太阳城集团

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基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法.pdf

摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201410151512.8

申请日:

2014.04.16

公开号:

CN103983622A

公开日:

2014.08.13

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 21/64申请公布日:20140813|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20140416|||公开
IPC分类号: G01N21/64 主分类号: G01N21/64
申请人: 南昌大学
发明人: 熊勇华; 江湖; 许杨; 郭亮; 许恒毅
地址: 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号
优先权:
专利代理机构: 南昌新天下专利商标代理有限公司 36115 代理人: 施秀瑾
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法律状态
申请(专利)号:

CN201410151512.8

授权太阳城集团号:

||||||

法律状态太阳城集团日:

2017.10.24|||2014.09.10|||2014.08.13

法律状态类型:

太阳城集团发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

摘要

太阳城集团本发明属于分析检测领域,公开了一种基于两种量子点间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法。本发明选择绿色量子点与OTA偶联,红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联,二者混合后,由于抗原抗体特异性结合,两种量子点间距离靠近而发生能量共振转移,导致绿色量子点荧光下降,红色量子点荧光增强。当反应体系含有OTA时,游离的OTA与绿色量子点偶联的OTA共同竞争红色量子点偶联的抗体,OTA的浓度直接影响绿色量子点能量转移效率,且在一定范围内绿色量子点能量转移效率与OTA浓度对数成反比例关系。本发明方法具有检测太阳城集团短,灵敏度和准确性高,操作流程简单和检测成本低等特点。

权利要求书

权利要求书
1.  一种基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法,其特征在于包含以下步骤:(1)分别制备绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物;(2)将绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物混合,并与梯度浓度的OTA标准品溶液在结合缓冲液中共孵育,在波长450 nm的激发光下测定绿色量子点能量转移效率;以OTA标准品溶液浓度对数值为横坐标,绿色量子点能量转移效率为纵坐标,绘制检测OTA的标准曲线;(3)将待测样品提取液、绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物在结合缓冲液中共孵育,测定绿色量子点能量转移效率,与标准曲线比对即得到待测样品提取液中OTA含量。

2.  如权利要求1所述的方法,其特征在于所述绿色量子点和红色量子点满足:绿色量子点最大发射波长介于530 nm至550 nm,表面氨基化修饰的量子点;红色量子点最大发射波长介于590 nm至620 nm,表面羧基化修饰的量子点。

3.  如权利要求1所述的方法,其特征在于所述步骤(1)中绿色量子点与OTA偶联,采用NHS活化法制备OTA与绿色量子点偶联物,葡萄糖酸封闭绿色量子点表面残留的氨基位点;量子点与OTA偶联摩尔比为1:2~1:20,优选为1:10。

4.  如权利要求1所述的方法,其特征在于所述步骤(1)中红色量子点与抗OTA单域抗体偶联,抗OTA单域抗体通过免疫羊驼后分离血清获得,采用EDC,NHSS介导将红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联,氨基葡萄糖封闭红色量子点表面残留的羧基位点,量子点与抗OTA的单域抗体偶联摩尔比为1:1。

5.  如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(2)绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA单域抗体偶联物混合摩尔比为1:1~1:6,优选为1:5。

6.  如权利要求3或4所述方法,使用的EDC和NHSS的物质量分别是量子点的100~500倍和50~100倍;活化太阳城集团是20~40min;偶联时将pH值调至7~8,偶联太阳城集团是20~40min;封闭剂葡萄糖酸或氨基葡萄糖的终浓度是0.1%~2%,封闭太阳城集团是0.5~1小时;封闭后调pH值至弱酸性为pH 4.5至5.5;偶联产物用高速离心方法分离出来,离心条件是4℃~10℃,12000r/min~20000r/min ,20~40min;复溶液为含有20%至30%丙三醇的0至0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。

7.  如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(2)结合缓冲液为含10%甲醇的0.01 M 磷酸盐缓冲液,溶液pH值为7.4,结合温度为37℃,结合太阳城集团20 分钟。

