太阳城集团

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用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法.pdf

摘要
申请专利号:

太阳城集团CN201410146130.6

申请日:

2014.04.11

公开号:

CN103954760A

公开日:

2014.07.30

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/577申请公布日:20140730|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20140411|||公开
IPC分类号: G01N33/577; G01N33/569 主分类号: G01N33/577
申请人: 中国兽医药品监察所; 广东永顺生物制药股份有限公司
发明人: 宁宜宝; 王海光; 林旭埜; 冯忠泽; 张毓金; 吴文福; 赖月辉; 陈坚; 王芳; 陈瑞爱; 孙进忠; 漆世华
地址: 100081 北京市海淀区中关村南大街8号
优先权:
专利代理机构: 北京君智知识产权代理事务所 11305 代理人: 郑明
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法律状态
申请(专利)号:

太阳城集团CN201410146130.6

授权太阳城集团号:

||||||

法律状态太阳城集团日:

2016.09.14|||2014.08.27|||2014.07.30

法律状态类型:

太阳城集团发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明涉及一种细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力检验方法。本发明主要涉及一种用将猪瘟疫苗稀释后接种适宜的敏感传代细胞,然后使用抗原捕获ELISA检测不同稀释度疫苗中活病毒在感染细胞后增殖的子代病毒,计算疫苗病毒的最高细胞感染剂量,建立了猪瘟疫苗病毒的细胞感染量(CID)的效力检验方法;比对效力检验,用本发明提供CID法和现行质量标准兔体感染量检测结果分别为:12批猪睾丸细胞系源猪瘟活疫苗每头份均含4×105CID和2.6~3.0×104RID之间,3批牛睾丸原代细胞源猪瘟活疫苗每头份均低于4×104CID和7.0~8.0×103RID;试验证明:本实验室建立的ELISA检测CID的结果与现行质量标准兔体感染量检测结果存在良好的相关性,能够较好反映疫苗中活病毒的含量,有望成为RID的替代方法。

权利要求书

权利要求书
1.  一种用检测猪瘟疫苗中所含病毒细胞感染量来评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于:该方法是将猪瘟疫苗中猪瘟兔化弱毒稀释后接种适宜的细胞系,通过细胞增殖一定太阳城集团后用于疫苗中病毒细胞感染剂量的测定,该方法检测到的是活的具有感染性的猪瘟兔化弱毒,其检测结果与疫苗免疫原性直接相关。

2.  如权利要求1所述的一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于:是用猪瘟疫苗病毒感染细胞后12天收获的细胞上清或细胞裂解液用于猪瘟疫苗中病毒细胞感染剂量的测定。

3.  如权利要求1所述的一种细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力检验的方法,其特征在于该检验方法是用猪瘟抗原捕捉ELISA检测感染细胞中猪瘟病毒抗原,评价疫苗活病毒的细胞感染量,该方法特异性强,可排除死亡病毒和消除非特异性。

4.  如权利要求1所述的一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于该检验方法是猪瘟兔化弱毒细胞感染量测定用传代细胞包括猪睾丸细胞、猪肾细胞等,该类细胞适合猪瘟病毒增殖。

