太阳城集团

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一种测定原花青素含量及鉴别的方法.pdf

摘要
申请专利号:

CN201410146549.1

申请日:

2014.04.12

公开号:

太阳城集团CN103954700A

公开日:

2014.07.30

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 30/02申请公布日:20140730|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20140412|||公开
IPC分类号: G01N30/02; G01N30/06 主分类号: G01N30/02
申请人: 陕西衡道检测技术有限公司
发明人: 秦蓉; 王让成; 李苗鸽; 钱英; 王涛; 任静; 孙蕊艳; 苌钊; 翟巧丽
地址: 710065 陕西省西安市高新区锦业路69号创业研发园C区1号瞪羚谷E101A室
优先权:
专利代理机构: 云南派特律师事务所 53110 代理人: 龚笋根
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法律状态
申请(专利)号:

CN201410146549.1

授权太阳城集团号:

||||||

法律状态太阳城集团日:

2017.02.08|||2014.08.27|||2014.07.30

法律状态类型:

发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开一种测定原花青素含量及鉴别的方法,涉及一种用于天然物质、保健食品、药品中原花青素含量的检测方法,属于有机化学领域。其特征在于:本发明用分析纯甲醇作为溶剂,将试样与分析纯甲醇混合于40KHz超声处理20min,以4000r/min离心后取上清液,制得试样溶液。其有益效果在于:该检测过程运用常规实验设备及材料,便于方法推广和应用;含量测定部分样品前处理简单,确定原花青素B2做为对照品,测定结果准确,避免了由于对照品不同而造成的结果差异;产品鉴别部分采用了可靠的HPLC方法,建立了不同来源原花青素类产品的特征谱图,可有效鉴别其来源,方法专属性强。

权利要求书

权利要求书
1.  一种测定原花青素含量的方法,其特征在于:
(1)试样溶液制备:称取50-100mg试样置于50mL容量瓶中,加入30mL甲醇,以40KHz超声处理20min,放冷至室温后,加甲醇至刻度,摇匀,以4000r/min离心后取上清液,即试样溶液;
(2)标准曲线的绘制:精密称取原花青素标准品B2(≥99%)10mg,溶于10mL甲醇中,分别吸取该溶液0mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL置于具塞锥瓶中,采用与试样相同的测定方法测吸光度,以浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标制标准曲线;
(3)试样测定:将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出6mL置于具塞容器中,再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1mL试样溶液,混匀,置98-100℃沸水浴回流,精确加热40min后,立即置2-10℃冷水中冷却15min后,于546nm波长处测吸光度,用标准曲线计算试样中原花青素的含量。

2.  一种利用权利要求1所述测定方法鉴别物料中原花青素的方法,其特征在于:包括以下步骤:以乙腈作为流动相添加剂,通过梯度洗脱,实现原花青素试样的鉴别,具体步骤如下:
①标准样品溶液制备:称取样品200mg置于50mL容量瓶中,加入分析纯甲醇40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用微孔滤膜过滤后进样测定;
②溶液制备:称取样品200mg置于50mL容量瓶中,加入分析纯甲醇40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
③色谱条件:色谱柱:PRP-125cm×4.6mm×5μm,
流动相A:分析纯乙腈
流动相B:0.3%磷酸水溶液
太阳城集团(min)045656685流动相A1020601010流动相B9080409090
流速:1ml/min
检验波长:278nm
柱温:室温
进样量:5μL。

