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抗人B7H4单克隆抗体及其制备和应用.pdf

摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201410121768.4

申请日:

2014.03.28

公开号:

太阳城集团CN103981150A

公开日:

2014.08.13

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/20申请日:20140328|||公开
IPC分类号: C12N5/20; C07K16/18; G01N33/577; G01N33/574; A61K39/395; A61P35/00; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: C12N5/20
申请人: 苏州大学
发明人: 张学光; 虞培娟; 傅丰庆; 张光波
地址: 215123 江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号
优先权:
专利代理机构: 苏州创元专利商标事务所有限公司 32103 代理人: 陶海锋
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201410121768.4

授权太阳城集团号:

||||||

法律状态太阳城集团日:

太阳城集团2016.06.01|||2014.09.10|||2014.08.13

法律状态类型:

太阳城集团授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

太阳城集团本发明公开了抗人B7-H4单克隆抗体及其制备和应用,具体涉及一种单克隆抗体,所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCCNo.8788的杂交瘤细胞株产生;本发明所述抗人B7-H4单克隆抗体2B7识别不同肿瘤细胞株表面B7-H4分子的表达,可作为生物学检测指标应用在肿瘤细胞检测中;并且,通过体外实验发现,本发明所述抗人B7-H4单克隆抗体2B7能阻断B7-H4分子对T细胞增殖的抑制效应。

权利要求书

权利要求书
1.  一种杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株为分泌小鼠抗人B7-H4分子单克隆抗体杂交瘤细胞株2B7,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其简称为CGMCC,保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期是2014年2月19日,保藏编号为CGMCC No.8788。

2.  一种抗人B7-H4 单克隆抗体,其特征在于,所述抗人B7-H4 单克隆抗体为保藏编号CGMCC No.8788的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.  权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体在制备用于肿瘤细胞检测的药物中应用。