8.  如权利要求1所述方法,其特征在于具体包括如下步骤:
(1)试剂1即绿色量子点与OTA偶联物的制备:
1)OTA的活化:每1mg OTA溶解于0.1mg无水四氢呋喃,加入0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及2mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)于室温下避光剧烈摇动1小时,活化后4000r/min离心15min;取上清,挥发四氢呋喃,残留物溶解于0.2mL二甲基甲酰胺; 2)偶联:每在洁净的小烧杯中加入0.2mL 硼酸盐缓冲液和5μL浓度为10μM的绿色量子点,缓慢加入浓度为10μM的OTA活化物50μL,使OTA与绿色量子点偶联摩尔比为10,室温、避光下偶联1.5h; 3)封闭:加入质量浓度1%的葡萄糖酸100μL封闭45min,缓调pH至5.0; 4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用20%甘油水溶液20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的1000×试剂1母液;
(2)试剂2即红色量子点与OTA单域抗体偶联物的制备:
1)红色量子点活化:每在洁净小烧杯中加入0.2mL 硼酸水溶液,缓慢加入5μL浓度为10μM的红色量子点,将8μL 0.5mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和2μL 0.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHSS)混匀后加入,室温活化20min; 2)偶联:逐滴加入浓度为10μM的OTA单域抗体5μL,使OTA单域抗体与红色量子点偶联摩尔比为1:1,用0.1M NaOH调pH至7.4,室温偶联30min; 3)封闭:加入5%氨基葡萄糖100μL封闭45min,用0.1M 盐酸缓调pH至5.0; 4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用含有20%甘油的磷酸缓冲液(0.01mol PB,pH7.4)20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的200×试剂2母液;
(3)OTA浓度标准曲线的制作:每各取试剂1和试剂2母液1μL,分别用1mL和0.2mL超纯水稀释,得到试剂1和试剂2待用液;10μL试剂1与90μL试剂3(含10%甲醇的1×PBS,pH7.4)混合,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,得到数据记为F;将10μL试剂1、10μL试剂2和用80μL试剂3倍比稀释的OTA溶液(0 ng/mL至5 ng/mL),37℃孵育20min后,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,得到数据记录为FN,分别代表F0,F0.01、F0.06、F0.08、F0.1、F0.3、F0.5、F1和F5,其中下标数值代表OTA溶液浓度(ng/mL);将(F-FN)/ F×100%记录为荧光能量转移效率E(%);以OTA浓度对数值为横坐标,荧光能量转移效率E(%)为纵坐标,绘制出的检测OTA浓度的标准曲线;
(4)OTA的检测:
1)待测样品溶液准备:每取待测样品1g,用5mL 60%甲醇水溶液震荡提取5min,5000 g离心10min,上清液经0.45μm滤器过滤,取100μL体积加入100μL 0.01M,pH7.4的2×PBS和400μL的pH7.4的1×PBS稀释,即得30倍稀释的待测样液;
2)取80μL待测样液与10μL试剂1和10μL试剂2在37℃下孵育20min,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,计算待测物的E(%)值,代入OTA浓度的标准曲线即得到待测样液中OTA含量。