说明书

说明书用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法
技术领域
本专利涉及一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法。属于兽用生物制品领域。 
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种猪的烈性传染性疾病,感染后的临床症状受不同因素的影响而变化多样,从急性死亡到隐性感染均可能出现,是危害我国养猪业的一种重要动物疫病,目前主要以点状散发流行为主,流行范围极广,全国各个养猪地区几乎均有发生。我国对于猪瘟的防控措施主要以猪瘟活疫苗大规模免疫为主,这是猪瘟大规模爆发得以控制的主要原因。 
我国猪瘟兔化弱毒株制备的猪瘟活疫苗是国际上公认的最安全、有效的猪瘟疫苗之一,应用十分广泛,在对猪瘟的防控中起到了重要的作用,其具有对不同日龄猪均安全、诱导免疫反应快和可以保护猪只抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击等优点。猪瘟兔化弱毒疫苗在理论上能够产生极佳的免疫效果,但是为了能够在临床使用时发挥疫苗的最大作用,就必须实现对商品化疫苗质量的有效控制。疫苗质量控制的一个重要方面就是要保证所生产疫苗具有符合标准的活病毒效价,能够确实激活被免疫动物的免疫系统。疫苗效力的定义为疫苗接种动物获得保护自身抵抗感染的能力,或在接种疫苗动物体内诱导产生的抗体转移到后代使新生动物获得保护的能力。对于弱毒疫苗而言,对宿主的免疫效力是通过病毒感染宿主细胞激活免疫系统而实现的,在一定范围内,感染宿主的疫苗毒越多,对宿主免疫系统的激活就越强。因此,猪瘟兔化弱毒疫苗的效价是可以通过确定疫苗中有感染性病毒的数量(浓度)来衡量的。 
在我国猪瘟兔化弱毒疫苗效价的判定目前采用的是以兔体定型热法和猪免疫攻毒为基础的动物试验的方法,其中以兔体定型热法的应用最为广泛。但是该方法存在很多弊端,如:检测结果易受兔体个体差异和环境因素影响、费时费力并且成本较高等。建立不依赖动物试验的效检替代方法是大势所趋,也势在必行。对于活疫苗而言,疫苗的效价(滴度)取决于疫苗中含有的有感染性微生物数量(浓度)。产生满意效果的最小滴度是建立在测定最小有效剂量研究的基础上。 
发明内容
本发明的目的在于建立一种不使用实验动物的、重复性高的、能够有效反映猪瘟疫苗中有感染性病毒粒子数量(浓度)的效检替代方法 
本发明实施的技术方案 
1.一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法,其特征在于:该方法是将传代猪瘟疫苗稀释后接种适宜的细胞系,疫苗中的猪瘟兔化弱毒株病毒通过细胞增殖后用于病毒细胞感染量的测定,该方法检测到的活的具有感染性的猪瘟病毒兔化弱毒病毒,其检测结果与疫苗免疫原性直接相关; 
2.该效检方法是用猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒株病毒感染细胞后的上清液或细胞裂解液用于病毒感染量的测定; 
3.该检验方法是用猪瘟抗原捕捉ELISA检测感染细胞中猪瘟病毒兔化弱毒株病毒抗原,评价疫苗中病毒的细胞感染量,该方法特异性强,重复性好; 
4.该检验方法的检测样品是用细胞系包括猪睾丸细胞、猪肾细胞等扩繁的猪瘟兔化弱毒株病毒,此类细胞适合猪瘟病毒增殖。 
本发明的具体描述 
一、效检方法的建立 
(一)检验样品的制备 
按常规方法消化生长良好的猪睾丸细胞系(ST细胞),按适当细胞密度接种若干细胞培养瓶(板)。置于37℃,5%CO2温箱中培养48h至细胞长至良好单层。将猪瘟活疫苗用细胞维持液做10倍系列稀释至10-7。将10-4~10-7稀释度的猪瘟兔化弱毒分别接种已培养48h长至80%~100%单层的正常ST细胞。每个稀释度分别接种4瓶ST细胞,每瓶细胞接种4mL稀释后的病毒液,留4瓶正常ST细胞以细胞维持液代替病毒液做相同的接毒处理作为空白对照,置于37℃、5%CO2温箱中孵育4h后,吸弃病毒液,用维持液润洗三次后(每次以4mL维持液润洗)更换为6mL新鲜维持液,置于37℃、5%CO2温箱中培养。4d后第一次收毒换液,每个稀释度取一瓶细胞收获一半的细胞培养液上清,剩余上清液连同细胞直接置于-20℃冻结,反复冻融三次收获病毒液,其余每瓶细胞弃去旧维持液更换新鲜维持液6mL,置于37℃、5%CO2温箱中继续培养。此后每隔4d按上述方法收毒换液一次,最后一次收获时,取一半的细胞培养液上清收获,另一半上清液连同细胞置于-20℃冻结保存,冻融三次收获病毒液。共收获4次。所有收获的样品全部置于-20℃保存待用。 
对以上制备的所有检测样品采用抗原捕获ELISA(或称ELISA)进行检测,并对所得到 的检测结果进行比较。 
(二)检测方法 
1.猪瘟抗原捕捉ELISA检测感染细胞中猪瘟病毒 
(1)样品的准备 
消化生长良好的ST细胞,扩大接种细胞培养瓶(板孔),置于37℃,5%CO2温箱中培养48h至细胞长至良好单层。 
取猪瘟活疫苗冻干制品做10倍系列稀释至10-7,取10-4~10-7稀释度分别接种已培养48h长至80%~100%单层的ST细胞。置于37℃,5%CO2温箱中吸附4h后,吸弃毒液,更换为含2%血清的MEM维持液,置于37℃,5%CO2温箱中培养。每种疫苗设空白细胞对照。 
4d后做第1次收毒换液,以后每隔4d再收毒换液1次,连续收获4次,最后一次收获时,吸取一半的上清液,另一半上清液连同细胞一起冻结保存。所有收获的毒液置于-20℃保存待检。 
(2)待检样品的ELISA检测 
按照IDEXX猪瘟病毒抗原扑捉ELISA检测试剂盒/血清的说明书的说明对以上第(1)项中制备的各收次样品进行ELISA检测。所有样品均采用37℃孵育2h。为了探索裂解液(BVDVSerumPlus)对检测的影响,对部分样品用不同比例的裂解液处理后进行ELISA检测。 
(3)ELISA检测操作步骤方法:按照IDEXX猪瘟病毒抗原扑捉ELISA检测试剂盒/血清的说明书的说明书进行(见附件1)。 
结果判定 
①被检样品的S-N值等于或小于0.100时,判为猪瘟病毒抗原阴性。 
②被检样品的S-N值大于0.100,小于或等于0.300,判为可疑,之后可用猪瘟病毒特异性方法进行确认。 
③被检样品的S-N值大于0.300时,判为猪瘟病毒抗原阳性。 
(三)效检用样品收次、收获方式和判定标准的确定 
采用猪瘟病毒抗原血清检测试剂盒/血清(IDEXX,USA产品)对系列稀释的疫苗接种ST细胞培养后的第一次、第二次、第三次和第四次收获(简称一收、二收、三收和四收)的所有样品进行检测,按说明书(见附件1)对阴性、阳性和可疑样品进行判定。采用两种样品处理方式进行检测,一种为样品原液不经过裂解液处理直接检测,一种使用IDEXX公司提供的裂解液与样品原液1:1混合裂解处理后进行检测。比较裂解液处理对检测结果的影响。以确定适用于效检的样品收次和收获方式(结果见表1)。 
表1猪瘟病毒兔化弱毒株接种细胞后一~四收样品检测结果 

