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一种犬细小病毒化学发光检测试剂盒.pdf

摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201310556137.0

申请日:

2013.11.11

公开号:

CN103630688A

公开日:

2014.03.12

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情: 专利权的转移IPC(主分类):G01N 33/569登记生效日:20171207变更事项:专利权人变更前权利人:洛阳莱普生太阳城集团科技有限公司变更后权利人:洛阳现代生物技术研究院有限公司变更事项:地址变更前权利人:471000 河南省洛阳市洛龙科技园区牡丹大道西N3号变更后权利人:471000 河南省洛阳市洛龙区科技园开元大道西S8号变更事项:共同专利权人变更前权利人:洛阳现代生物技术研究院有限公司|||专利权保全的解除IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20131111授权太阳城集团日:20160525解除日:20170116|||专利权的保全IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20131111授权太阳城集团日:20160525登记生效日:20160822|||专利权的转移IPC(主分类):G01N 33/569登记生效日:20160722变更事项:专利权人变更前权利人:洛阳莱普生太阳城集团科技有限公司变更后权利人:洛阳莱普生太阳城集团科技有限公司变更事项:地址变更前权利人:471000 河南省洛阳市洛龙科技园区牡丹大道西N3号变更后权利人:471000 河南省洛阳市洛龙科技园区牡丹大道西N3号变更事项:专利权人变更后权利人:洛阳现代生物技术研究院有限公司|||著录事项变更IPC(主分类):G01N 33/569变更事项:发明人变更前:王善普 李秀梅 李长印 王会会 张莎莎变更后:李秀梅 方先珍 程果 朱前磊 耿玉静 李权伟 刘玉宝|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20131111|||公开
IPC分类号: G01N33/569; G01N21/76 主分类号: G01N33/569
申请人: 洛阳莱普生太阳城集团科技有限公司
发明人: 王善普; 李秀梅; 李长印; 王会会; 张莎莎
地址: 471000 河南省洛阳市洛龙科技园区牡丹大道西N3号
优先权:
专利代理机构: 洛阳公信知识产权事务所(普通合伙) 41120 代理人: 时国珍
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201310556137.0

授权太阳城集团号:

|||||||||||||||||||||

法律状态太阳城集团日:

2017.12.26|||2017.03.15|||2016.09.21|||2016.08.10|||2016.08.10|||2016.05.25|||2014.04.09|||2014.03.12

法律状态类型:

太阳城集团专利申请权、专利权的转移|||专利权的保全及其解除|||专利权的保全及其解除|||专利申请权、专利权的转移|||著录事项变更|||授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

太阳城集团一种犬细小病毒化学发光检测试剂盒,涉及检测犬细小病毒的试剂盒,包括盒体,盒体内设有包被有浓度为10ug/mL的犬细小病毒包被抗体的聚苯乙烯96孔微孔板、犬细小病毒抗原质控对照品、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体溶液、犬细小病毒标准溶液、样品稀释液、浓缩洗涤液和化学发光液。本发明试剂盒灵敏度高可达3ng/mL,并且具有高特异性、宽检测范围、操作方法简单、反应结果易于观察等特点,不仅提高了检测效率,而且保证了检测的精确度,可用于出口检验、食品安全检验及动物养殖业现场快速检测。

权利要求书

权利要求书
1.  一种犬细小病毒化学发光检测试剂盒,包括盒体,其特征在于:盒体内设有包被有浓度为10ug/mL的犬细小病毒包被抗体的聚苯乙烯96孔微孔板、犬细小病毒抗原质控对照品、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体溶液、犬细小病毒标准溶液、样品稀释液、浓缩洗涤液和化学发光液;
所述犬细小病毒标准溶液有6种,浓度分别为:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL和65ng/mL;
所述样品稀释液是将8g NaCl、0.2g KH2P04、22.9g Na2HP04·12H20、0.2g KC1和酪蛋白溶于1000mL蒸馏水中制备而成,其中酪蛋白浓度为1%;
所述浓缩洗涤液是将80g NaCl、2.0g KH2P04、229.0g Na2HP04·12H20、2.0g KC1和吐温-20溶于1000mL蒸馏水中制备而成,其中吐温-20的浓度为5%;
所述化学发光液分为化学发光底物液A和化学发光底物液B两种液体,化学发光底物液A为用Tris缓冲液配制的含2mmol/L鲁米诺和0.2mmol/L对碘苯酚的混合液,化学发光底物液B为用Tris缓冲液配制的含7.5mmol/L双氧水的混合液。