4.  权利要求2所述抗人B7-H4单克隆抗体在制备阻断B7-H4分子对T细胞增殖抑制的药物中的应用。

说明书

说明书抗人B7-H4单克隆抗体及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体,具体涉及抗人B7-H4单克隆抗体及其制备方法,以及所述单克隆抗体在阻断B7-H4分子抑制T细胞增殖中的应用。 
背景技术
T细胞活化需要双信号。第一信号是由T细胞特异性受体TCR识别APC细胞表面MHC复合物,第二信号是由共刺激分子与相应的配体或受体结合而产生。缺乏共刺激信号会导致T细胞无能。B7家族是经典的共刺激信号提供者,成员包括CD80、CD86与他们的配体CD28、CTL-4,在T细胞的活化过程中提供正向或负向的信号。最近,一些B7家族的同源物被鉴定,包括B7-H1、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6。B7-H4也称为B7X或B7S1,是最新发现的新成员之一,广泛表达在人类正常组织和细胞上,通过抑制T细胞增殖、活化、减少细胞因子分泌和阻滞细胞周期来调节适应性免疫应答,同时也通过抑制中性粒细胞前体细胞的生长调节固有免疫。B7-H4高表达于各种肿瘤组织,被视为预后不良指标。因此,B7-H4成为研究分子免疫调节的新热点,有助于打破肿瘤微环境中的负性免疫网络。 
B7-H4为I型跨膜蛋白,胞外段与B7家族其他成员有20-30%氨基酸同源性。人鼠B7-H4分子87%的氨基酸序列相同。B7-H4的mRNA广泛表达在人类的外周组织,如肺、睾丸、胰腺、前列腺、胎盘、尿道、皮肤、肌肉、肠道、胃、肾脏、肝脏、心脏、大脑和卵巢;然而,B7-H4蛋白却很少表达。B7-H4在结肠癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤的恶性肿瘤细胞和卵巢癌、肺癌等组织中被发现。 
在适应性免疫中,B7-H4抑制了CD4 、CD8阳性T细胞活化、增殖,减少了细胞因子IL-2,IFN-γ的分泌,并通过阻滞细胞周期减少CTL的产生。B7-H4在APC上表达也抑制了T细胞的增殖。在体内,利用特异性单克隆抗体阻断内源性的B7-H4能增强T细胞反应,暗示了B7-H4在T细胞活化中扮演了重要的角色。在急性淋巴细胞减少诱发的自稳性T细胞增殖能促进抗肿瘤免疫,这些细胞B7-H4表达很微弱,与特异性抗B7-H4抗体结合后无抑制作用,并且不能产生IL-10。与野生型小鼠相比,B7-H4敲基因小鼠能轻度增强Th1细胞反应,减少杜氏原虫的感染,这说明B7-H4能抑制Th1细胞的抗感染作用。然而,缺失B7-H4不影响由Th1或Th2细胞介导的气道或皮肤的炎症反应高敏感性。同样的,B7-H4敲基因小鼠不影响CTL抗病毒作用。这些结果提示了B7-H4可能为负性共刺激分子家族中的一员,共同参与了T细胞免疫的微观调节。没有直接的证据证明B7-H4有屏障功能,尽管它在肿瘤细胞表面有不同水平的糖基化,这表明糖基化可能是CTL和肿瘤细胞之间相互作用的潜在机制。B细胞表面的B7-H4的作用并未被研究,然而增强EB病毒感染的B细胞表面B7-H4的表达能增加细胞内ROS的水平,从而诱导Fas配体表达,继而引发Fas介导的细胞凋亡。研究发现,B7-H4的表达显著抑制了EB病毒阳性淋巴细胞的生长,主要通过下调CDK4/6,CDK2,细胞周期蛋白E/D的表达、使蛋白激酶和细胞周期蛋白E发生磷酸化和上调P21的表达使细胞周期阻滞在G0-G1期。这些结果说明B7-H4是治疗EB病毒阳性淋巴细胞的潜在靶点。这些研究结果表明了B7-H4能抑制B细胞的增殖和活化,诱导其凋亡,使免疫球蛋白的产生减少从而抑制了适应性免疫应答。 
另有研究显示肿瘤相关性B7-H4+巨噬细胞和CD4+CD25+FOXP3+的调节性T细胞抑制了肿瘤相关抗原特异性T细胞免疫,肿瘤相关巨噬细胞自分泌趋化因子CCL22介导调节性T细胞向肿瘤组织移动,这些调节性T细胞又介导了APC和巨噬细胞表面B7-H4的表达。已有报道称调节性T细胞能介导巨噬细胞自分泌IL-10、IL-6,这些细胞因子又刺激了巨噬细胞表达B7-H4,这两个研究表明调节性T细胞可通过B7-H4途径来抑制APC细胞的活化。 
B7-H4在固有免疫中作用主要通过抑制中性粒细胞的增殖来抑制固有免疫。B7-H4敲基因小鼠比野生型更耐受产单核李斯特菌的感染,暗示了B7-H4在固有免疫中发挥负性效应。进一步研究发现敲基因小鼠外周器官中的中性粒细胞数量多于野生型小鼠,但是杀菌功能没有变化。体外实验发现B7-H4抑制骨髓来源中性粒细胞前体细胞的增殖,这暗示了B7-H4负性调节中性粒细胞的增殖。由于固有免疫主要依赖于中性粒细胞,B7-H4又能负向调节中性粒细胞的抗感染免疫,所以B7-H4可以通过抑制中性粒细胞的增殖来抑制固有免疫。 