A:原液未经处理直接检测;B:裂解液与原液1:2混合裂解处理。 
NC:正常细胞对照;“/”:ST细胞未接种;“+”:阳性;“-”:阴性;“+/-”:可疑;所有检测按照试剂盒说明要求阴、阳性对照结果均成立,检测符合试剂盒说明的要求。 
抗原捕获ELISA的检测结果表明(表1),一收和二收两个收次冻结液(分别为10-4和10-6)和细胞上清的最高阳性稀释度(分别为10-3和10-5)之间存在差异。三收和四收两个收次中,冻结液和细胞上清用抗原捕获ELISA所能检测到的最高阳性稀释度相同,均为10-6。其三收及之后各收次中能检测到的阳性稀释度达到最高并保持不变。 
从表1结果可以看出:用ELISA法检测,在第一收样品只能在103稀释的样品中检测到病毒抗原,第二收样品只有104(或105)稀释的样品中检测到病毒抗原,在第三收后才能在106稀释的样品中检测到猪瘟病毒抗原;用ELISA检测猪瘟病毒抗原时,只有病毒达到足够量时才能被检测到,在第一、二收中由于接种后病毒在细胞中没有充分增殖,所以当将样品稀释到106时,由于细胞中新增殖的猪瘟病毒抗原量不足以被ELISA检测到,所以检测均为阴性结果。 
因此,以三收上清的ELISA检测结果作为ELISA检测的最终判定结果,所有“可疑”样品一律视为阴性。 
在使用本发明对猪瘟活疫苗(传代和原代细胞源)进行效检时应采用稀释后的疫苗液接种ST细胞培养的三收细胞上清作为待检测样品,该样品的检测结果作为疫苗效力检验的效价指标。 
(四)适用于ELISA效检方法的猪瘟活疫苗类型的确定 
1.不同类型的猪瘟疫苗进行效检:采用已建立的疫苗效检替代方法的操作流程对市场上随机抽检的14批不同厂家不同类型的猪瘟疫苗进行效检,待检疫苗经10倍系列稀释后每个稀释度接种四瓶细胞,按已建立的操作流程进行不同收次的收毒换液。每个批次疫苗的每个收次中,将同一稀释度所接种的四瓶细胞分别收获的样品混合均匀后采用抗原捕获ELISA进行检测。以确定适用于该效检方法的疫苗类型。 
按所建立的操作流程对14批猪瘟疫苗为市场中随机抽取的不同厂家的猪瘟兔化弱毒ST细胞系源疫苗、猪瘟兔化弱毒牛睾丸原代细胞源疫苗和猪瘟兔化弱毒兔脾淋苗进行效检。以三收上清的检测结果作为判定标准(表2),ST细胞系源疫苗的阳性稀释度均可达到10-6,牛睾丸疫苗低于ST疫苗,能达到10-5。而脾淋苗在所有稀释度几乎均不能检测到阳性。因此只有细胞系源和牛睾丸细胞源的猪瘟疫苗适于使用该替代方法进行效检,而脾淋苗没有检测到病毒,是病毒量太低还是其他原因,还有待进一步验证。 
表2不同类型疫苗接种细胞后所收样品的ELISA检测结果 