说明书

说明书一种犬细小病毒化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域,具体的说涉及一种犬细小病毒化学发光检测试剂盒。
背景技术
犬细小病毒(CPV)是美国Eugster于1978年从患处血性肠炎的犬粪便中发现的病毒,该病毒为细小病毒科细小病毒属,单股线状DNA病毒。犬细小病毒以导致犬发病率高,传染性强、死亡率高等特点已成为犬科动物临床发病的重要致病病毒。犬细小病毒已成为我国养犬业最为严重的传染病之一,该病既影响着家养宠物的生命健康,又危害着我国养犬业、毛皮动物养殖业及野生动物保护业的发展。
目前,犬细小病毒的传统检测方法有血清学检测方法和病原学检测方法。血清学检测方法主要为血凝试验、酶联免疫吸附试验和免疫胶体金检测方法,但灵敏度不高、特异性不强。病原学检测方法目前常用F81、MDCK等传代细胞系分离培养病毒,病毒分离方法虽然在理论上可以检出一个感染性的病毒粒子,确诊犬细小病毒的感染,但也因分离病毒的操作繁琐、代价高及确诊缓慢等因素没有投入临床和满足基层使用。随着分子生物学的发展,目前已有多种PCR方法用于犬细小病毒的检测,虽在灵敏度方面有所改进,但由于需要精密仪器的配套使用,同样也无法满足现有检测的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高灵敏、高特异性、操作方法简单、反应结果易于观察,非常适用于现场检测犬细小病毒的化学发光试剂盒。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:一种犬细小病毒化学发光检测试剂盒,包括盒体,盒体内设有包被有浓度为10ug/mL的犬细小病毒包被抗体的聚苯乙烯96孔微孔板、犬细小病毒抗原质控对照品、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体溶液、犬细小病毒标准溶液、样品稀释液、浓缩洗涤液和化学发光液。
所述犬细小病毒抗原质控对照品包括30-80IU/L的低质控对照品和200-350IU/L的高质控对照品。
所述犬细小病毒标准溶液有6种,浓度分别为:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL和65ng/mL。
所述样品稀释液是将8g NaCl、0.2g KH2P04、22.9g Na2HP04·12H20、0.2g KC1和酪蛋白溶于1000mL蒸馏水中制备而成,其中酪蛋白浓度为1%。
所述浓缩洗涤液是将80g NaCl、2.0g KH2P04、229.0g Na2HP04·12H20、2.0g KC1和吐温-20溶于1000mL蒸馏水中制备而成,其中吐温-20的浓度为5%。
所述化学发光液分为化学发光底物液A和化学发光底物液B两种液体,化学发光底物液A为用Tris缓冲液配制的含2mmol/L鲁米诺和0.2mmol/L对碘苯酚的混合液,化学发光底物液B为用Tris缓冲液配制的含7.5mmol/L双氧水的混合液。
所述辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体溶液为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液。
所述犬细小病毒包被抗体的包被过程是将犬细小病毒单克隆抗体溶于0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中形成10ug/mL的溶液,将上述溶液加入到聚苯乙烯96孔微孔板的各孔中,并在4℃下静置12h,然后倾去上述溶液,用洗涤液洗涤各孔3次、拍干,然后向各孔加入150ul/孔的封闭液,并在37℃下孵育2h,倾去孔内液体,洗涤液洗涤3次,拍干,最后将微孔板用铝箔袋真空密封,并在4℃下保存。其中,所述的犬细小病毒单克隆抗体与0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的稀释度为1:800,所述封闭液是由10g BSA溶于100ml水中,再加入5%的脱脂奶粉、1%的明胶、0.05%的NaN3制成的。
有益效果:本发明试剂盒灵敏度高可达3ng/mL,并且具有高特异性、宽检测范围、操作方法简单、反应结果易于观察等特点,不仅提高了检测效率,而且保证了检测的精确度,可用于出口检验、食品安全检验及动物养殖业现场快速检测。
具体实施方式