人类很多肿瘤中,B7-H4在mRNA和蛋白水平上有表达并且与病人的预后呈负相关。正常组织不表达B7-H4蛋白或仅在mRNA水平有表达,肿瘤组织却过表达B7-H4,这说明与蛋白转录过程中的异常调节有关。B7-H4优先表达于人类脑胶质瘤和髓母细胞瘤的未分化细胞和一群CD133+肿瘤干细胞上。在免疫缺陷小鼠中,CD133+的脑胶质瘤细胞比CD133-的具有更强的增殖能力。 
在一些动物模型中发现B7-H4在肿瘤细胞上高表达,能抑制细胞凋亡和刺激肿瘤生长。B7-H4有广泛而多样的糖基化,这是肿瘤细胞逃避免疫监视的屏障。在肿瘤的进展中,B7-H4扮演了转化癌症前期细胞并使之逃避免疫监视的角色,比如在卵巢癌的免疫缺陷小鼠模型中,高表达B7-H4能刺激肿瘤的形成,主要通过刺激细胞增殖,增加细胞粘附,转移和侵袭来实现,这说明了B7-H4也许是独立于免疫之外的直接刺激肿瘤形成的因素。正常上皮细胞过表达B7-H4会导致其恶性转变,主要是抑制了细胞的凋亡。在体外实验中,用siRNA干扰B7-H4基因的肿瘤细胞株会加速凋亡。 
在肿瘤微环境中,除了肿瘤细胞,肿瘤浸润巨噬细胞,小血管的内皮细胞等被发现组成性表达B7-H4。卵巢癌患者腹水中的肿瘤相关巨噬细胞上高表达B7-H4促进了肿瘤的生长。用寡义核苷酸阻滞B7-H4后能使巨噬细胞恢复对T细胞的刺激功能从而使肿瘤衰退。 
最近研究数据发现B7-H4在外周组织中发挥作用负向调节靶器官的免疫应答。B7-H4在mRNA水平广泛表达但在蛋白水平表达受限,说明B7-H4是在转录后受到调控。寻找受体是研究B7-H4功能的热点和要点,但目前仍存在困难,主要由于受体/配体的低亲和力。因此,需要更多的研究致力于B7-H4受体的寻找。鉴于B7-H4高表达于肿瘤组织或肿瘤患者的外周血中,因此通过调控B7-H4或其受体的表达来调节免疫应答将成为免疫治疗的新路径。研究B7-H4的表达类型,也为诊断肿瘤和判断预后提供有利指标。现有结果都提示B7-H4是个重要的负性协同刺激分子,值得大家的关注和研究;但遗憾的是,自从2003年被发现以来已经过去十余年的太阳城集团,人们对B7-H4的了解还只是冰山一角,尽管许多实验室数据提示B7-H4通过抑制T细胞活化,改变细胞因子分泌和阻滞细胞周期来实现负性调控免疫应答反应,但其中具体的信号机制还尚未清楚,并且B7-H4的受体至今尚未明确。现有技术中抗人B7-H4的单克隆抗体主要有MIH43(美国,BioLegend)和H74(美国,eBioscience)两种,但他们识别的肿瘤位点较少,无法检测到B7-H4在肿瘤细胞株上的表达。因此,研制新的B7-H4的单克隆抗体,创造靶向研究工具迫在眉睫。 
发明内容
本发明目的是提供一种抗人B7-H4单克隆抗体以及能产生抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株;所述抗人B7-H4单克隆抗体具有新型识别位点,可以用于流式细胞术、免疫印迹技术及免疫组化检测。 
为达到上述发明目的,本发明采用的技术方案是:一种杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤 : 
1)构建高表达人B7-H4分子的转基因细胞:将 B7-H4基因克隆入真核表达载体,转染小鼠成纤维细胞293T细胞,构建高表达分子的转基因细胞293T/B7-H4;用转基因细胞293T/B7-H4免疫Balb/c小鼠;
2)获取融合细胞生长克隆:从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞,按常规方法,将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合,然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选,进而获取融合细胞生长克隆;
3)应用流式细胞学技术筛选和鉴定后,挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.8788的杂交瘤细胞株2B7。
上述杂交瘤细胞株的保藏太阳城集团为:保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期是2014年2月19日,保藏编号为CGMCC No.8788,分类命名为杂交瘤细胞株2B7。 
