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利用HPLC检测木聚糖合成中Β1,4木糖转移酶活性的方法.pdf

摘要
申请专利号:

CN201410150610.X

申请日:

2014.04.15

公开号:

CN103954701A

公开日:

2014.07.30

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20140415|||公开
IPC分类号: G01N30/02 主分类号: G01N30/02
申请人: 华南农业大学
发明人: 吴蔼民; 赵先海; 邓小梅; 陈晓阳; 宋丽丽
地址: 510642 广东省广州市天河区五山路483号
优先权:
专利代理机构: 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 代理人: 苏运贞
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法律状态
申请(专利)号:

CN201410150610.X

授权太阳城集团号:

||||||

法律状态太阳城集团日:

2015.12.09|||2014.08.27|||2014.07.30

法律状态类型:

太阳城集团授权|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开一种利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法。本发明通过提取植物微囊体,利用微囊体中存在的β-1,4-木糖转移酶,进行Xyln-AA与UDP-Xyl的加成反应,然后利用HPLC进行加成产物的检测,探讨XylT在植物中的活性。由于XylT是木聚糖合成的关键酶,木聚糖是生物质半纤维素的主要成分,理解木聚糖的合成机理有利于更好地利用生物质半纤维素。本发明为深入研究木聚糖合成机理和调节半纤维素中木聚糖成分提供了一种可靠的途径,可根据需要,通过筛选木聚糖合成缺陷型植株,研究调节木聚糖形成的基因,或通过调节影响XylT合成的关键基因,来满足对材料中半纤维素不同含量的需求。

权利要求书

权利要求书
1.  一种利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将植物茎部去皮,加入提取液,4℃匀浆,过滤,收集滤液,将滤液离心,取上清液进行离心,得到的沉淀为细胞的膜结构,加入含有蛋白酶抑制剂的提取液悬浮沉淀,得到微囊体;利用BCA法测定得到的微囊体的蛋白浓度;-80℃保存;
(2)以尿苷二磷酸木糖和含荧光基团的低聚木糖为底物,利用步骤(1)中制备的微囊体的蛋白活性进行加成反应,反应产物进行酶失活处理,离心后,取上清,过滤,收集滤液,即为加成产物;
(3)取步骤(2)得到的加成产物和标准品分别进行高效液相色谱检测,通过对照各寡聚产物与标准品的保留太阳城集团获得加成产物构成谱;
(4)对步骤(2)得到的加成产物进行酶失活处理,然后离心,弃沉淀,取上清液,进行酶解,酶解产物进行高效液相色谱分析,可验证加成产物糖苷键的结构;
(5)对步骤(2)得到加成产物,进行纯化,然后进行MALDI-TOF-MS分析,通过比对分子量得知加成产物为不同聚合度的木糖。

2.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的含荧光基团的低聚木糖通过如下步骤制备:
①配制衍生反应试剂:30mg/mL荧光基团2-氨基苯甲酸和20mg/mL氰基硼氢化钠溶解在MABS中,得到衍生反应试剂;其中,MABS为:24mg/mL醋酸钠和20mg/mL硼酸溶解在甲醇溶液中,MABS要现配现用;
②标记反应:将低聚木糖与步骤①中得到的衍生反应试剂按照质量体积比1mg:1mL混合,在80℃反应80min,过量的衍生试剂通过加入乙醚混合后萃取三次去除上层溶液,底层为荧光基团2-氨基苯甲酸标记的低聚木糖,再通过Sep-Pak C18萃取萃取小柱纯化,得到将低聚木糖的还原末端标记荧光基团2-氨基苯甲酸成含荧光基团的低聚木糖,通过高效液相色谱中紫外检测;
所述的纯化通过如下步骤进行:按体积百分比:Sep-Pak C18固相萃取小柱用含0.1%甲酸的60%乙腈洗过后,用10mL1%甲酸活化小柱,100μL反应产物和等量的水混合上柱,再用10mL1%甲酸洗柱,最后用2mL含0.1%甲酸的 60%乙腈洗脱低聚木糖,得到纯化的产物;纯化的产物用氮气吹干后,溶解于20~100μL水备用。

3.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的将植物茎部去皮,加入提取液,植物与提取液的质量体积比为(2~5)g:1mL;
步骤(1)中所述的植物为黄梁木(Neolamarckia cadamba(Rubiaceae))或芦笋(Asparagus officinalis L.)。