“/”:细胞脱落死亡;“+”:阳性;“-”:阴性;“+/-”:可疑;所有检测按照试剂盒说明要求阴、阳性对照结果均成立,检测符合试剂盒说明的要求 
※2012-2、2012-9、2012-10、2012-11为ST细胞系猪瘟疫苗;2012-3、2012-12、2012-13为牛睾丸原代细胞猪瘟疫苗;2012-1、2012-4、2012-5、2012-6、2012-7、2012-8、2012-14为兔脾、淋组织猪瘟疫苗。 
2.ELISA效检方法对成品疫苗的检测:将广东永顺生产的12批猪瘟兔化弱毒ST细胞系源疫苗和3批猪瘟兔化弱毒牛睾丸疫苗按已建立的效检替代方法操作流程经系列稀释后分别接种易感细胞,每个稀释度接种四瓶细胞,共做三个收次的收毒换液。在每个批次疫苗的每个收次中,将同一稀释度所接种的四瓶细胞分别收获的样品进行混合后用于之后的检测。采用抗原捕获ELISA试剂盒对所有收获样品进行检测。 
猪瘟抗原捕获ELISA对收获样品的检测:由检测结果可见,阳性样品比例随收次的增加而提高,以三收细胞培养液上清最高。其中ST细胞系源猪瘟活疫苗的细胞感染量可达疫苗的10-6~10-7,而牛睾丸原代细胞源猪瘟活疫苗在10-4以上稀释度的疫苗液接种细胞后均没有检测到感染细胞的病毒(见表3)。 
表3抗原捕获ELISA对猪瘟活疫苗(细胞系和原代细胞)的不同收次样品的检测结果 