3.  如权利要求2所述测定方法鉴别物料中原花青素的方法,其特征在于:所述微孔滤膜孔径为0.45μm。

说明书

说明书一种测定原花青素含量及鉴别的方法
技术领域
本发明涉及一种用于天然物质、药品中原花青素含量的检测方法,属于有机化学领域,具体的说是一种测定原花青素含量及鉴别的方法。
背景技术
原花青素(Proanthocyanidins),也叫做缩合鞣质(condensed tannins)或前花青素,是一种由若干个儿茶素类化合物聚合而成,具有黄烷-3-醇结构的植物多酚类化合物,存在于自然界多种植物中,银杏叶、葡萄籽、越橘、松树皮、莲房、玫瑰花等植物中均含有原花青素。研究表明原花青素不仅具有很强的抗氧化活性,同时还具有良好的抗肿瘤活性、血管内皮细胞保护作用、调节血压功能、抗炎症和过敏功能,是多种功能性食品的有效成分,因此近年来从植物中提取的各种原花青素广泛用于各类保健食品中。
由于原花青素是一类成分及其复杂的化合物,同时又缺少商业可用的对照,因此,目前原花青素的含量测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法;鉴别方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法。
分光光度法的基本原理是利用原花青素在无机酸存在和加热的条件下被降解,产生红色花青素,在546nm处有最大吸收,测定原花青素类化合物。此方法具有代表性的是2007版的《保健食品评价与技术规范》。分光光度法虽能测得原花青素总量,但方法中规定原花青素对照品过于笼统,不宜购得,且该方法不能鉴别原花青素来源。
HPLC的基本原理是利用前处理将原花青素降解成花青素或样品经过前处理 后,再利用HPLC色谱柱将原花青素中的各类组分分离,再用标准品定量。前者虽能测定原花青素含量,但不能鉴别不同来源的产品;后者由于原花青素的组成比较复杂,选定的标准品不同,结果就不同,因此该方法很难准确定量绝大部分产品的原花青素。前者具有代表性的是GB/T22244-2008《保健食品中前花青素的测定》;后者具有代表性的是美国药典(USP35)《葡萄籽原花青素》。
薄层色谱法的基本原理是利用原花青素类成分及其它杂质成分对固定相能力不同,使在移动相流过固定相的过程中,连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,从而达到各成分的互相分离的目的,再利用合适的显色从而达到鉴别的目的。该方法对于原花青素类产品鉴别的专属性差,因此也不能有效鉴别原花青素来源。具有代表性的是美国药典(USP35)《葡萄籽原花青素》。由于不同来源原花青素的提取物产品价格差异大,各类原花青素产品大部分无统一的检测标准或检测标准低,特别是不同来源原花青素的鉴别报道甚少,导致一些非法商家用低价格的原花青素产品掺加到高价格产品中,以次充好,扰乱市场,并且危害食用者的健康和安全。
目前最常用的测定方法检测太阳城集团都很长,反应太阳城集团均在半小时以上,不能做到快速检测,由于在线检测讲究速度与准确度,目前这几种方法都不能满足便于方法推广和应用的需求。
发明内容
本发明主要针对现有技术的不足,提出一种测定原花青素含量及鉴别的方法,其能对含原花青素的样品在常温常压下进行,所需太阳城集团短且无毒,检测结果准确。
为实现上述目的,本发明所述一种测定原花青素含量及鉴别的方法,其实现方法如下:
1、试样溶液制备:称取50-100mg试样置于50mL容量瓶中,加入30mL甲醇,以40KHz超声处理20min,放冷至室温后,加甲醇至刻度,摇匀,以4000r/min离心后取上清液,即试样溶液;
2、标准曲线的绘制:精密称取原花青素标准品B2(≥99%)10mg,溶于10mL甲醇中,分别吸取该溶液0mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL置于具塞锥瓶中,采用与试样相同的测定方法测吸光度,以浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标制标准曲线;
3、试样测定:将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出6mL置于具塞锥瓶中,再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1mL试样溶液,混匀,置98-100℃沸水浴回流,精确加热40min后,立即置2-10℃冷水中冷却15min后,于546nm波长处测吸光度,用标准曲线计算试样中原花青素的含量。
本发明所述一种测定原花青素鉴别的方法,以乙腈作为流动相添加剂,通过梯度洗脱,实现原花青素试样的鉴别,具体步骤如下:
①标准样品溶液制备:称取样品200mg置于50mL容量瓶中,加入分析纯甲醇40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用微孔滤膜过滤后进样测定;
②溶液制备:称取样品200mg置于50mL容量瓶中,加入分析纯甲醇40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
③色谱条件:色谱柱:PRP-125cm×4.6mm×5μm,
流动相A:分析纯乙腈
流动相B:0.3%磷酸水溶液
太阳城集团(min)045656685流动相A1020601010流动相B9080409090
流速:1ml/min
检验波长:278nm
柱温:室温
进样量:5μL。
所述微孔滤膜孔径为0.45μm。
④HPLC鉴别比较:
在上述色谱条件下,待仪器稳定后,进样记录色谱图,比较试样谱图与标准样品谱图。
所述原花青素B2作为分光光度法检测原花青素用对照品,所述原花青素B2对照品由ChromaDex提供。
所述刚性苯乙烯-二乙烯苯共聚物微球形填料柱为原花青素HPLC鉴别用色谱柱,该色谱柱由Hamilton提供。
所述甲醇的浓度为分析纯。
本发明所述一种测定原花青素含量的方法,其有益效果在于:本发明用分析纯甲醇作为溶剂,将试样与分析纯甲醇混合于40KHz超声处理20min,以4000r/min离心后取上清液,制得试样溶液。其有益效果在于:该检测过程运用常规实验设备及材料,便于方法推广和应用;含量测定部分样品前处理简单,确定原花青素B2做为对照品,测定结果准确,避免了由于对照品不同而造成的结果差异;产品鉴别部分采用了可靠的HPLC方法,建立了不同来源原花青素类 产品的特征谱图,可有效鉴别其来源,方法专属性强。
附图说明
图1为蔓越橘提取物标准样品HPLC色谱图;
图2为葡萄籽提取物标准样品HPLC色谱图;
