所示: 
表1  标准品浓度与发光值对应表
喹诺酮标准品(ng/ml)发光值0.19865400.51973080.8123300198654519530109865
图1为取标准品浓度对数做横坐标,标准品检测发光值对数做纵坐标,所得的标准曲线。

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一种 喹诺酮类 药物 快速 化学 发光 检测 试剂盒 及其 测试 方法
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