说明书

说明书基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法
技术领域
本发明属于生物物理学分析检测技术领域,涉及一种赭曲霉毒素A检测的方法。
背景技术
赭曲霉毒素A(OTA)是粮食制品易污染的真菌毒素,对人体危害极大。加强对它的检测监控对维护人类健康有着重要意义。目前快速筛查方法多为基于免疫学检测方法对其进行定性定量分析,如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫层析柱测定法和基于不同标记物显色的快速筛查试纸条等等。
1993年比利时科学家首次在Nature报道:在骆驼科动物血液中的抗体,只包含一个重链可变区(variable domain of heavy chain of HCAb, VHH)和两个常规的CH2与CH3区,更重要的是单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性,VHH是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。其相对分子质量为15 000,仅为常规抗体的1/10左右,分子高度4.8 nm,直径2.2 nm,所以VHH也称纳米抗体或单域抗体。
荧光共振能量转移(F?rster resonance energy transfer,简称FRET),是指受激发的能量供体将能量传递给基态受体的一个非辐射能量转移过程,它对能量供受体对之间的距离及相对偶极方向的纳米范围内变化非常敏感,只有在非常近的距离(10 nm)以内,才能够发生有效的能量共振转移,且这种能量转移效率与供受体之间距离的6次方成反比(见公式1)。因此FRET被称为一种高效的“光学分子尺”,近年来,该技术已经在物理、化学及生物学领域得到了广泛的研究与应用。
公式1:E=nR06/(n R06+r6)
公式1中E为能量转移效率;n为每个能量供体分子对应的平均能量受体分子个数;r为能量供受体之间的距离;R0是距离常数。
将单域抗体和抗原分别与能量供受体偶联,抗原抗体间特异性结合会使能量供受体之间靠近并发生能量共振转移。而相对于传统抗体,单域抗体体积小,按照公式1中能量转移效率与能量供受体之间距离6次方成反比,即距离越近检测灵敏度越高,可以大大提高能量转移效率。并且,由于整个反应为均相的免疫学检测反应,免疫学反应效率大大高于目前常规的半固相免疫学反应,既提高了检测灵敏度,又能缩短检测太阳城集团,如果配有高通量荧光检测器,可以同时测定大量样品。
量子点是一种随粒径大小变化可激发出不同波长荧光的纳米晶体,随粒径或最大发射波长的变化,量子点呈现出不同的颜色。如在最大发射波长530 nm至550 nm范围内的量子点呈现绿色,而在最大发射波长590 nm至620 nm范围内的量子点呈现红色。量子点的优点是荧光产率高,光稳定性好,激发光谱广而发射光谱窄,并且量子点表面可以修饰任何所需的化学基团,能方便的标记在生物分子上,是作为FRET能量供受体的良好材料。
发明内容
本发明的创新性在于提出了一种新的快速、灵敏和廉价的免疫学定量检测OTA的方法,即基于红、绿量子点间能量共振转移信号来定量检测痕量的OTA。本发明基于两种量子点之间能量转移的OTA检测方法,包括红色量子点与OTA偶联物(试剂1),绿色量子点与抗OTA单域抗体偶联物(试剂2)和结合缓冲液(试剂3)。其中红、绿量子点的选择前提是二者发射光谱没有重叠,且绿色量子点的发射光谱在红色量子点吸收光谱范围内,具体为:绿色量子点最大发射波长介于530 nm至550 nm,表面氨基化修饰;红色量子点最大发射波长介于590 nm至620 nm,表面羧基化修饰。
抗OTA单域抗体由OTA人工抗原免疫羊驼后由羊驼血液中分离获得。
试剂1和试剂2在激发光下都有特征发射波谱出现,当试剂1和试剂2以一定比例与试剂3混合孵育片刻后,由于抗原抗体结合,两种量子点靠近而产生能量共振转移,绿色量子点的能量转移给红色量子点,使二者能量一升一降,体现在发射光谱上就是绿色量子点特征发射光检测值下降而红色量子点特征发射光检测值提高,且升降幅度可以达到35%以上。在试剂1、试剂2和用试剂3倍比稀释的OTA溶液混合孵育片刻后,由于游离的OTA与试剂1共同竞争试剂2,导致部分试剂1与试剂2不能结合而使绿色量子点能量回升,能量转移效率下降。也就是说,OTA的浓度直接影响绿色量子点能量转移效率,且在一定范围二者成线性的反比例关系。以游离的OTA浓度对数值为横坐标,绿色量子点能量转移效率为纵坐标,绘制出的检测OTA浓度的标准曲线。检测食品样品中OTA含量时,试剂1、试剂2和待测食品样品中OTA提取溶液(以下简称待测样液)混合孵育片刻后,测定荧光强度,代入公式1(参见实施例1),按照计算出的能量转移效率,可以根据标准曲线计算出对应的OTA含量。