一种犬细小病毒化学发光检测试剂盒,包括盒体,盒体内设有包被有浓度为10ug/mL的犬细小病毒包被抗体的聚苯乙烯96孔微孔板、犬细小病毒抗原质控对照品、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体溶液、犬细小病毒标准溶液、样品稀释液、浓缩洗涤液和化学发光液。
所述犬细小病毒抗原质控对照品包括30-80IU/L的低质控对照品和200-350IU/L的高质控对照品。
所述犬细小病毒标准溶液有6种,浓度分别为:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL和65ng/mL。
所述样品稀释液是将8g NaCl、0.2g KH2P04、22.9g Na2HP04·12H20、0.2g KC1和酪蛋白溶于1000mL蒸馏水中制备而成,其中酪蛋白浓度为1%。
所述浓缩洗涤液是将80g NaCl、2.0g KH2P04、229.0g Na2HP04·12H20、2.0g KC1和吐温-20溶于1000mL蒸馏水中制备而成,其中吐温-20的浓度为5%。
所述化学发光液分为化学发光底物液A和化学发光底物液B两种,化学发光底物液A为用Tris缓冲液配制的含2mmol/L鲁米诺和0.2mmol/L对碘苯酚的混合液,化学发光底物液B为用Tris缓冲液配制的含7.5mmol/L双氧水的混合液。
所述辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体溶液为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液。
所述犬细小病毒包被抗体的包被过程是将犬细小病毒单克隆抗体溶于0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中形成10ug/mL的溶液,将上述溶液加入到聚苯乙烯96孔微孔板的各孔中,并在4℃下静置12h,然后倾去上述溶液,用洗涤液洗涤各孔3次、拍干,然后向各孔加入150ul/孔的封闭液,并在37℃下孵育2h,倾去孔内液体,洗涤液洗涤3次,拍干,最后将微孔板用铝箔袋真空密封,并在4℃下保存。其中,所述的犬细小病毒单克隆抗体与0.1mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的稀释度为1:800,所述封闭液是由10g BSA溶于100ml水中,再加入5%的脱脂奶粉、1%的明胶、0.05%的NaN3制成的。
应用本发明的试剂盒检测犬细小病毒的方法包括如下步骤:
(1)配洗液:将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍,制成工作浓度的洗涤液;
(2)编号:在所述包被过犬细小病毒包被抗体的聚苯乙烯96孔微孔板上设高质控对照品孔、低质控对照品孔、犬细小病毒标准溶液孔以及待检样品孔,并编号;
(3)加样孔稀释液:向待检样品孔加入样品稀释液,每孔90ul;
(4)加样:分别向高质控对照品孔和低质控对照品孔加入对应的质控对照品100ul,向犬细小病毒标准溶液孔内加入各个标准溶液100ul/孔,并向各待检样品孔加入待检样品10ul,然后在37±2℃下温育30分钟;
(5)洗涤:倾出各孔中的液体,然后向各孔加入步骤(1)的洗涤液250μL,洗涤3次,拍干;
(6)加酶标羊抗鼠抗体溶液:将辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体溶液与步骤(1)的洗涤液配制成1:2500工作浓度的稀释液,然后向各孔加入100μL上述稀释液,再在37±2℃下温育30分钟;
(7)洗涤:倾出各孔中的液体,每孔加入步骤(1)的洗涤液250μL,洗涤3次,拍干;
(8)加化学发光液:向各孔均先后加入化学发光底物液A和化学发光底物液B各50μL;
(9)检测:用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光强度;
(10)结果判断:以犬细小病毒标准溶液的浓度对数做横坐标,标准溶液的发光值对数做纵坐标,做标准曲线,根据每一个待检样品的发光值可以从标准曲线上计算出待检样品的浓度。
本发明试剂盒的特异性、灵敏度和精密度的检测结果如下:
1、特异性试验结果

高、低质控对照品的发光值检测结果符合标准。
2、精密性试验结果

精密性:CV%=8%。
3、灵敏度试验结果

太阳城集团经计算本试剂盒的灵敏度为3ng/mL。

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