4.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的提取液的组成成分为100mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,1mM DTT,1mM EDTA,0.1mM MnCl2,0.4M蔗糖;
步骤(1)中所述的过滤通过滤布进行过滤;
步骤(1)中所述的将滤液离心的条件为10000g,4℃离心10min;
步骤(1)中所述的取上清液进行离心的条件为100000g,4℃离心1h;
步骤(1)中所述的含有蛋白酶抑制剂的提取液为蛋白酶抑制剂的终浓度是1×cocktail的提取液;
所述的加入含有蛋白酶抑制剂的提取液悬浮沉淀,植物与含有蛋白酶抑制剂的提取液的重量体积比为1g:20μL。

5.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(2)中的反应的体系为:50mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,5mMMnCl2,1mM DTT,0.5%Triton X-100,0.1mM UDP-Xyl,0.5μM Xyln-AA,4μg/μL微囊体,共90μL;20℃反应30mim~6h;所述的酶失活处理为用5μL终浓度是0.017M的乙酸进行酶失活处理5min。

6.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的离心的条件为3000g离心3min;
步骤(2)中所述的过滤通过0.22μm滤膜过滤;
步骤(3)中所述的标准品为含有Xyl1-AA~Xyl6-AA,其终浓度均为0.1mM。

7.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(3)和(4)中所述的高效液相色谱的色谱,其中,高效液相色谱的色谱柱为2.1mm×250mm,1.8μm的ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,流动相:A相为50mM pH4.3的乙酸钠水溶液,B相为色谱纯乙腈;分析条件:流速为0.5mL/min,柱温为20℃,检测器:Agilent1100HPLC systems,Ex320nm,Em420nm,进样量为5μL,记录太阳城集团为42min,洗脱方式为梯度洗脱。

8.  根据权利要求7所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
所述的梯度洗脱为:0,5min,25min,30min,35min,42min;相应的B相的体积变化为:0%,8%,20%,40%,100%,0%。

9.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(4)中所述的进行酶失活处理的条件为100℃处理3min;
步骤(4)中所述的离心的条件为12000g离心5min;
步骤(4)中所述的酶解的反应体系为50mM pH6.0的乙酸钠水溶液和9U木聚糖内切酶或0.01U木聚糖外切酶,30μL,10μL上清液,共40μL;37℃反应6h;反应产物用5μL0.1M乙酸钠水溶液处理后过0.22μm滤膜,得到酶解产物。

10.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
步骤(5)中所述的纯化的步骤为:按体积百分比:Sep-Pak C18固相萃取小柱用含0.1%甲酸的60%乙腈洗过后,用10mL1%甲酸活化小柱,100μL加成产物和等量的水混合上柱,最后用2mL含0.1%甲酸的60%乙腈洗脱低聚木糖,得到纯化的加成产物;纯化的加成产物用氮气吹干后溶解于20μL水,取1μL和等量的MALDI基质混合,在样品板上干燥,进行MALDI-TOF-MS分析;
所述的MALDI基质为0.2M2,5-二羟基苯甲酸,0.06M1-羟基异喹啉,体积比50%乙腈。