“/”:ST细胞未接种;“+”:阳性;“-”:阴性;“+/-”:可疑;所有检测按照试剂盒说明要求阴、阳性对照结果均成立,检测符合试剂盒说明的要求 
※ST2012036~ST2012056为ST细胞系疫苗;2012124~2012126为原代细胞猪瘟活疫苗。 
(五)本检验法与兔体定型热法的比较 
采用已建立的疫苗效检替代方法对适用于该方法的多个批次的成品冻干苗进行效检,待检疫苗经10倍系列稀释后每个稀释度接种四瓶细胞,按已建立的操作流程进行不同收次的收 毒换液。在每个批次疫苗的同一收次中,将同一稀释度所接种的四瓶细胞分别收获的样品混合均匀后,采用抗原捕获ELISA试剂盒对所有收获样品进行检测。对同一批次的疫苗以兔体定型热法按《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定的方法测定每批疫苗每头份中的兔体感染量(RID),并与效检替代方法得到的结果进行比对。 
对每批次疫苗系列稀释进行兔体定型热检测得到的每头份RID含量与ELISA方法检测结果的比较可见(表4),当ST细胞系源疫苗阳性稀释度达到10-6时,每头份中含有2.6~3.0×104RID。考虑到ST细胞系源疫苗国家质量标准为每头份≧7,500RID,并且ST细胞系源猪瘟疫苗ELISA效检的阳性稀释度均能够达到10-6,因此可将ELISA方法的质量合格标准定为疫苗阳性稀释度≧10-6,当检测结果阳性稀释度≤10-5时,以兔体定型热法确认。 
表4兔体定型热法与效检替代方法检测结果 

本发明的积极意义 
本发明涉及一种用检测病毒细胞感染量评价传代和原代细胞源猪瘟活疫苗免疫效力的方法。将猪瘟疫苗10倍序列稀释后接种敏感细胞系,然后使用抗原捕获ELISA检测不同稀释 度猪瘟疫苗中的猪瘟病毒在感染细胞后增殖的子代病毒,计算疫苗中所含猪瘟病毒的最高细胞感染剂量(CID),建立了猪瘟疫苗病毒的CID效力检验方法。经过对用CID与RID两种方法对12批猪睾丸细胞系源猪瘟活疫苗的检验结果进行比较发现:用本发明建立的CID法检测,每头份猪瘟疫苗含4×105CID,用现行质量标准RID法检测,每头份猪瘟疫苗含2.6~3.0×104RID,二者之间存在良好的相关性。试验证明:本发明建立的用猪瘟抗原扑捉ELISA检测猪瘟疫苗活病毒CID的结果能够很好反映疫苗中活病毒的含量,与RID方法检测的结果相关性好,可以作为RID的替代方法。 
实施例
本实施例为更好的说明本发明,对本申请要求保护的技术方案不构成限制。 
实施例1 
——检测样品的制备 
按常规方法消化生长良好的猪睾丸细胞系(ST细胞,来自中国兽医微生物菌种保藏中心),按适当细胞密度接种若干细胞培养瓶(板)。置于37℃,5%CO2温箱中培养48h至细胞长至良好单层。 
用细胞维持液将待检的(细胞系源)猪瘟活疫苗按规定的头份量进行溶解,取1个头份剂量的疫苗液用细胞维持液做10倍系列稀释至10-7。将10-2~10-7稀释度的猪瘟疫苗液分别接种已培养48h长至80%~100%单层的正常ST细胞。每个稀释度分别接种4瓶ST细胞,每瓶细胞接种4mL稀释后的病毒液,留4瓶正常ST细胞以细胞维持液代替病毒液做相同的接毒处理作为空白对照,置于37℃、5%CO2温箱中孵育4h。4h后,吸弃病毒液,用维持液洗三次后(每次以4mL维持液洗)更换为6mL新鲜维持液,置于37℃、5%CO2温箱中培养。4d后第一次收毒换液,每个稀释度取一瓶细胞收获一半的细胞培养液上清,剩余上清液连同细胞直接置于-20℃冻结,反复冻融三次后收获病毒液,其余每瓶细胞弃去旧维持液更换新鲜维持液6mL,置于37℃、5%CO2温箱中继续培养。此后每隔4d按上述方法收毒换液一次,共收获4次(即一收至四收)。所有收获的四次样品全部置于-20℃保存待检。 
在使用本发明对(细胞系源)猪瘟活疫苗作为效力检验应采用三收细胞上清样品作为检测样品(见表5)。 
表5不同类型猪瘟活疫苗接种细胞后所收样品(三收)的ELISA检测结果 