本发明所述的一种基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法,技术方案包含下列步骤:
一种基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法,包含以下步骤:(1)分别制备绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物;(2)将绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物混合,并与梯度浓度的OTA标准品溶液在结合缓冲液中共孵育,在波长450 nm的激发光下测定绿色量子点能量转移效率;以OTA标准品溶液浓度对数值为横坐标,绿色量子点能量转移效率为纵坐标,绘制检测OTA的标准曲线;(3)将待测样品提取液、绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物在结合缓冲液中共孵育,测定绿色量子点能量转移效率,与标准曲线比对即得到待测样品提取液中OTA含量。
所述绿色量子点和红色量子点满足:二者发射光谱要分的足够开,即二者的发射峰形不能有交叠,具体为:绿色量子点最大发射波长介于530 nm至550 nm,表面氨基化修饰;红色量子点最大发射波长介于590 nm至620 nm,表面羧基化修饰。
所述步骤(1)中绿色量子点与OTA偶联,采用NHS、DCC法活化OTA,再与绿色量子点偶联,葡萄糖酸封闭绿色量子点表面残留的氨基位点;量子点与OTA偶联摩尔比为1:2~1:20,优选为1:10。
所述步骤(1)中红色量子点与抗OTA单域抗体偶联,采用EDC,NHSS介导将红色量子点与抗OTA单域抗体偶联,氨基葡萄糖封闭红色量子点表面残留的羧基位点;量子点与抗OTA单域抗体偶联摩尔比为1:1。
步骤(2)绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA单域抗体偶联物混合摩尔比为1:1~1:6,优选为1:5。
使用的EDC和NHSS的物质量分别是量子点的100~500倍和50~100倍;活化太阳城集团是20~40min;偶联时将pH值调至7~8,偶联太阳城集团是20~40min;封闭剂葡萄糖酸或氨基葡萄糖的终浓度是0.1%~2%,封闭太阳城集团是0.5~1小时;封闭后调pH值至弱酸性为pH 4.5至5.5;偶联产物用高速离心方法分离出来,离心条件是4℃~10℃,16000r/min~20000r/min ,20~40min;复溶液为含有20%至30%丙三醇的0.05mol/L碳酸氢钠溶液或0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。
结合缓冲液为含10%甲醇的0.01 M 磷酸盐缓冲液,溶液pH值为7.4,结合温度为37℃,结合太阳城集团20 分钟。
基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法,具体包括如下步骤:
(1)试剂1的制备:试剂1即绿色量子点与OTA偶联物。采用NHS法制备OTA与绿色量子点偶联物,首先,OTA与NHS在DCC的辅助下脱水形成共价连接,DCC吸水形成相应的不溶物通过离心而除去;然后,加入表面氨基修饰的绿色量子点,量子点表面氨基取代NHS与OTA偶联;之后,用葡萄糖酸封闭量子点表面残留的氨基,调pH值至弱酸性后离心纯化,沉淀部分加入复溶液复溶。
(2)试剂2的制备:试剂2即红色量子点与抗OTA单域抗体偶联物。将表面羧基修饰的红色量子点用水溶性碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠(NHSS)活化,与抗OTA单域抗体偶联,之后用氨基葡萄糖封闭,调pH值至弱酸性,离心纯化,加入复溶液复溶。
(3)OTA浓度标准曲线的制作:试剂1单独与试剂3(即结合溶液,含10%甲醇的0.01M磷酸盐缓冲液,pH7.4)混合,在激发光下测定绿色量子点特征发射荧光强度,得到数据记为F。将试剂1、试剂2和用试剂3倍比稀释的OTA溶液共同混合孵育后,在激发光下测定绿色量子点特征发射荧光强度,得到数据记为FN,其中N代表OTA溶液的浓度。将(F-FN)/ F×100%记录为荧光能量转移效率E(%)。以OTA浓度对数为横坐标,绿色量子点能量转移效率E(%)为纵坐标,绘制出检测OTA浓度的标准曲线。
(4)OTA的检测:疑似含有OTA的待测样液与试剂1和试剂2在37℃下孵育20min,在激发光下测定绿色量子点特征发射荧光强度,得到数据带入公式中FN位置,计算得到E值,根据标准曲线计算得到待测样液中OTA含量。
更具体的,包括如下步骤:
1)试剂1即绿色量子点与OTA偶联物的制备:
1.1)OTA的活化:每1mg OTA溶解于0.1mg无水四氢呋喃,加入0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及2mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)于室温下避光剧烈摇动1小时,活化后4000r/min离心15min。取上清,挥发四氢呋喃,残留物溶解于0.2mL二甲基甲酰胺;
1.2)偶联:每在洁净的小烧杯中加入0.2mL 硼酸盐缓冲液和5μL浓度为10μM的绿色量子点,缓慢加入浓度为10μM的OTA活化物50μL,使OTA与绿色量子点偶联摩尔比为10,室温、避光下偶联1.5h;
1.3)封闭:加入1%葡萄糖酸100μL封闭45min,缓调pH至5.0;
1.4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用20%甘油水溶液 20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的1,000×试剂1母液;
2)试剂2即红色量子点偶联OTA单域抗体的制备:
2.1)红色量子点活化:每在洁净小烧杯中加入0.2mL 硼酸水溶液,缓慢加入5μL浓度为10μM的红色量子点,将8μL 0.5mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和2μL 0.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHSS)混匀后加入,室温活化20min;
2.2)偶联:逐滴加入浓度为10μM的OTA单域抗体5μL,使OTA单域抗体与红色量子点偶联摩尔比为3:1,用0.1M NaOH调pH至7.4,室温偶联30min;
2.3)封闭:加入5%氨基葡萄糖100μL封闭45min,用0.1M 盐酸缓调pH至5.0;
2.4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用含有20%甘油的磷酸缓冲液(0.01mol PB,pH7.4)20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的200×试剂2母液;
3)OTA浓度标准曲线的制作:每各取试剂1和试剂2母液1μL,分别用1mL和0.2mL超纯水稀释,得到试剂1和试剂2待用液;10μL试剂1与90μL试剂3(含10%甲醇的1×PBS,pH7.4)混合,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度(F2700型分光光度计,日立),得到数据记为F;将10μL试剂1、10μL试剂2和用80μL试剂3倍比稀释的OTA溶液(0ng/mL至20ng/mL),37℃孵育20min后,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,得到数据记录为FN,分别代表F0,F0.01、F0.06、F0.08、F0.1、F0.3、F0.5、F1和F5,其中下标数值代表OTA溶液浓度(ng/mL);将(F-FN)/ F×100%记录为荧光能量转移效率E(%);以OTA浓度对数值为横坐标,荧光能量转移效率E(%)为纵坐标,绘制出的检测OTA浓度的标准曲线;
4)OTA的检测:
4.1)待测样品溶液准备:每取待测样品1g,用5mL 60%甲醇水溶液震荡提取5min,5000 g离心10min,上清液经0.45μm滤器过滤,取100μL体积加入100μL 0.01M,pH7.4的2×PBS和400μL的pH7.4的1×PBS稀释,即得30倍稀释的待测样液;
4.2)取80μL待测样液与10μL试剂1和10μL试剂2在37℃下孵育20min,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,计算待测物的E(%)值,代入OTA浓度的标准曲线即得到待测样液中OTA含量。
本发明技术方案具有如下优点:
(1)本发明技术方案灵敏度高,由于巧妙的运用了两种量子点作为OTA和其单域抗体的标记物,利用抗原抗体反应的特异性确保了检测的准确性。而量子点间的荧光能量共振转移这一“分子尺”直接用于测定OTA的浓度信号,单域抗体的小尺寸大大缩小了红绿量子点之间的距离,提高能量转移效率。由于整个反应为均相的免疫学检测反应,免疫学反应效率大大高于目前常规的半固相免疫学反应,提高了检测灵敏度,且免去了常规ELISA反复洗板的繁琐过程。
(2)本发明技术方案操作方法简单,检测太阳城集团短。由于量子点具有优良的光化学稳定性,测试者在一台荧光分光光度计做好OTA的标准曲线后,每次检测只需要将3种试剂与待测样液混合20min,读取1个荧光数据,带入公式即可得到准确的OTA浓度,整个检测过程可在30min内完成。如果配有高通量荧光检测器,此方法可以同时测定大量样品。