说明书

说明书利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域,特别涉及一种利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶(Xylosyltransferase,XylT)活性的方法。
背景技术
纤维素、半纤维素和木素是农林生物质资源的主要组份,了解它们在植物体内的合成过程有利于更好地利用这些生物质资源。木聚糖为单子叶和双子叶植物次生壁的主要半纤维素,主链为β-1,4-糖苷键连接的D-吡喃式木聚糖,XylT为催化尿苷二磷酸木糖(UDP-Xylose,UDP-Xyl)加成到木聚糖主链上的关键酶,定位于内膜,可促进木聚糖主链的延长。
涉及木聚糖主链延长的木糖转移酶(XylT)基因的研究较晚,2007年才有第一篇文章,且主要是通过核磁共振(NMR)及分子量分析(SEC)。虽然有报道可以通过同位素分析测定XylT的加成反应,但方法繁琐,需要较严格的实验条件,不易操作。
目前已报道的涉及XylT活性的基因主要有IRX9,IRX10,IRX14等,它们可能通过复合体的方式行使功能。建立一套有效的测定方法,不但可以促进XylT复合体的形成及木聚糖合成机理的研究,还可以为体外合成低聚木糖等生物材料提供方便。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法。该方法具有稳定性和精密度高,重现性好等优点,能客观真实地反映XylT加成反应产物的组分。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,包括以下步骤:
(1)制备微囊体;
(2)以尿苷二磷酸木糖(UDP-Xyl)和含荧光基团的低聚木糖(Xyln-AA)为底物,利用步骤(1)中制备的微囊体的蛋白活性进行加成反应,反应产物进 行酶失活处理,离心后,取上清,过滤,收集滤液,即为加成产物;
(3)取步骤(2)得到的加成产物和标准品分别进行高效液相色谱(HPLC)检测,通过对照各寡聚产物与标准品的保留太阳城集团获得加成产物构成谱;
(4)对步骤(2)得到的加成产物进行酶失活处理,然后离心,弃沉淀,取上清液,进行酶解,酶解产物进行高效液相色谱(HPLC)分析,可验证加成产物糖苷键的结构;
(5)对步骤(2)得到加成产物,进行纯化,然后进行MALDI-TOF-MS分析,通过比对分子量得知加成产物为不同聚合度的木糖。
步骤(2)中所述的含荧光基团的低聚木糖(Xyln-AA)优选通过如下步骤制备:
①配制衍生反应试剂:30mg/mL荧光基团2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)和20mg/mL氰基硼氢化钠(NaBH3CN)溶解在MABS中,得到衍生反应试剂;其中,甲醇醋酸硼酸溶液(Methanol Acetate Borate Solution,MABS)为:24mg/mL醋酸钠和20mg/mL硼酸溶解在甲醇溶液中,MABS要现配现用;
②标记反应:将低聚木糖(Xyln)与步骤①中得到的衍生反应试剂按照质量体积比1mg:1mL混合,在80℃反应80min,过量的衍生试剂通过加入乙醚混合后萃取三次去除上层溶液,底层为荧光基团2-氨基苯甲酸(AA)标记的低聚木糖,再通过Sep-Pak C18萃取萃取小柱纯化,得到将低聚木糖(Xyln)的还原末端标记荧光基团2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)成含荧光基团的特异性好且稳定的低聚木糖(Xyln-AA),可以通过高效液相色谱(HPLC)中紫外检测。
所述的纯化优选通过如下步骤进行:Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)用60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗过后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL反应产物和等量的水混合上柱,再用10mL1%(v/v)甲酸洗柱,最后用2mL60%乙腈(v/v)(含0.1%甲酸,v/v)洗脱低聚木糖,得到纯化的产物;纯化的产物用氮气吹干后,溶解于20~100μL水备用。
所述的微囊体优选通过如下步骤制备:将植物茎部去皮,加入提取液,4℃匀浆,过滤,收集滤液,将滤液离心,取上清液进行离心,得到的沉淀为细胞的膜结构,加入含有蛋白酶抑制剂的提取液悬浮沉淀,得到微囊体;利用BCA法测定得到的微囊体的蛋白浓度;-80℃保存;
所述的将植物茎部去皮,加入提取液,植物与提取液的质量体积比(g/mL) 优选为(2~5):1;更优选为2:1;
所述的提取液的组成成分优选为100mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,1mMDTT,1mM EDTA,0.1mM MnCl2,0.4M蔗糖;