“/”:细胞脱落死亡;“+”:阳性;“-”:阴性;“+/-”:可疑;所有检测按照试剂盒说明要求阴、阳性对照结果均成立,检测符合试剂盒说明的要求 
实施例2 
——采用猪瘟病毒抗原捕获ELISA法检测 
对全部15批细胞源猪瘟活疫苗接种的ST细胞第三收的上清样品按照IDEXX猪瘟病毒抗原扑捉ELISA检测试剂盒/血清的说明书的操作程序和判定标准进行ELISA检测,并将检测结果与RID检测结果比较。其检测结果见表4。. 
附件1 
——试剂盒使用说明书 
猪瘟病毒(CSFV)抗原检测试剂盒/血清 
HerdChekCSFVAg/Serum 
名称与用途 
IDEXX猪瘟病毒抗原检测试剂盒/血清,是根据酶联免疫反应原理设计的、用于检测血清、血浆和组织样品(扁桃体、脾脏、肠系膜淋巴结或肾脏为宜)中猪瘟病毒抗原的一种诊断试剂盒。 
概述 
猪瘟病毒(CSFV),牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和边界病毒(Border Disease VirusBDV)是同属于黄病毒科瘟病毒属的3个成员。 
猪瘟作为绝对病原体和广泛的致死性,对养猪业造成严重的损失。感染高致病力猪瘟病毒后,猪在出现临床症状前会排出大量的病毒。耐过急性或亚急性感染的动物会产生抗体并且不再散毒。低致病力温和病毒会造成猪的慢性感染,病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。先天性感染可能导致流产,木乃伊胎儿,死产和/或弱仔及畸形胎儿。低致病力病毒的先天感染导致最常见的结果是产出持续性感染的猪仔、在无疾病症状条件下传播病毒以及无免疫应答。 
猪也有可能感染BVDV或BDV,尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的,而且很难检测到病毒。IDEXXCSFV抗原检测试剂盒对瘟病毒属病毒有极高的敏感性,不能区分BVDV或BDV抗原,阳性检测结果需要用CSFV特异的方法确认。 
原理微量滴定的形式是将猪瘟病毒(Erns)的单克隆抗体包被于微量板上装配而成的。样品中的猪瘟病毒抗原被捕获在板子上。检测样品于微孔中孵育之后,捕获的猪瘟病毒抗原由瘟病毒特异性抗体和辣根过氧化物酶标记物来检测。然后,没结合的酶标记物被洗掉,再加入底物和/色原体溶液。在酶的存在下,底物转化为可以与色原体发生反应的产物并产生蓝色。在加了终止液之后,产生黄色。用分光光度仪检测在450nm[A(450)]下的单波长或者450nm和650nm[A(450/650)]双波长下的吸光值。样品的校正OD值由检测样品得到的吸光值和阴性对照的校正吸光值来计算 
试剂所有试剂要保存在2-8℃。 
1Ems单克隆抗体包被的微量反应板 2板 5板 2阳性对照 1.6ml 2.0ml 3阴性对照 1.6ml 2.0ml 4辣根过氧化物酶标记物 25ml 60ml 5浓缩组织浸泡缓冲液(2X) 115ml 2×115ml ATMB底物溶液N.12 20ml 60ml B终止液N.3 20ml 60ml C浓缩洗涤液(10×) 125ml 480ml D检测溶液 15ml 30ml
试剂准备 
洗涤液制备 
10倍浓缩的洗涤液在使用前必须让它恢复到18~26℃,使用时要摇匀使析出的盐溶解。用蒸馏水或去离子水对浓缩洗涤液进行10倍稀释(如:30ml的浓缩洗涤液要加270ml的水并充分混匀)。无菌条件下制备的洗涤液在2~8℃可保存1周。 
组织浸泡缓冲液 
浓缩组织浸泡缓冲液(2×)在使用前必须让它恢复到18~26℃,使用时要摇匀使析出的盐溶解。用蒸馏水或去离子水对浓缩组织浸泡缓冲液进行2倍稀释。根据需要计算需要稀释组织浸泡缓冲液的量。无菌条件下制备的组织浸泡缓冲液在2~8℃可保存1周。 