上述技术方案中,步骤1)中高表达人B7-H4分子的转基因细胞293T/B7-H4具有较强的免疫原性,并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面,从而可更有效地激发机体的免疫反应。 
上述技术方案中,步骤1)中,制备293T/B7-H4细胞的方法可以按照本领域技术人员熟知的DNA操作技术(例如参见Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour,1989)进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养;具体构建步骤参照毛一香等人发表的文献(参见:毛一香,王勤,陈洁  陈永井 施勤 杨明峰 李文香 张学光 . 人B7-H4基因转染细胞的构建及其对T细胞的共刺激效应的初步研究. 中华微生物学和免疫学杂志2006年8月第25卷第8期609-613页)。 
上述技术方案中,制备抗人B7-H4单克隆抗体的方法可以按照本领域已知的常规方法(参见:Kohler and Milstein,Nature 265:495 -497,1975)。也可以按照美国专利5,585,089中所述的方法制备相应的人源化形式的抗单克隆抗体。 
采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有以下两种: 
1)在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞,培养后培养液中分离纯化所需单克隆抗体;
2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞,动物腹水液中分离和纯化所需单克隆抗体。
本发明中,保藏编号为CGMCC No.8788杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体为抗人B7-H4的单克隆抗体2B7。 
流式细胞仪分析结果显示,所述抗人B7-H4的单克隆抗体2B7能识别多种肿瘤细胞上表达的B7-H4分子;竞争抑制试验结果进一步显示,所述抗人B7-H4单克隆抗体2B7与现有商品化抗体识别完全不同的抗原表位;因此,2B7可制备用于识别人B7-H4的检测抗体,亦可能成为检测肿瘤细胞的重要标志。 
因此,本发明同时要求保护上述抗人B7-H4单克隆抗体2B7作为生物学检测指标,在制备用于肿瘤细胞检测药物中的应用。 
本发明同时要求保护上述抗人B7-H4单克隆抗体2B7在制备阻断B7-H4信号对T细胞增殖的抑制的药物中的应用。 
由于上述技术方案运用,本发明与现有技术相比具有下列优点: 
本发明公开的新的抗人B7-H4单克隆抗体2B7能特异性地识别B7-H4分子,与现有的单抗的识别位点存在差异,能检测到隐蔽位点,具有更广的识别谱,可以检测到多种肿瘤细胞株上B7-H4的表达,为临床检测能提供更好的帮助。除此之外,2B7生产成本低,性价比高,为临床、科研减低成本。
附图说明
图1为实施例一中以流式细胞术分析抗人B7-H4单克隆抗体2B7对转基因细胞上B7-H4分子的识别; 
图2为实施例一中2B7杂交瘤细胞株染色体的核型分析(X1000倍)图;
图3为实施例一中单克隆抗体2B7的Ig亚型和效价测定结果图;
图4为实施例一中用western blot验证单克隆抗体2B7的识别结果图;
图5为实施例一中用细胞免疫组化的方法验证单克隆抗体2B7的识别结果图;
图6为实施例一中以流式细胞术分析单克隆抗体2B7和商品化抗体MIH43识别的抗原位点的竞争性抑制的结果图;
图7为施例一中以流式细胞术分析克隆抗体2B7对肿瘤细胞株上B7-H4识别的结果图;
图8为实施例一中以免疫组化方法分析克隆抗体2B7对新鲜组织上B7-H4分子的识别结果图;
图9为实施例二中以检测CCK8的方法鉴定克隆抗体2B7对B7-H4分子的信号作用。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述: 
实施例一:抗人B7-H4单克隆抗体的制备
本实施例描述本发明的抗人B7-H4单克隆抗体2B7的制备。
(1) 抗人B7-H4单克隆抗体的制备 
构建高表达B7-H4分子的转基因细胞(293T/B7-H4),具体构建步骤参照毛一香等人发表的文献:人B7-H4基因转染细胞的构建及其对T细胞的共刺激效应的初步研究(毛一香,王勤,陈洁等,中华微生物学和免疫学杂志2006年8月第25卷第8期609-613页)。