所述的植物优选为黄梁木(Neolamarckia cadamba(Rubiaceae))或芦笋(Asparagus officinalis L.),但不限于这些植物;
所述的过滤优选通过滤布进行过滤;
所述的将滤液离心的条件优选为10000g,4℃离心10min;
所述的取上清液进行离心的条件优选为100000g,4℃离心1h;
所述的含有蛋白酶抑制剂的提取液优选为蛋白酶抑制剂的终浓度是1×cocktail的提取液;
所述的加入含有蛋白酶抑制剂的提取液悬浮沉淀,植物与含有蛋白酶抑制剂的提取液的重量体积比优选为1g:20μL;
步骤(2)中的反应的体系为:90μL(50mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,5mM MnCl2,1mM DTT,0.5%Triton X-100,0.1mM UDP-Xyl,0.5μM Xyln-AA,4μg/μL微囊体),20℃反应30mim~6h;所述的酶失活处理优选为用5μL终浓度是0.017M的乙酸进行酶失活处理5min;
步骤(2)中所述的离心的条件优选为3000g离心3min;
步骤(2)中所述的过滤优选通过0.22μm滤膜过滤;
步骤(3)中所述的标准品为含有Xyl1-AA~Xyl6-AA,其终浓度均为0.1mM;
步骤(3)和(4)中所述的高效液相色谱的色谱,其中,高效液相色谱的色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1mm×250mm,1.8μm),流动相:A相为50mM乙酸钠水溶液(pH4.3),B相为色谱纯乙腈;分析条件:流速为0.5mL/min,柱温为20℃,检测器:Agilent1100HPLC systems,Ex320nm,Em420nm,进样量为5μL,记录太阳城集团为42min,洗脱方式为梯度洗脱;
所述的梯度洗脱为:0,5min,25min,30min,35min,42min;相应的B相的体积变化为:0%,8%,20%,40%,100%,0%;
步骤(4)中所述的进行酶失活处理的条件优选为100℃处理3min;
步骤(4)中所述的离心的条件优选为12000g离心5min;
步骤(4)中所述的酶解的反应体系优选为30μL(50mM pH6.0的乙酸钠水溶液,9U木聚糖内切酶或0.01U木聚糖外切酶),10μL上清液,共40μL;37℃反应6h;反应产物用5μL0.1M乙酸钠水溶液处理后过0.22μm滤膜,得到酶解产物;其中,木聚糖内切酶(endo-β-xylanase)具有内切β-1,4-糖苷键的功能, 木聚糖外切酶(exo-β-xylosidase)具有外切β-1,4-糖苷键的功能的;
步骤(5)中所述的纯化的步骤优选为:Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)用60%乙腈(v/v)(含0.1%甲酸,v/v)洗过后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL加成产物和等量的水混合上柱,最后用2mL60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗脱低聚木糖,得到纯化的加成产物;纯化的加成产物用氮气吹干后溶解于20μL水,取1μL和等量的MALDI基质(0.2M2,5-二羟基苯甲酸,0.06M1-羟基异喹啉,50%(v/v)乙腈)混合,在样品板上干燥,进行MALDI-TOF-MS分析。
本发明的机理是:半纤维素是自然界仅次于纤维素的植物多糖,而禾本科单子叶和双子叶植物半纤维素主要是木聚糖。木聚糖的主链合成主要有β-1,4-木糖转移酶(或者可以定义为木聚糖合酶)完成。我们首先通过在低聚木糖的还原末端标记荧光基团,再通过提取微囊体,利用微囊体中的β-1,4-木糖转移酶活性催化低聚木糖的加成反应,最后经过高效液相色谱检测产物的组成谱,根据产物的组成谱与标准样品谱的比对推测反应产物,以反应产物体现木聚糖合酶活性。
本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:
(1)将荧光基团2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)连接到低聚木糖(Xyln)上,以得到含荧光集团的Xyln-AA作为木糖加成反应的底物,通过荧光检测器(Ex320nm,Em420nm)可区分加成反应产物的组分,以此来反映XylT活性。为阐明木聚糖合成的机理,建立了一种准确快速的测定方法。
(2)XylT是木聚糖合成时的关键酶,建立测定XylT活性的方法对于研究木聚糖合成的机理有很大意义,利用多重转基因与生物化学等分析,可以帮助我们分析涉及XylT活性的关键基因,这有利于我们进一步了解半纤维素木聚糖的合成,也为将来体外合成低聚木糖打下基础;
(3)本发明采用的高效液相色谱(HPLC)法,操作简单,能够准确快速方便的检测到木聚糖的加成反应;提供了一整套从提取微囊体到检测提取到的微囊体中XylT活性的方法,具有准确性、灵敏度高及重现性好等特点。