样品准备 
血清和血浆 
血清和血浆(新鲜或冻结)都可用于检测。 
组织 
最好使用新鲜的扁桃体,但如果需要,扁桃体也可冷冻保存。对送检的每个动物处理一或两个扁桃体,扁桃体、脾脏、肠系膜淋巴结或肾脏为宜。 
(1)用剪刀将组织剪成小块(250mg). 
(2)将剪碎的组织置于适当的离心管或Eppendorf管中,加入1ml组织浸泡缓冲液。置于18~26℃条件下1~2小时。 
(3)1500×g离心10分钟,取50μl上清液按照说明书进行检测。 
组织样品请使用过夜孵育模式操作。 
操作步骤 
在使用之前,所有的试剂盒组分都必须恢复到18-26℃。试剂应通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。每个样本都使用不同的吸头。 
1.取出用抗体包被的微量反应板,并在纪录表上标记好每个样本的位置。 
2.在每个反应孔中加入50μl的检测溶液。可以用多道移液器(8或12道)加样。 
3.在阴性对照的双孔中各加50μl阴性对照。 
4.在阳性对照的双孔中各加50μl阳性对照。 
5.在剩下的反应孔中分别加入50μl被检样品。 
6.轻弹微量反应板或用振荡器振荡,将反应板中的溶液混匀。 
7.样品孵育: 
(1)血清和血浆样品:在37℃(±3℃)的条件下孵育2小时(±5分钟),也可在2-8℃的条件下孵育12-18小时。无论选择哪种孵育方式,在孵育过程中应将微量反应板封闭或在湿盒内孵育,以防反应孔中的液体蒸发。 
(2)组织样品:在2-8℃的条件下孵育过夜(12-18小时)。在孵育过程中应将微量反应板封闭或在湿盒内孵育,以防反应孔中的液体蒸发。 
8.吸出反应孔中的液体物质并弃入废液缸中。 
9.每个反应孔加入约300μl的洗涤液进行洗涤,洗涤五次。每次洗涤后吸出所有孔中的液体。在最后一次洗涤完后,将反应板在吸水性强的物质上拍干。在洗涤时以及在加辣根过氧化物酶标记物之前要防止反应板出现干燥现象。 
10.在每个反应孔中加入100μl辣根过氧化物酶标记物。 
11.在18-26℃条件下孵育30分钟(±3分钟)。 
12.重复步骤8和9。 
13.在每个反应孔中加入100μlTMB底物溶液N.12。 
14.在18-26℃条件下避光孵育10分钟(±1分钟)。在加完第一个孔后开始计时。 
15.在每个反应孔中加入100μl的终止液N.3终止反应。在加终止液时要按加入底物溶液的顺序进行滴加。 
16.将酶标仪在空气中调零。 
17.于450nm单波长或450nm和650nm双波测定样本以及对照的吸光值。18.计算结果。 
结果 
阳性对照OD的平均值与阴性对照OD的平均值之差(P-N)必须大于或等于0.150OD,另外阴性对照OD的平均值必须小于或等于0.250OD,这样实验结果才算成立。 
若试验结果失败,有可能是实验操作失误造成,应按操作说明进行重复试验。判断各样品是否含有待测抗原主要通过计算修正OD值(S-N)来决定的。 
示例见计算部分。 
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计算 

结果判定 
1.被检样品的S-N值等于或小于0.100的,判为猪瘟病毒抗原阴性。 
2.被检样品的S-N值大于0.100,小于或等于0.300,判为可疑,之后可用猪瘟病毒特异性方法进行确认。 
3.被检样品的S-N值大于0.300的,判为猪瘟病毒抗原阳性。 

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