(3)本发明技术方案样品和试剂用量少,检测成本低。1微摩尔偶联OTA的绿色量子点和5微摩尔偶联OTA单域抗体的红色量子点可以检测5万份OTA疑似污染的样品。
附图说明
图1为本发明基于绿色量子点和红色量子点间能量共振转移建立的OTA检测方法的荧光扫描图。图中实线是10μL试剂1——偶联OTA的绿色量子点(最大发射波长530nm)和10μL试剂2——偶联单域抗体的红色量子点(最大发射波长620nm)分别在90μL磷酸盐缓冲液中的荧光发射扫描图谱,即红、绿量子点原有的能量发射图谱;虚线圆点是10μL试剂1和10μL试剂2在磷酸盐缓冲液中37℃孵育20min后的荧光发射扫描图谱,此时因抗原抗体结合使两种量子点靠近而发生能量共振转移,导致绿色量子点能量下降而红色量子点能量升高;虚线短线是10μL试剂1和10μL试剂2与80μL浓度为3 ng/mL OTA的试剂3(含10%甲醇的磷酸盐缓冲液)37℃孵育20min后的荧光发射扫描图谱,由于游离的OTA介入,能量转移强度下降。上述激发波长均为450nm;
图2为实施例1中制作的OTA浓度的标准曲线。
具体实施方式
实施例1 
基于最大发射波长为530 nm的绿色量子点和最大发射波长为620 nm红色量子点间能量共振转移建立的OTA检测方法,包括以下主要步骤。
(1)绿色量子点与OTA偶联物(试剂1)的制备:绿色量子点(货号QSA a -530-20,表面氨基化修饰,Oceannano公司,美国),OTA(Sigma公司,美国);
1)OTA的活化:每1mg OTA溶解于0.1mg无水四氢呋喃,加入0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及2mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)于室温下避光剧烈摇动1小时,之后4000r/min离心15min。取上清,挥发四氢呋喃,残留物溶解于0.2mL二甲基甲酰胺;
2)偶联:每在洁净的小烧杯中加入0.2mL 硼酸盐缓冲液和5μL浓度为10μM的绿色量子点,缓慢加入浓度为10μM的OTA活化物50μL,使OTA与绿色量子点偶联摩尔比为10,室温、避光下偶联1.5h。偶联全过程用磁力搅拌器匀速缓慢搅拌;
3)封闭:加入1%葡萄糖酸100μL封闭45min,缓调pH至5.0;
4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用20%甘油水溶液 20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的1,000×试剂1母液。
(2)红色量子点与OTA单域抗体偶联物(试剂2)的制备:量子点(货号QSHb-620-20,表面羧基化修饰,Oceannano公司,美国),OTA单域抗体(通过免疫羊驼、分离血清获得);
1)量子点活化:每在洁净小烧杯中加入0.2mL 硼酸水溶液,缓慢加入5μL浓度为10μM的量子点,将8μL 0.5mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和2μL 0.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHSS)混匀后加入,室温活化20min;
2)偶联:逐滴加入浓度为10μM的OTA单域抗体5μL,使OTA单域抗体与量子点偶联摩尔比为1:1,用0.1M NaOH调pH至7.4,室温偶联30min;
3)封闭:加入5%氨基葡萄糖100μL封闭45min,用0.1M 盐酸缓调pH至5.0;
4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用含有20%甘油的磷酸缓冲液(0.01mol PB,pH7.4)20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的200×试剂2母液。
(3)绿色量子点偶联OTA、红色量子点偶联单域抗体后两种量子点之间相互作用的考察:使用荧光扫描(附图1)考察了两种量子点偶联抗原抗体后具体的行为关系。