(4)本发明通过提取植物微囊体,利用微囊体中存在的木糖转移酶XylT,进行Xyln-AA与UDP-Xyl的加成反应,然后利用HPLC进行加成产物的检测,探讨XylT在植物中的活性。本发明为深入研究木聚糖合成机理和调节半纤维素中木聚糖成分提供了一种可靠的途径,可根据我们实验的需要,通过筛选木聚糖合成缺陷型植株,研究调节木聚糖形成的基因,或通过调节影响XylT合成的 关键基因,如IRX9,IRX10,IRX14等,来满足对植物中半纤维素不同含量的需求。目前国内还没有同类技术的报道,国外最近才有极少数类似报道但只应用于模式植物拟南芥,本发明经验证可应用于木本植物和草本植物,并且实验中的主要技术与之不同。
附图说明
图1为标准样品经HPLC检测图。
图2为黄梁木上、中、下三个部位微囊体XylT加成产物经HPLC检测图。
图3为黄梁木下部微囊体不同反应太阳城集团XylT加成产物经HPLC检测图。
图4为黄梁木下部微囊体不同受体XylT加成产物经HPLC检测图。
图5为黄梁木微囊体加成反应产物酶解产物经HPLC检测图。
图6为黄梁木微囊体加成反应产物的MALDI-TOF-MS检测图。
图7为芦笋微囊体不同反应太阳城集团XylT加成产物经HPLC检测图。
图8为芦笋微囊体不同受体XylT加成产物经HPLC检测图。
图9为芦笋微囊体加成反应产物酶解产物经HPLC检测图。
图10为芦笋微囊体加成反应产物的MALDI-TOF-MS检测图。
图11为木聚糖/低聚木糖逐级加成反应示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
所述技术领域的普通实验人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围,均可实现本发明的目的。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。
实施例1含荧光基团的低聚木糖(Xyln-AA)的标记
①配制衍生反应试剂:30mg/mL荧光基团2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)和20mg/mL氰基硼氢化钠(NaBH3CN)溶解在MABS中,得到衍生反
应试剂;其中,MABS(甲醇Methanol,醋酸Acetate,硼酸Borate混合溶液)
为:24mg/mL醋酸钠和20mg/mL硼酸溶解在甲醇溶液中,MABS要现配现用;
②标记反应:将低聚木糖(Xyln,n为1~6)(购自美国佐治亚大学碳水化合物研究中心,http://www.ccrc.uga.edu/services/index.php)与步骤①中得到的衍 生反应试剂按照质量体积比1mg:1mL混合,在80℃反应80min,过量的衍生试剂通过加入乙醚(diethyl ether,分析纯)混合后萃取三次去除上层溶液,底层为AA标记的低聚木糖,再通过Sep-Pak C18萃取萃取小柱纯化,得到将低聚木糖(Xyln,n为1~6)的还原末端标记荧光基团2-氨基苯甲酸(Anthranilic Acid,AA)成含荧光基团的特异性好且稳定的低聚木糖(Xyln-AA,n为1~6),可以通过高效液相色谱(HPLC)中紫外检测。
所述的纯化通过如下步骤进行:Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)用60%乙腈(v/v)(含0.1%甲酸,v/v)洗过后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL反应产物和等量的水混合上柱,再用10mL1%(v/v)甲酸洗柱,最后用2mL60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗脱低聚木糖,得到纯化的产物;纯化的产物用氮气吹干去除有机物后,溶解于20~100μL水备用。
实施例2建立HPLC检测Xyln-AA的方法
(1)配制Xyl1-AA~Xyl6-AA的单个标准样品和混合标准样品,每个组分终浓度皆为0.1mM。
(2)用HPLC测定每个标准样品和混合标准样品的出峰太阳城集团。色谱条件为:色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1mm×250mm,1.8μm)(Agilent,购自安捷伦科技有限公司),流动相:A相为50mM乙酸钠水溶液(pH4.3),B相为色谱纯乙腈(Honeywell,霍尼韦尔,99.99%纯,购自上海鼎国生物技术有限公司),流速:0.5mL/min,柱温:20℃,检测器:Agilent1100HPLC systems(购自安捷伦科技有限公司),Ex320nm,Em420nm,进样量5μL,记录太阳城集团:42min。梯度洗脱程序为:0~5min(8%B相),5~25min(20%B相),25~30min(40%B相),30~35min(100%B相),35~42min(0%B相)(按体积百分比),后运行5min。具体见下表1,结果如图1。
表1梯度洗脱程序