将高表达B7-H4分子的转基因细胞(293T/B7-H4)作为免疫原,三次免疫接种Balb/c小鼠(107/500 1/只)(间隔3周)。末次免疫后第四天,取小鼠脾脏细胞与Ag8骨髓瘤细胞株进行细胞融合(共20块96孔板)。以高表达B7-H4分子的293T/B7-H4为阳性对照及不表达B7-H4分子的293T/mock为阴性对照,用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定(参见图1,图1显示以流式细胞术分析抗人B7-H4单克隆抗体2B7对转基因细胞上B7-H4分子的识别。其中灰色峰为阴性对照,一抗为小鼠IgG,二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示转基因细胞与抗人B7-H4单抗反应的结果,其中第一抗体是本发明的抗人B7-H4单抗2B7,第二抗体是荧光素PE标记的羊抗鼠IgG)。阳性克隆经3次有限稀释后,克隆的阳性率达到约95%。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人B7-H4的杂交瘤细胞株,并被命名为2B7(保藏号为CGMCC No.8788)。这些杂交瘤细胞经体外持续传代(40代)后,仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株2B7的染色体分析显示,这株杂交瘤细胞的染色体数目大于100条(参见附图2),超过小鼠B细胞和杂交瘤细胞Ag8的染色体数,表明此杂交瘤为融合体。 
(2)抗人B7-H4单克隆抗体的生产与特性性鉴定 
(a)采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠,腹腔内注入Pristane (0.5ml/只)。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞(1×107/只),同时再次腹腔内注射Pristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物(0.2ml/只)。5-10天后收获腹水,并离心取上清于-80℃保存。
(b)腹水型单抗的纯化和定量。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后,以蛋白 G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液,对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8~10mg/ml。间接免疫荧光法分析结果表明,纯化的单克隆抗体的效价在1∶2000以上。 
(c)Ig亚类鉴定。采用试纸快速测定(Argen公司)法鉴定Ig亚类,结果显示2B7为小鼠IgG1型,轻链为κ。 
附图3为上述单克隆抗体2B7的Ig亚型和效价测定结果图,显示2B7的重链为IgG1,轻链为Kappa,效价大于1∶2000。 
(d)用化学发光的免疫印迹Western blot 分析的方法鉴定单克隆抗体2B7识别特异性。简述步骤如下:293T/B7-H4细胞,293T/mock细胞各取1×107个,PBS洗两遍,重悬于0.3ml的预冷RIPA(1×PBS,1%NP-40,0.5%去氧胆酸钠,0.1%SDS)细胞裂解液中,加蛋白酶抑制剂(10 mg/ml PMSF,30 μg/ml aprotinin,100mmol/L Na3VO4),摇匀2~3min,置冰盒中用1ml针筒吸放3~4次,15min后再重复3~4次,再放置15~20min,移入Eppendoff管,离心(12000rpm,10min),取上清30μl,加入6×SDS-Loading Buffer煮沸10min。取出样品和商品化B7-H4人FC融合蛋白经12% SDS-PAGE电泳,并电转移(0.65mA/cm2)至硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜;次日加入纯化的鼠抗人B7-H4 mAb室温孵育1 h,用PBST洗去未结合的抗体,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,孵育1h,洗涤后加入ECL显色试剂,在暗室用X光片曝光数分钟,进行显影后再定影。以商品化的B7-H4融合蛋白为阳性对照组,293T/mock细胞裂解液为阴性对照组,293T/B7-H4细胞裂解液为实验组,2B7能特异性结合B7-H4人Fc融合蛋白(40-60KD)和293T/B7-H4转基因细胞裂解物,并在40-55KD之间形成特异性条带,而不能和293T/Mock细胞裂解物结合(参见附图4)。 