(4)OTA浓度标准曲线的制作:每各取试剂1和试剂2母液1μL,分别用1mL和0.2mL超纯水稀释,得到试剂1和试剂2待用液;10μL试剂1与90μL试剂3(含10%甲醇的1×PBS,pH7.4)混合,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度(F2700型分光光度计,日立),得到数据记为F;将10μL试剂1、10μL试剂2和用80μL试剂3倍比稀释的OTA溶液(0ng/mL至5ng/mL),37℃孵育20min后,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,得到数据记录为FN,分别代表F0,F0.01、F0.06、F0.08、F0.1、F0.3、F0.5、F1和F5,其中下标数值代表OTA溶液浓度(ng/mL);将(F-FN)/ F×100%记录为荧光能量转移效率E(%);以OTA浓度对数值为横坐标,荧光能量转移效率E(%)为纵坐标,绘制出的检测OTA浓度的标准曲线。得到的标准曲线方程为:OTA含量 (ng/mL) =e (E—16.54)/ 5.54。
(5)OTA的检测:
1)待测样品溶液准备:每取待测样品1g,用5mL 60%甲醇水溶液震荡提取5min,5000 g离心10min,上清液经0.45μm滤器过滤,取100μL体积加入100μL 0.01M,pH7.4的2×PBS和400μL的pH7.4的1×PBS稀释,即得30倍稀释的待测样液;
2)取80μL待测样液与10μL试剂1和10μL试剂2在37℃下孵育20min,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,计算待测物的E(%)值,代入OTA浓度的标准曲线方程即得到待测样液中OTA含量,再乘以稀释倍数30即得到对应样品中OTA含量(μg/kg)。
实施例2
基于最大发射波长为535 nm的绿色量子点和最大发射波长为620 nm的红色量子点间能量共振转移建立的OTA检测方法,使用高通量检测设备(全波长扫描式多功能读数仪,热电公司,美国)和96孔黑色荧光板(3603型,康宁,美国)。
(1)绿色量子点与OTA偶联物(试剂1)的制备:使用最大发射波长为535 nm的绿色量子点(QSA a-535-20,表面氨基化修饰,Oceannano公司,美国),基本操作步骤同于实施例1。
(2)红色量子点与OTA单域抗体偶联物(试剂2)的制备:基本操作步骤同于实施例1。
(3)OTA浓度标准曲线的制作:分别取1μL试剂1母液和5μL试剂2母液,各用1mL超纯水稀释,得到试剂1和试剂2。10μL试剂1与90μL试剂3(即结合溶液,含10%甲醇的1×PBS,pH7.4)混合,加入96孔黑色荧光板孔a1;再将10μL试剂1、10μL试剂2和80μL试剂3稀释的OTA溶液(浓度分别为0.06ng/mL,0.08 ng/mL,0.1 ng/mL,0.3 ng/mL,0.5 ng/mL,1 ng/mL和5 ng/mL)于37℃孵育20min后,加入96孔黑色荧光板孔a2至a8。在激发光450nm下测定535nm处荧光强度,孔a1数据记为F。孔a2至a8得到数据分别记为F0.06、F0.08、F0.1、F0.3、F0.5、F1和F5,代入公式1(见实施例1)中FN的位置,计算E(%)值。以游离的OTA浓度对数为横坐标, E(%)为纵坐标,绘制检测OTA浓度的标准曲线。
(4)OTA的检测:24份可疑含有OTA的花生样品和24份玉米样品分别粉碎,各称取1g待测。每份样品用5mL 60%甲醇水溶液震荡提取15min,9000 g离心10min,上清液经0.45μm滤器过滤,取100μL体积加入100μL的2×PBS (0.01M,pH7.4)和400μL的1×PBS (pH7.4)稀释,即得30倍稀释的待测样液。每份待测样液分别取80μL与10μL试剂1和10μL试剂2在37℃下孵育20min,加入黑色荧光板相应各孔,在激发光450nm下测定540nm处荧光强度,得到每个样品的数据分别带入公式(1)(见实施例1)中FN位置,计算得到E值,根据标准曲线计算即得到待测样液中OTA含量,再乘以稀释倍数30即得到对应样品中OTA含量(μg/kg)。
实施例3
基于最大发射波长为540 nm的绿色量子点和最大发射波长为610 nm的红色量子点间能量共振转移建立的OTA检测方法。
(1)绿色量子点与OTA偶联物(试剂1)的制备:使用最大发射波长为540nm的绿色量子点(QSAa-540-20,表面氨基化修饰,Oceannano公司,美国),基本操作步骤同于实施例1。
(2)红色量子点与OTA单域抗体偶联物(试剂2)的制备:使用最大发射波长为610 nm的红色量子点(QSHb-610-20,表面羧基化修饰,Oceannano公司,美国),基本操作步骤同于实施例1。
(3)OTA浓度标准曲线的制作:基本操作步骤同于实施例1。
(4)OTA的检测:可疑含有OTA的待测样液(制备方法同实施例2)80μL与10μL试剂1和10μL试剂2在37℃下孵育20min,在激发光450nm下测定520nm荧光强度,得到数据带入公式(1)(见实施例1)中FN位置,计算得到E值,根据标准曲线公式即得到待测样液中OTA含量。

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