实施例3黄梁木XylT活性分析
1、黄梁木微囊体提取
取一年生黄梁木(Neolamarckia cadamba(Rubiaceae)(采于广州市天河公园内)上中下三个部位的去皮茎段,分别于提取液(100mM pH6.8的Hepes-KOHbuffer,1mM DTT,1mM EDTA,0.1mM MnCl2,0.4M蔗糖;其中,100mM pH6.8的Hepes-KOH buffer是将23.831g4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)溶解在去离子水中,定容至1L,用KOH调节100mM Hepes溶液的pH至6.8。)在4℃高速组织捣碎机(型号DS-1,购自上海标本模型厂)中匀浆(植物与提取液的重量体积比为2g:1mL),用滤布(cat.475855,Miracloth,Calbiochem公司)进行过滤,得到的滤液在10000g,4℃下离心10min,收集上清液,将上清液进一步在100000g,4℃下离心1h,得到的沉淀为细胞的膜结构,加入含有蛋白酶抑制剂(终浓度为1×cocktail,Roch公司,Pancreas extract胰浸膏0.015~0.03mg/mL,Pronase链酶蛋白酶0.0015~0.003mg/mL,Thermolysin嗜热菌蛋白酶0.0008mg/mL,Chymotrysin胰凝乳蛋白酶0.0015mg/mL,Trypsin胰蛋白酶0.0002
mg/mL,Papain木瓜蛋白酶1.0mg/mL)的提取液悬浮沉淀(植物与含有蛋白酶抑制剂的提取液的重量体积比为1g:20μL),得到微囊体。利用BCA法测定得到的微囊体蛋白浓度。-80℃保存。
蛋白质定量试剂盒(BCA法),购自Pierce公司;具体操作步骤按照说明书进行。
2、黄梁木微囊体XylT活性的检测
以下加成反应皆在如下体系中进行:90μL(50mM pH6.8的Hepes-KOHbuffer,5mM MnCl2,1mM DTT,0.5%(v/v)Triton X-100,0.1mM UDP-Xyl,0.5μM Xyln-AA,4μg/μL微囊体),反应温度为20℃。反应完成以后产物通过0.22μm滤膜过滤,取5μL在HPLC上检测加成产物,检测方法如实施例2所述。木聚糖/低聚木糖逐级加成反应如图11所示。
加成反应(1):不同部位的微囊体XylT活性检测,配制分别含有上、中、下三个部位微囊体的反应体系,以Xyl5-AA为受体,反应太阳城集团为6h,结果如图2所示。
加成反应(2):下部微囊体以Xyl5-AA为受体,不同加成反应太阳城集团的活性检测,反应太阳城集团分别为0.5h,3h,6h,9h,结果如图3。
加成反应(3):下部微囊体以不同聚合度的低聚木糖(Xyl1-AA,Xyl2-AA, Xyl3-AA,Xyl4-AA,Xyl5-AA,Xyl6-AA)为底物,反应6h的活性检测,结果如图4。
3、加成产物验证
对步骤2中加成反应(2)的6h加成产物进行酶解分析。对步骤2中加成反应(2)的6h得到的加成产物进行100℃酶失活处理3min,然后12000g离心5min,弃沉淀,取上清液,进行酶解。酶解的反应体系为:30μL(50mM pH6.0的乙酸钠水溶液,9U木聚糖内切酶或0.01U木聚糖外切酶),10μL上清液,共40μL;37℃,6h。反应产物用0.1M乙酸钠水溶液(5μL)处理后过0.22μm滤膜,得到酶解产物,HPLC分析酶解产物,结果如图5。
对步骤2中加成反应(2)的6h加成产物进行MALDI-TOF-MS分析。加成产物纯化Sep-Pak C18Plus short cartridge(Sep-Pak C18固相萃取小柱)(Waters公司)用60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗过后,用10mL1%(v/v)甲酸活化小柱,100μL加成产物和等量的水混合上柱,最后用2mL60%(v/v)乙腈(含0.1%甲酸,v/v)洗脱低聚木糖,得到纯化的加成产物。纯化的加成产物用氮气吹干去除有机物后,溶解于20μL水,取1μL和等量的MALDI基质(0.2M2,5-二羟基苯甲酸,0.06M1-羟基异喹啉,50%(v/v)乙腈)混合,在样品板上干燥,进行MALDI-TOF-MS分析,结果如图6。
实施例4芦笋XylT活性分析
芦笋(Asparagus officinalis L.)(芦笋,市售)XylT活性分析过程与黄梁木类似。也分为微囊体的提取,XylT活性检测,加成产物验证三个步骤。提取的芦笋微囊体以Xyl4-AA为受体,反应太阳城集团分别为0.5h,2h,6h,10h,加成反应结果见图7。提取的芦笋微囊体以不同聚合度的低聚木糖(Xyl1-AA,Xyl2-AA,Xyl3-AA,Xyl4-AA,Xyl5-AA,Xyl6-AA)为受体,反应太阳城集团为1h,加成反应结果见图8。对以Xyl4-AA为受体,反应太阳城集团6h的加成产物进行酶解分析,结果见图9。对以Xyl4-AA为受体,反应太阳城集团6h的加成产物进行MALDI-TOF-MS分析,结果见图10。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

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