图3为花生衣提取物标准样品HPLC色谱图。
具体实施方式
以下实施例为本发明作进一步出阐述。
实施例1
1、试样溶液制备:称取蔓越橘提取物样品50mg试样置于50mL容量瓶中,加入30mL分析纯甲醇,以40KHz超声处理20min,放冷至室温后,加分析纯甲醇至刻度,摇匀,以4000r/min离心后取上清液,即试样溶液;
2、标准曲线的绘制:精密称取原花青素标准品B2(≥99%)10mg,溶于10mL分析纯甲醇中,分别吸取该溶液0mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL置于具塞锥瓶中,采用与试样相同的测定方法测吸光度,以浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标制标准曲线;
3、试样测定:将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出6mL置于具塞锥瓶中,再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1mL试样溶液,混匀,置100℃沸水浴回流,精确加热40min后,立即置2℃冷水中冷却15min后,于546nm波长处测吸光度,用标准曲线计算试样中原花青素的含量;
4、HPLC鉴别:
①色谱条件:色谱柱:PRP-125cm×4.6mm×5μm
流动相A:分析纯乙腈
流动相B:0.3%磷酸水溶液
太阳城集团(min)045656685流动相A1020601010流动相B9080409090
流速:1ml/min
检验波长:278nm
柱温:室温
进样量:5μL
②溶液制备:称取蔓越橘提取物样品约200mg置于50mL容量瓶中,加入分析纯甲醇40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
③标准样品溶液制备:称取蔓越橘提取物标准样品约200mg置于50mL容量瓶中,加入甲醇约40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
5、HPLC鉴别比较:
在上述色谱条件下,待仪器稳定后,进样记录色谱图,比较试样谱图与标准样品谱图。
实施例2
1、试样溶液制备:称取葡萄籽提取物样品50mg试样置于50mL容量瓶中,加入30mL分析纯甲醇,以40KHz超声处理20min,放冷至室温后,加分析纯甲醇至刻度,摇匀,以4000r/min离心后取上清液,即试样溶液;
2、标准曲线的绘制:精密称取原花青素标准品B2(≥99%)10mg,溶于10mL分析纯甲醇中,分别吸取该溶液0mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL 置于具塞锥瓶中,采用与试样相同的测定方法测吸光度,以浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标制标准曲线;
3、试样测定:将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出6mL置于具塞锥瓶中,再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1mL试样溶液,混匀,置100℃沸水浴回流,精确加热40min后,立即置10℃冷水中冷却15分钟后,于546nm波长处测吸光度,用标准曲线计算试样中原花青素的含量;
4、HPLC鉴别:
①色谱条件:色谱柱:PRP-125cm×4.6mm×5μm
流动相A:分析纯乙腈
流动相B:0.3%磷酸水溶液
太阳城集团(min)045656685流动相A1020601010流动相B9080409090
流速:1ml/min
检验波长:278nm
柱温:室温
进样量:5μL
②溶液制备:称取葡萄籽提取物样品约200mg置于50mL容量瓶中,加入分析纯甲醇约40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
③标准样品溶液制备:称取葡萄籽提取物标准样品约200mg置于50mL容量瓶中,加入甲醇约40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
5、HPLC鉴别比较同实施例1。
实施例3
1、试样溶液制备:称取花生衣提取物样品100mg试样置于50mL容量瓶中,加入30mL分析纯甲醇,以40KHz超声处理20min,放冷至室温后,加分析纯甲醇至刻度,摇匀,以4000r/min离心后取上清液,即试样溶液;
2、标准曲线的绘制:精密称取原花青素标准品B2(≥99%)10mg,溶于10mL分析纯甲醇中,分别吸取该溶液0mL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL置于具塞锥瓶中,采用与试样相同的测定方法测吸光度,以浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度为纵坐标制标准曲线;
3、试样测定:将正丁醇与盐酸按95:5的体积比混合后,取出6mL置于具塞锥瓶中,再加入0.2mL硫酸铁铵溶液和1mL试样溶液,混匀,置100℃沸水浴回流,精确加热40min后,立即置10℃冷水中冷却15min后,于546nm波长处测吸光度,用标准曲线计算试样中原花青素的含量;
4、HPLC鉴别:
①色谱条件:色谱柱:PRP-125cm×4.6mm×5μm
流动相A:分析纯乙腈
流动相B:0.3%磷酸水溶液
太阳城集团(min)045656685流动相A1020601010流动相B9080409090
流速:1ml/min
检验波长:278nm
柱温:室温
进样量:5μL
②溶液制备:称取花生衣提取物样品约200mg置于50mL容量瓶中,加入分析纯甲醇约40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
③标准样品溶液制备:称取花生衣提取物标准样品约200mg置于50mL容量瓶中,加入甲醇约40mL,以40KHz超声振荡30min后冷却至室温定容,用0.45μm微孔滤膜过滤后进样测定;
5、HPLC鉴别比较同实施例1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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一种 测定 花青素 含量 鉴别 方法
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