(e)用细胞免疫组织化学的方法鉴定单克隆抗体2B7识别特异性:收集生长良好的293T/mock、293T/B7-H4细胞进行离心甩片,1×104细胞/片,丙酮固定后按常规免疫组化步骤进行,阴性对照组的一抗为鼠IgG,实验组一抗为1:100稀释后纯化的mAb,二抗为HRP羊抗鼠IgG,DAB显示,苏木素染核,树胶封片观察。细胞免疫组化的结果也显示2B7仅能特异性识别转基因细胞表面B7-H4分子的表达。(参见附图5, A为2B7与293T/B7-H4细胞结合,B为同型IgG与293T/B7-H4细胞结合,C为2B7与293T细胞结合,B为同型IgG与293T细胞结合)。 
(f)抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验: PBS洗涤293T/B7-H4细胞两次,调整到5×105/管,分别加入纯化后单克隆抗体2B7  0ug 、0.25ug、0.5ug、1ug、2ug 、3ug ,4℃孵育30min,PBS洗涤后加入1 test PE标记商品化单抗MIH43,再4℃孵育30min,PBS洗涤后用流式细胞仪检测,附图6为识别结果,灰色峰表示阴性对照,虚线峰代表阳性对照,实线峰表示竞争峰。结果显示不同浓度的2B7均不能抑制转基因细胞与商品化抗体MIH43的结合,表明2B7与MIH43的识别的抗原表位不同。 
(g)按照常规技术,以流式细胞术分析单抗2B7对多种肿瘤细胞株上B7-H4分子的识别情况,参见附图7,其中灰色峰为阴性对照,一抗为鼠抗人B7-H4单抗2B7,二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG。透明峰显示肿瘤细胞与鼠抗人B7-H4单抗(2B7)反应的结果;可以看出本发明公开的新的抗人B7-H4单克隆抗体2B7能特异性地识别B7-H4分子。 
(h)以免疫组化方法分析单抗2B7对新鲜组织上B7-H4分子的识别情况:取样本组织,10%中性福尔马林固定,95%酒精脱水,正丁醇透明过夜,渗蜡、包埋、制备厚5μm的石蜡切片,贴附于多聚赖氨酸载玻片上,70℃烤片1h。切片脱蜡(二甲苯I 10min, 二甲苯II 10min, 无水乙醇10min, 95%乙醇 5min, 85%乙醇5min, 蒸馏水洗涤5min), 于高压锅中放入适量柠檬酸钠缓冲液, 放入切片,加热至放气1min以修复抗原。冷却后取出切片。PBS洗涤后加入0.3%过氧化氢以阻断内源过氧化物酶,室温10min,PBS洗涤后,每张切片分别加入3%BSA封闭,于37℃孵育30min后分别加入浓度为10μg/ml特异性鼠抗人B7-H4抗体2B7作为一抗,37℃孵育1h。PBS(PH7.2)洗涤3次后加入HRP标记的二抗,于37℃孵育40min。PBS洗涤后,加DAB显色,显微镜下观察3-10min,自来水冲洗,苏木素复染,60℃水浴返蓝,梯度乙醇脱水干燥,中性树胶封片,观片,显影并摄影。以同型IgG来代替一抗作为阴性对照。最后B7-H4的显色结果判断根据在细胞浆和细胞膜上是否有显著棕色而分别判定为阳性或阴性。若样本组织的阳性细胞数大于10% 则该样本为阳性,不然则为阴性。结果见图8(A为放大200倍的阳性表达,B为放大400倍的阳性表达,C为放大200倍的阴性对照,D为放大400倍的阴性对照),免疫组化方法分析2B7对人乳腺癌组织中B7-H4分子的识别结果显示,单抗 2B7 检测到乳腺癌组织中癌细胞的薄膜和胞浆弥漫性表达B7-H4抗原。 
实施例二:单克隆抗体2B7对T 细胞增殖抑制的阻断作用 
1)分离正常人外周血PBMC,磁珠分选T细胞,接种到预先包被激发型单抗CD3(100ng/ml)和CD28(500ng/ml)的96孔板中(10×105/孔),分别加入B7-H4鼠Fc融合蛋白(10ug/ml)、B7-H4单克隆单体(10ug/ml)或两者混合物,每组设3个复孔,培养72h后加CCK8检测增殖情况。激发型单抗CD3和CD28刺激T细胞增殖,B7H4鼠Fc融合蛋白抑制T细胞的增殖,加入单克隆抗体2B7观察阻断抑制效应。CCK8结果显显示2B7能在一定程度上阻断负性分子的抑制效应;参见附图9,其中1为未刺激的T细胞、2为刺激活化后T细胞、3为活化的T细胞中加入B7-H4鼠Fc融合蛋白、4为活化的T细胞中加入B7-H4鼠Fc融合蛋白和2B7,可以看出第2组和第3组比较** P <0.05,第3组和第4组比较*P <0.05。单克隆抗体2B7有效地阻断B7-H4对T细胞增殖的抑制效应。

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